Métodos Físicos de Análise Métodos Físicos de Análise
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Métodos Físicos de Análise - RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Prof. Dr. Leonardo Lucchetti Mestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – Fiocruz Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – Fiocruz Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica – Farmanguinhos – Fiocruz Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise O que é e para que serve? - dá informação sobre o número de núcleos quimicamente não equivalentes (hidrogênios e carbonos, principalmente) - dá informação sobre o ambiente dos núcleos (estado de hibridização, átomos ligados etc) Fundamentos - o sinal para a RMN de 13C é 10-4 vezes menor que o sinal para o 1H - o sinal para o núcleo de 13C apresenta apenas cerca de 1% da intensidade do sinal do núcleo de 1H devido às propriedades magnéticas e à sua abundância natural de 1,1% - sinais de 13C ocorrem em uma faixa muito maior que os de 1H, facilitando a identificação e contagem dos núcleos individuais Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Spins nucleares são orientados randomicamente na ausência (a) de um campo magnético externo; na presença de um campo externo B0, apresentam orientação específica (b) • Alguns spins nucleares são alinhados paralelamente ao campo externo – Orientação de mais baixa energia – Maior probabilidade • Alguns spins nucleares são alinhados de forma antiparalela ao campo externo – Orientação de energia mais alta – Menor probabilidade Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 1 Métodos Físicos de Análise Quando os núcleos são alinhados paralelamente a um campo magnético externo são irradiados com uma determinada frequência de radiação eletromagnética, a energia é absorvida e os núcleos têm seus spins deslocados a um alinhamento antiparalelo de mais alta energia Núcleos que são submetidos a este deslocamento em resposta à radiação aplicada são considerados como ressonantes A frequência necessária para a ressonância depende da força do campo externo e da identidade dos núcleos. A diferença de energia ∆E entre os estados de spin nucleares depende da força do campo magnético aplicado Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Muitos núcleos exibem o fenômeno da ressonância: • • • Todos os núcleos com número ímpar de protons Todos os núcleos com número ímpar de neutrons Núcleos com número par de tanto protons como neutrons não apresentam ressonância Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 2 Métodos Físicos de Análise A frequência de absorção não é a mesma para todos os núcleos de 1H e 13C – Núcleos nas moléculas são cercados por eletrons – Eletrons geram pequenos campos magnéticos locais que atuam em oposição ao campo aplicado, blindando os núcleos do efeito do campo externo – O campo efetivo realmente sentido pelo núcleo é o campo aplicado reduzido pelos efeitos de blindagem locais – Cada núcleo quimicamente distinto em uma molécula está em um ambiente eletrônico diferente e, consequentemente, em um campo efetivo diferente – Cada núcleo quimicamente distinto de 13C ou 1H em uma molécula experimente diferentes campos efetivos e exibirão sinais diferentes para a RMN de 13C ou 1H Βefetivo = Βaplicado – Βlocal Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise 1H, 25oC, 60MHz... 1.000.009 no estado mais baixo 1.000.000 no estado mais alto 9 núcleos = população em excesso → RMN! 200MHz = 32 300MHz = 48 600MHz = 96 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Preocupação com a água! • Concentração da água em solução aquosa: ~100 M Não é possív el exibir esta imagem no momento. • • • Concentração de amostra: tipicamente 1 mM! Vários problemas de faixa dinâmica (fator de 100.000)!!! Originalmente achava-se que a RMN de biomoléculas em solução aquosa não era possível… Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 3 Métodos Físicos de Análise Adquirindo o espectro... • • • Amostra: mg, nm, fg; sólida ou líquida Solventes deuterados: • D2O • Py-d6 • DMSO-d6 • CD3OD • MeCO-d6 • CDCl3 Uso de referência: TMS Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Operação esquemática de um espectrômetro de RMN Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise 300 MHz NMR 900 MHz NMR Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 4 Métodos Físicos de Análise Informações do espectro de RMN 1H: 1. Número de sinais: quantos tipos diferentes de hidrogênios há na molécula. 2. Posição dos sinais (deslocamento químico): que tipos de hidrogênios há na molécula. 3. Áreas relativas sob os sinais (integração): quantos hidrogênios de cada tipo há na molécula. 4. Padrão de desdobramento de sinais: quantos hidrogênios vizinhos há na molécula. Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Deslocamentos Químicos O gráfico de RMN 1H O campo baixo, desblindado, fica à esquerda e precisa de uma força de campo menor para a ressonância O campo alto, blindado, fica à direita e requer campo com mais força para a ressonância A absorção do tetrametilsilano (TMS) é usada como referência Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Fatores que afetam o deslocamento químico (13C): 1. 2. Deslocamento afetado por átomos eletronegativos vizinhos • Carbonos ligados a átomos eletronegativos absorvem em campo baixo (comparando aos respectivos alcanos) Hibridização do carbono • carbonos sp3 geralmente absorvem de 0 a 90 δ • carbonos sp2 geralmente absorvem de 110 a 220 δ • C=O absorvem de 160 a 220 δ Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 5 Métodos Físicos de Análise A maioria dos deslocamentos químicos em RMN 1H ocorrem dentro da faixa de 0 a 10 δ, exceto para hidroxilas de ácidos carboxílicos (geralmente ocorrem entre 11-12 δ) Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Deslocamento químico aumento do campo magnético em frequência fixa aumento da frequência em campo magnético fixo Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 6 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 7 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Ambiente Químico e Deslocamento Químico Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Alguns fatores que afetam o deslocamento químico Efeitos estereoeletrônicos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Indutivos Hibridação Anisotropia magnética (mudança de propriedade física em função da direção) Ressonância Repulsão eletrônica Densidade eletrônica Efeito isotópico Efeito do solvente Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 8 Métodos Físicos de Análise Efeito indutivo Diferença de eletronegatividade H3C-X X F OMe Cl N Br I C H δ 1H 4,3 3,24 3,0 2,3 2,7 2,2 0,9 0,2 δ 13C 75,4 49,3 25,1 28,3 10,0 -20,7 5,7 -2,3 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Efeito indutivo Diferença de eletronegatividade Quanto mais substituído, maior o efeito indutivo Composto CHCl3 CH2Cl2 CH3Cl δ 7.27 5.30 3.05 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Efeito indutivo Diferença de eletronegatividade A influência do substituinte diminui com a distância Composto -CH2Br -CH2CH2Br -CH2CH2CH2Br δ 3.30 1.69 1.25 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 9 Métodos Físicos de Análise Tipo de hibridação Diferença de eletronegatividade e anisotropia sp3 sp2 sp δ 1H 0,7 – 3,5 5–7 1,5 – 3 δ 13C 0 – 50 100 – 200 50 – 80 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Repulsão eletrônica (WW) Compressão estérica e distorção de nuvens eletrônicas a c d b δ Ha > δ Hc δ < δ 13Cd 13Cb Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Repulsão eletrônica (WW) Compressão estérica e distorção de nuvens eletrônicas δ H = 0,92 δ H = - 1,40 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 10 Métodos Físicos de Análise Ressonância (a) Hα ≅ 6.2 ppm Hβ ≅ 6.8 ppm (b) Hα ≅ 6.2 ppm Hβ ≅ 4.6 ppm Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Campo elétrico ∆δ = - 1,82 β β E ≠ = - 3,36 β β ∆δ = - 5,18 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Efeito de solvente CDCl3 b a H-1 C5D5N b EFEITO DE SOLVENTE H-4 H-3 H-5 H-2 c H-7 c’ H-6a,b a Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 11 Métodos Físicos de Análise 13C: Influências nos deslocamentos - estado de hibridização do carbono - eletronegatividade de grupos ligados ao carbono carbono sp3 é mais blindado que sp2 um átomo eletronegativo desblinda o carbono ao qual está ligado Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Tipo de carbono Deslocamento químico (δ), ppm RCH3 0-35 RC CR 65-90 R2CH2 15-40 R2C CR2 100-150 R3CH 25-50 R4C 30-40 Tipo de carbono Deslocamento químico (δ), ppm 110-175 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Tipo de carbono Deslocamento químico (δ), ppm Tipo de carbono RCH2Br 20-40 O RCH2Cl 25-50 RCOR RCH2NH2 35-50 O RCH2OH 50-65 RCR RCH2OR 50-65 Deslocamento químico (δ), ppm 160-185 190-220 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 12 Métodos Físicos de Análise Espectros de (a) RMN 1H e (b) 13C do acetato de metila. TMS: calibração Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Uma vez que os três hidrogênios em cada metila estão em um mesmo ambiente eletrônico, eles são blindados na mesma intensidade e são considerados equivalentes Núcleos quimicamente equivalentes sempre mostram a mesma absorção Os três hidrogênios em cada metila apresentam o mesmo sinal em RMN 1H Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise As duas metilas não são equivalentes: dois grupos de hidrogênios absorvem em posições diferentes Quando a frequência de radiação é mantida constante e a força do campo aplicado é variada, cada núcleo em uma molécula entre em ressonância em campos com força levemente diferente, permitindo o mapeamento da estrutura carbono-hidrogênio de uma molécula orgânica Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 13 Métodos Físicos de Análise O espectro de RMN 13C do acetato de metila mostra três sinais, um para cada um dos três carbonos quimicamente distintos na molécula Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise RMN requer mais tempo (cerca de 10-3s) comparativamente ao IV (cerca de 10-13s) Se duas espécies que se interconvertem rapidamente estão presentes em uma amostra, o espectro no IV será único para ambas; porém, em RMN, será registrado um espectro da “média” – esta característica pode seu usada para medir cinética de reações e a energia de ativação de processos muito rápidos Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 14 Métodos Físicos de Análise A área sob o sinal é proporcional ao número de protons que o geram Integrar (medir eletronicamente) a área sob cada sinal torna possível determinar o número relativo de cada proton na molécula Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise A absorção de um proton pode se dividir em múltiplos sinais - multiplete O espectro de RMN 1H NMR do bromoetano mostra quatro sinais (um quarteto) em 3.42 δ para os proton de –CH2Br e três sinais (um triplete) em 1.68 δ para protons de –CH3 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Absorções múltiplas, chamadas de desdobramento spin-spin, são causadas pela interação dos spins de núcleos vizinhos • Pequenos campos magnéticos produzidos por um núcleo afetam os campos sentidos pelos núcleos vizinhos – Se os protons se alinham com o campo aplicado, o campo efetivo sentido pelos vizinhos é levemente maior – Se os protons se alinham contra o campo aplicado, o campo efetivo sentido pelos vizinhos é levemente menor Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 15 Métodos Físicos de Análise Regra do “n + 1” • Protons que apresentam número de vizinhos equivalente apresentam (n + 1) sinais em seus espectros de RMN 1H Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Acoplamento spin-spin Sinal de RMN S = 2nI + 1 S = MULTIPLICIDADE n = No. DE ESPÉCIES VIZINHAS I = No. DE SPIN desdobrado I = 1/2 S=n+1 1H, 13C, 19F, 31P nJ a,b Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Multiplicidades Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 16 Métodos Físicos de Análise Triângulo de Pascal Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise S=1+1=2 dupleto S=1+1=2 dupleto Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 17 Métodos Físicos de Análise S=2+1=3 tripleto S=1+1=2 dupleto Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise S=2+1=3 tripleto S=3+1=4 quarteto Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise S=1+1=2 S=1+1=2 Duplo-dupleto S=1+1=2 S=1+1=2 Duplo-dupleto S=1+1=2 S=1+1=2 Duplo-dupleto 18 H-2 !! dddd !! 2J H-2, F 3J H-2, H-3b 3J H-2, H-1 3J H-2, H-3a a 3 b 1 2 Métodos Físicos de Análise A origem do acoplamento spin-spin Tipo - X Tipo - Y Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Fatores que afetam o acoplamento spin-spin Ângulo de ligação Eletronegatividade Tensão de torção Comprimento de ligação Distância entre os átomos Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 19 Métodos Físicos de Análise Resumo do desdobramento spin-spin na RMN 1H 1. Protons quimicamente equivalentes não apresentam desdobramento Os três protons C-H são quimicamente equivalentes – não há desdobramento 2. Os quatro protons C-H são quimicamente equivalentes – não há desdobramento O sinal de um proton com n protons equivalentes vizinhos é dividido em um multiplete de (n + 1) sinais com constante de acoplamento J Ocorre o desdobramento Desdobramento geralmente não observado Métodos Físicos de Análise Por que não há desdobramento em RMN 13C? – Porque a abundância natural baixa torna improvável que dois núcleos de 13C sejam adjacentes na mesma molécula – Não há acoplamento de spins carbono-hidrogênio • A molécula é irradiada com um pulso de radiofrequeência para cobrir as frequências de ressonância dos carbonos e hidrogênios simultaneamente • A inversão dos spins dos hidrogênios é tão rápida que a média de seus campos magnéticos locais é zero Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Constante de Acoplamento • • • • • Distância entre os picos em um multipleto Denominado como J e medida em hertz (Hz) Geralmente situa-se na faixa de 0 a 18 Hz A mesma constante de acoplamento é compartilhada pelos grupos de hidrogênios cujos spins estão acoplados As constantes de acoplamento são independentes da força do campo do espectrômetro Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 20 Métodos Físicos de Análise EXEMPLOS Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cannabis sativa Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cannabis sativa Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 21 Métodos Físicos de Análise Cannabis sativa Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cannabis sativa Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cannabis sativa Fragmentação do ∆9-THC (EI-MS) 22 Métodos Físicos de Análise Anfetaminas Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Anfetaminas Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Anfetaminas Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 23 Métodos Físicos de Análise Anfetamina/metanfetamina Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise 44 91 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Anfetamina (fragmentação) Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 24 Métodos Físicos de Análise 58 91 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Metanfetamina (fragmentação) Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cetamina (ou) Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 25 Métodos Físicos de Análise Cetamina Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cetamina Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cetamina Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 26 Métodos Físicos de Análise Cetamina Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cetamina Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cocaína 82 (base peak) 182 [M-121]+ 303 (M+) 121 [M-31]+ 272 Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 27 Métodos Físicos de Análise Cocaína (fragmentação) Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cocaína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Cocaína x crack Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 28 Métodos Físicos de Análise Heroína (diacetilmorfina) Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 29 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 30 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 31 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 32 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 33 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 34 Métodos Físicos de Análise Heroína Perito Criminal – Polícia Federal – junho/2012 Métodos 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