propriedade antinflamatória da dibenzalacetona em modelo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
KARLA CAROLINE MARQUES DE OLIVEIRA
PROPRIEDADE ANTINFLAMATÓRIA DA DIBENZALACETONA
EM MODELO EXPERIMENTAL DE BOLSA DE AR EM RATOS
WISTAR
BELÉM-PARÁ
2010
KARLA CAROLINE MARQUES DE OLIVEIRA
PROPRIEDADE ANTINFLAMATÓRIA DA DIBENZALACETONA
EM MODELO EXPERIMENTAL DE BOLSA DE AR EM RATOS
WISTAR
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado a Coordenação da
Faculdade
de
Biomedicina
da
Universidade Federal do Pará, como
requisito para o título de Bacharelado
em Biomedicina.
Orientador: Profº. Drº. José Luiz
Martins do Nascimento
BELÉM-PARÁ
2010
KARLA CAROLINE MARQUES DE OLIVEIRA
PROPRIEDADE ANTINFLAMATÓRIA DA DIBENZALACETONA
EM MODELO EXPERIMENTAL DE BOLSA DE AR EM RATOS
WISTAR
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado
Biomedicina
à
Faculdade
da
de
Universidade
Federal do Pará, como requisito
parcial para obtenção do grau de
Bacharel em Biomedicina, aprovado
com o conceito________________
Belém (PA), 16 de dezembro de 2010.
Banca Examinadora:
______________________________________
Profº. Dr. José Luiz Martins do Nascimento
ICB – UFPA (Orientador)
_______________________________________
Profª. Drª. Gilmara de Nazareth Tavares Bastos
ICB – UFPA
_______________________________________
Profª.Drª. Raquel Montenegro
ICB – UFPA
________________________________________
Profº. Msc. Luís Antônio Loureiro Maués
ICB – UFPA (Suplente)
i
AGRADECIMENTOS
A Deus, obrigada pela vida, saúde, ensinamentos, por me ajudar a trilhar o meu caminho e
pelas pessoas que estão presentes em minha vida.
Aos meus pais, Luiz Carlos e Sônia, pelo amor, carinho e atenção dedicados a mim durante
toda minha vida, pela força nos momentos difíceis, por entender minhas ausências nos fins de
semana, pelo incentivo à profissão que escolhi, pelos conselhos que nem sempre aceitei,
muitas vezes por imaturidade, pelos valores passados a mim, pelos momentos divertidos e
raros que nunca esquecerei, e obrigada principalmente por sempre caminharem ao meu lado
me amparando em todos os momentos.
A minha irmã, Louize, pelo amor, carinho, conselhos, loucuras, pelas conversas inúteis sobre
as coisas mais absurdas e por entender meu mau-humor, muitas vezes constante, e
principalmente pela amizade e companheirismo.
Ao meu orientador, professor José Luiz, por me dar uma oportunidade única de desenvolver
minha vida científica no Laboratório de Neuroquímica. Obrigada por acreditar no meu
trabalho e por transmitir um pouco do seu vasto conhecimento científico e cultural a cada
momento.
A Gilmara por acreditar que eu conseguiria alcançar meus objetivos em momentos em que
estava desestimulada pelos obstáculos impostos durante essa longa caminhada e pelos
“puxões de orelha” divertidos que faziam com que eu me reerguesse e seguisse em frente.
Obrigada pelas conversas úteis que engrandeciam meu conhecimento e pelas fúteis que
sempre faziam com que problemas rotineiros se tornassem divertidos e fáceis de serem
solucionados. Muito obrigada!
Ao professor Heriberto Bitencourt pelo fornecimento da substância testada neste trabalho.
A Barbarella por sempre confiar no meu trabalho desde o momento em que entrei no
Laboratório de Neuroquímica, por ter paciência em me ensinar e passar um pouco dos seus
conhecimentos e principalmente obrigada pela amizade. Obrigada Chefinha!
ii
Aos meus avôs, Waldemar, Georgina e Raimundo, pelo amor e carinho dedicados a mim e
pelos momentos em família, que por mais que fossem raros sempre rendiam belos momentos.
As minhas Power-puffs, Leila e Laine, pela amizade, carinho, companheirismo, conversas,
por escutarem minhas doidice e baboseiras e principalmente pelo incentivo diário. Obrigada
por quatro anos de lutas, brigas, tristezas e alegrias. Vocês sempre estarão em meu coração.
Seremos sempre vencedoras!
As minhas amigas de longa data, Bruna, Jamille, Glenda, Lorena e Carla, pela amizade, por
entender minha ausência em nossos encontros, pelos momentos hilários que faziam com que
esquecesse tudo e por sempre estarem dispostas a me escutar.
Ao Luís Antônio que me ensinou com tanta paciência determinadas técnicas deste trabalho e
pelas dicas valiosas durante todos os anos em que estive no Laboratório de Neuroquímica.
A Claudia pela sua valiosa ajuda em todos os momentos deste trabalho com todo seu bom
humor, amizade, equívocos lingüísticos que rendiam momentos hilários, por sempre tornar
engraçado até os piores momentos.
A Neidianne Ramos por sempre ser um ombro amigo, pelos “puxões de orelha”, pelo auxílio
durante os dias de trabalho e obrigada pelo café e conversas diárias.
Ao Igor por sempre estar disposto a me ajudar durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao pessoal do Laboratório de Neuroquímica: Marcos Lebrego, Reinaldo, Társis, Vanessa,
Dayanne, Mauro e Luizinho Sawada. Obrigada pelas conversas e momentos divertidos que se
tornaram únicos.
Gostaria de agradecer aos meus amigos, Patrícia, Breno, Ivy, Erlonia, Yasmin Farias e
Edvaldo Penha pelos momentos em que estivemos reunidos ao longo desta caminhada. Vocês
sempre estarão em meu pensamento. Vamos nos separar, mas espero que sempre tenhamos a
macacolândia e fins de semana de reuniões. Desejo que todos sejam vitoriosos.
iii
Meuas agredecimentos aos órgãos financiadores, CNPq e FAPESPA, e a Universidade
Federal do Pará.
iv
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ---------------------------------------------------------------- VI
RESUMO ----------------------------------------------------------------------------------------- VII
ABSTRACT -------------------------------------------------------------------------------------- VIII
1. INTRODUÇÃO ------------------------------------------------------------------------------- 1
1.1 INFLAMAÇÃO ------------------------------------------------------------------------------ 1
1.1.1 Via inflamatória ---------------------------------------------------------------------- 2
1.2 TIPOS DE RESPOSTA IMUNE E SEU PAPEL NO PROCESSO
INFLAMATÓRIO -------------------------------------------------------------------------------- 3
1.2 MIGRAÇÃO CELULAR ------------------------------------------------------------------- 4
1.3 VASODILATAÇÃO ------------------------------------------------------------------------ 5
1.4 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMATÓRIO ------------------------------------------- 6
1.5.1 Óxido Nítrico -------------------------------------------------------------------------- 7
1.5.2 Superóxido ----------------------------------------------------------------------------- 9
1.6 FÁRMACOS ANTIINFLAMATÓRIOS -------------------------------------------------- 11
1.7 AGENTE FLOGÍSTICO -------------------------------------------------------------------- 13
1.8 NOVOS AGENTE ANTIINFLAMATÓRIOS ------------------------------------------- 14
2. OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------------------------- 15
3. MATERIAL E MÉTODOS ----------------------------------------------------------------- 16
3.1 ANIMAIS -------------------------------------------------------------------------------------- 16
3.2 BOLSA DE AR ------------------------------------------------------------------------------- 16
3.3 GRUPOS EXPERIMENTAIS -------------------------------------------------------------- 17
3.4 ANÁLISE DO EXSUDATO ---------------------------------------------------------------- 17
3.5 AVALIAÇÃO DA VASODILATAÇÃO DOS GRUPOS
EXPERIMENTAIS -------------------------------------------------------------------------------- 18
3.6 AVALIAÇÃO DA MIGRAÇÃO CELULAR --------------------------------------------- 18
3.7 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO ------------------------------- 18
3.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA SOD DOS GRUPOS
EXPERIMENTAIS -------------------------------------------------------------------------------- 19
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ------------------------------------------------------------------- 19
v
4. RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------- 20
4.1 ANÁLISE DA MIGRAÇÃO CELULAR EM ANIMAIS
TRATADOS COM DBZ -------------------------------------------------------------------------- 20
4.2 VOLUME DO EXSUDATO EM ANIMAIS TRATADOS COM DBZ --------------- 23
4.3 VASODILATAÇÃO EM ANIMAIS TRATDOS COM DBZ -------------------------- 24
4.4 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO DURANTE O PROCESSO
INFLAMATÓRIO -------------------------------------------------------------------------------- 26
4.5 REDUÇÃO DA ATIVIDADE DA SOD EM ANIMAIS TRATADOS
COM DBZ ------------------------------------------------------------------------------------------- 28
5. DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------------------------------ 29
6. CONCLUSÃO ---------------------------------------------------------------------------------- 34
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ----------------------------------------------------- 35
vi
LISTA DE ABREVIAURAS
AINE – Antiinflamatório Não-esteroidal
AP – 1 – Ativador de Proteína 1
COX – Ciclooxigenase
DBZ - Dibenzalacetona
DMEM – Meio de Cultura: Dulbecco’s Modified Eagles Medium
eNOS – Óxido Nítrico Endotelial
FBS – Soro Bovino Fetal
ICAM – Molécula de Adesão Intracelular
IL-1 – Interleucina – 1
iNOS – Óxido Nítrico Induzida
NF-κB – Fator de Transcrição Nuclear κB
nNOS – Óxido Nítrico Neuronal
NO – Óxido Nítrico
PAMP – Padrão Molecular Associado a Patógeno
PGs – Prostaglandinas
PMN – Células Polimorfonucleares
ROS – Espécies Reativas de Oxigênio
SNA – Sistema Nervoso Autônomo
SNC – Sistema Nervoso Central
SOD – Superóxido Dismutase
TLR – Receptor Toll-Like
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
vii
RESUMO
Inflamação é uma resposta do tecido vascularizado frente a um agente agressor, caracterizada
morfologicamente pela saída de líquidos e de células do sangue para o intertíscio. Diversos
trabalhos têm sido desenvolvidos para elucidar os mecanismos pró-inflamatórios com o
intuito de desenvolver fármacos que atuem como antiinflamatórios. Por isso o presente
trabalho tem por objetivo analisar as propriedades antinflamatórias da substância
Dibenzalacetona (DBZ) em ratos Wistar em modelo de bolsa de ar. Foram feitas análise da
migração celular, vasodilatação, espécies reativas de oxigênio como, óxido nítrico e
superóxido, e exsudação induzidos com carragenina, e tratados com indometacina ou 1
mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg de DBZ. Concluiu-se que a DBZ promoveu uma ação
antiinflamatória principalmente nos aspectos relacionados à migração de células próinflamatórias, exsudação, vasodilatação e na produção de determinadas espécies reativas de
oxigênio e a dose de 10 mg/Kg, em determinados pontos analisados, foi mais eficiente que a
indometacina.
Palavras-Chave: Dibenzalacetona, antiinflamatório, espécies reativas de oxigênio e
inflamação.
viii
ABSTRACT
Inflammation is the response of the vascularizated tissues to an injury that is morphologically
characterized by the exit of fluid and blood cells to the interstice. Many researches have been
developed with the aim to elucidate the mechanisms involved in the pro-inflammatory process
and to develop new medicines that is capable to avoid the inflammatory process. Therefore,
the present study has the aim to investigate the anti-inflammatory properties of
Dibenzalacetone (DBZ) in Wistar rats. Analyses had been made in a model of pouch air,
where the Carrageenan was used as phlogistc agent. The exudate was analysed to cellular
migration, vasodilatation, reactive oxygen species and exudates in groups of animals that
were treated with only carrageenan, indomethacin and, 1, 5 and 10 mg/Kg of DBZ. The DBZ
promotes an anti-inflammatory action, mainly in aspects related to cellular migration,
exudates, vasodilatation, and in the production of reactive oxygen species. The concentrations
of the DBZ were effectives in the anti-inflammatory process, since occurred the decreased of
cellular migration, nitrite production (metabolite of nitric oxide), dismutase superoxide and
vasodilatation, and the dose of 10 mg/Kg in some points was more efficiently that
indomethacin.
Key-words: Dibenzalacetone, anti-inflammatory, reactive oxygen species and inflammation.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 INFLAMAÇÃO
Inflamação ou flogose (do latim inflamare e do grego phlogos, que significa pegar
fogo) é uma resposta dos tecidos vascularizados a um agente agressor caracterizada
morfologicamente pela saída de líquidos e de células do sangue para o intertíscio. Embora em
geral constitua um mecanismo defensivo muito importante contra inúmeras agressões, em
muitos casos a reação inflamatória pode também causar danos ao organismo (Brasileiro Filho,
2006).
A inflamação é estudada na tentativa de lidar com este processo patológico por
milhares de anos. Celsius (em 30 D.C.) descreveu os quatro sinais cardinais da inflamação
(rubor, calor, dor e tumor) e usou extratos de salgueiro para aliviar esses sintomas. Na Roma
antiga houve o desenvolvimento do uso de plantas contendo salicilato para amenizar o
processo inflamatório. Na Ásia plantas contendo salicilato foram muito utilizadas
terapeuticamente. Durante a idade média, outras substâncias eram utilizadas em emplastros
para curar feridas além de várias outras aplicações internas e externas incluindo o tratamento
de cólicas menstruais e disenteria (Vane & Botting, 1987).
O processo inflamatório caracteriza-se principalmente por uma vasodilatação
local, com um conseqüente aumento do fluxo sanguíneo; Aumento da permeabilidade dos
capilares, permitindo a saída de grande quantidade de líquido para os espaços intersticiais;
Coagulação do líquido nos espaços intersticiais devido às quantidades excessivas de
fibrinogênio e outras proteínas que sairiam dos capilares; Migração de grande quantidade de
granulócitos e monócitos para os tecidos e dilatação das células teciduais. Alguns dos muitos
produtos teciduais causadores dessas reações incluem histamina, neuropeptídeos, bradicinina,
serotonina, prostaglandinas, entre outras substâncias que constituem o sistema complemento e
do sistema de coagulação (Guyton, 2006).
A inflamação pode ser dividida em duas fases, durante a fase aguda da inflamação
há um aumento do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular com o acúmulo de fluídos,
leucócitos, e mediadores inflamatórios como as citocinas. As fases, subaguda e crônica, são
caracterizadas pelo desenvolvimento de uma resposta imune celular e humoral específica aos
agentes agressores (Feghali et al., 1997).
2
O início do processo inflamatório acontece a partir do recrutamento de células do
sistema imune para o local da injúria, essas células por sua vez, irão produzir citocinas próinflamatórias e irão ativar a expressão, em células endoteliais e em neutrófilos, de moléculas
de adesão e a produção aumentada de mediadores vasoativos como o Óxido Nítrico (NO) e
ecosanóides produzidos pela enzima Ciclooxigenase-2 (COX-2), que possuem um importante
papel na resposta fisiopatológica da inflamação. Todo este processo irá gerar como resposta
estresse oxidativo gerado pela liberação de espécies reativas de oxigênio, vasodilatação
gerada pelo NO e migração celular pela ativação de moléculas de adesão (Cuzzocrea et al.,
2000)
1.1.1 Via Inflamatória
No processo inflamatório, quando ocorre uma lesão na membrana celular, que é
constituída principalmente por fosfolipídeos, a enzima fosfolipase A2, após ser ativada por
citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina-1 (IL-1) leva a degradação de fosfolipídeos
de membrana como o aracdonato, resultando na produção de ácido aracdônico. Quando o
ácido aracdônico é metabolizado ocorre à formação dos leucotrienos pela ação da enzima
lipooxigenase, e as prostagladinas (PGs), prostaciclinas e tromboxanos, pela ação das
ciclooxigenases (COX) (Hilário et al., 2006). Estes metabólitos fazem parte de processos
fisiológicos normais, como por exemplo, a manutenção da pressão sanguínea e temperatura
corporal, protegendo o organismo contra danos causados por doenças e estresse (Ninnemann,
1988).
Os metabólitos do ácido aracdônico são críticos para diversos processos
biológicos, incluindo inflamação, ovulação, angiogênesis, agregação plaquetária, e função
imunológica. Eicosanóides são produtos do metabolismo do ácido aracdônico, através das
Ciclooxigenases (COX) que exercem um papel importante na produção de eicosanóides. O
ácido aracdônico é um ácido graxo insaturado com 20 carbonos distribuído através da
bicamada lipídica da célula. A enzima fosfolipase cliva a membrana ligada ao ácido
aracdônico, esta ação torna viável a conversão de lipídeos bioativos. Uma vez liberado, o
ácido aracdônico pode ser metabolizado através de três vias de sinalização: via da
ciclooxigenase, via da lipooxigenase que irá metabolizar o ácido aracdônico em leucotrienos e
a via do citocromo P-450 monooxigenase. Porém, a via da COX é mais estudada (Williams et
al., 1999 e Hilário et al., 2006).
3
Figura 1: Vias que levam a geração de eicosanóides pela COX-1 ou COX-2. Modificado de Mitchell et al., 1999.
1.2 TIPOS DE RESPOSTA IMUNE E SEU PAPEL NO PROCESSO
INFLAMATÓRIO
O sistema imunológico possui como função fisiológica reconhecer o que é próprio
de cada organismo para poder ter a capacidade de reconhecer agentes infecciosos ou agentes
químicos que causem algum tipo de dano tecidual (Abbas et al., 2008).
O sistema imune é dividido em imunidade inata (natural) e imunidade adaptativa
(adquirida). Esses dois componentes do sistema imune têm sido caracterizados
independentemente. O sistema imune adaptativo é um dos principais interesses no campo da
imunologia, por ser encontrado principalmente em vertebrados (Takeda et al., 2005).
O sistema imune inato é a primeira defesa contra microrganismos infecciosos,
onde macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e linfócitos NK (natural-killer) são as
principais células presentes na primeira defesa do organismo. Apesar de pouco estudado o
sistema imune inato é de grande importância para ativação da imunidade adaptativa, devido às
células apresentadoras de antígenos que sinalizam para presença de agentes infecciosos e
4
ativam células da imunidade adaptativa, como os linfócitos T, para gerar uma resposta imune
mais específica (Palm et al., 2009).
A especificidade imunológica inata não é tão eficiente quanto à adaptativa, no
entanto as células do sistema imune inato possuem receptores de reconhecimento padrão que
podem ativar uma discreta resposta imunológica (Kumar et al., 2009). Um exemplo de
receptores padrão seriam os receptores Toll-like (TLRs), cuja função é reconhecer Padrões
Moleculares Associados à Patógenos (PAMPs), como determinados fatores de virulência,
antígenos presentes em bactérias, vírus, fungos e protozoários, assim como proteínas de
choque térmico do hospedeiro (HSPheat shock proteins) (Loharungsikul et al., 2008; Abbas
et al.,2008).
Receptores Toll-like ativados pelos PAMPs, ativam uma cascata de sinalização
onde serão recrutadas proteínas cinases que ativarão fatores de transcrição nuclear que por sua
vez irão estimular a expressão gênica de citocinas, proteínas sinalizadoras que regulam
mecanismos imunológicos, expressão gênica de enzimas como a ciclooxigenase-2 (COX-2) e
a óxido nítrico sintase induzida (iNOS), durante o processo inflamatório essas enzimas são
essenciais para o desencadeamento de uma resposta pró-inflamatória (Ooi et al., 2010;
Anderson et al., 1996).
O sistema imune inato produz mediadores que têm como uma de suas funções o
recrutamento de células que pertencem a resposta adquirida do sistema imune que é
subdividida em imunidade celular e humoral. A imunidade celular caracteriza-se pela
produção de células especializadas (linfócitos T), já a imunidade humoral caracteriza-se
principalmente pela produção de imunoglobulinas ou anticorpos, que são proteínas
especializadas na ação específica contra determinados antígenos. As células deste tipo de
resposta estão presentes no sangue e na linfa como células circulantes (Abbas et al., 2008)
A resposta imune a agentes ou substâncias antigênicas pode resultar em benefícios
para o hospedeiro ou deletério se essa resposta resultar em uma inflamação crônica sem
regressão do processo subjacente (Katzung, 2003).
1.3 MIGRAÇÃO CELULAR
Leucócitos, principalmente neutrófilos e monócitos são recrutados do sangue para
os locais onde está ocorrendo à injúria tecidual, para tanto eles se ligam a moléculas de adesão
em células endoteliais e quimiocinas produzidas durante o processo inflamatório. O
5
recrutamento dos leucócitos envolve um processo de fixação dos leucócitos circulantes à
superfície luminal das células epiteliais das vênulas pós-capilares e a migração pela parede
dos vasos (Abbas et al., 2008). O processo de migração através das paredes dos vasos
denomina-se diapedese, através de junções interendoteliais (Bechara & Szabó, 2006)
A migração celular em resposta a processos inflamatórios é vista em poucas horas
após o estímulo que está causando a injúria tecidual, há um recrutamento de neutrófilos para o
local onde está ocorrendo o dano tecidual (Jiang et al., 1997 ; Bresnihan, 2002; Shin et al.,
2009). Muito embora os neutrófilos sejam as primeiras células na remoção de agentes
patogênicos como bactérias, eles também contribuem para o processo inflamatório liberando
mediadores inflamatórios, incluindo mediadores que atraem macrófagos para o local da
inflamação (Chabaud, 1998; Shin et al., 2009). Os macrófagos por sua vez liberam citocinas
pró-inflamatórias, como o Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) (Feldmann, 1996; Day, 2002,
apud, Shin et al., 2009). Este é um estimulador de iNOS em certos tipos celulares, além disso
o TNF-α induz a quimiotaxia de neutrófilos e linfócitos T e a expressão de moléculas de
adesão (Xie et al., 1993 ; Adams et al., 2002 ; Shin et al., 2009).
O recrutamento de leucócitos da circulação sanguínea é uma reação crucial para o
processo inflamatório. Esta ação ocorre através de muitos passos em que o leucócito interage
com o endotélio. Os leucócitos se aderem ao endotélio microvascular e, por conseguinte
ocorre a transmigração dessas células através da parede dos vasos e extravasam atingindo
desta forma o tecido extra vascular. Diversos fármacos têm objetivado impedir a migração
celular como forma de amenizar o processo inflamatório (Ulbrich et al., 2003).
1.4 VASODILATAÇÃO
Os fenômenos vasculares durante a inflamação são representados por
modificações hemodinâmicas e reológicas da microcirculação comandadas por mediadores
químicos liberados durante os fenômenos irritativos e, menos freqüentemente, por ação direta
do agente flogístico. Embora sempre se associe vasodilatação arteriolar no processo
inflamatório com a ação de mediadores químicos (histamina, substância P, bradicinina, PGE2
e PGI2), é possível que fatores vasoativos produzidos no endotélio (NO e prostaciclina)
também desepenhem um papel importante sobre a vasodilatação no processo inflamatório
(Brasileiro Filho, 2006).
6
Trabalhos têm demonstrado que durante as primeiras horas depois de uma injúria
capaz de iniciar um processo inflamatório, a produção de NO mediada por iNOS começa a ser
regulada positivamente, produzindo uma explosão na liberação do NO, que excede os níveis
basais de radicais livres. Essa produção aumentada de NO tem como conseqüência um dano
celular. Primeiramente o NO pode promover diretamente uma exacerbação da vasodilatação
periférica, resultando em uma alteração vascular; o NO pode também regular positivamente o
NF-κB, iniciando uma via de sinalização inflamatória que culminará na produção de citocinas
pró-inflamatórias (Szabo, 1996 ; Szabo, 1998; 1998; Horton, 2003).
As PGs, que são produtos do metabolismo do ácido aracdônico, também possuem
ação vasodilatadora, como dito acima.
A PGD2 é liberada de mastócitos ativados por
estímulos alérgicos ou outros e a PGE2 inibe a ação de linfócitos e outras células que
participam das respostas alérgicas ou inflamatórias (Chahade et al., 2008).
1.5 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMATÓRIO
Estudos sobre radicais livres iniciaram por volta de 1924. Os principais estudos
relacionaram a atuação desses radicais em Biologia Celular e Molecular, Fisiologia,
Imunologia e Patologia Humana (Bast et al., 1991, apud, Vannucchi et al., 1998).
A importância dos radicais livres no metabolismo celular vem se tornando clara,
em função de intensa investigação sobre a peroxidação lipídica, dos sistemas de
oxidorredutase e no papel da superóxido dismutase (SOD). O interesse por radicais livres e
antioxidantes tem se intensificado ultimamente, pelo possível papel dessas substâncias na
patogênese de diversas doenças. Assim, estudos sobre os sistemas de oxirredução, envolvendo
a peroxidação lipídica e espécies oxidantes mediadas por radicais livres, e a relação desses
sistemas com a arteriosclerose, inflamação, diabetes, câncer e outras doenças, bem como uma
desejada proteção efetuada pelos antioxidantes, tem levado inúmeros autores a se dedicarem
ao assunto, procurando estabelecer uma segura base fisiopatológica para os vários processos
(Vannucchi et al., 1998).
O termo radical livre é freqüentemente usado para designar qualquer átomo ou
molécula com existência independente, contendo um ou mais elétrons não pareados, nos
orbitais externos. Um elétron não pareado é aquele que ocupa um orbital atômico ou
molecular isoladamente (Vannucchi et al., 1998).
7
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) que incluem peróxido de hidrogênio, ânion
superóxido e NO, geralmente são considerados citotóxicos.
1.5.1 Óxido Nítrico
O Óxido Nítrico (NO) é uma molécula lipofílica pequena que pode ser
rapidamente difundida através das barreiras da membrana celular e desse modo pode alcançar
os compartimentos intracelulares de células adjacentes com funções diversificadas (Ignarro,
1990). Em mamíferos, o NO participa de diversas funções biológicas que vai desde a
formação de um mecanismo de proteção contra diversos microrganismos até a regulação da
pressão sanguínea e o processo de neurotransmissão (Alderton et al., 2001). O NO é
produzido pela enzima Óxido Nítrico Sintase (NOS) (Griffith et al., 1995).
Existem três isoformas da enzima NOS. A isoforma neuronal (nNOS) é uma
enzima constitutiva presente em muitos neurônios no sistema nervoso central (SNC) e no
sistema nervoso autonômico (SNA) (McCann,1997). A isoforma endotelial (eNOS) forma a
molécula de NO no sistema cardiovascular, onde atua como uma importante molécula de
sinalização. No sistema cardiovascular o NO tem como principais funções a vasodilatação,
inibição da proliferação de células do músculo liso vascular, atenuador da adesão de células
inflamatórias no endotélio e inibição da agregação plaquetária (Naseem, 2005). A isoforma
induzida (iNOS) é produzida por macrófagos diante da ativação por patógenos intracelulares,
determinadas células tumorais, produtos microbianos como o lipopolissacarídeo (LPS), e
citocinas pro-inflamatórias, como interferon-gama (IFN-γ), TNF-α, IL-1 e IL-6. A produção
de NO por macrófagos ativados é uma importante resposta imune inata, implicada com a
atividade bactericida dos macrófagos (He et al., 2003).
O papel do óxido nítrico na inflamação tem sido estudado extensivamente. Um
número considerável de pesquisas tem demonstrado que esse radical livre possui atividade
regulatória antiinflamatória através das formas constitutivas, ou seja, em concentrações
basais, entretanto outros estudos sugerem que o NO, gerado pela forma induzida da enzima
NOS (iNOS), promove a inflamação e disfunção tecidual, e, portanto possui propriedades próinflamatórias e deletérias (Sautebin, 2000).
O NO é caracterizado como um radical livre e seu metabolismo é ativado a partir
da oxidação de L-arginina (Sautebin, 2000) pela NOS. As isoformas constitutivas são
sintetizadas por pequenas quantidades de NO em resposta a vários agonistas que aumentam a
8
concentração de Ca2+ (Sautebin, 2000). A o isoforma iNOS é expressa seguindo a indução
transcricional por lipolissacarídeo e um número de citocinas em diferentes tipos de células,
assim como macrófagos, neutrófilos, células endoteliais e células do músculo liso (Knowles et
al., 1994, apud, Sautebin, 2000).
Durante o metabolismo do NO a enzima NADPH é um importante componente
desse processo. Esta enzima foi primeiramente reportada para a iNOS (Lyengar et al., 1987,
apud, Marletta, 1993). Depois, com o advento de novas técnicas descobriu-se que todas as
isoformas de NOS requeriam NADPH e durante esta reação ocorre a oxidação da L-arginina
que irá gerar NO e citrulina (Marletta, 1993).
Os produtos finais da formação do NO in vivo, são o nitrito (NO 2-) e o nitrato
(NO3-) (figura 2). A proporção de NO2- é encontrado no meio reacional em quantidade
suficiente para ratificar a presença de NO (Marletta, 1993). A formação de espécies reativas
de nitrogênio é importante na determinação das atividades antiinflamatórias e inflamatórias do
NO (Sautebin, 2000). Salvemini e colaboradores demosntraram que o NO endógeno e
exógeno possuem um papel crítico na liberação de PGE2 através da direta ativação da COX
(Salvemini et al., 1993).
REAÇÕES DE FORMAÇÃO DE NITRITO E NITRATO
2 NO + O2
2 NO2 (Dióxido de Nitrogênio)
2 NO + 2 NO2
2 N2O3 (Trióxido de dinitrogênio)
2 N2O3 + 2 H2O
O2 + NO
[ONOOH]
4 NO2- (NITRITO) + 4 H-
ONOO- (Peroxinitrito) + H+
OH- + NO2-
[ONOOH]
NO3- (NITRATO)
Figura 2: Reações de Nitrito e Nitrato. Modificado de Marletta, 1993
1.5.2 Superóxido Dismutase
Em 1968, descobriu-se que uma proteína do eritrócito era capaz de remover
cataliticamente os radicais superóxidos e, então, essa função ficou identificada como a da
enzima superóxido dismutase. A SOD é uma metaloenzima que, em sistemas eucarióticos,
possui cobre, zinco e manganês e nos procarióticos contém ferro e manganês. As diferentes
9
formas de SOD catalisam a mesma reação, a de dismutação do radical superóxido (Halliwel et
al., 1989 e Pitt et al., 1991, apud, Vannucchi et al., 1998)
O superóxido (O2-) é formado de várias origens, incluindo respiração celular
normal, leucócitos polimorfonucleares ativados, células endoteliais e mitocôndrias. Sob
condições fisiológicas, a reatividade do superóxido é controlada pela enzima superóxido
dismutase (SOD). Durante um processo de inflamação aguda e crônica, o superóxido é
intensamente produzido. Fatores importantes que caracterizam o superóxido como um
mediador pró-inflamatório, incluem: danos causados às células endoteliais e o aumento da
permeabilidade microvascular, gera uma regulação positiva de moléculas de adesão assim
como a ICAM – 1 (Molécula de Adesão Intracelular) e Selectina – P, que recruta neutrófilos
para os locais de inflamação, gera danos ao DNA (Ácido Desoxirribonucléico), ativa a
ativação de fatores de transcrição como NF-κB e AP-1 (ativador de proteína 1), que regulam a
expressão de citocina pró-inflamatórias e pró-nociceptivas (Salvemini et al., 2006).
Quando o NO é produzido em níveis basais ele pode atuar mantendo o tônus do
vaso sanguíneo, inibindo o processo de adesão e agregação das células e protegendo os órgãos
por citoproteção. O NO é também conhecido por mediar diversos efeitos benéficos através da
ativação de COX que irá ativar mediadores antiinflamatórios, porém a interação do
superóxido com o NO inativa as propriedades benéficas que o NO constitutivo poderia
possuir. (Salvemini et al., 2006).
Em doenças inflamatórias a SOD é inativada, favorecendo o superóxido a
aumentar. O superóxido interage com o NO, destruindo os seus efeitos benéficos. Por
conseguinte, os níveis de superóxido e NO (gerado pela iNOS) aumentam, inclinando o
balanço entre superóxido/NO para formação de um potente agente pró-inflamatório e próapoptótico, o peroxinitrito (ONOO-) (Salvemini et al., 2006) (Figura 3).
10
Figura 3: Desenho esquemático da interação entre o superóxido (O2-) e o NO, durante processos não-inflamatórios (basais) e
processos inflamatórios. Modificado de Salvemini et al ., 2006.
11
1.6 FÁRMACOS ANTIINFLAMATÓRIOS
O uso de substâncias químicas para amenizar a dor e a inflamação é uma das
necessidades mais antigas da humanidade. O controle da dor e da inflamação é um dos
objetivos mais primários na origem do homem. Desde o isolamento da salicilina e a
demonstração dos seus efeitos antipiréticos em 1829 por Leraux, um longo caminho de
pesquisa sobre o processo inflamatório vem sendo trilhado (Oliveira Jr. et al., 2007; Solomon
et al., 2007; Brenol et al., 2000; Chahde et al., 2008).
O salicilato de sódio foi usado para tratar a febre reumática como agente
antipirético e no tratamento da gota em 1875. O enorme sucesso do fármaco levou à produção
do ácido acetilsalicílico. Um longo caminho de pesquisa foi desencadeado e, em 1899, por
Dresser, o ácido acetilsalícilico foi introduzido, com o nome de aspirina, que se perpetuou
com o passar dos anos (Oliveira Jr. et al., 2007; Solomon et al., 2007; Brenol et al., 2000;
Chahade et al., 2008).
Devido à toxicidade gastrointestinal causada pelo ácido acetilsalicílico
procuraram-se sintetizar outras substâncias com menores efeitos adversos e, assim,
desenvolveu-se o primeiro antiinflamatório não-salicilato, a fenilbutazona, no início de 1950
(Chahade et al., 2008).
Diversos fármacos têm sido utilizados como potenciais agentes antiinflamatórios.
Há dois grupos de fármacos antiinflamatórios que são os antiinflamatórios não-esteroidais
(AINEs) e os antiinflamatórios esteroidais.
O principal mecanismo de ação dos esteróides acontece através da inibição da
fosfolipase A2, atividade que é necessária para liberação de ácido aracdônico. Os esteróides
inibem a formação de prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos (Vane & Botting, 1987).
Os AINEs compõem um grupo heterogêneo de compostos, que consiste de um ou
mais anéis aromáticos ligados a um grupamento ácido funcional. São ácidos orgânicos fracos
que atuam principalmente nos tecidos inflamados e se ligam, significativamente, à albumina
plasmática (Oliveira Jr. et al., 2007; Solomon et al., 2007; Brenol et al., 2000).
Essencialmente, todos AINEs são convertidos em metabólitos inativos pelo fígado e são,
predominantemente, excretados pela urina (Klippel et al., 2001).
O principal mecanismo de ação dos AINEs ocorre através da inibição específica
da COX e conseqüente redução da conversão do ácido araquidônico(AA) em prostaglandinas.
12
Reações mediadas pelas COXs, a partir do AA produzem PGG2 (Prostaglandina G2), que sob
ação da peroxidase forma PGH2 (Prostaglandina H2), sendo então convertidas às
prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos (TXs) (Figura 4) (Oliveira Jr. et al., 2007).
Figura 4. Via inflamatória culminando na síntese de prostaglandinas (PGs). Modificado de
Brasileiro Filho, 2006.
Os AINEs constituem um grupo, sendo na maioria ácidos orgânicos com ação
analgésica, antitérmica e antiinflamatória combatendo assim os principais sintomas gerados
pela produção de prostaglandinas. Esses medicamentos são largamente usados para combater
a febre e a dor aguda ou crônica. São as medicações mais vendidas em todo o mundo e, em
conjunto com os analgésicos e antitérmicos, correspondem a aproximadamente 30% dos
medicamentos utilizados (Hilário et al., 2006).
Sabe-se que as prostaglandinas são produtos originados do ácido aracdônico que é
obtido da dieta ou do ácido linoléico, encontrando-se presentes em todos os tecidos animais
13
exercendo várias funções. Quimicamente são parte de um grupo conhecido como
eicosanóides derivados de ácido aracdônico e liberados de fosfolipídeos de membrana de
células lesadas por ação catalítica da fosfolipase A2. A COX-1 e COX-2 e a hidroperoxidase
catalisam as etapas seqüenciais de síntese de prostanóides e as lipoxigenases transformam o
ácido aracdônico em leucotrienos e outros compostos (Brenol et al., 2000 and Oliveira Jr. et
al., 2007).
Outra classe de antiinflamatórios seriam os esteroidais, como os corticosteróides,
inibem a ação da fosfolipase A2, que é necessária para liberação de ácido aracdônico. Os
corticoesteróides possuem como função final a inibição da produção de PGs.
No presente trabalho utilizou-se como controle um AINE com propriedades
antipiréticas, analgésicas já conhecidas, a Indometacina.
1.7 AGENTE FLOGÍSTICO
A injeção de carragenina, um irritante químico derivado de algas marinhas, nos
animais do modelo experimental é uma forma de estudo comum sobre inflamação e dor
inflamatória (Nantel et al., 1999). Em um experimento de bolsa de ar a carragenina induz
inflamação aguda que é caracterizada pela análise do conteúdo presente na bolsa de ar, pela
capacidade do exsudato e os tecidos que estão próximos a região da bolsa a produzirem
mediadores inflamatórios (Tao et al., 1998).
A inflamação induzida por carraginina é comumente usada para avaliar a eficácia
de AINEs. Em um modelo experimental em ratos o número de células inflamatórias e
exsudato alcançam um pico em até 24 horas e diminui depois (Gilroy et al., 1999). No
modelo de inflamação induzida por carraginina, existem dois tipos predominantes de células
inflamatórias os leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são os tipos celulares predominantes
após 12 horas; depois essas células são substituídas por células mononucleares que estão
migrando e se diferenciando em macrófagos (Gilroy et al., 1999).
14
1.8 NOVOS AGENTES ANTIINFLAMATÓRIOS
A Dibenzalacetona possui uma estrutura química semelhante às chalconas.
Artigos publicados sobre o papel das chalconas sintéticas sobre o processo inflamatório
demonstraram que essas substâncias são capazes de inibir a liberação de mediadores químicos
liberados por mastócitos, neutrófilos, macrófagos e microglias em estimulação in vitro do
processo inflamatório (Lin et al., 1997 and Ko et al., 2003, apud, Won et al., 2005) e outras
substâncias
sintéticas
como
a,
2′,5′-dihidroxi-4-cloro-dihidrochalcona
e
2′,5′-
dihidroxidihidrochalcona eram capazes de inibir a expressão de iNOS nos macrófagos e a
expressão de COX-2 em linhagens de macrófagos como a RAW 264.7 e na formação de
outros eicosanóides (Won et al., 2005) . Trabalhos demonstraram que chalconas naturais,
como a broussochalcone A, isolada da Broussonetia papyrifea, exercia o papel de um ótimo
agente antioxidante e inibia uma explosão respiratória nos neutrófilos e a expressão de iNOS
nos macrófagos (Won et al., 2005).
Rojas e colaboradores (2002), realizaram uma pesquisa sobre a atividade
inibitória de nove derivados de uma determinada chalcona, sobre a iNOS e seus resultados
demonstraram que dois derivados, dos nove testados, inibiam a produção de mediadores
inflamatórios, NO e PGE2, em macrófagos da linhagem RAW 264.7 ativados com LPS,
demonstrando desse jeito que esses dois derivados poderiam atuar como antiinflamatórios.
A liberação de radicais livres geralmente tem como conseqüência a peroxidação
lipídica, como visto anteriormente, é um processo danoso aos componentes lipídicos da
membrana celular. Segundo Haraguchi e colaboradores, retrochalconas (ausência da
funcionalidade do oxigênio), presentes em plantas como a G. inflata, podem exercer um papel
antiperoxidativo (Haraguchi et al., 1998).
Portanto, as chalconas e seus derivados, apresentam um potencial para atuar como
moléculas antiinflamatórias, principalmente pela inibição de mediadores inflamatórios. No
presente trabalho, procuramos observar se, além da semelhança estrutural, a DBZ possui uma
semelhança atuando como agente antiinflamatório.
15
2. OBJETIVOS
2.1. GERAL
- Verificar as propriedades antinflamatórias da Dibenzalacetona (DBZ)
em
modelo de bolsa de ar em ratos Wistar
2.2. ESPECÍFICO
- Analisar a migração a das células provenientes do exsudato induzido por
carragenina em modelo de bolsa de ar e comparar com aqueles animais tratados com DBZ.
- Analisar os níveis de nitrito em exsudato induzido por carragenina em modelo
de bolsa de ar e comparar com aqueles tratados com DBZ.
- Medir a atividade da enzima superóxido dismutase em exsudatos obtidos pela
indução por carregenina em modelos de bolsa de ar e compara com aqueles tratados com DBZ
16
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Para realização do presente trabalho, foram utilizados ratos Wistar, fêmeas,
pesando entre 120-200 g, fornecidas pelo biotério do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará. Os animais foram mantidos com água e ração balanceada ad
libitum.
3.2 BOLSA DE AR
As bolsas de ar foram produzidas por uma injeção subcutânea de 20 mL de ar
estéril na área intraescapular. O ar foi retirado da câmara de fluxo laminar previamente
esterelizado com luz ultravioleta. As bolsas foram reinfladas por mais duas vezes com
intervalos de dois dias, porém eram injetados somente 10 mL de ar estéril (Figura 5).
Figura 5:Desenho esquemático dos dias do experimento.
17
3.3 GRUPOS EXPERIMENTAIS
Os animais foram divididos em seis grupos experimentais. O primeiro grupo não
recebeu nenhum tipo de tratamento até o momento da injeção de carragenina. O segundo
grupo recebeu primeiramente uma dose via intraperitoneal (i.p.) de 10 mg/Kg de
Indometacina diluída em salina, que é um agente com propriedades antiinflamatórias e
analgésicas já conhecidas e após 1 hora o grupo recebeu uma injeção na bolsa de ar de
carraginina (10 mg/Kg). Os grupos seguintes receberam doses de 1mg/Kg, 5 mg/Kg, 10
mg/Kg e via i.p. da substância Dibenzalacetona(DBZ) diluídas em óleo mineral (1%) e Tween
20 (0,01%), respectivamente e após 1 hora todos os animais receberam uma dose de 10
mg/Kg de carraginina na bolsa de ar (tabela 1). A DBZ foi diluída em óleo mineral, Tween e
solução fisiológica e depois a solução foi sonicada para obtenção de uma melhor solubilização
da DBZ.
Tabela 1. Grupos experimentais
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
Injeção de 10
mg/Kg de
carragenina na
bolsa de ar
Injeção de 10
mg/Kg de
indometacina +
10 mg/Kg de
carragenina
após 1 hora
Injeção de 1
mg/Kg de DBZ
+ 10 mg/Kg de
carragenina
após 1 hora
Injeção de 5
mg/Kg de DBZ
+ 10 mg/Kg de
carragenina
após 1 hora
Injeção de 10
mg/Kg de DBZ
+ 10 mg/Kg de
carragenina
após 1 hora
3.4 ANÁLISE DO EXSUDATO
Após a aplicação das drogas os animais foram mantidos com água e ração
balanceada ad libitum por 16 horas até seu sacrifício. Primeiramente os animais foram
eutanizados com éter etílico e foi feita uma incisão na bolsa de ar com auxílio de um bisturi e
a área lesionada foi lavada com 1 mL de solução salina e EDTA (1 mM) e depois, a solução
formada foi coletada para as análises quantitativas e qualitativas.
18
3.5 AVALIAÇÃO DA VASODILATAÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
Após 16 horas da injeção de carragenina e do tratamento com DBZ os animais
foram sacrificados com éter etílico e depois que foi retirado o exsudato da bolsa de ar, a
mesma foi aberta com o auxílio de um bisturi para que o dorso do animal ficasse exposto para
que fotos que evidenciassem a vasodilatação presente na área em questão fossem tiradas.
3.6 AVALIAÇÃO DA MIGRAÇÃO CELULAR
Foram retirados 50 µL do exsudato para que fosse feita cultura com o exsudato
retirado da bolsa. O exsudato foi incubado em DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium
– Sigma), suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (SBF), e com gentamicina e
penicilina, em placa com 24 poços que continham lamínulas previamente tratadas com Poliornitina. Após 24 horas de incubação na estufa com uma atmosfera formada por 5% CO2 e
95% O2 a 37° C, foram tiradas fotomicrografias de cada grupo de tratamento no microscópio
invertido.
3.7 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO A PARTIR DO
EXSUDATO
A produção de óxido nítrico do sobrenadante do exsudato após tratamento com
carraginina, indmetacina e DBZ, foi avaliada através da quantificação de seu metabólito
nitrito, utilizando-se o método do Reagente de Griess (Grenn et al., 1982), que consiste na
reação do sobrenadante com o reagente de Griess (sulfanilamida 1% e naftilenediamina 0,1%,
ambos preparados em solução de ácido fosfórico 2.5%). Após 10 minutos de reação, as
amostras foram lidas em leitor de microplacas ELISA com comprimento de onda de 540 nm.
As concentrações de nitrito nas amostras são determinadas através do fator obtido da curva
padrão com diluições seriadas de nitrito de sódio a concentrações conhecidas.
19
Para excluir interferências do acúmulo de proteínas do exsudato durante a
passagem das amostras no leitor de ELISA, as amostras foram centrifugadas por 5’ a 3.000
rpm antes do procedimento padrão.
3.8 AVALIAÇÃO DA SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) A PARTIR DO
EXSUDATO DOS GRUPOS DE EXPERIMENTO
A produção de superóxido durante o processo inflamatório foi avaliada através da
medição da atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD), enzima de degradação do
superóxido. As amostras foram diluídas em tampão fosfato/ EDTA (1mM) e foi feito um teto
(tampão fosfato + EDTA+ Xantina oxidase (0,25 U/ml)) somente com a solução tampão. As
reações das amostras e teto tiveram a hipoxantina (10 µM) e NBT (500 µM) como substrato.
As amostras foram passadas em um leitor de ELISA com comprimento de onda de 540 nm.
3. 9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a realização dos testes estatísticos foi utilizado o BioEstat 5.0, um programa
estatístico com aplicações nas áreas das Ciências Biológicas e Médicas (Ayres et al., 2007) e
foi considerado significativo um valor de p<0,05 e p<0,001 n os testes aplicados (Análise de
Variância – ANOVA e Teste t ).
20
4. RESULTADOS
4.1 ANÁLISE DA MIGRAÇÃO CELULAR EM ANIMAIS TRATADOS COM
DBZ
A migração celular é uma característica comum no local ou tecido que esteja
ocorrendo um processo inflamatório. As células migram dos vasos sanguíneos para a área
inflamada da bolsa de ar. A analise foi feita logo após a retirada do exsudato, e a sua
quantificação foi realizada na câmara de Neubauer.
No Gráfico 1 pode-se observar uma diminuição na quantidade de células no
exsudato de animais tratados quando comparado com o exsudato de animais tratados com o
agente inflamatório, a carragenina. Em grupos que receberam tratamento com indometacina
ocorreu uma redução do número de células em aproximadamente 30% quando comparado
com o grupo que recebeu somente a dose de carragenina. Quando analisamos a substância em
teste, a DBZ, há uma redução de aproximadamente 69% de células no exsudato em animais
tratados com 1 mg/Kg, 80% em animais tratados com 5 mg/Kg e 94% em animais tratados
com 10 mg/Kg em relação ao grupo que recebeu somente o tratamento com carragenina. Este
dado é confirmado pelas fotomicrografias da cultura de células com o exsudato que foi
mantida por 24 horas na estufa. Na Figura 6 pode-se observar nas fotomicrografias da cultura
de células de animais tratados com DBZ há uma diminuição da migração celular comparado
com o grupo somente tratado com o agente inflamatório. Para o grupo tratado com
indometacina não ocorreu uma redução significativa se comparado com o grupo tratado com
carragenina e nos grupos tratados com DBZ observou-se p<0,05 comparando-se com o
controle negativo.
21
Gráfico 1. Efeito da DBZ no número total de células do exsudato da bolsa de ar em grupos tratados com 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg
e o número total de células em grupos controle. Carragenina (n=10); Indometacina (n=7); 1 mg/Kg (n=7); 5 mg/Kg (n=8); 10 mg/Kg
(n=8). * p<0,05e ** p<0,001 em relação ao grupo tratado somente com carragenina.
22
A
B
C
D
E
Figura 6. Fotomicrografias da cultura de células, analisadas em microscópio invertido na objetiva de 10X , cultivadas em DMEM, dos
grupos de tratamento. Em (A) são células do exsudato de animais tratados apenas com o agente inflamatório, carragenina. Em (B) são
células do exsudato de animais tratados com Indometacina. Em (C) são células do exsudato de animais tratados com 1 mg/Kg de DBZ.
Em (D) são células do exsudato de animais tratados com 5 mg/Kg de DBZ. Em (E) são células do exsudato de animais tratdos com 10
mg/Kg de DBZ.Barra: 10µm para todas as amostras
23
4.2 VOLUME DO EXSUDATO EM ANIMAIS TRATADOS COM DBZ
O volume total do exsudato da bolsa de ar de cada animal também foi medido
pois o aumento do exsudato caracteriza uma quantidade maior de edema no tecido em que
está ocorrendo o processo inflamatório, gerado pelo acúmulo de células pró-inflamatórias e
mediadores químicos. Na figura 3 podemos observar a média do volume do exsudato de cada
grupo experimental, onde podemos ratificar que há uma diminuição no exsudato dos animais
tratados com DBZ quando comparado com os grupos que receberam carraginina e
indometacina. Para o grupo tratado com indometacina não ocorreu uma redução significativa
quando comparado com o grupo tratado com carraginina e no grupos tratados com DBZ
observou-se p<0,05 comparando-se com o controle.
A indometacina reduziu em 15% a formação de exsudato quando comparado com
o grupo que recebeu somente a dose de carragenina. Enquanto que a DBZ reduziu em 94% a
produção de exsudato em todos os grupos que receberam DBZ, quando comparado com o
grupo que recebeu somente dose de carragenina. A droga não demonstrou uma resposta dose
dependente, apenas uma diminuição expressiva da exsudação, como demonstrado no gráfico
2.
Gráfico 2. Efeito da DBZ no volume total do exsudato em grupos tratados com 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg e o
número total de células em grupos controle. Carragenina (n=10); Indometacina (n=7); 1 mg/Kg (n=7); 5 mg/Kg (n=8);
10 mg/Kg (n=8). * p<0,05 em relação ao grupo tratado somente com carragenina.
24
4.3 VASODILATAÇÃO DE ANIMAIS TRATADOS COM DBZ
Para evidenciar o processo de vasodilatação na área da bolsa de ar foi aberta com
o auxílio de um bisturi para que o dorso do animal ficasse exposto para que fotos que
evidenciassem a vasodilatação presente na área da bolsa fossem tiradas. Na Figura 7 pode-se
observar os diferentes graus de vasodilatação em diferentes grupos experimentais. Nos grupos
tratados com DBZ há uma diminuição da vasodilatação gradual seguindo as concentrações
administradas da DBZ.
Na figura 7A, pode-se visualizar um animal que recebeu tratamento somente com
carragenina. Nota-se que a região onde foi induzido o processo inflamatório, a carragenina
promoveu uma vasodilatação intensa, como observado pelas setas e pela região marcada com
um círculo, enquanto que na figura 7B é um animal que recebeu tratamento com indometacina
um antiinflamatório não-esteroidal com propriedades farmacológicas já conhecidas, 7C, 7D e
7E, animais que receberam doses de 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg, respectivamente, nota-se
que há uma diminuição no número de vasos dilatados, demonstrando que esta substância atua
em uma das principais características do processo inflamatório .
25
A
B
C
D
E
e
Figura 7. Efeito da DBZ no volume total do exsudato em grupos tratados com Indometacina, 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg e o núm ero
total de células em grupos controle. As setas mostram um processo de vasodilatação diminuindo de acordo com o grupo de tratamento em
questão. A área em questão é o dorso do animal, onde foram injetadas as doses de ar estéril durante o experimento. Em (A) um animal que
foi tratado somente com Carraginina, em (B) o animal que foi tratado com Indometacina, em (C) o animal que foi tratado com 1 mg/Kg de
DBZ, em (D) um animal que foi tratado com 5 mg/Kg de DBZ e em (E) o animal que foi tratado com 10 mg/Kg de DBZ.
26
4.4 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO DURANTE O
PROCESSO INFLAMATÓRIO
Após avaliação do número de células no exsudato, análise das fotosmicrografias e
avaliação do volume do exsudato, analisamos a quantidade de nitrito presente no exsudato
retirado da bolsa de ar. Quando os animais foram somente tratados com carragenina ocorreu
um aumento na concentração de nitrito, enquanto que nos grupos tratados com Indometacina
e DBZ ocorreu uma redução na quantidade de nitrito produzida.
As concentrações obtidas de nitrito no grupo tratado somente com carragenina
foram de 3,3 µM. Porém, nos animais tratados com indometacina a concentração de nitrito
decaiu para 1,8 µM comparado com o grupo que recebeu tratamento somente com
carragenina. Nos grupos tratados com 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg a concentração de
nitrito foi reduzida para 2,4 µM, 2,2 µM e 1,8 µM, respectivamente. A produção de nitrito foi
uma resposta dose-dependente quando analisamos os grupos tratados com DBZ (Gráfico 3).
A diminuição da quantidade de nitrito em animais pré-tratados com indometacina
foi de aproximadamente 46% se comparado ao grupo de animais tratados somente com
carragenina. Nos grupos que foram pré-tratados com DBZ a diminuição da concentração de
nitrito foi de aproximadamente 28% em animais que receberam uma dose de 1 mg/Kg de
DBZ, 34% em animais que receberam uma dose de 5 mg/Kg de DBZ e 46% em animais que
receberam uma dose de 10 mg/Kg de DBZ.
27
Gráfico 3: Efeito da DBZ na concentração do metabólito do NO, nitrito no exsudato presente na bolsa de ar, em grupos
tratados com 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg
e o número total de células em grupos controle. Carragenina (n=10);
Indometacina (n=7); 1 mg/Kg (n=7); 5 mg/Kg (n=8); 10 mg/Kg (n=8).
4.5 ATIVIDADE DA SOD NO PROCESSO INFLAMATÓRIO
Para avaliar a liberação de superóxido durante o processo inflamatório foi
analisada a atividade da enzima SOD, que degrada o reativo superóxido e gera peroxinitrito. É
importante ressaltar que no decorrer de processos inflamatórios há um aumento na liberação
de radicais livres como o superóxido e que a quantidade de enzima de degradação, SOD, é
insuficiente para degradação do superóxido. É importante ressaltar que uma unidade de
redução da atividade da SOD equivale a uma redução de 0,001de densidade óptica por minuto
em relação ao teto.
Os resultados sobre a avaliação da atividade da SOD mostraram que quando se
utilizou somente o agente flogístico (controle negativo) a atividade da SOD foi de
aproximadamente 5,9 unidades de redução da atividade da SOD. Em animais pré-tratados
com Indometacina há uma redução de aproximadamente 12% (5,2 unidades de redução da
28
atividade da SOD) na atividade da SOD quando comparado com o grupo que recebeu
somente o agente flogístico (Gráfico 3). Nos grupos tratados com 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10
mg/Kg ocorreram reduções de 4% (5,7 unidades de redução da atividade da SOD), 12% (5,2
unidades de redução da atividade da SOD) e 33% (4,0 unidades de redução da atividade da
SOD), respectivamente. Analisando os resultados é importante ressaltar que em grupos
tratados com 10 mg/Kg de DBZ ocorreu uma redução mais acentuada, de 23%, quando
comparada ao grupo que recebeu pré-tratamento com Indometacina (Gráfico 3).
Gráfico 4: Efeito da DBZ na produção de SOD em grupos tratados somente com Carragenina, Indometacina, 1 mg/Kg de DBZ, 5
mg/Kg de DBZ e 10 mg/Kg de DBZ. Carragenina (n=5); Indometacina (n=4); 1 mg/Kg (n=5); 5 mg/Kg (n=6); 10 mg/Kg (n=5). Para
medição da SOD foi considerado que 1 unidade de redução da atividade da SOD equivale a redução de 0,001 densidade óptica por
minuto em relação ao teto.
29
5. DISCUSSÃO
Os nossos resultados demonstraram que a DBZ aplicada intraperitonealmente nos
ratos Wistar como tratamento para um processo inflamatório gerado pela aplicação da
carragenina em modelo de bolsa de ar, possui um significante efeito antiinflamatório de forma
dose-dependente.
O presente estudo mostrou que a DBZ gerou a inibição da migração celular para
área da bolsa de ar, diminuiu o processo de vasodilatação no local onde foi induzida a
inflamação, houve a inibição da produção de metabólitos de óxido nítrico e uma redução na
atividade da enzima SOD (não houve estatística).
Um dos principais pontos em que podemos avaliar a atividade antiinflamatória da
DBZ é em relação a inibição da migração celular de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) e
células monocíticas para região da bolsa de ar (Fig. 6). Esta diminuição da migração
leucocitária pode ser devido ao bloqueio da expressão de moléculas de adesão que são
responsáveis pelo “rolamento” das células leucocitárias ao longo do endotélio. Este bloqueio
na expressão dessas moléculas pode ser justificado pela inibição de fatores de transcrição
nuclear como o, NF-κB que é responsável peça transcrição de genes para iNOS, COX-2 e
Molécula de adesão vascular 1(VCAM -1) (Martin et al., 2000; Kim et al., 2010). É
importante ressaltar que o NF-κB é encontrado em sua forma inativada ligada a uma proteína
inibitória, IκB. A ligação de mediadores inflamatórios a receptores presentes em macrófagos
resulta na fosforilação e degradação de IκB e a translocação de NF-κB para o núcleo celular e
se liga as regiões promotoras do DNA que irão iniciar a transcrição de outros mediadores
inflamatórios (Laskin et al., 2001).
O superóxido é um ânion produzido por muitas enzimas oxidativas como produto
da redução de um elétron do oxigênio. Xantina oxidase é uma das principais enzimas
oxidativas produzindo o anion superóxido, resultando em uma injúria tecidual (Smith, 1985;
Mayumi et al., 1993, apud, Haraguchi et al., 1998). O anion superóxido possa está envolvido
em um dos principais pontos presentes durante um processo inflamatório, a migração PMNs,
principalmente neutrófilos. Durante um processo inflamatório os neutrófilos produzem
superóxido e este superóxido reage com um precursor no plasma para produzir mediadores
quimiotáticos (Petrone et al., 1980).
30
Petrone e colaboradores (1980) pesquisaram a ação quimiotática de superóxido
sobre neutrófilos sob influência de radicais livres e um processo inflamatório em leucócitos
humanos, eles observaram que durante a exposição do plasma a xantina e xantina oxidase
ocorreu a ativação de atividade quimiotática para neutrófilos, o que demonstrou
a
participação de superóxido como um radical livre que participa do processo de migração
celular para áreas onde está ocorrendo o processo inflamatório. Salvemini e colaboradores
(1995) quando utilizaram inibidores para iNOS em modelo inflamatório de bolsa de ar,
observaram que havia uma ação anti-inflamatória, não somente pelo bloqueio da iNOS, mas
também pela diminuição do infiltrado celular e de prostaglandinas na área onde estava
ocorrendo o processo inflamatório.
Diversas pesquisas já sugeriram que os AINEs podem atuar diretamente na
superfície de células mononucleares impedindo a migração dessas células para os sítios de
inflamação. É interessante ressaltar que agentes imunosupressivos podem exercer um
atividade antiinflamatória reduzindo o infiltrado de PMNs (Duke et al., 1973,apud, Meacock
& Kitchen, 1976). Meacock & Kitchen (1976) testaram a atuação de diversos AINEs como,
indometacina, fenilbutazona, cetoprofeno, ibuprofeno, aspirina, fenoprofeno e naproxeno, no
processo de migração celular,e concluíram que nenhum dos fármacos testados impediu a
migração de PMNs em um processo inflamatório induzido por carragenina, entretanto alguns
AINEs testados suprimiram a migração de células mononucleares (monócitos). Nossos
resultados demonstram que há uma migração de leucócitos para área da bolsa de ar, pois o
número médio de células encontradas no grupo que foi tratado somente com carragenina foi
de 177, enquanto que nos grupos tratados com indometacina, 1 mg/Kg, 5 mg/Kg e 10 mg/Kg
de DBZ as médias foram de 124, 55, 35, 10 respectivamente. O resultado do número de
células pode ser um dos indicativos de que o processo inflamatório está de fato sendo inibido
pela ação da DBZ.
As fotomicrografias (figura 6) mostradas em nossos resultados corroboram com a
contagem do número de células (gráfico 1), onde o número de células em animais tratados
com pré-tratamento com 1 mg/Kg foi aproximadamente 69% menor se comparado ao controle
(somente com carragenina), na concentração de 5 mg/Kg ocorreu uma redução de 81%, na
concentração de 10 mg/Kg ocorreu uma redução de aproximadamente 94%, portanto
podemos sugerir que a DBZ realmente esteja atuando em uma dos principais pontos presentes
31
no processo inflamatório, como a migração de PMNs e células monocíticas para área onde
está ocorrendo a injúria.
Além da migração de leucócitos para área onde está ocorrendo o processo
inflamatório, há um ponto relevante a ser analisado, o intenso quadro de vasodilatação
periférica. Esta vasodilatação poderia ser o resultado da liberação de mediadores vasoativos
como a histamina e determinados produtos do metabolismo do ácido aracdônico, presentes
durante um quadro de inflamação, como as PGs produzidas pela COX (Salvemini et al.,
1993). Durante um processo inflamatório agudo há uma modificação no calibre dos vasos, no
fluxo sanguíneo e na permeabilidade vascular (Bechara & Szabó, 2006). Nossos resultados
demonstraram que há uma diminuição no número de vasos dilatados em animais que
receberam um pré-tratamento com indometacina ou DBZ (figura 7).
O NO é um mediador pleiotrópico que atua em uma variedade de processos
fisiológicos e fisiopatológicos. Essa pequena molécula é produzida pela oxidação de Larginina pela enzima NOS (Marzocco et al., 2007). Há três isoformas da NOS, porém neste
trabalho é importante dar ênfase para isoforma induzida da enzima, pois ela atua na produção
de NO durante a defesa do organismo podendo gerar um estresse oxidativo durante um
quadro inflamatório.
Jung e colaboradores (2010) analisaram a ação antiinflamatória do n-Propil
Gallato através da regulação negativa de NF-κB em cultura de macrófagos da linhagem RAW
264.7, chegando a conclusão de que se há uma diminuição da concentração de nitrito em
células tratadas com substâncias que possuem atividade antiinflamatória, provavelmente essa
diminuição é resultado da inibição de fatores de transcrição nuclear, como o NF-κB. Em
modelos experimentais de inflamação induzida por carragenina em bolsa de ar há um aumento
da ativação de NF-κB e quando os animais são tratados com dexametasona (antiinflamatório
esteroidal) há uma redução da marcação para NF-κB quando se fez uma imunohistoquímica
para o tecido retirado da área da bolsa (Ellis et al., 2000).
Analisando nossos resultados da concentração de nitrito podemos observar que
em animais pré-tratados com DBZ ocorreu uma redução deste metabólito e esta redução
poderia ter ocorrido em função da inibição da via de ativação do NF-κB (Crippen, 2006) em
células como os macrófagos durante o processo antiinflamatório. Os animais que receberam
Indometacina e a dose de 10 mg/Kg de DBZ tiveram uma redução de 46% comparando com
32
os animais tratados somente com carragenina e podemos concluir que a DBZ possui um
potencial antiinflamatório por também inibir a produção de espécies reativas de oxigênio
liberadas durante o processo inflamatório.
Nossos resultados também demonstram que em animais que receberam somente o
agente flogístico há um aumento da atividade da enzima SOD, inferindo que este aumento é
resultado de uma intensa liberação principalmente de superóxido. Quando observamos os
animais que foram tratados com indometacina há uma leve redução na atividade da enzima
SOD e nos animais que foram tratados com DBZ, as doses de 1 mg/Kg e 5 mg/Kg reduziram
levemente a atividade da SOD e podemos observar que a dose mais eficiente na redução da
atividade da SOD foi a de 10 mg/Kg que se mostrou mais eficiente que a indometacina.
Com os resultados vistos acima da atividade da SOD, podemos chegar a
conclusão de que a tendência de um antiinflamatório ou potencial agente antiinflamatório é
reduzir a quantidade de enzima de degradação devido a redução do radical livre, superóxido e
há pesquisas que demosntram que a interação entre superóxido e NO na produção de um
processo inflamatório no tecido (Salvemini et al., 1996), portanto se está ocorrendo uma
diminuição na liberação de NO e superóxido como demosntram os gráficos 3 e 4 podemos
inferir que esta diminuição seja resultado da ação antiinflamatória ocasionada pela DBZ.
A DBZ possue uma semelhança estrutural com chalcona, por isso fazendo uma
análise comparativa com resultados de outras pesquisas, demonstram que a utilização de
chalconas ou seus derivados como antiinflamatórios podem agir diminuindo a concentração
de PGE2, NO, mediadores liberados por mastócitos e neutrófilos e na concentraçõa do anion
superóxido (Rojas et al., 2002 & Hsieh et al.,1998) . Em um estudo realizado com dois
derivados da chalcona-dimetilamina, os derivados 5 e 6, observaram que ambos os derivados
diminuem a concentração de PGE2, nitrito, iNOS e volume de edema. Foram utilizados
modelos in vivo com indução de edema de pata em camundongos posteriormente tradados
comn derivado 6 e indometacina para ação antiinflamatória e o modelo in vitro
foi
desenvolvido com macrófagos da linhagem RAW 264.7 estimulados com LPS e
posteriormente tratados com os derivados 5 e 6. Os resultados deste estudo demonstraram que
a chalcona 6 foi a mais eficiente na inibição de determinados fatores pró-inflamatórios como
PGE2, iNOS e nitrito e redução do edema de pata. As concentrações utilizadas do derivado 6
33
foram de 25 mg/Kg no modelo in vivo e 0,1 µM; 1 µM; 5 µM e 10 µM no modelo in vitro e
observou-se que ocorreu uma diminuição no edema de pata e um redução dose-dependente na
com centração de nitrito e PGE2 (Rojas et al., 2002). Nossos resultados mostraram que
utilizando DBZ, ocorreu uma redução no número de células presentes no exsudato e
concentração de nitrito de forma dose-dependente, onde a concentração de 10 mg/Kg foi mais
eficiente que a concentraçãode 10 mg/Kg de indometacina.
Rao e colaboradores (2009) reportaram que análogos de 3’, 4’, 5’ –
trimetoxichalcona funcionam como um potente inibidor na produção de NO durante um
processo inflamatório e proliferação de células tumorais. Este mesmo grupo de pesquisa
demonstrou que os análogos (em torno de 23 análogos) desta chalcona poderiam atuar durante
o processo inflamatório gerado no epitélio gástrico pela infecção por Helicobacter pylori, uma
bactéria gram-negativa, podem atuar como agentes antiinflamatórios. Os análogos 1, 7 e 13
por terem demonstrado um menor efeito citotóxico em células epiteliais da mucosa gástrica e
por terem um maior efeito bactericida foram utilizadas para o experimentos posteriores onde
se observou o potencial antiinflamatório e bactericida que esses análogos tinham inibindo a
liberação de NO pela ativação de NF-κB e a liberação de interleucina-8 (IL-8), um importante
citocina que atua como quimiotático e ativador de neutrófilos (Lai et al., 2010). Nossos
resultados utilizando a DBZ evideciaram uma redução na liberação de nitrito e na migração
de leucótictos,como os neutrófilos durante um processo inflamatório.
34
6. CONCLUSÃO
Os nossos resultados mostraram que a DBZ possui atividades antiinflamatórias
em modelo de inflamação em bolsa de ar induzida por carragenina. Os resultados mostraram
que ocorreu uma diminuição da migração celular para área onde foi aplicado o agente
flogístico, devido à ação antiinflamatória exercida pela DBZ, assim como ocorreu uma
redução do processo de vasodilatação, do volume de exsudato, na concentração de nitrito e
diminuição da atividade da SOD. Quando observamos o número de células, a vasodilatação
na área da bolsa e a concentração de nitrito do exsudato, a concentração de 10 mg/Kg de DBZ
apresentou uma maior eficácia do que o AINE utilizado como controle positivo.
35
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