efeitos anatomopatológicos após contaminação in vitro por
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EFEITOS ANATOMOPATOLÓGICOS APÓS CONTAMINAÇÃO IN VITRO POR CLORETOS DE MERCÚRIO E DE CÁDMIO EM TESTÍCULOS DO PEIXE TELEÓSTEO Gymnotus carapo (tuvira) (LINNAEUS, 1758) RENATA VASCONCELOS MOREIRA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ NOVEMBRO DE 2010 EFEITOS ANATOMAPATOLÓGICOS APÓS CONTAMINAÇÃO IN VITRO POR CLORETOS DE MERCÚRIO E DE CÁDMIO EM TESTÍCULOS DO PEIXE TELEÓSTEO Gymnotus carapo (tuvira) (LINNAEUS, 1758) RENATA VASCONCELOS MOREIRA Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual Fluminense como do Norte parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Biociências. Orientador: Prof. Dr. Edésio José Tenório de Melo UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO - UENF CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ NOVEMBRO DE 2010 i EFEITOS ANATOMOPATOLÓGICOS APÓS CONTAMINAÇÃO IN VITRO POR CLORETOS DE MERCÚRIO E DE CÁDMIO EM TESTÍCULOS DO PEIXE TELEÓSTEO Gymnotus carapo (tuvira) (LINNAEUS, 1758) Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual Fluminense como do Norte parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Biociências. Aprovada em 12 de novembro de 2010. Comissão examinadora: _________________________________________________________________ Prof. Carlos Eduardo de Rezende (Dr. em Ciências Biológicas - Biofísica) - UENF _________________________________________________________________ Prof. Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho (Dr. em Patologia - Anatomia Patológica) UENF _________________________________________________________________ Prof. Leonardo Gomes da Silva (Dr. em Biociências e Biotecnologia) - UFRJ ________________________________________________________________ Prof. Edésio José Tenório de Melo (Dr. em Ciências Biológicas - Biofísica) - UENF (Orientador) ii “Não é o desafio com que nos deparamos que determina quem somos e o que estamos nos tornando, mas a maneira com que respondemos ao desafio. Somos combatentes, idealistas, mas plenamente conscientes. Problemas para vencer, liberdade para provar. E, enquanto acreditamos em nosso sonho, nada é por acaso.” (Henfil) iii AGRADECIMENTOS As nossas principais conquistas não são frutos de um trabalho isolado, tão pouco individual, por isto agradeço, primeiramente, ao meu orientador Prof. Dr. Edésio José Tenório de Melo, pela oportunidade de crescimento e por ter acreditado em mim! Obrigada. À minha querida mãe, pelo incentivo e apoio não só durante este período, mas em toda minha vida. Aos meus irmãos Alex e Alan, pela união, respeito e amizade. Ao meu marido Leonardo pela cumplicidade e amor incondicional. Meu porto seguro. Amo você! À Juliana, minha “irmã”, pela amizade e, sobretudo, pelo apoio e encorajamento para superar as dificuldades vividas. Ao meu amigo Diogo, pelo carinho e por estar sempre me fazendo sorrir com seu jeito espontâneo de ser. A Cristiane Vergílio, pela ajuda indispensável durante a execução deste trabalho, e, é claro, pelas sugestões e críticas. Ao pescador César. Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Veiga de Carvalho pela colaboração e incentivo. Ao Prof. Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho e aos técnicos Luciano Grillo de Almeida, Luciana da Silva Lemos, Ricardo Guerreiro e Elizabeth Gonçalves Pires do Setor de Morfologia e Anatomia Patológica do Laboratório de Sanidade Animal (CCTA/UENF), por todo auxílio e disponibilidade. iv Aos funcionários do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, especialmente as técnicas: Beatriz Ferreira Ribeiro e Giovanna Alves de Moraes, pela ajuda no desenvolvimento da pesquisa. Ao Laboratório de Ciências Ambientais (LCA). As meninas do Setor de Toxicologia Celular: Carol e Laís pela ajuda nos aquários e pela amizade, que mesmo em pouco tempo, foi muito importante para mim. A todos os professores do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, por todo conhecimento transmitido durante esses anos. Em especial ao Prof. Dr. Flávio Costa Miguens. Aos membros da banca examinadora: Carlos Eduardo de Rezende, Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho e Leonardo Gomes da Silva. À CAPES, FAPERJ e UENF pelo apoio logístico e financeiro. v SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS............................................................................................................... vii LISTA DE TABELAS.............................................................................................................. viii ABREVIATURAS ..................................................................................................................... ix RESUMO ..................................................................................................................................x ABSTRACT.............................................................................................................................. xi 1.INTRODUÇÃO.......................................................................................................................1 1.1.Metais Pesados ..................................................................................................................1 1.2.Mercúrio..............................................................................................................................3 1.3.Cádmio ...............................................................................................................................6 1.4.Contaminação in vitro e Exposição aguda .........................................................................8 1.5.Peixes nos estudos de Toxicologia ............................................................ .......................9 1.5.1.Espécie utilizada: Gymnotus carapo .............................................................................10 1.6.Testículos e espermatogênese em peixes .......................................................................14 1.7.Histopatologia.... ...............................................................................................................17 1.8.Efeito dos metais pesados nos testículos.........................................................................18 2.OBJETIVOS.........................................................................................................................20 2.1.OBJETIVO GERAL...........................................................................................................20 2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................20 3.MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................21 3.1.Coleta dos exemplares de Gymnotus carapo...................................................................21 3.2.Preparação de soluções ...................................................................................................22 3.3.Contaminação dos exemplares de Gymnotus carapo por HgCl2 e CdCl2 ........................22 3.4.Preparação para Microscopia Óptica (MO) ......................................................................26 3.5.Preparação para Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ....................................27 3.6.Preparação para Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).........................................27 4. RESULTADOS. ..................................................................................................................29 4.1.Efeitos tóxicos do HgCl2 e CdCl2 nos exemplares de Gymnotus carapo..........................29 4.2.Aspectos anatômicos do testículos de Gymnotus carapo ................................................30 4.3.Aspectos histológicos .......................................................................................................32 4.4. Aspectos ultraestruturais .................................................................................................40 4.5. Aspectos morfológicos dos espermatozóides de Gymnotus carapo ...............................43 5.DISCUSSÃO........................................................................................................................43 6.CONCLUSÕES....................................................................................................................48 7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................49 vi LISTA DE FIGURAS Figura 1.Tabela periódica dos elementos químicos....................................................2 Figura 2. Principais alvos para toxicidade do Hg........................................................5 Figura 3. Foto da espécie Gymnotus carapo............................................................10 Figura 4. Localização do órgão elétrico em Gymnotiformes.....................................11 Figura 5. Localização dos testículos de Gymnotus carapo.......................................13 Figura 6. Testículos de Gymnotus carapo.................................................................14 Figura 7. Espermatogênese em peixes.....................................................................15 Figura 8. Localização da Lagoa de cima...................................................................21 Figura 9. Aspectos anatômicos do testículo de Gymnotus carapo............................31 Figura 10. Região do testículo de Gymnotus carapo onde foram realizados cortes transversais................................................................................................................32 Figura 11. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo controle)......................................................................................................................35 Figura 12. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto a 5µM e 10µM de HgCl2)............................................................................................36 Figura 13. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto a 20µM e 30µM de HgCl2)..........................................................................................37 Figura 14. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto a 10µM, 30µM e 40µM de CdCl2)...............................................................................38 Figura 15. Corte transversal dos testículos de Gymnotus carapo.............................39 Figura 16. Organização ultraestrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo controle)......................................................................................................................41 Figura 17. Organização ultraestrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2).........................................................................................42 Figura 18. Fotomicrografia dos espermatozóides de Gymnotus carapo corados com Giemsa.......................................................................................................................44 Figura 19. Fotomicrografia (MEV) dos espermatozóides de Gymnotus carapo........45 Figura 20. Porcentagem de espermatozóides do grupo controle e do grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2 com flagelo e sem flagelo..............................................................46 vii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Resumo das alterações histológicas nos testículos de peixes causados por metais pesados....................................................................................................19 Tabela 2. Tabela de conversão das concentrações de HgCl2 em µM para µg/g...... 24 Tabela 3 Tabela de conversão das concentrações de CdCl2 em µM para µg/g........24 Tabela 4. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de Gymnotus carapo utilizados para o experimento de HgCl2........................................25 Tabela 5. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de Gymnotus carapo utilizados para o experimento de CdCl2........................................25 Tabela 6. Numero de exemplares de Gymnotus carapo que morreram durante a exposição ao HgCl2....................................................................................................29 Tabela 7. Número de exemplares de Gymnotus carapo que morreram durante a exposição ao CdCl2....................................................................................................29 Tabela 8. Número amostral, peso do testículo e o índice gonadossomático dos exemplares de Gymnotus carapo expostos ao HgCl2................................................31 Tabela 9. Número amostral, peso do testículo e o índice gonadossomático dos exemplares de Gymnotus carapo expostos ao CdCl2................................................32 viii ABREVIATURAS Cd: Cádmio CdCl2: Cloreto de cádmio EODs: Descargas dos órgãos elétricos Hg: Mercúrio HgCl2: Cloreto de mercúrio HgT: Concentração de mercúrio total it: Tecido intersticial L: Célula de Leydig ppb: Parte por bilhão ppm: Parte por milhão PBS: Phosphate buffer solution ROS: Espécies reativas de oxigênio S: Célula de Sertoli SPCI: Espermatócito primário SPCII: Espermatócito secundário SD: Espermátide SPG: Espermatogônia SPGI: Espermatogônia primária SPGII: Espermatogônia secundária SZ: Espermatozóide ix RESUMO Poluentes ambientais são lançados diariamente nos ecossistemas aquáticos e podem trazer sérias conseqüências para os organismos, dentre eles destacam-se os metais. Mercúrio e cádmio são metais reconhecidos por sua alta toxicidade e grande persistência no ambiente. Estudos anteriores demonstraram que mesmo em baixas concentrações, estes metais têm a capacidade de afetar o sistema reprodutor dos peixes, inibindo o desenvolvimento das gônadas e a espermatogênese. Com isso, o presente estudo tem como objetivo verificar se o HgCl2 e CdCl2 provocam alterações nos testículos e espermatozóides de Gymnotus carapo (tuvira). A contaminação foi realizada através de injeção intraperitoneal de solução de HgCl2 ou CdCl2 (5μM/10μM/20μM/30μM/40µM) por 24h, 48h, 72h e 96h. Alterações histológicas foram identificadas nos testículos dos peixes expostos ao HgCl2 e CdCl2, porém no grupo tratado com HgCl2 os efeitos foram considerados mais severos. Após tratamento com 5µM de HgCl2, alterações histológicas foram observadas a partir de 72 horas, enquanto que para 10μM, 20µM e 30μM essas alterações foram visualizadas em todos os tempos de exposição analisados. Em relação ao CdCl2, as alterações foram observadas a partir de 72h de exposição com 10µM. As lesões encontradas no tecido foram semelhantes em todas as concentrações administradas, sendo os efeitos observados progressivos com o aumento da concentração ao metal exposto. As alterações mais significativas identificadas no testículo dos espécimes expostos ao HgCl2 e CdCl2, incluem fibrose intersticial, hiperemia, desintegração intersticial e tubular, desorganização dos túbulos seminíferos, degeneração e agregação espermática. Além disso, pela análise ultraestrutural observamos as células germinativas em apoptose e em processo de vacuolização. Mudanças morfológicas foram visualizadas em espermatozóides de G. carapo. Após o tratamento com 20μM de HgCl2 e CdCl2 por 72/96h respectivamente, foram observadas deformidades na porção da cabeça e ausência de flagelo. Portanto, os resultados apresentados no presente estudo demonstram mudanças no testículo e nos espermatozóides de G. carapo, após exposição ao HgCl2 e CdCl2. Essas mudanças consequentemente vão afetar a reprodução desta espécie, levando prejuízos à nível de população. Assim as informações obtidas neste estudo demonstram que histopatologia gonadal pode ser um biomarcador de poluição por metais pesados nesta espécie de peixe. Palavras-chave: testículo, Gymnotus carapo, mercúrio, cádmio, histopatologia, peixe. x ABSTRACT Environmental pollutants are released daily in aquatic ecosystems and can have serious consequences for the organisms, among the polluents include the metals. Metals mercury and cadmium are known for their high toxicity and great persistence in the environment. Previous studies had show that even at low concentrations, these metals are able to affect the reproductive system of fish, inhibiting gonad development and spermatogenesis. Thus, this study aims to determine if the HgCl2 and CdCl2 can causes changes in the testes and spermatozoa of Gymnotus carapo (tuvira). The contamination was performed by intraperitoneal injection of HgCl2 or CdCl2 solution (5μM/10μM/20μM/30μM/40µM) for 24h, 48h, 72h e 96h. Histological changes were identified in the testes of fish exposed to HgCl2 and CdCl2, but in the group treated with HgCl2 effects were considered severe. After treatment with 5μM HgCl2, histopathological changes were observed after 72 h, while for 10μM, 20μM and 30μM these changes were seen at all exposure times examined. In relation to CdCl2, changes were observed from 72 h exposure to 10µM. The lesions found in the tissue were similar at all concentrations administered, and the progressive effects observed with increasing concentration of the exposed metal. The most significant changes identified in the testes of fish exposed to HgCl2 and CdCl2, includes fibrosis, blood vessel congestion or hyperemia, interstitial and lobular disintegration, disorganization of the seminiferous lobules degeneration, sperm aggregation. Furthermore, by ultrastructural analysis we can observe the germ cells in apoptosis and vacuolization. Morphological changes also were observed in spermatozoa of G. carapo. After treatment with 20µM of HgCl2 and CdCl2 for 72/96h respectively, deformities were observed on the head and also the flagellum absence. Therefore, the results presented in this study show changes in the testis and spermatozoa of G. carapo after exposure to HgCl2 and CdCl2. These changes will go affect the reproductive success of this species, which may cause damage to the level of population. Thus the information obtained during this study show that gonadal histopathology may be a biomarker of heavy metal pollution in this fish species. Keywords: testes, Gymnotus carapo, mercury, cadmium, histopathology, fish. xi 1. INTRODUÇÃO A ação antropogênica vem aumentando a concentração de vários compostos químicos no ambiente aquático. Estes poluentes podem provocar graves consequências em vertebrados e invertebrados e, com o passar do tempo, podem comprometer sua permanência no ecossistema (Jobling,1995). Dentre os contaminantes mais intensamente estudados nos ecossistemas aquáticos estão os metais (Palenzuela et al., 2004). Os metais podem interromper ou prejudicar a reprodução de animais aquáticos, afetando o sistema endócrino e agindo nos órgãos reprodutivos e nos gametas desses organismos. Como resultado desse distúrbio, o processo de desenvolvimento das gônadas é seriamente prejudicado juntamente com a taxa de fertilização (Dietrich et al, 2004; Rurangwa, 1998). 1.1. METAIS PESADOS A denominação “metal pesado” é aplicada a um grupo heterogêneo de elementos, incluindo metais, semi metais e não metais (Figura 1) que possuem número atômico maior do que 20 ou peso específico maior que 5 g cm-3 (Malavolta, 1994). São denominados tóxicos aqueles metais que produzem danos em pequenas concentrações, dentre eles estão arsênio, cádmio, cobre, cromo, chumbo e mercúrio. Em geral, metais tóxicos estão presentes em pequenas quantidades no meio aquático por ação de fenômenos naturais, mas podem ser despejados em quantidades significativas por atividades industriais, agrícolas e de mineração (Abel, 1989). Um organismo aquático pode apresentar dois tipos básicos de comportamento em relação aos metais: ou é sensível à ação tóxica de um determinado metal, ou não é sensível, mas o bioacumula, potencializando seu efeito nocivo através das cadeias alimentares de forma a colocar em risco organismos situados nos topos destas cadeias (Viarengo, 1989). 1 Figura 1. Tabela periódica dos elementos químicos. Fonte: grandeabobora.com Os efeitos tóxicos dos metais podem incluir tanto a letalidade e efeitos subletais, como alterações no crescimento, desenvolvimento, reprodução e respostas farmacocinéticas, patológicas, bioquímicas e comportamentais (Baatrup, 1991). A toxicidade dos metais está relacionada à sua capacidade de interferir em reações enzimáticas, por meio do bloqueio ou deslocamento do íon essencial de várias biomoléculas. Ainda possuem baixa mobilidade, em virtude das pequenas dimensões e das cargas duplas e triplas, fazendo com que se acumulem por longo período no ambiente (Conell & Miller, 1984). A alta toxicidade de alguns metais para os organismos, mesmo em baixas concentrações, reforça a importância de estudos relacionados com os efeitos induzidos por esses elementos (Baatrup, 1991). Dentre os metais considerados “pesados”, mercúrio e cádmio geram grande preocupação ambiental devido a sua ampla utilização industrial, toxicidade e comportamento no ambiente (Búcio et al., 1995). 2 Informações importantes sobre o potencial tóxico dos metais podem ser obtidas de ambientes contaminados ou através de estudos de simulação em laboratório, diferindo quanto ao objetivo e metodologias de avaliação. Estudos em toxicologia ambiental devem considerar alguns aspectos importantes: modelo de estudo, parâmetros analisados e desenho experimental (campo ou laboratório). Deste modo, é possível contribuir com informações que possibilitem um melhor entendimento do processo toxicológico do metais. 1.2. MERCÚRIO O mercúrio é um elemento químico de número atômico 80, cujo símbolo Hg deriva do nome grego Hidrargyrium, o qual significa prata líquida. Encontra-se no grupo IIB da tabela periódica de classificação dos elementos e é o único metal em estado líquido à temperatura ambiente (Hoffman et al., 1995). O mercúrio é considerado altamente tóxico, devido a sua capacidade de bioacumular nos organismos, biomagnificar através da cadeia alimentar e possuir uma intensa ciclagem no ecossistema (Förstner & Wittman,1983). Dentre as formas químicas destacam-se o mercúrio metálico Hg0 que é volátil e libera um gás monoatômico: o vapor de mercúrio. Este é estável, podendo permanecer na atmosfera por meses ou até anos, revelando-se, deste modo, muito importante no ciclo do mercúrio, pois pode sofrer oxidação, originando o mercúrio mercuroso (Hg+1) e o mercúrio mercúrico (Hg+2). Essas formas inorgânicas podem se ligar a elementos como o cloro, enxofre ou oxigênio e originar compostos de mercúrio inorgânico também designado como sais de mercúrio (sais mercurosos e mercúricos) (Malm et al.,1997) Um dos sais mais importantes industrialmente é o cloreto de mercúrio (I) ou calomelano (Hg2Cl2) que é um composto branco, pouco solúvel em água e utilizado como purgante, anti-helmíntico e diurético, e o cloreto de mercúrio (II) (HgCl2), um sublimado corrosivo muito tóxico, empregado como desinfetante e utilizado em muitas aplicações, incluindo as medicinais, entretanto, é uma das formas mais tóxicas do mercúrio pela sua solubilidade em água em relação a outros compostos de mercúrio (HSDB, 2000). 3 Quando um átomo de mercúrio se liga covalentemente a grupos metil (CH3), dá origem a um composto orgânico conhecido como metilmercúrio. O metilmercúrio (CH3Hg), por sua vez, é originado a partir do processo de metilação, através do Hg2+, mediado por diversos microorganismos em ambientes aquáticos, particularmente no sedimento (Malm et al.,1997). As fontes naturais mais significativas de mercúrio são gaseificação da crosta terrestre, as emissões de vulcões e a evaporação de corpos aquáticos (Who, 1991). As fontes antrópicas ocorrem através de indústrias que queimam combustíveis fósseis, produção eletrolítica de cloro-soda, produção de acetaldeído, incineradores de lixo, polpa de papel, tintas, pesticidas, fungicidas, lâmpadas de vapor de mercúrio, baterias, produtos odontológicos, amalgamação de mercúrio em extração de ouro, entre outros (Canela,1995). Independente da origem, o mercúrio na forma orgânica ou inorgânica pode sofrer transformações no ambiente, o que torna sua distribuição ambiental bastante complexa. Em geral o ciclo biogeoquímico do mercúrio exibe um equilíbrio dinâmico, mas ações humanas podem introduzir elementos ou compostos mais rápidos e em nível maior que os processos naturais, alterando os padrões dos ciclos e as condições às quais a flora e a fauna estão adaptadas (Mauro et al., 1999). O mercúrio atinge os ecossistemas aquáticos através da precipitação e por meio do descarte de resíduos agro-industriais na proximidade de rios, lagos e lagoas. A absorção deste elemento nos peixes ocorre pela alimentação ou respiração branquial e a sua distribuição acontece por meio da circulação sanguínea. A absorção do mercúrio é influenciada pela concentração deste elemento, pela taxa metabólica e pela eficiência de absorção (disponibilidade), determinada pelas características do ambiente aquático. Os níveis de mercúrio na biota aquática variam entre as espécies de uma mesma localidade e para uma mesma espécie em diferentes localidades (Azevedo, 2003). A toxicidade do mercúrio e seus compostos se deve a sua forte interação com grupos sulfidrila, R-SH de proteínas, enzimas (Lacerda, 1997; Baatrup, 1991) e proteínas de baixo peso molecular (como coenzima A, cisteína, glutationa, entre outros) (Valle & Ulmer, 1972). Nas sulfidrilas, o Hg2+ substitui o átomo de hidrogênio, sendo capaz de inativar enzimas sulfidriladas, interferindo no metabolismo e nas funções celulares. O mercúrio também se liga, afetando a configuração de purinas e pirimidinas e ácidos nucléicos podendo levar danos ao DNA (Bucio et al., 1999). 4 Além disso, pode reagir diretamente com vários constituintes de membrana, interferindo na integridade estrutural e nas propriedades físicas das membranas celulares (Baatrup, 1991). A capacidade dos metais pesados atravessarem a membrana para o interior das células pode prejudicar suas funções, causando a morte celular e a destruição de qualquer tecido com a qual entrem em contato (Azevedo, 2003). Além disso, em condições fisiológicas normais, os animais possuem um balanço entre a geração e neutralização das espécies reativas de oxigênio (ROS). Entretanto, quando os organismos estão expostos aos Hg e a outros metais pesados, a taxa de produção das ROS excede a sua capacidade de neutralização pelas defesas antioxidantes dos organismos (Figura 3), levando ao estresse oxidativo (Stohs & Bagchi, 1995). Células sob estresse oxidativo desenvolvem várias disfunções, em razão das lesões causadas pelas ROS aos lipídios, proteínas e DNA (Ercal et al., 2001; Van Der Oost et al., 2003). Assim, torna-se necessário conhecer os reais danos à saúde dos organismos em diferentes níveis de organização biológica frente à exposição crônica e aguda a este metal. Figura 2. Principais alvos para toxicidade do Hg. 5 1.3. CÁDMIO O cádmio é um elemento químico de símbolo Cd de número atômico 48 e assim como o Hg está situado no grupo IIB (grupo 12) da tabela periódica de classificação dos elementos. É um metal branco azulado que à temperatura ambiente encontra-se no estado sólido. O cádmio pode ser liberado no meio ambiente através de fontes naturais ou antropogênicas, dentre as principais fontes naturais destaca-se o vulcanismo, spray oceânico e queimadas de florestas (Hutton, 1987). Por outro lado, um aumento das concentrações de Cd no ambiente tem ocorrido principalmente em função de suas inúmeras aplicações industriais, como nos processos de galvanoplastia, além de ser um elemento constituinte de baterias, pilhas, pigmentos, revestimentos elétricos, estabilizantes e catalisadores (Fielder & Dale, 1983). Com isso, a produção, utilização e emissões de Cd para o ambiente têm aumentado dramaticamente durante o século 20, e consequentemente levado a contaminação dos ecossistemas aquáticos (Burger, 2008). A exposição ao cádmio nos humanos ocorre geralmente através de duas fontes principais: a primeira é por via oral (por água e ingestão de alimentos contamnados), e a segunda por inalação (através da fumaça do cigarro). Nesse sentido, a inalação do fumo ou de aerossóis contendo cádmio pode causar doenças pulmonárias crônicas ou agudas. Dentro de certas indústrias, a exposição ocupacional é a fonte de contaminação predominante (Friberg, 1983). O cádmio entra na corrente sanguínea, sendo absorvido pelo estômago ou intestino após a ingestão do alimento ou da água, ou por absorção nos pulmões após a inalação. De qualquer forma, uma vez que o cádmio é absorvido é fortemente retido, inclusive baixas doses deste metal podem constituir um nível significativo no organismo (Marettová et al., 2010). Um vez absorvido, o cádmio é transportado pela corrente sanguínea até o fígado. Pequenas quantidades desse complexo proteína-cádmio passam continuamente do fígado para a corrente sanguínea, para ser transportado até os rins. O rim excreta de 1 a 2% do cádmio obtido diretamente das fontes ambientais. A concentração do metal nos rins é aproximadamente 10 mil vezes mais alta que a da corrente sanguínea. A excreção fecal do metal representa uma mínima quantidade 6 do cádmio não absorvido no sistema gastrointestinal (Burger, 2008). Além do fígado, rim e pulmões, outros órgãos também são danificados por exposição ao cádmio em animais ou humanos, incluindo o sistema reprodutor, o sistema imunológico e o sistema nervoso (Jarup; Akesson, 2009). A toxicidade do cádmio está relacionada com a sua capacidade de substituir o cálcio nas reações biológicas. Cádmio e cálcio são dois elementos intimamente relacionados, com similaridades em muitos aspectos, devido a sua semelhança nos raios iônicos. A captação celular de cádmio, ocorre principalmente através dos canais de Ca +2 e Cd torna-se um potente bloqueador dos canais de Ca +2, inibindo a captação celular de Ca +2 (Beyersmann & Hechtenberg, 1997). O cádmio também é capaz de causar um aumento no estresse oxidativo pela ligação a grupos sulfidrilas de proteínas e pela diminuição da glutationa (Valko et al., 2005). Consequentemente, o estresse oxidativo pode promover alteração nos mecanismos de reparo do DNA e indução da proliferação celular, que, por sua vez, pode levar a tumorigênese (Beyersmann & Hartwig, 2008). Além disso, o cádmio se liga preferivelmente a resíduos de cisteína de proteínas, em particular com a metalotioneína e também pode inibir muitas enzimas. A metalotioneína é uma enzima importante no transporte e armazenamento do cádmio e outros metais (Who, 1992). Apesar de muitas pesquisas analisarem a concentração de cádmio em tecidos internos dos organismos (Carignan & Villard, 2001), existe uma maior necessidade de estudos em laboratório com este metal para avaliação dose-efeito (tanto subletal como letal) tanto a nível celular como a nível tecidual (Burger & Gochfeld, 2001; Stansley et al., 1991). Futuras descobertas nesse campo ajudariam a aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos básicos que determinam os danos causados pelo cádmio, permitindo um maior conhecimento da sua toxicidade. 7 1.4. CONTAMINAÇÃO IN VITRO E EXPOSIÇÃO AGUDA A realização de experimentos em laboratório é importante para a observação dos efeitos nocivos do mercúrio e cádmio, na ausência de ações sinérgicas ou antagônicas que podem ocorrer com outros elementos do ambiente. Nesse sentido, os bioensaios de contaminação em laboratório oferecem à vantagem de avaliar a toxicidade dos metais pesados em concentrações específicas, com isso as mudanças induzidas por esses elementos utilizados podem ser empregadas para observação da relação dose/resposta dos organismos expostos (Vergílio, 2009). Segundo Rand e Petrocelli (1985), estudos em toxicologia aquática podem ser qualitativos e quantitativos em relação aos efeitos tóxicos sobre os organismos aquáticos. A toxicologia aquática também está relacionada com as concentrações dos agentes químicos que podem ocorrer no ambiente aquático (água, sedimento e alimento). A toxicidade de um composto químico depende da exposição, da suscetibilidade do organismo, das características químicas do agente e de fatores ambientais. A exposição é o contato/reação entre o organismo e o composto químico, sendo que os fatores mais importantes relacionados à exposição são: o tipo, a duração e freqüência da exposição e a concentração do agente químico. Com relação à duração e a freqüência da exposição dos organismos ao agente químico, Rand e Petrocelli (1985) afirmaram que na exposição aguda, os organismos entram e contato com o composto químico num evento único ou em eventos múltiplos que ocorrem num pequeno período de tempo, geralmente variando de horas a dias. Nas exposições agudas, onde o agente químico é rapidamente absorvido, geralmente os efeitos são imediatos, embora seja possível a produção de efeitos retardados similares àqueles resultantes da exposição crônica. A freqüência de exposição também afeta a toxicidade dos compostos químicos. Uma exposição aguda pode resultar num efeito adverso imediato num organismo, enquanto duas exposições sucessivas, com que a soma equivale à exposição aguda única podem não ter efeito ou este ser pequeno, devido ao metabolismo (desintoxicação) do composto químico pelo organismo entre as exposições ou à adaptação do organismo ao composto. Organismos estressados em função de exposição prévia a outras substâncias tóxicas também podem ser mais susceptíveis aos compostos químicos, cenário comum na realidade dos 8 ecossistemas, pois normalmente há a presença simultânea de diferentes produtos (Barak e Mason, 1990). 1.5. PEIXES NOS ESTUDOS DE TOXICOLOGIA Os peixes constituem um grupo de grande importância nas avaliações de toxicidade ambiental, pois refletem a saúde do ecossistema aquático, ambiente fundamental para a sobrevivência dos seres vivos. Além disso, são vertebrados de ampla distribuição e participam de diferentes níveis tróficos da cadeia alimentar, sendo considerados excelentes modelos biológicos de estudo (Mela, 2004). Os teleósteos são considerados excelentes organismos para o monitoramento e estudo da disponibilidade dos metais pesados para as populações humanas, já que os peixes podem acumular esses elementos em seus tecidos (Bastos et al., 2006; Lacerda, 1997; Pfeiffer et al.,1992). Porém, deve ser considerado que alguns fatores influenciam na acumulação de metais pesados pelos organismos, como o tamanho, idade, ecologia do animal e hábitos alimentares (Haines et al., 1992). A principal via de acesso à contaminação por metais pesados ao homem é através do consumo de pescado. Os peixes constituem uma importante fonte de proteínas, em especial para as populações que vivem nas proximidades dos corpos d’água (Pfeiffer et al.,1992 ; Silva Filho et al., 2000). 9 1.5.1. ESPÉCIE UTILIZADA: Gymnotus carapo. A tuvira (Gymnotus carapo) (Linnaeus, 1758) (Figura 5) é um peixe da classe dos Actinopterígios de água doce e pertence à ordem dos Gymnotiformes, família dos Gymnotidae (FishBase, 2010). Essa espécie é também conhecida sarapoá, peixe espada, sarapó, carapó e ituí, sendo muito utilizada como isca viva na pesca esportiva por ser a mais preferida de espécies consideradas nobres, como os piscívoros de grande porte. Figura 3. Foto da espécie Gymnotus carapo (Tuvira). Os Gymnotiformes apresentam corpo anguiformes, abertura branquial muito estreita e são desprovidos das nadadeiras dorsal e ventral; possuem nadadeira anal muito longa, estendendo-se por quase toda a face ventral (Theodoro, 2003). Também possuem órgãos elétricos que são utilizados para produzir choques (p. ex.: poraquê) ou para a eletrocominucação (p. ex.: tuvira) promovida pela emissão de uma pequena descarga elétrica. A tuvira utiliza o campo elétrico gerado por esta descarga para sua orientação, que compensa sua falta de visão na hora de predar espécies menores, como também para suas interações sociais, principalmente na época de reprodução (Westby, 1975). 10 Figura 4. Localização do órgão elétrico em Gymnotiformes (A). Para localizar um objeto, o cérebro do peixe elétrico emite um sinal de comando excitando os eletrócitos (células contidas nos órgãos elétricos), essas células se tornam polarizadas agindo como baterias interconectadas, resultando em descargas dos órgãos elétricos (EODs) que são emitidas na água, gerando um campo elétrico (B) (adaptado de Markham et al., 2009). As tuviras habitam em locais rasos, com profundidades inferiores a um metro, em áreas marginais de baías e vazantes, com bastante vegetação aquática (Resende, 1999). Podem ainda sobreviver em valas, canais e pequenos lagos secos (FishBase, 2010). Caracterizam-se por respiração aérea facultativa, sendo uma adaptação comum em peixes que vivem em ambientes hipóxicos e pela bexiga natatória altamente vascularizada (Moraes et al., 2002). Estudos feitos por Resende (1999) e Resende e Pereira (2000) sobre os aspectos biológicos e ecológicos da tuvira demonstram que esses peixes vivem em ambientes lênticos, com plantas aquáticas, onde se abrigam e encontram alimento. Possuem ainda hábito noturno, saindo no crepúsculo para águas mais abertas (Menin, 1989; Barbieri & Barbieri, 1984). Silva & Oliveira (1997) concluíram que a tuvira está adaptada a uma dieta predominantemente carnívora, com o bolo alimentar sofrendo uma rápida absorção ao chegar ao intestino. Dessa forma, o intestino deste peixe está adaptado para uma dieta constituída principalmente de pequenos organismos de fácil digestão. Nesta espécie, a presença do estômago químico desenvolvido sugere uma adaptação à digestão de uma dieta rica em proteínas. 11 Quando em ambiente natural, a tuvira alimenta-se principalmente à noite de vermes, insetos (por exemplo, larvas de libélulas), camarão, peixe (preferencialmente caracídeos de pequeno porte, por exemplo, Ctenobrycon e curimatã) e matéria vegetal (FishBase, 2010). A tuvira apresenta crescimento rápido em comprimento no seu primeiro ano de vida, antes de alcançar a maturidade sexual, quando os indivíduos atingem, em média, cerca de 20 cm de comprimento. Já quanto ao peso, o comportamento é o inverso, uma vez que esses peixes começam a ganhar mais peso após o segundo ano de vida (Barbieri & Barbieri, 1984). Barbieri & Barbieri (1983), estudando um ambiente lêntico-lótico (represa) em São Paulo observaram que houve uma relação direta entre o período reprodutivo de Gymnotus sp. e a variação dos fatores abióticos, como temperatura da água, concentração de oxigênio dissolvido, precipitação pluviométrica e fotoperíodo, não evidenciando relação com a variação do pH e do nível da água. Entretanto, Resende & Pereira, (2000), estudando ambientes sazonalmente inundados no Pantanal do Mato Grosso do Sul, afirmam que a chegada da inundação é o fator desencadeador da atividade reprodutiva. Para Barbieri & Barbieri (1982, 1983, 1984) na Represa do Lobo (Estado de São Paulo) a reprodução da tuvira ocorre de setembro a janeiro, com pico entre outubro e dezembro, coincidindo com o início da época mais quente do ano. Os mesmos autores observaram que para as fêmeas, o pico ocorre no mês de outubro e, para os machos, nos meses de outubro a dezembro. A reprodução da tuvira corresponde a um período de repouso intercalado por períodos de atividade sexual os quais finalizam com o surgimento de nova prole. Segundo Westby (1975) não é possível reconhecer macroscopicamente diferenças sexuais na tuvira. Entretanto, alguns isqueiros da região do Pantanal acreditam que tuvira fêmeas sejam mais amarronzadas e tuvira machos sejam mais escuras, quase pretas. A disposição das gônadas masculinas e femininas acha-se em um arranjo semelhante ao tubo digestivo, pois os ovidutos e os dutos espermáticos dirigem-se para a região cranial, terminando na papila genital que se encontra próximo ao istmo, sob a cabeça, imediatamente posterior ao ânus (Figura 5) (González et al., 2001). 12 Os machos, diferentemente das fêmeas, não apresentam alterações morfológicas perceptíveis nos testículos que possibilitem identificar diferentes estádios de maturação (Resende, 1999). A atividade espermatogênica dos machos ocorre durante o ano todo, variando, porém, de intensidade, que é maior de setembro a janeiro, com pico entre outubro e dezembro (Barbieri & Barbieri, 1982, 1983, 1984). A morfologia externa dos testículos da tuvira difere da descrita para a maioria dos peixes teleósteos. Apresentam-se como órgãos pares, ovais, consistentes (Figura 6) e com dois longos dutos espermáticos, ao contrário dos testículos alongados que se estendem por todo o comprimento da cavidade abdominal observado na maioria das espécies de teleósteos (Barbieri & Barbieri, 1984). Eles permanecem, independentemente de seu estádio de maturação, próximos à extremidade caudal do conjunto visceral (Menin, 1989). Figura 5. Localização dos testículos em Gymnotus carapo. Em A: seta indica o ânus e a papila genital, em B: detalhe do duto deferente partindo do testículo até a papila genital. 13 Figura 6. Testículos de Gymnotus carapo. Barra: 1cm 1.6. TESTÍCULOS E ESPERMATOGÊNESE EM PEIXES Os testículos da maioria dos peixes são órgãos pares, assimétricos, podendo estar parcial ou totalmente fundidos entre si e são frequentemente alongados, embora existam outras formas como lobulados e foliáceos (Le Gac; Loir, 1999). Os lóbulos testiculares são preenchidos por túbulos seminíferos os quais apresentam paredes formadas por cistos que se apóiam na lâmina basal e que são revestidos por prolongamentos citoplasmáticos das células de Sertoli (Matta, 2000). A organização básica do testículo é comum a todos os peixes ósseos e anfíbios. Este órgão tem as funções espermatogênica e androgênica, possuindo dois compartimentos principais: intersticial e tubular. No compartimento intersticial ou interlobular estão situados vasos sanguíneos, fibras nervosas, células e fibras do conjuntivo, além das células de Leydig que possuem função esteroidogênica. A produção de andrógenos é importante para diferenciação sexual, e para regulação da espermatogênese (Weltizien et al., 2004). O compartimento tubular contém células somáticas (células de Sertoli) e as células germinativas que irão formar os espermatozóides, após passarem por um processo bastante complexo e altamente organizado, a espermatogênese (Billard, 1990; Koulish et al., 2002) (Figura 7). 14 Figura 7. Espermatogênese em peixes. O epitélio germinal contém células de Sertoli (SE) e células germinativas envolvidas por uma lâmina basal (LB) e células mióides peritubulares (MI). No espaço intersticial são encontrados as células intersticiais ou de Leydig (LE) e vasos sanguíneos (VS). A(Ind*): Espermatogônia tipo A indiferenciada (célula-tronco); A(Ind): Espermatogônia tipo A indiferenciada; B (tardia): Espermatogônia B tardia; Z/L: Espermatócitos primários em leptóteno e zigóteno; P: Espermatócito primário em paquíteno; D/MI: Espermatócito primário em diplóteno / metáfase; S/MII: Espermatócito secundário/ metáfase secundária II; E1: Espermátide inicial; E2: Espermátide intermediária; E3: Espermátide final. (Adaptado de Schulz et al., 2010). Unidas entre si por complexos juncionais especializados, as células de Sertoli dos teleósteos delimitam física e funcionalmente um clone de células germinativas no mesmo estágio de desenvolvimento que tem origem a partir de uma única espermatogônia primária, formando, assim os espermatocistos ou cisto espermatogênico. Desta forma, as células de Sertoli fornecem as células germinativas suporte físico e fatores importantes para sobrevivência, proliferação e diferenciação das mesmas, estando ainda envolvidas na intermediação hormonal e na fagocitose de restos celulares originados da espermiogênese (Weltizien et al., 2004). As células de Sertoli que delimitam os cistos espermatogênicos se apóiam na 15 túnica própria, que é constituída pela membrana basal (camada acelular) e pelas células tubulares mióides que possuem capacidade contrátil (Pudney, 1995; Le Gac; Loir, 1999). Portanto, diferentes dos mamíferos, em peixes as espermatogônias diferenciadas (a partir da espermatogônia primária) não estão em contato com a membrana basal (Billard, 1984). Exceto pelo arranjo cístico, no qual as células germinativas se desenvolvem de forma sincronizada, provavelmente devido à presença de pontes intercelulares (Russell et al., 1990; Koulish et al., 2002), o processo espermatogênico de teleósteos assemelha-se muito ao de mamíferos. Durante a fase proliferativa, a espermatogônia tipo A se divide e origina a espermatogônia secundárias ou do tipo B que, depois de um número de divisões mitóticas que varia entre as espécies, originam os espermatócitos primários, iniciando a fase meiótica. Após a primeira divisão meiótica formam-se os espermatócitos secundários haplóides que, num curto intervalo de tempo, originam as espermátides através da segunda divisão meiótica. Em seguida ocorre a fase de diferenciação, no qual as espermátides se transformam em espermatozóides (Silva, 1987). As espermatogônias primárias são as maiores células germinativas na maioria das espécies de teleósteos, apresentando um núcleo grande e claro, com pouca heterocromatina, contendo um ou dois nucléolos bastante evidentes (Miura, 1999). Após sucessivas divisões, a partir da espermatogônia primária, o número de espermatogônias secundárias por cistos aumenta geograficamente, enquanto o diâmetro nuclear das mesmas sofre gradual redução (Vilela et al., 2006). Considerando-se o número de espécies de peixes, existem poucos relatos na literatura a respeito da duração dos eventos espermatogênicos nestes vertebrados. No entanto, pode ser evidenciado que, de maneira geral, a duração da espermatogênese em peixes é bem mais rápida do que o observado para mamíferos (Silva; Godinho, 1983; Koulish et al., 2002; França et al., 2002; Vilela et al., 2003). 16 1.7. HISTOPATOLOGIA As lesões detectadas em células, tecidos ou órgãos representam uma integração dos efeitos cumulativos dos estressores em nível fisiológico e bioquímico e potencialmente em níveis mais altos de organização biológica (Myers & Fournie, 2002). Além disso, em função de possibilitar a visualização dos locais dos danos, as respostas histopatológicas dos peixes a várias classes de xenobióticos precisam ser determinadas e caracterizadas, sendo um indicativo dos sítios de ação de tal xenobiótico (Hinton et al., 1976). A histopatologia é reconhecida como uma importante ferramenta para avaliação do impacto ambiental de poluentes em peixes (Oliveira Ribeiro et al; 2002). É um método capaz de detectar efeitos adversos agudos e crônicos em vários tecidos e órgãos de peixes mediante exposição a diversos compostos químicos. Além disso, a histopatologia pode fornecer uma indicação da saúde dos peixes, determinando lesão precoce de células (Pieterse, 2004). Recentemente, vem ocorrendo o enriquecimento e a implementação da literatura relacionada aos efeitos histopatológicos de estresse ambiental. Isto tem aumentado os argumentos quanto ao uso destes dados como indicador de adversidades, efeitos crônicos subletais e injúrias para vertebrados aquáticos (especialmente peixes) em ambientes biomonitorados ou mesmo em experimentos em laboratórios (Myers & Fornie, 2002). 17 1.8. EFEITO DOS METAIS PESADOS NOS TESTÍCULOS O mercúrio e o cádmio são dois metais capazes de provocar diversas alterações testiculares devido à sua toxicidade, essas alterações são observadas em uma variedade de modelos animais (camundongos, coelhos e peixes) em diferentes fases de crescimento e maturidade (Thompson & Bannigan, 2008). Segundo Lockhart e Uthe, 1972; McKim et al., 1976; Hodson et al., 1994; Pelletier e Audet, 1995) em concentrações baixas o mercúrio tem a capacidade de acumulação nas gônadas de peixes das espécies (Esox lucius, Salvelinus fontinalis, Anguilla rostrata, Myoxocephalus aenaus), onde inibe o desenvolvimento gonadal (Dey e Bhattacharya, 1989; Kirubagaran e Joy, 1992), reduz o crescimento (Panigrahi e Misra, 1978; Rodgers e Beamish, 1982; Snarski e Olson, 1982; Weis e Khan, 1990; Niimi e Kissoon, 1994) e função imunológica (Roales e Perlmutter, 1977) que pode afetar a sobrevivência da prole. Estudos têm mostrado que exposição aguda in vivo a cádmio causa o rompimento da barreira hematotesticular, perda de células germinativas, edema testicular, hemorragia, necrose e esterilidade em várias espécies de mamíferos (roedores, coelhos, cães, bezerros e cavalos). O cádmio também é capaz de provocar diversas lesões testiculares em peixes de várias espécies. Embora os danos testiculares induzidos pelo cádmio sejam reconhecidos por décadas atrás (Parizek, 1957), os mecanismos que levam a esses danos ainda permanecem obscuros (Siu et al., 2009). A tabela 1 mostra um resumo das principais alterações testiculares causadas por metais em diversas espécies de peixes. 18 Tabela 1. Resumo das alterações histológicas nos testículos de peixes causados por metais pesados (adaptado de Pieterse, 2004). Metais pesados Rota de exposição Espécies Tecidos afetados CdCl2 Água Brook trout Testículo CdCl2 Água Salvelinus tontinalis Testículo 1ppb Cádmio Injeção Intraperitoneal Goldfish Testículo Chumbo e Cádmio Água Clarias batrachus Testículo HgCl2 Água Clarias batrachus Testículo Lesões no tecido Hemorragia Vasodilatação Congestão Necrose das células de Leydig Referência Sangalang and O'Halloran, 1972 Sangalang and Freeman, 1972 Baixo índice de desenvolvimento espermatogênico Aumento do número de macrófagos Tafanelli and Necrose das Summerfelt, células 1975 germinativas com atrofia dos túbulos seminíferos Infiltração de células inflamatórias Fibrose Estereidogênese comprometida (Cd) Diminuição da Kalti and reprodutibilidade Sathyanesan, (Pb) 1985 Inibição da espermatogênese e Danos testiculares Inibição da atividade gonadal Picnose das células Kirubagaran and Joy, de Leydig 1992 Túbulos seminíferos menores Obs: as setas indicam as alterações testiculares encontradas no presente estudo. 19 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GERAL Este trabalho tem como objetivo verificar se os metais pesados (Cloreto de Mercúrio e Cloreto de Cádmio) provocam alterações nos testículos de Gymnotus carapo (tuvira). 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Descrever a estrutura do testículo e dos espermatozóides de Gymnotus carapo (tuvira) através da microscopia óptica e eletrônica. - Empregar a metodologia de contaminação in vitro e de contaminação aguda para visualização de danos nos testículos. - Descrever as alterações teciduais e celulares dos testículos e espermatozóides de Gymnotus carapo (tuvira) expostos à ação do HgCl2 e CdCl2. 20 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. COLETA DOS EXEMPLARES DE Gymnotus carapo. Os exemplares utilizados neste trabalho foram coletados na Lagoa de Cima (Figura 7), localizada na região norte do Estado do Rio de Janeiro (21º 46’ S e 41º 31’W), obtidos diretamente de pescadores locais. As amostras foram coletadas durante o período de março de 2009 a junho de 2010. No presente estudo foram utilizados 112 exemplares machos de Gymnotus carapo. Durante a coleta foram considerados todos os peixes, e somente através da dissecação, realizada no Laboratório de Ciências Ambientais (LCA) foi possível identificar machos e fêmeas. Figura 8. Localização da Lagoa de Cima. 21 Os peixes coletados foram transportados vivos em caixas de isopor com água obtida de seu habitat natural, e encaminhados para o Laboratório de Ciências Ambientais (LCA), na UENF, onde permaneceram acondicionados num sistema de aquários de fluxo contínuo (livre de cloro, por evaporação), com circulação constante da água por um sistema de bombas com filtros internos. A qualidade da água foi monitorada, medindo-se amônia tóxica, nitrito, pH através de kits colorimétricos (Labcon Teste – Alcon). Os valores de pH estão de acordo com o banco de dados publicados pelo FishBase para a espécie (FishBase, 2010). Durante este período, os peixes foram mantidos a uma temperatura média de 25ºC. 3.2. PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES Para o preparo das soluções de HgCl2 e CdCl2 utilizadas nesse estudo, uma solução estoque com o sal desses metais foi preparada, diluindo-se o sal em água destilada na concentração de 0,1M. Diluições da solução estoque foram em H2O destilada nas concentrações finais de 5μM, 10μM, 20μM, 30μM e 40μM (Vergílio, 2009). 3.3. CONTAMINAÇÃO DOS EXEMPLARES DE Gymnotus carapo POR HgCl2 E CdCl2. Para cada experimento de contaminação por HgCl2 e CdCl2 foram selecionados 6 exemplares machos, sendo que quatro foram expostos ao HgCl2 e CdCl2 (um para cada tempo de exposição 24h/ 48h/ 72h/ 96h) e 2 restantes foram estabelecidos como controle (dissecados após 96h). O procedimento descrito anteriormente foi repetido duas vezes consecutivas para HgCl2 nas concentrações 5μM, 10μM, 20μM e 30μM, em cada tempo de exposição, totalizando 8 exemplares utilizados para cada concentração testada e 16 controles. O experimento de CdCl2 também foi repetido por duas vezes consecutivas nas concentrações 10μM, 20μM, 30μM e 40 μM, em cada tempo de exposição, totalizando 8 exemplares utilizados para cada concentração testada e 16 controles 22 (Tabela 2 e 3). A concentração testada para os dois metais (HgCl2 e CdCl2) foi diferente, pois durante a fase de teste observamos que os peixes expostos a concentrações de 5μM de CdCl2 não apresentaram nenhuma alteração anatomopatológica, justificando assim a utilização de concentrações mais altas desse metal no decorrer do experimento. A contaminação foi realizada através de injeção intraperitonial da solução de HgCl2 e CdCl2 , nos tempos de exposição de 24, 48, 72 e 96 horas. No grupo controle, por sua vez, foi injetado solução de PBS (Phosphate Buffer Solucion). A contaminação aguda foi documentada após uma única dose nas concentrações 5μM, 10μM, 20μM e 30μM e 40μM, sendo o volume injetado de acordo com o peso do peixe (Vergílio, 2009). Após cada tempo de exposição, os exemplares de Gymnotus carapo foram anestesiados para obtenção dos seguintes dados: peso total (PT) e comprimento total (CT), logo foram seccionados para a retirada dos testículos, que foram então pesados para obtenção do índice gonadossomático (IGS), através da expressão: IGS= Pg/PCX100. Os testículos retirados foram utilizados para a análise histológica e ultraestrutural. 23 Tabela 2. Tabela de conversão das concentrações de HgCl2 em uM para ug/g. HgCl2 ug ug/g 5 μM: 135,7 1,04846 10 μM: 271,5 2,0884615 20 μM: 543 4,1769231 30 μM: 814,5 6,2653846 Tabela 3. Tabela de conversão das concentrações de CdCl2 em uM para ug/g. CdCl2 ug ug/g 10 μM: 201,3 1,54846 20 μM: 402,6 3,09692 30 μM: 604 4,64615 40 μM: 805 6,1923 24 Tabela 4. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de G. carapo utilizados para o experimento de HgCl2. Número de exemplares Comprimento (cm) Peso (g) controle 20 31 125 5 µM 8 33 100 10 µM 8 31 110 20 µM 12 33 153 30 µM 8 32 161 32 130 56 Total Obs: No grupo controle foram utilizados 20 exemplares, 16 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 foram utilizados para Microscopia de Varredura. Na concentração de 20µM, 8 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 exemplares foram utilizados para Microscopia de Varredura, totalizando 12 exemplares. Tabela 5. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de G. carapo utilizados para o experimento de CdCl2. Número de exemplares Comprimento (cm) Peso (g) controle 20 31 120 10 µM 8 30 116 20 µM 12 31 130 30 µM 8 35 135 40 µM 8 34 128 32 126 Total 56 Obs: No grupo controle foram utilizados 20 exemplares, 16 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 foram utilizados para Microscopia de Varredura. Na concentração de 20µM, 8 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 exemplares foram utilizados para Microscopia de Varredura, totalizando 12 exemplares. 25 3.4. PREPARAÇÃO PARA MICROSCOPIA ÓPTICA (MO) Pequenas porções do testículo (aproximadamente 5 x 5 x 5 mm3) foram fixados por meio da técnica de imersão com formol tamponado 10% por 24 horas. As amostras foram então desidratadas em séries crescentes de álcool (70% / 80%/ 90% / 95 % por uma hora e 100% por 30 minutos, três vezes consecutivas), sofrendo diafanização em (1:1) xilol:álcool e xilol puro, em processador automático (Leica TP 1020). Por fim, as amostras foram incluídas em parafina a 60° C e cortadas com o auxílio de um micrótomo tipo Minot (Leica RM 2145) para obtenção de cortes de 5 μm. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e observados ao microscópio óptico de campo claro (Axioplan – Zeiss). Microfotografias digitais foram obtidas através do microscópio Axioplan acoplado á câmera Cannon Power Shot A610/620. Adicionalmente, pequenas porções do testículo (aproximadamente 1,0 mm3) foram fixados com tampão cacodilato de sódio 0,1M; formaldeído 4%; glutaraldeído 2,5%, sacarore 5%, cloreto de cálcio 5 mM e pós-fixadas com tetróxido de ósmio 1% e ferricianeto de potássio 0,8%. Após sucessivas desidratações com acetona (50% / 70%/ 90%/ 100% comum / 100% comum / 100% super seca), as amostras foram incluídas em resina Epóxi, para serem cortadas no ultra-micrótomo REICHERCUTS LEICA em seções semi-finas de 0,4 μm e coradas com azul de toluidina 1% para posterior observação em microscópio óptico de campo claro (ZEISS - AXIOPLAN). 26 3.5. PREPARAÇÃO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET) Pequenas porções do testículo (aproximadamente 1,0 mm3) fixados com tampão cacodilato de sódio 0,1M; formaldeído 4%; glutaraldeído 2,5%, sacarose 5%, cloreto de cálcio 5 mM e pós fixadas com tetróxido de ósmio 1% e ferricianeto de potássio 0,8% seguiram o mesmo processo realizado para microscopia óptica citado anteriormente. Com o auxilio de um ultramicrótomo (Reichert Ultracur ultramicrotome) e faca de diamante foram obtidos cortes ultrafinos (70nm) que foram contrastados com acetato de uranila 5% (30min) e citrato de chumbo 0,2% em 0.01mol/L NaOH (5 min) (Reynolds, 1963). Depois de lavadas, as grades secas foram guardadas para posterior observação em um Microscópio Eletrônico de Transmissão (ZEISS TEM 900), com uma aceleração de voltagem de 80 Kv. 3.6. PREPARAÇÃO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV). Para o experimento de Microscopia de Varredura utilizamos espermatozóides de peixes contaminados com a concentração de 20µM de HgCl2 e CdCl2 por 96h. Essa concentração foi utilizada por ser considerada tóxica e por provocar alterações nos testículos, visualizados através da histologia. O fluido com espermatózoides dos peixes do grupo controle e do grupo contaminado foram fixados com tampão cacodilato 0,1 M, formaldeído 4%, glutaraldeído 2,5%, sacarose 5% e cloreto de cálcio. A amostra foi separada em duas partes: uma foi centrifugada a 800 rpm por 15 min a 4 °C, o pellet foi lavado duas vezes em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) por 30 min. A outra amostra não foi centrifugada. Testadas as duas amostras, utilizamos a amostra não centrifugada para análise no microscópio óptico e no varredura. Três gotas da amostra foram aderidas com poly L lisina em lamínulas, pós fixadas com tetróxido de ósmio 1% e tampão cacodilato de sódio 0,1M, desidratadas em séries crescentes de etanol e secas em C02 pelo método de ponto crítico (BALTEC CPD 030 Critical Point Dryer), as amostras secas foram posicionados em um suporte e cobertas com uma camada fina de ouro (BAL-TEC SCD 050 Sputter Coater). A observação foi através de um Microscópio Eletrônico de Varredura (Zeiss 27 EVO 40 a 15Kv), utilizando elétrons secundários. Adicionalmente, o fluido seminal foi colocado sobre a lâmina histológica, realizando assim um esfregaço celular. As lâminas foram secas ao ar. Após esse processo, as células foram coradas com solução de Giemsa (azul de metileno), por 30 minutos. As lâminas coradas foram lavadas em H20 destilada e, após secas ao ar, a lamínula então foi aderida com Bálsamo do Canadá ao esfregaço celular. Foram obtidas imagens dos espermatozóides devidamente fixados e corados para contagem e análise morfológica das mesmas, através do microscópio Axioplan acoplado á câmera Cannon Power Shot A610/620. 28 4. RESULTADOS 4.1. EFEITO TÓXICO DO HgCl2 E CdCl2 NOS EXEMPLARES DE TUVIRA A morte dos exemplares de Gymnotus carapo foi observada durante a execução dos experimentos de contaminação in vitro, principalmente nas concentrações mais elevadas de HgCl2 e CdCl2 (Tabela 6 e 7). É importante ressaltar que na ocorrência de morte de um dos espécimes de Gymnotus carapo, outro exemplar era contaminado em seu lugar, respeitando a concentração e o tempo de exposição da amostra, para não haver a redução do número amostral. Tabela 6. Número de exemplares de G. carapo que morreram durante a exposição de HgCl2. 5µM 10µM 20µM 30µM Até 24h 0 0 3 1 Entre 24 e 48h 1 1 1 2 Entre 48h e 72h 0 2 2 2 Entre 72h e 96h 1 1 2 2 Total 2 4 8 7 Tabela 7. Número de exemplares de G. carapo que morreram durante a exposição de CdCl2. 5µM 10µM 20µM 30µM Até 24h 0 0 0 1 Entre 24 e 48h 0 1 1 1 Entre 48h e 72h 0 1 1 1 Entre 72h e 96h 0 1 2 2 Total 0 3 4 5 29 4.2. ASPECTOS ANATÔMICOS DO TESTÍCULO DE Gymnotus carapo Uma investigação externa foi realizada em cada peixe antes e após a execução dos experimentos. Os peixes do grupo controle demonstraram estar saudáveis, de acordo com as condições macroscópicas de suas brânquias, olhos e escamas. Os órgãos internos também foram investigados. Nos peixes do grupo controle, os órgãos internos como fígado, rim e testículos demonstraram estar normais. Os testículos apresentavam-se consistentes e com uma coloração amarelada (Figura 9A e B). Já os peixes que foram expostos a concentrações de 30µM e 40µM de CdCl2 nos tempos de exposição de 24 a 96 horas, foram observados alterações no fígado e no rim, esses órgãos apresentavam um aspecto liquefeito, já os testículos apresentavam um aspecto amarelado (com a presença de sangue) e flácidos (Figura 9C e D). Nas concentrações abaixo de 30µM e 40µM de CdCl2 e em todas as concentrações de HgCl2 não foi visualizada nenhuma alteração significativa nos órgãos internos. A fim de avaliar a mudança testicular em resposta à exposição ao HgCl2 e CdCl2, o índice gonadossomático foi calculado (Tabela 8 e 9), através disso observamos que houve uma diminuição no GSI do grupo que foi exposto a 30µM e 40µM de CdCl2 (0,05), quando comparado ao GSI do grupo controle (0,09) (Tabela 8). Esses resultados confirmam as alterações anatômicas visualizadas no grupo exposto a 30µM e 40µM de CdCl2, concluindo que a redução do GSI pode ser uma resposta do testículo ao CdCl2. O índice gonadossomatico também foi calculado no grupo exposto ao HgCl2 e observamos que não houve uma diminuição significativa do GSI do grupo exposto a concentrações de HgCl2 (0.07), quando comparado ao GSI do grupo controle (0,07 e 0,06) (Tabela 9). 30 Figura 9. Aspectos anatômicos do testículo de Gymnotus carapo. Em A-B: testículos (espécime controle), C-D: testículos (espécime exposto à 30µM de CdCl2 por 96 horas). Tabela 8. Número amostral, peso do testículo e o índice gonadossomático dos exemplares de G. carapo expostos ao HgCl2 N° de exemplares Comprimento (cm) Peso do testículo GSI Controle 20 33 100 0,070 0,07 5µM 8 31 110 0,081 0,07 10µM 8 33 153 0,110 0,07 20µM 12 32 161 0,120 0,07 30µM 8 32 131 0,080 0,06 Peso (g) 31 Tabela 9. Número amostral, peso do testículo e o índice gonadossomático dos exemplares de G. carapo expostos ao CdCl2 N° de exemplares Comprimento (cm) Peso (g) Peso do testículo Controle 20 30 116 0,109 0,09 10µM 8 31 130 0,080 0,06 20µM 12 35 135 0,089 0,06 30µM 8 34 128 0,069 0,05 40µM 8 32 127 0,071 0,05 GSI 4.3. ASPECTOS HISTOLÓGICOS Para análise histológica dos testículos do grupo controle e do grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2 foram realizados cortes transversais (Figura 10). O testículo de G. carapo mostrou-se arredondado, envolvido por uma camada de epitélio peritoneal (Figura 11A). Figura 10. Região do testículo de Gymnotus carapo (seta) onde foram realizados cortes transversais. Barra:1cm 32 Os testículos de G. carapo são formados por um grande número de túbulos seminíferos com diferentes diâmetros (Figura 11B), dentro desses túbulos foram visualizadas as células de Sertoli (S) e células germinativas (espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozóides) (Figura 11B e 11C). As células de Sertoli (S) são pequenas e em maior aumento possuem o formato triangular, muitas vezes localizada na periferia dos túbulos associadas às células germinativas, principalmente as espermatogônias (SPG) (Figura 11E). Entre os túbulos seminíferos identificamos o tecido intersticial onde encontramos as células de Leydig ou células intersticiais e vasos sanguíneos (Figura 11B, 11D e 11F). As células de Leydig são ovóides e geralmente aparecem em grupos (Figura 11D). No peixe teleósteo esta célula é responsável pela síntese de 11 cetotestosterona (11KT), um hormônio que induz a progressão da espermatogênese (Billard, 1990) Assim, verificamos que a estrutura interna dos testículos do grupo controle mostrava-se compacta, sem espaçamento. Os túbulos seminíferos tinham um arranjo normal e entre estes túbulos o tecido intersticial não apresentava nenhuma alteração. As células germinativas aparecem normais e os espermatozóides livres na luz do túbulo sem aparente agregação (Figura 11A - 11E, 15A e 15B). Durante a análise histológica dos testículos do grupo controle e do grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2, observamos o estágio de maturação gonadal seguindo a escala de maturidade de Barbieri para G. carapo (1981), com isso, verificamos que a maioria dos peixes encontravam-se no estágio II (Adultos em reprodução -maduros), neste estágio os testículos possuem túbulos seminíferos que exibem células germinativas em várias fases de desenvolvimento, principalmente espermátides e espermatozóides. Várias alterações histológicas foram identificadas nos exemplares expostos ao HgCl2 e CdCl2, porém no grupo tratado com HgCl2 os efeitos foram visualizados mais rapidamente. Após o tratamento com 5µM de HgCl2 alterações histopatológicas foram observadas a partir de 72 horas, enquanto que para 10μM, 20µM e 30μM essas alterações foram visualizadas em todos os tempos de exposição analisados. As lesões mais significativas identificadas no testículo dos espécimes expostos ao HgCl2, incluem aumento do tecido intersticial caracterizado por fibrose (Figura 12A, 12C, 15C, 15D), congestão dos vasos sanguíneos ou hiperemia passiva (Figura 12B), desorganização dos túbulos seminíferos (Figura 12D e 13A) desintegração 33 intersticial e tubular caracterizado por áreas com espaçamento (Figura 13B e 13D) e variações acentuadas no tamanho dos túbulos seminíferos (Figura 13C). Com relação ao grupo exposto ao CdCl2, às alterações histopatológicas foram observadas a partir de 72h de exposição na concentração de 10µM. É importante ressaltar que as lesões encontradas no tecido reprodutor do grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2 foram semelhantes em todas as concentrações administradas, sendo os efeitos progressivos observados com o aumento da concentração ao metal exposto. As lesões mais significativas identificadas no testículo dos espécimes expostos ao CdCl2, incluem proliferação do tecido intersticial entre os túbulos seminíferos (Figura 14A), fibrose (Figura 14B, 14F e 15E), congestão dos vasos sanguíneos ou hiperemia passiva (Figura 14C), desorganização dos túbulos (Figura 14D), degeneração do tecido, caracterizado por um processo de vacuolização (Figura 14E, 14F e 15F), agregação espermática na luz dos túbulos (Figura 14E). 34 Figura 11. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo controle). Em A: destaca-se a túnica albugínea envolvendo o testículo (seta) e o lúmen do túbulo, B: as setas indicam os túbulos seminíferos. Inset: túbulos seminíferos, C: destacam-se as células germinativas: espermatogônias, espermatócitos, espermátides, espermatozóides e células de Sertoli (seta). Inset: Célula de Sertoli. Em D as setas indicam células sanguíneas e células de Leydig. Inset: célula de Leydig, F: destaca-se o tecido intersticial entre túbulos seminíferos. Inset: tecido intersticial. TA: Túnica Albugínea, LI: Lúmen do túbulo, it: tecido intersticial, L: célula 35 de Leydig, S: célula de Sertoli, SZ: espermatozóides, SCI: espermatócitos primários, SD: espermátides, SGI: espermatogônias primárias. Coloração: Hematoxilina e Eosina. Barra de Escala: A: 200µm, B: 100µm, C-E: 50µm. Figura 12. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto a 5μM e 10μM de HgCl2). Em A e C: as setas indicam fibrose. Insets: regiões do testículo com fibrose, B: a seta indica hiperemia passiva, D: desorganização dos túbulos seminíferos. Inset: região do testículo com desorganização dos túbulos. Coloração: Hematoxilina e Eosina. Barra de escala: A-D: 100µm. 36 Figura 13. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto a 20μM e 30μM de HgCl2). Em A: desorganização dos túbulos seminíferos, B e D: desintegração intersticial e tubular. Insets: região do testículo com o tecido intersticial e tubular desintegrado. Em C: variações acentuadas no tamanho dos túbulos seminíferos (setas). Coloração: Hematoxilina e Eosina. Barra de escala: A-D: 100µm. 37 Figura 14. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto a 10µM, 30µM e 40µM CdCl2). Em A: as marcações indicam uma proliferação intersticial entre os túbulos seminíferos. Inset: região entre túbulos com proliferação, B: fibrose (seta). Inset: região do tecido com fibrose, C: hiperemia passiva (seta), D: desorganização dos túbulos, E: agregação espermática (seta) e degeneração do tecido. Inset: detalhe dos espermatozóides em agregação no lúmen do túbulo, F: degeneração do tecido acompanhada de fibrose. Inset: região do tecido degenerada e com fibrose. Coloração: Hematoxilina e Eosina. Barra de escala: A-F: 100µm. 38 Figura 15. Corte transversal dos testículos de Gymnotus carapo. Em A e B, detalhe do tecido intersticial e células germinativas (grupo controle), em C e D as marcações indicam o aumento de tecido intersticial entre túbulos seminíferos (grupo exposto a HgCl2). Em E destaca-se o aumento do tecido intersticial e desorganização nos túbulos, em F as setas mostram vacúolos entre as células germinativas indicando uma degeneração do tecido (grupo exposto a CdCl2). Coloração: Azul de Toluidina. Barra de escala: A-F: 20µm. 39 4.4. ASPECTOS ULTRAESTRUTURAIS As observações ultraestruturais revelam que as espermatogônias primárias (SPGI), que são as maiores células da linhagem germinativa, possuem o formato arredondado, um núcleo esférico e central com cromatina granular e uniformemente distribuída. O nucléolo proeminente é esférico e eletrodenso (Figura 16A). As espermatogônias primárias se dividem mitoticamente para dar origem as espermatogônias secundárias. As espermatogônias secundárias (SPCII) são caracterizadas por uma diminuição no tamanho da célula, o núcleo é central e agregação da cromatina difere segundo a fase do ciclo celular observada (Figura 16A). Nos túbulos seminíferos, também podemos observar espermatócitos primários (SPCI), que se originam de espermatogônias secundárias tardias e são vistas em várias fases de desenvolvimento meiótico. Essas células possuem um núcleo central esférico, com um formato regular, ocupando uma grande parte da célula, o nucléolo não é visível e a presença de diferentes graus de condensação da cromatina no núcleo revela que essas células estão em diferentes estágios da prófase meiótica (Figura 16B). Os espermatócitos primários se transformam em espermatócitos secundários, que são células menores que os espermatócitos primários. Cistos de espermatócitos secundários são raramente observados. Diversas espermátides (SPD) foram visualizadas na luz dos túbulos seminíferos em diferentes estágios de espermiogênese (Figura 16B e C). Com o avanço do processo de espermiogênese, as espermátides tornam-se células menores e o núcleo ocupa grande parte da célula (Figura 16B e C). Ao mesmo tempo, uma migração dos centríolos ocorre em direção à espermátide. Dependendo do estágio da espermiogênese, o volume de citoplasma diminui consideravelmente e ocorre um aumento no volume de mitocôndrias (Figura 16C). A análise ultraestrutural também revelou alterações em células da linhagem espermatogênica e essas alterações foram mais evidentes com o aumento da concentração e tempo de exposição do organismo ao HgCl2 e CdCl2. No grupo tratado com 20µM de HgCl2 por 72h, observamos na luz dos túbulos seminíferos várias espermátides, que não possuíam formato arredondado e apresentavam-se deformadas, com núcleo irregular e mitocôndrias maiores (Figura 17A). No grupo tratado com 30µM de HgCl2 por 96h, foram observadas alterações 40 mais severas, já que em algumas células germinativas não foi possível identificar o seu estágio de desenvolvimento espermatogênico pois estavam totalmente danificadas e algumas já se encontravam em processo apoptótico (Figura 17B). Nos testículos dos espécimes tratados com 30µM e 40µM de CdCl2 por 96h e 24h respectivamente, observamos várias células germinativas em processo de vacuolização (Figura 17C-17D). Figura 16. Organização ultraestrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo controle). Em A destacam-se as espermatogônias, B: espermatócitos primários e espermátides C: lúmen do túbulo com espermátides, D: espermatozóide. SPGI: espermatogônia primária, SPGII: espermatogônia secundária, SPCI: espermatócitos primários SPD: espermátides, SZ: espermatozóide N: núcleo, n: nucléolo, c: centríolo, Ll: Lúmen do lóbulo, m: mitocôndria, f: flagelo. 41 Figura 17. Organização ultraestrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto a HgCl2 e CdCl2). Em A, a seta indica uma espermátide com várias mitocôndrias com o seu tamanho anormal, B: células germinativas em apoptose (cabeça da seta) e restos celulares (seta), C: célula germinativa vacuolizada (seta), D: célula germinativa danificada com pequenos vacúolos. n: núcleo, m: mitocôndria, v: vacúolos. 42 4.4. ASPECTOS MORFOLÓGICOS DOS ESPERMATOZÓIDES DE Gymnotus carapo. Os espermatozóides de G. carapo são as menores células da linhagem espermatogênica e são constituídos de uma cabeça arredondada (com ausência de acrossoma), um flagelo alongado e uma peça intermediária (que não é evidente nesta espécie de peixe) (Figura 16D, 18A e 19A e B). Durante a análise morfológica dos espermatozóides do grupo controle foi observado um núcleo arredondado e uma pequena parte do citoplasma evidente na região ântero-posterior da cabeça (Figura 18A). Para análise da morfologia dos espermatozóides do grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2 foi testado apenas uma concentração (20µM) nos tempos (24, 48, 72 e 96h). No grupo exposto a 20µM de HgCl2 e CdCl2 por 24h e 48h não foi observado nenhuma alteração significativa nos espermatozóides, já após 72h foram observados espermatozóides com a cabeça totalmente corada indicando uma máxima condensação do DNA (Figura 18B), além disso, verificamos por meio da microscopia de varredura, espermatozóides apresentando cabeças deformadas e com ausência de flagelo (Figura 19C-19F). Através da análise quantitativa para verificação da presença de flagelo, observamos que no grupo controle aproximadamente 90% dos espermatozóides apresentavam flagelo. No grupo exposto a 20µM de HgCl2 (24h/72h) houve uma diminuição do número de espermatozóides com flagelo (54% e 62% respectivamente, Figura 20A). No grupo exposto a 20µM de CdCl2 (24h/ 96h) também foi observado a diminuição do número de espermatozóides com flagelo (63 e 62% respectivamente, Figura 20B). O cloreto de mercúrio e o cloreto de cádmio apresentaram efeitos similares na morfologia dos espermatozóides expostos a 20µM, entretanto, o HgCl2 aparentou ser mais tóxico do que o CdCl2. De acordo com a Figura 20, pode-se observar que o percentual de espermatozóides com flagelo não variou muito em função do tempo de exposição ao CdCl2 e HgCl2, porém, realizado um comparativo entre os metais, foi revelado que a porcentagem do número de espermatozóides com flagelo foi o mesmo (62%) para o HgCl2 e o CdCl2 nos tempos (72h e 96h respectivamente). 43 Figura 18. Fotomicrografia dos espermatozóides de Gymnotus carapo corados com Giemsa. A: espermatozóides do grupo controle, B: espermatozóides do grupo exposto a 20μM de HgCl2 por 72h, C: espermatozóides do grupo exposto a 20µM de CdCl2 por 96h c: cabeça, f: flagelo. Barra de escala: A-C: 20µm. 44 Figura 19. Fotomicrografia (MEV) dos espermatozóides de Gymnotus carapo. Em A e B: espermatozóide do grupo controle, C: espermatozóide do grupo exposto a HgCl2 por 72h D: espermatozóides do grupo exposto a CdCl2 por 96h. c: cabeça e f: flagelo. Barra de escala: A: 2μm, B, D e E: 1μm. 45 Figura 20. Porcentagem de espermatozóides do grupo controle e do grupo exposto ao HgCl2 (A) e ao CdCl2 (B) com flagelo e sem flagelo. 46 5. DISCUSSÃO Os bioensaios em laboratório têm como objetivo analisar a toxicidade dos metais pesados em concentrações específicas e com isso as mudanças induzidas por esses elementos podem ser empregadas para observação da relação dose/resposta dos organismos expostos (Vergílio, 2009). Além disso, a análise histopatológica vêm como uma ferramenta essencial para diagnosticar e fornecer uma descrição exata das lesões causadas por metais em tecidos e células. Assim, torna-se importante detectar estas alterações histopatológicas antes dos efeitos prejudiciais tornarem-se visíveis nos níveis mais altos, como o nível de organismo ou população. Os organismos, incluindo os peixes, podem responder de diferentes formas a exposição ao Hg e Cd. Essa resposta irá depender tanto da dose quanto do tempo de exposição a esses compostos químicos. Com isso, em alguns casos, o organismo pode sofrer adaptação quando for exposto continuamente a um agente químico. Porém, em outros casos, o composto pode induzir respostas, sendo observadas principalmente através de danos celulares e teciduais. Finalmente, se a exposição for quantitativamente além do limite de detoxificação dos organismos, ou ocorrer por um período prolongado, se estabelece uma resposta tóxica que pode ocasionar a mortalidade dos organismos susceptíveis (Boelsterli, 2007). O testículo de peixe é um órgão pouco estudado, pois não é considerado alvo direto do mercúrio e cádmio, porém nos últimos anos, estudos têm demonstrado que o testículo vem sofrendo diversas alterações devido à exposição a esses poluentes e com isso tem se mostrado importante nas avaliações de toxicidade ambiental (Thompson & Bannigan, 2008; Siu et al., 2009). Com base em estudos anteriores do grupo, onde foram utilizados em cultura de células (hepatócitos HUH-7) e no tecido hepático de G. carapo várias concentrações de HgCl2 em diferentes tempos de exposição, decidimos ajustar algumas dessas concentrações para visualização de efeitos tóxicos nos testículos. No presente estudo, a investigação das respostas celulares e sub-celulares por microscopia de luz e microscopia eletrônica foram fundamentais para descrever as alterações celulares precoces e danos testiculares nos peixes expostos a diferentes concentrações de cloreto de mercúrio e cádmio. Kirubagaran e Joy (1988) e Pelgrom et al. (1995) observaram que o mercúrio e o cádmio têm a capacidade de inibir a gametogênese, induzindo lesões 47 testiculares (desorganização dos túbulos e desintegração das células de Sertoli). No presente estudo, a desorganização dos túbulos seminíferos foi claramente observada após 96h de exposição a 10μM de HgCl2. Além disso, foi observado também outro tipo de lesão no tecido testicular como a desintegração dos túbulos e do tecido intersticial após 72h de exposição a 20µM de HgCl2. Alterações similares também foram observadas nos peixes expostos ao cádmio. Adicionalmente, em estudo de contaminação subletal por cobre em O. mossambicus (0.16; 0.40 e 2.00 mg Cu/L) por 96 horas, Pieterse (2004), também observou no tecido testicular desorganização dos túbulos seminíferos e desintegração do tecido intersticial e das células de Sertoli. Para o autor, essas alterações degenerativas que ocorrem nos túbulos podem comprometer o processo espermatogênico, fazendo com que haja uma mudança ou até mesmo uma interrupção desse processo. Segundo Wester e Canton (1992), testículos maduros de P. reticulata expostos a 5.6µg MeHg/L durante três meses demonstraram alterações histopatológicas incluindo a ocorrência de fibrose e inflamação no interstício. A fibrose ocorre quando o tecido conjuntivo fibroso em excesso se desenvolve no tecido testicular como um processo reparativo. Em nosso estudo a fibrose foi observada nos testículos dos espécimes expostos a 5µM - 30µM de HgCl2 e a 10µM - 40µM de CdCl2 nos maiores tempos de exposição, indicando que esse processo ocorre como um tipo de defesa do tecido testicular contra os danos induzidos pelos metais. Além disso, verificamos que, nos testículos de espécimes expostos a 10µM HgCl2 e a 30µM de CdCl2 houve um aumento das células sanguíneas nos vasos, esse fenômeno é conhecido por congestão ou hiperemia. A hiperemia é causada pelo aumento no volume de sangue em uma região pela intensificação do abastecimento de sangue ou de uma diminuição do fluxo venoso. É um indício de que está havendo uma inflamação aguda local. No presente estudo, a ocorrência de hiperemia pode estar relacionada com o tempo de exposição ao HgCl2 e ao CdCl2, já que esse evento foi documentado a partir de 24 horas nas concentrações descritas acima. Durante o andamento dos experimentos foi observada a morte de alguns exemplares de G. carapo (Tabela 4 e 5), principalmente quando ambos estavam expostos as maiores concentrações de HgCl2 e CdCl2. Isso indica que o tratamento 48 foi estabelecido desde concentrações sub-letais (5µM e 10µM) onde puderam ser observados os efeitos progressivos da contaminação por HgCl2 e CdCl2, até concentrações letais (20µM, 30µM e 40µM) onde a concentração foi num nível tal que proporcionou a morte dos peixes analisados. Em um estudo realizado por Predes et al. (2010), onde foram injetados intraperitonealmente baixas doses de CdCl2 em ratos (1 e 1.2 mg/kg) foi observado através da análise morfométrica uma diminuição no diâmetro dos túbulos seminíferos após 7 dias de exposição, além disso, observações microscópicas mostraram danos progressivos no tecido testicular de animais expostos ao CdCl2. Após sete dias de exposição, o lúmen dos túbulos seminíferos foram preenchidos com células germinativas degeneradas e agregado de espermátides com o núcleo apoptótico. Vacuolização do epitélio seminífero também foi observado. Após 56 dias, houve um aumento dos danos, resultando em túbulos seminíferos vacuolizados. De acordo com Creasy (2001), a vacuolização é uma resposta morfológica comum do epitélio testicular a vários tipos de agressões causadas por metais. No presente estudo, os túbulos seminíferos apresentaram variações acentuadas no tamanho após 72h de exposição a 30µM de HgCl2. Alterações como degeneração, agregado de espermátides e espermatozóides e vacuolização do epitélio e do túbulo seminífero também foram observados nos espécimes expostos a 40µM de CdCl2. Assim como o estudo citado acima, o presente estudo mostra que os efeitos tóxicos do cádmio no aparelho reprodutor masculino foram dose-dependente, as alterações mais drásticas foram visualizadas no tecido testicular de G. carapo na concentração de 40µM de CdCl2. Cameron e Foster (1963) demonstraram em um estudo realizado com coelhos, que através de uma única injeção subcutânea de cloreto de cádmio (18mg/kg) após 72h de exposição, foi possível observar nos testículos vários efeitos histopatológicos, dentre eles destacam-se: desorganização do epitélio seminífero, interstício distendido com extravasamento de células sanguíneas e aumento da área intersticial. Para esses autores, as principais linhas de evidência para explicar o efeito destrutivo do cádmio no tecido testicular são: (a) que inibe as enzimas sulfidril, formando mercaptides com seus grupos SH, (b) que se combina com grupos similares SH no aparato mitótico (c) que compete com o zinco. A última explicação é a mais provável porque as injeções de zinco dão proteção contra danos induzidos pelo cádmio, embora apenas por um período limitado. 49 No presente estudo nós observamos no tecido testicular de G. carapo o interstício distendido após 72h de exposição a 10µM de CdCl2, além disso, verificamos um aumento da área intersticial no tecido testicular dos exemplares expostos a 20µM de HgCl2 (24 e 72h) e 30µM de CdCl2 (96h). Homma - Takeda et al. (2001) mostraram a indução de apoptose em células germinativas de camundongos machos que haviam sido expostos ao cloreto de metilmercúrio (10 mg/kg por 8 dias). Após a contaminação, eles observaram o fenômeno apoptótico principalmente em espermatócitos e espermátides. Apoptose é um processo que está geralmente envolvido no desenvolvimento e homeostase tecidual, mas também parece estar envolvido numa ampla faixa de condições patológicas (Thompson, 1995). Muitos autores mostraram a formação de ROS na toxicidade de metais pesados dentro das células, sendo proposto que estariam envolvidos na citotoxicidade e apoptose (Bower, 2005; Lemarie et al., 2004). As células que sofrem apoptose encolhem morfologicamente devido à perda de volume citoplasmático, além disso, ocorre condensação da cromatina e restos celulares de organismos apoptóticos ficam evidentes. Assim, a apoptose, é um indicador precoce de estresse a xenobióticos e fornece dados sobre o estado de saúde do organismo (Sweet et al., 1999). Através de uma análise ultraestrutural, podemos observar em nosso estudo que o testículo do grupo contaminado com 20µM de HgCl2 por 72h apresentou a formação de espermátides deformadas com a presença de núcleos irregulares e mitocôndrias maiores. No grupo tratado com 30µM de HgCl2 por 96h foram observados alterações mais severas, já que em algumas células germinativas não foi possível identificar o seu estágio de desenvolvimento espermatogênico, pois estavam totalmente danificadas e algumas espermátides já se encontravam em processo apoptótico. A morfologia dos espermatozóides de peixes tem sido pouco investigada, porém estudos com mamíferos sugerem que baixas concentrações de mercúrio podem causar danos no flagelo (Mohamed et al., 1986; Rao, 1989) Em estudos realizados por Popek, et al. (2006), Dietrich et al. (2004 e 2005), Rurangwa, et al. (1998) onde foram testados em peixes várias concentrações de mercúrio e cádmio (1, 10, 100 mg/l) em um curto período de tempo (0-24h), concluiuse que esses metais tem a capacidade de diminuir a qualidade dos gametas, 50 afetando a motilidade do espermatozóide, integridade do plasmalema e fragmentação do DNA. Kime, (1999) em uma revisão sobre os efeitos dos xenobióticos na reprodução de peixes revela que a maioria das substâncias químicas presentes no ecossistema aquático exerce efeitos nos testículos durante a espermatogênese o que resulta em espermatozóides anormais, malformados e com motilidade reduzida. Segundo este autor, a morfologia espermática pode, portanto fornecer uma boa medida quantitativa do desenvolvimento dos efeitos aos xenobióticos. No presente estudo, observamos através da microscopia óptica e eletrônica alterações nos espermatozóides de G. carapo expostos ao HgCl2 e CdCl2. Essas alterações incluem anormalidade na cabeça, ausência de flagelo e máxima condensação do DNA. É importante ressaltar, que as lesões encontradas no tecido reprodutor do grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2 foram semelhantes em todas as concentrações administradas, sendo os efeitos progressivos observados com o aumento da concentração ao metal exposto, porém no grupo tratado com HgCl2 os efeitos foram considerados mais severos. Após 72h de exposição a 5µM de HgCl2 foi observado alterações no tecido reprodutivo. Já o CdCl2 as alterações foram visualizadas após 72 horas de exposição a 10µM. Isso indica que o HgCl2 foi mais tóxico no tecido reprodutor que o CdCl2. A ocorrência de alterações histopatológicas documentadas no presente estudo sugerem uma disfunção reprodutiva e uma falha no processo espermatogênico no testículo de Gymnotus carapo após exposição ao HgCl2 e CdCl2. Dessa forma, os resultados obtidos através da análise dos espermatozóides e da histologia do tecido reprodutivo elucidam as alterações a nível celular e tecidual induzidas pela exposição aos metais pesados, podendo ser empregadas como ferramentas sensíveis no monitoramento ambiental e programas de avaliação de áreas impactadas, apresentado assim a habilidade de complementar as análises químicas. 51 6. CONCLUSÕES Através de análise microscópica o testículo de Gymnotus carapo mostrou-se arredondado e envolvido por uma camada de epitélio peritoneal. Internamente os testículos são formados por um grande número de túbulos seminíferos com diferentes diâmetros, dentro desses túbulos foram visualizados as células de Sertoli (S) e células germinativas (espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozóides). As células de Sertoli (S) são pequenas e em maior aumento possuem o formato triangular, muitas vezes localizadas na periferia dos túbulos associadas a células germinativas, principalmente as espermatogônias (SPG). Entre os túbulos seminíferos identificamos o tecido intersticial onde encontramos as células de Leydig ou células intersticiais e vasos sanguíneos. As células de Leydig são ovóides e geralmente aparecem em grupos. Os espermatozóides de G. carapo são constituídos de uma cabeça arredondada (com ausência de acrossoma), um flagelo alongado e uma peça intermediária (que não é evidente nesta espécie de peixe). A metodologia de contaminação in vitro e de contaminação aguda empregada no presente estudo foi realizada com sucesso. A espécie de peixe utilizada (Gymnotus carapo) se adaptou bem as condições do laboratório. Após testadas várias concentrações (5µM, 10µM, 20µM, 30µM, 40µM) de HgCl2 e CdCl2 em diferentes tempos de exposição (24h, 48h, 72h, 96h) conclui-se que tanto o HgCl2 e CdCl2 afetam o testículo de Gymnotus carapo, provocando diversas alterações, tanto teciduais quanto celulares, porém neste estudo o HgCl2 foi mais tóxico que o CdCl2. Os efeitos nos testículos foram visíveis a partir de 5µM para HgCl2 e 10µM para CdCl2. As alterações nos testículos e espermatozóides foram semelhantes para ambos os metais e progressivas com o aumento da concentração e do tempo de exposição. 52 As lesões mais significativas identificadas no testículo dos espécimes expostos ao HgCl2, incluem aumento do tecido intersticial caracterizado por fibrose, hiperemia, desorganização dos túbulos seminíferos, desintegração intersticial e tubular caracterizado por áreas com espaçamento e variações acentuadas no tamanho dos túbulos seminíferos, já as lesões identificadas no testículo dos espécimes expostos ao CdCl2, incluem proliferação do tecido intersticial entre os túbulos seminíferos, fibrose, hiperemia, desorganização dos túbulos seminíferos, degeneração do tecido caracterizado por um processo de vacuolização, agregação espermática na luz dos túbulos. Para análise da morfologia dos espermatozóides do grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2 foi testado apenas uma concentração (20µM) nos tempos (24, 48, 72 e 96h). No grupo exposto a 20µM de HgCl2 e CdCl2 após 72h foram observados espermatozóides com a cabeça totalmente corada indicando uma máxima condensação do DNA, além disso, verificamos por meio da microscopia de varredura, espermatozóides apresentando cabeças deformadas e com ausência de flagelo. 53 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ABEL, P. D. (1989) Water pollution biology. Chichester: Ellis Howood. 328p. AZEVEDO, F. A. (2003) Toxicologia do mercúrio. Editora Rima, São Carlos, 272p. BAATRUP, E. (1991) Structural and functional effects of heavy metals on the nervous system, including sense organs, of fish. Comparative Biochemical Physiology; 100: 253-257. BARBIERI, G.; BARBIERI, C. B. (1982) Fecundidade e tipo de desova de Gymnotus carapo (Linnaeus, 1758) na represa do Lobo, Estado de São Paulo (Pisces, Gymnotidae). Spectrum (J. Bras. Ci.). 2:25-29. BARBIERI, G.; BARBIERI, C. B. (1983) Dinâmica da reprodução de Gymnotus carapo na represa do Lobo, estado de São Paulo. 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