Determinação da magnitude do infarto do miocárdio por medida da

Relato de Pesquisa/Research Reports
ISSN 2176-9095
2176-9095
ISSN
Science in Health
2011 mai-ago; 2(2): 73-82
Determinação da magnitude do infarto do miocárdio por medida da angulação
entre as bordas da parede infartada: proposta de nova técnica.
Determination of myocardial infarct magnitude by measurement of angle between the
infarct wall border zone: a proposal for a new technique.
Rogério Canil*
Julianne dos Santos Maldonado**
Pamella Ramona Moraes de Souza***
Marcia Kiyomi Koike****
Resumo
ABSTRACT
O infarto do miocárdio pode ser definido como perda de
cardiomiócitos (necrose) devido ao desbalanço prolongado
entre o suprimento de sangue e a demanda de oxigênio do
miocárdio (isquemia). Os modelos experimentais de infarto
do miocárdio são frequentemente utilizados para o estudo
da fisiopatologia do remodelamento cardíaco, representando um modelo fácil, consistente e econômico. Geralmente,
o tamanho de infarto é determinado em cortes histológicos do ventrículo esquerdo por planimetria. A maioria das
técnicas de biologia molecular requer tecido fresco, entretanto não há literatura sobre estimativa de infarto no coração fresco. O objetivo deste estudo é apresentar uma
nova proposta para a determinação do tamanho de infarto
por mensuração do ângulo entre as bordas da parede com
infarto.
Myocardial infarction can be defined as a loss of cardiac
myocytes (necrosis) caused by prolonged perfusion-dependent imbalance between supply and demand (ischemia) of
myocardium. The experimental model of myocardial infarction is commonly used to study pathophysiology of ventricular remodeling, representing an easily, consistently and
economically model. In general, infarct size is determined
in histological slices of the left ventricle by planimetry. The
most techniques in molecular biology require fresh tissue,
however there is no literature about the infarct size estimation in fresh heart. The aim of this study was present a new
proposal for the infarct size determination by measurement
of angle between the infarct wall border zone regions.
Key-words: Myocardial Infarction • Ventricular Remodeling
• Rats.
Palavras-chaves: Infarto do Miocárdio • Remodelação ventricular • Rato.
****Biomédico formado pela Universidade Cidade de São Paulo (UNICID)
****Biomédica formada pela Universidade Cidade de São Paulo (UNICID)
****Fisioterapeuta, doutoranda da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP)
**** Bióloga, Doutora em ciências pela Faculdade de Medicina da USP, professora do curso de biomedicina da UNICID e orientadora pelo Programa de pósgraduação em Ciências da Saúde do Instituto de Assistência Médica ao Servidor Público Estadual (IAMSPE)
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Introdução
A elevação da expectativa de vida e as mudanças
socioeconômicas da população brasileira têm contribuído para o aumento dos fatores de risco e elevação
do número de casos de doenças cardiovasculares.
Segundo o DATASUS, em 2006, as maiores causas
de óbito no Brasil foram doenças do aparelho circulatório, cerca de 32% da mortalidade total por doenças especificas, e a mais representativa foi a doença
isquêmica do coração. Na região Sudeste, principalmente em São Paulo, 25.374 indivíduos, por 100.000
habitantes, foram a óbito por doença isquêmica do
coração, representando cerca de 28% do total de óbitos das unidades de federação (Brasil1, 2006, Brasil2,
2006).
Estudos indicam que até o ano de 2030, a doença isquêmica do coração será a principal causa de
mortalidade, incapacitação e morbidade no mundo,
e atualmente é a responsável pelo grande número de
hospitalizações (Mathers e Loncar3, 2006).
O termo “doença isquêmica do coração” (I20I25), utilizado pelo DATASUS, se refere às patologias
associadas ao processo isquêmico do coração, que
são: angina pectoris (I20), infarto agudo do miocárdio
(I21), infarto do miocárdio recorrente (I22), algumas
complicações atuais subsequentes ao infarto agudo
do miocárdio (I23), outras doenças isquêmicas agudas do coração (I24) e doença isquêmica crônica do
coração (I25) (Brasil 4, 2008).
O infarto do miocárdio ocorre quando a artéria
coronária é obstruída, causando isquemia do tecido
cardíaco e é seguido pelo remodelamento cardíaco
caracterizado por alterações moleculares, celulares e
intersticiais que se manifestam através de alterações
da forma, da função e do tamanho do coração (Cohn
et al.5, 2000).
Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos, a
patogênese do infarto do miocárdio é ainda extensamente estudada, buscando-se a compreensão dos
mecanismos fisiopatológicos envolvidos nas síndromes coronarianas para prevenção e tratamento da
insuficiência cardíaca que se segue.
O modelo de ligadura da artéria coronária esquerda no rato se tornou o modelo de escolha para o
estudo do infarto do miocárdio nos últimos 30 anos.
Além da semelhança com os seres humanos em relação às alterações morfológicas e funcionais após o
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infarto do miocárdio, o desenvolvimento da insuficiência cardíaca e a baixa taxa de mortalidade após a
fase aguda, o baixo custo e o fácil manuseio do animal
tornaram o modelo indispensável nas pesquisas cardiovasculares.
Há características peculiares da oclusão da artéria
coronária esquerda em ratos, tais como a ocorrência
frequente de infarto do miocárdio transmural e subendocárdico e o maior acometimento do ápice do
coração esquerdo e menor da base (Zornoff et al.6,
2009).
Diversos métodos foram propostos para a determinação do tamanho do infarto:
1) Determinação da área infartada em relação à
área do ventrículo esquerdo, determinada por pesagem (Boor e Reynolds7, 1977) ou por planimetria
(Mill et al.8, 1990);
2) Determinação do perímetro interno da região
infartada em relação ao perímetro total da cavidade
por histologia (Pfeffer et al.9, 1979);
3) Determinação do volume de tecido cicatricial
em relação ao volume de tecido remanescente, por
sistema de contagem de pontos (Anversa et al.10,
1986) ou planimetria (Olivetti et al.11, 1991).
4) Determinação das circunferências epicárdicas e
endocárdicas dos segmentos infartados e não infartados por histologia, método que tem sido o mais
aplicado nos estudos experimentais. O cálculo para
determinação do tamanho do infarto se utiliza de
todos os cortes transversais, calculando-se um valor
médio. Spadaro et al.12 (1980), propuseram a utilização apenas do corte transversal médio do ventrículo
esquerdo, entre 5 e 6 mm a partir do ápice, o que
simplificaria a determinação do tamanho do infarto.
Isto se deve ao fato dessa região refletir a média do
tamanho do infarto de todo o ventrículo esquerdo.
No entanto, a manipulação do tecido cardíaco em
todos esses métodos inviabiliza a sua utilização em
análises bioquímicas ou moleculares, que necessitam
da rápida preservação por congelamento ou do tecido a fresco, o que explica o fato da análise da magnitude do infarto do miocárdio não ser contemplada
nesses tipos de ensaios. Assim, é desejável estabelecer um novo método de avaliação da magnitude do
infarto a partir de fotomacrografias digitais, que posteriormente poderá ser aplicado na análise de cortes
de corações a fresco.
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têmicas e ventriculares. O transdutor de pressão foi,
então, acoplado a um pré-amplificador calibrado (General Purpose Amplifier 4 – modelo 2, Stemtech Inc.,
Wiscowsin, EUA) e a um sistema computadorizado
de aquisição (Windaq/Dataq, Dataq Instruments Inc.,
Akron, Ohio, EUA). As medidas hemodinâmicas ventriculares foram registradas batimento a batimento,
por 10 minutos, após a estabilização das curvas.
Foram consideradas:
1) Diferença entre a pressão arterial média e a
pressão diastólica final do ventrículo esquerdo, para
cálculo da pressão de perfusão coronariana (PPC,
mmHg).
2)A velocidade máxima de elevação da pressão
ventricular durante a sístole (+dP/dt, mmHg/s) como
índice de função sistólica e a velocidade máxima de
queda da pressão ventricular durante a diástole (-dP/
dt, mmHg/s) como índice de função diastólica do ventrículo esquerdo.
Após a avaliação hemodinâmica, os animais foram
sacrificados com dose extra de anestésico e cloreto
de cádmio (1 ml/100g, 100 mM, Sigma) para parada
em diástole. A seguir, o coração foi lavado com solução fisiológica 0,9% e fixado com solução tamponada
de formol 10%.
O coração foi segmentado em quatro porções do
ápice à base (cortes A, B, C e D) (Figura 1) e processado em parafina para realização de cortes coronais de 5 micrometros de espessura. Os cortes foram
montados em lâminas de vidro e corados com Picrosirius red.
Foram considerados para a análise apenas os corações que apresentavam infarto transmural bem definido no ventrículo esquerdo.
Para as avaliações morfométricas foram utilizadas
fotos obtidas com o uso de uma lente óptica telemacro (28-70mm, Tamron, Japão) e câmera digital de
7,2 Mp. As fotos apresentavam 1280 x 960 pixels de
dimensões e cerca de 600 kb. Para o cálculo do tamanho de infarto foi utilizado apenas o corte equatorial
central (corte C) e o programa Image J (NIH, EUA).
O tamanho do infarto (%) foi estimado calculando-se
a média dos tamanhos do infarto externo e interno.
O infarto externo foi calculado pela razão percentual
entre o comprimento da superfície epicárdica com
infarto e o comprimento total da superfície epicárdica
do ventrículo esquerdo. O infarto interno foi calculado pela razão percentual entre o comprimento da
Assim, o objetivo deste estudo é estabelecer
uma nova forma de avaliar a magnitude do infarto do
miocárdio em ratos, através da avaliação da medida
do ângulo entre as bordas do infarto transmural em
cortes histológicos e testar se as mesmas relações
encontradas entre as alterações hemodinâmicas e
funcionais com o tamanho de infarto ocorrem com a
magnitude do infarto.
Materiais e métodos
Este estudo foi realizado de acordo com as normas estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e pelo The Universities Federation
for Animal Welfare e o protocolo experimental foi
aprovado pela Cappesq-HCFMUSP (no 777/07).
Foram utilizados 68 Ratos Wistar machos, pesando entre 300-350 g, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo.
A técnica de infarto em ratos utilizada foi uma modificação daquela descrita por (Selye et al.13, 1960).
Sob anestesia com cloridrato de quetamina (125 mg/
kg) e diazepan (1,5 mg/kg) e ventilação assistida (8
mL/kg, 60 ciclos/min), uma incisão transversal da pele
foi realizada sobre o hemitórax esquerdo para exposição dos músculos peitorais, os quais foram delicadamente afastados. A seguir, a toracotomia esquerda foi
realizada ao nível do terceiro espaço intercostal para
visibilização da parede ântero-lateral do ventrículo
esquerdo, próxima à base do coração. Após pericardiotomia, a artéria coronária esquerda foi localizada
na região entre o átrio esquerdo e a emergência da
artéria pulmonar. A ligadura da artéria foi realizada
com fio de nylon 6.0, um a dois mm após a origem.
A isquemia resultante pôde ser verificada pelo descoramento muscular da parede livre do ventrículo
esquerdo. A parede do tórax foi suturada com fio
de algodão 3.0 e o ar do espaço pleural drenado. Os
músculos peitorais foram reposicionados.
Ao final de sete dias de seguimento, foram realizadas medidas hemodinâmicas sob a mesma mistura
anestésica. Para as medidas das pressões do ventrículo
esquerdo, foi realizada a canulação da artéria carótida
direita com cateter de policloreto de vinila (0,05 mm
de diâmetro) preenchido com solução fisiológica heparinizada. O cateter foi introduzido até o ventrículo
esquerdo e acoplado ao transdutor de pressão para
identificação e registro das curvas hemodinâmicas sis-
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Figura 1– Esquema dos cortes equatoriais do coração.
superfície endocárdica com infarto e o comprimento
total da superfície endocárdica do ventrículo esquerdo (Spadaro et al.12, 1980).
Para o cálculo da magnitude do infarto nas quatro porções, foi utilizado programa Microsoft Powerpoint (PPT), régua e transferidor de 360º.
A magnitude do infarto nos quarto cortes transversais do coração foi estimada medindo-se a angulação das bordas da parede do infarto. Para tanto, a
imagem de cada lâmina, com quatro cortes, obtida
com câmera digital e colada em uma apresentação do
programa PPT (Figura 2).
Uma circunferência e duas retas foram desenhadas em cada corte para estabelecer o centro do ventrículo (Figura 3).
A apresentação PPT foi ampliada para mensurar
Figura 2– F otomacrografias digitais de lâmina com cortes do
coração corados com Picrosirius red observadas
pelo Programa Powerpoint.
a angulação entre as bordas da parede do infarto,
sobrepondo-se o transferidor sob a tela do monitor
(Figura 4).
Cada slide foi salvo em formato de imagem com
extensão JPEG (Figura 5).
Posteriormente, análise semelhante foi realizada
no programa Image J (Figura 6 e 7), para confrontação
de ambas as técnicas e confirmação dos resultados. A
ferramenta para mensuração de ângulo foi utilizada
aproveitando-se o centro localizado pelos recursos
Figura 3– F otomacrografias digitais de lâmina com cortes do
coração corados com Picrosirius red observadas
pelo Programa Powerpoint onde foram desenhadas circunferências em torno do ventrículo esquerdo e localizado o centro (linhas pretas).
Figura 4– Aumento da imagem de corte do coração corado
com Picrosirius red. Pronto para mensuração da angulação, com transferidor, entre as bordas do infarto
(corado com vermelho).
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Figura 5 – P rocesso de salvar o slide em forma de imagem
com extensão JPEG.
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Figura 6 – Ferramenta de medida de ângulo do programa
Image J ativado. Observe que a mesma foto pode
ser utilizada para a mensuração pelo software.
do programa PPT.
Por apresentar apenas cerca de 1% de diferenças
intraobservador e 5% de diferença interobservadores, foi considerado que os resultados obtidos pelo
uso de transferidor foram válidos para apresentação
nesta monografia.
erro-padrão (mínimo-máximo). O valor de p<0,05 foi
estabelecido como significativo.
A análise de variância para medidas repetidas foi
Análise estatística
Os resultados foram computados em planilhas do
programa Excel (Microsoft® Excel 2007) e posteriormente analisados utilizando-se o programa SigmaStat
(Sigma Stat for Windows Version 3.1, SysStat Software, Inc., EUA). Os dados estão expressos em média–
Figura 8 – Magnitude do infarto do miocárdio, obtida pela
mensuração do ângulo entre as bordas da parede
de infarto. Os cortes se referem ao ápice (A), equatoriais (B e C) e base (D). O losango representa o
valor da média e o erro-padrão médio encontrado
em cada corte. Dados analisados pela Analise
de Variancia para medidas repetidas e StudentNewman-Keuls como teste post-hoc. Houve diferenças estatísticas entre todos os cortes estudados
(p<0,05).
Figura 7 – M
ensuração da angulação (linha amarela) e
o resultado (quadro no canto inferior direito)
utilizando-se o programa Image J.
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Figura 9 – R
elação entre tamanho e magnitude do infarto do miocárdio, no corte B (à esquerda) e no corte C (à direita). Os
valores de p (<0,001) e o valor de r (>0,55) são significantes.
utilizada para comparação da magnitude do infarto
entre os quatro cortes e utilizado teste de post-hoc
Student-Newman-Keuls para localizar as diferenças
estatísticas.
A análise de regressão linear simples foi utilizada para investigar as possíveis associações entre: 1)
a magnitude do infarto e o tamanho de infarto e 2)
a magnitude do infarto ou tamanho de infarto e as
variáveis hemodinâmicas e funcionais (PPC e função
ventricular).
do proposto por Spadaro et al.12 (1980).
Os valores de magnitude do infarto, medidos pela
angulação das bordas do infarto, em 4 diferentes porções do coração (ápice-base), estão apresentados na
Figura 8. A análise estatística indicou que cada corte é
distinto dos demais (p<0,001).
O tamanho de infarto medido no corte C foi de
42,2%±1,42 (23,8-67,9).
Entre os quatro cortes, apenas os cortes B e C
apresentaram correlação da magnitude do infarto
medido pela angulação com o tamanho do infarto
medido pela extensão (Figura 9).
O tamanho de infarto mostrou relação inversa
com a PPC e com a função sistólica e diastólica. Da
mesma forma, a magnitude do infarto mostrou re-
Resultados
O termo magnitude do infarto foi utilizado para
representar o modelo novo proposto neste trabalho
e o termo tamanho de infarto mantido para o méto-
Tabela 1 – Coeficientes de correlação e valores de p obtidos na análise das relações entre a morfometria (tamanho de infarto
e magnitude do infarto) e hemodinâmica (PPC e função ventricular) no seguimento de sete dias após o infarto do
miocárdio.
PPC (mmHg)
Tamanho de infarto (%)
Corte B
Magnitude do
infarto (%)
Corte C
R
-0,354
-0,217
-0,343
+dP/dt (mmHg/s)
r
p
-0,254
0,047
-0,316
0,012
-0,222
0,089
P
0,005
0,091
0,007
-dP/dt (mmHg/s)
r
p
-0,344
0,006
-0,297
0,019
-0,293
0,023
PPC: pressão de perfusão coronariana; +dP/dt: índice de função sistólica; -dP/dt: índice de função diastólica; mmHg: milímetro de mercúrio.
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lação inversa com PPC no corte C, e com a função
ventricular sistólica e diastólica no corte B (Tabela 1).
Os cortes A e D não apresentaram correlações com
a PPC ou a disfunção ventricular.
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ma característica, pode se deformar ao ser colocado
em apenas um plano. Além disso, o remodelamento
cardíaco, como processo contínuo, leva à dilatação
da cavidade ventricular, ao afinamento e à expansão
da parede de infarto. Considerando-se esses fatos,
torna-se inadequada a mensuração da área por planimetria, esterologia ou métodos similares.
A determinação do perímetro interno da região
infartada em relação ao perímetro total da cavidade por histologia, proposta por Pfeffer et al.9 (1979),
não leva em consideração a variação existente entre
a ocorrência de infarto subendocárdico e subepicárdico. Pensando nisso, foi proposta a técnica que
estima o tamanho do infarto pela média das circunferências epicárdicas e endocárdicas dos segmentos
infartados e não infartados (Spadaro et al.12, 1980).
Essa técnica tem sido amplamente aplicada em estudos experimentais de isquemia miocárdica (infarto e
isquemia-reperfusão). Segundo Zornoff et al.23 (2009),
é o método mais recomendado, pois leva-se em consideração a variação na proporção de infarto subendocárdio e subepicárdico desse modelo. Agudamente, essa técnica de mensuração pode ser utilizada para
estimar o tamanho de infarto no coração a fresco,
pois o coração infartado se encontra em fases iniciais
do remodelamento cardíaco. Entretanto, se considerarmos o afinamento da parede de infarto decorrente
do remodelamento crônico, a mensuração a fresco
fica prejudicada.
Na técnica proposta no presente trabalho, apesar
de cada corte apresentar angulação distinta, houve relação entre as porções equatoriais do coração (corte
B e C) e o tamanho de infarto mensurado no corte C,
indicando que, nos cortes histológicos processados,
a mensuração pela média das circunferências endocárdicas e epicárdicas do infarto e a angulação entre
as bordas da parede de infarto apresentam estreita
relação quando consideradas no plano equatorial do
coração.
O processo de expansão e afinamento da parede
de infarto, a hipertrofia do miocárdio remanescente
e a dilatação ventricular (Cohn et al.5, 2000, Sutton e
Sharpe 24, 2000), o desenvolvimento da esfericidade
cardíaca (Zornoff et al.6, 2009, Pfeffer25, 1995), características do remodelamento cardíaco após infarto,
que tanto podem comprometer a estimativa do tamanho de infarto, pouco interferem na mensuração
Discussão
Os avanços nas pesquisas cardiovasculares, em
grande parte, se devem à utilização de modelos
experimentais de cardiopatias. O modelo de infarto
do miocárdio em ratos foi proposto, ao final da década
de 40, por (Heimburger 14, 1946). Desde então, vem
sofrendo diversas modificações: as primeiras foram
propostas por Selye et al.13 (1960), Kaufman et al.15
(1959), Johns e Olson16 (1954), Fishbein et al.17
(1978) e Fletcher et al.18 (1981). No Brasil, a técnica
foi trazida na década de 80 pelo Prof. Joel Spadaro,
atualmente professor titular aposentado da Faculdade
de Medicina da Universidade Julio de Mesquita Neto
(UNESP) de Botucatu. Spadaro et al.12 (1980), Zornoff
et al.6 (2009) apresentam um panorama histórico e
uma análise detalhada do modelo de infarto em rato.
O modelo de infarto em ratos utilizado neste estudo foi uma adaptação realizada no Laboratório de
Hipertensão do Instituto do Coração (HC-FMUSP),
em meados dos anos 90, com base no modelo de Selye et al.13 (1960). A modificação mais importante foi
manter o coração in situ no interior da caixa torácica
e adicionar lidocaína como tratamento agudo da ligadura da coronária, o que contribuiu para a redução da
taxa de mortalidade de 50-60% para 20% e obtenção
de tamanhos de infarto entre 30-70% (de Carvalho
Frimm et al.19, 2003, Koike et al.20, 2005, Koike et al.
21
, 2007, Koike et al.22, 2006).
Do mesmo modo que o modelo de infarto sofreu
adaptações, a forma de estimar o impacto do infarto
também se modificou ao longo do tempo. A determinação da área infartada em relação à área do ventrículo esquerdo, determinada por pesagem (Boor e
Reynolds7, 1977) ou por planimetria (Mill et al.8, 1990)
tem sido utilizada por muitos pesquisadores. Primeiramente, a técnica consiste em separar a parede de
infarto e a parede não infartada. As porções podem
ser pesadas ou escaneadas/fotografadas para posterior medida da área de tecido. No entanto, deve-se
considerar que o tecido cicatricial é um tecido mais
leve que o tecido muscular, o que prejudica uma
mensuração por pesagem. O coração, por sua for-
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da magnitude medida pela angulação.
As relações entre o tamanho de infarto e as alterações hemodinâmicas e funcionais são conhecidas (Zornoff et al.6, 2009, de Carvalho Frimm et al.19,
2003, Koike et al.21, 2007). Neste trabalho, demonstrou-se que de maneira similar a relação inversa existente entre o tamanho de infarto e a PPC e entre o
tamanho de infarto e as funções ventriculares, foram
encontradas para a magnitude do infarto nos cortes
equatoriais, reproduzindo as relações esperadas para
o coração infartado.
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a estimativa da magnitude do infarto considerou a
circunferência esférica ou ovalada, conforme o corte histológico, e um centro encontrado pelo cruzamento de duas retas, não representando o centro da
cavidade ventricular. Outra opção para este método
seria considerar a extensão da cavidade ventricular
para o cálculo do centro verdadeiro e a partir dele,
considerar a angulação. Provavelmente, no recálculo,
as correlações encontradas possam apresentar valores mais significantes.
Os valores apresentados no trabalho sobre a
magnitude estão representados em graus. Poder-seia calcular a porcentagem de ângulo encontrado em
relação à circunferência completa (360º) e, assim,
encontrar um valor percentual como na técnica de
mensuração do tamanho de infarto.
Limitações
A proposta da magnitude do infarto foi realizada
em cortes histológicos processados em parafina, visando-se estabelecer e validar a técnica de magnitude
do infarto pela angulação. Entretanto, a técnica não
foi aplicada em fotomacrografias de cortes a fresco.
O corte transversal do coração normal não representa um círculo perfeito, nem em sua porção
epicárdica, tão pouco em sua porção endocárdica.
O coração infartado, apesar de apresentar gradativamente certa esfericidade, não apresenta um círculo em sua porção equatorial transversal. É certo que
Conclusão
A magnitude do infarto mensurada pela angulação
entre as bordas nos cortes equatoriais é uma técnica
aplicável na estimativa do impacto do infarto sobre o
coração, porque as medidas de magnitude mantêm
estreita relação entre o tamanho de infarto e as variáveis hemodinâmicas e funcionais.
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