Análise Comparativa da Expressão de ICAM-1, TGF-B1 e

RAFAELA RODRIGUES MARTINS
ANÁLISE COMPARATIVA DA EXPRESSÃO DE
ICAM-1, TGF-β1 E ki-67 EM CISTOS
PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS E CISTOS
RESIDUAIS
2014
I
RAFAELA RODRIGUES MARTINS
ANÁLISE COMPARATIVA DA EXPRESSÃO DE ICAM-1, TGF-β1 E ki-67 EM
CISTOS PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS E CISTOS RESIDUAIS
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Odontologia
da
Universidade
Estácio de Sá, como parte dos
requisitos para obtenção do grau
de
Mestre
em
Odontologia
(Endodontia).
ORIENTADOR:
Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires
UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ
RIO DE JANEIRO
2014
ii
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
M379a MARTINS, Rafaela Rodrigues.
Análise comparativa da expressão de ICAM-1, TGF-β1 e ki-67 em
cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais/ Rafaela Rodrigues
Martins - Rio de Janeiro, 2014.
56f; 30cm.
Dissertação (Mestrado em Endodontia) - Universidade Estácio
de Sá, 2014.
Bibliografia: f.45
Orientador (a): Prof. Dr.Fábio Ramôa Pires.
1. Cisto perirradicular inflamatório 2. Cisto residual 3. Fator de
crescimento transformante beta 1 (TGF-β1) 4. Molécula de adesão intercelular
1 (ICAM-1); ki-67.
Capacidade respiratória
CDD 617.643
iii
“O SONHO É VER AS FORMAS INVISÍVEIS
DA DISTÂNCIA IMPRECISA, E, COM SENSÍVEIS
MOVIMENTOS DA ESPERANÇA E DA VONTADE,
BUSCAR NA LINHA FRIA DO HORIZONTE
A ÁRVORE, A PRAIA, A FLOR, A AVE, A FONTE,
OS BEIJOS MERECIDOS DA VERDADE".
(Fernando Pessoa)
iv
AGRADECIMENTOS
Ao meu noivo e em breve, meu marido André Dias, por me apoiar de todas as
maneiras para que esse sonho se realizasse. Sem você ao meu lado tenho
certeza que essa caminhada seria muito mais complicada. Nunca vou
conseguir agradecer por tudo que você faz por mim. Obrigada pelo amor,
companheirismo e dedicação.
Aos meus pais Vanda e Geraldo (in memorian) por toda a educação e apoio.
Serei eternamente grata por tudo que fizeram e abdicaram para que eu
pudesse ter um futuro melhor. Amo vocês incondicionalmente.
Às minhas irmãs Juliana e Daniela, pelo amor, apoio e conselhos.
Ao Professor Fábio Ramôa Pires, por toda a atenção dedicada para que esse
trabalho fosse realizado da melhor maneira possível. Suas orientações,
conselhos e apoio foram de suma importância para a realização desse estudo.
Ao Professor José Freitas Siqueira Júnior por ser um exemplo de profissional
dedicado e referência na Endodontia mundial.
À Angélica, por ser uma pessoa maravilhosa e prestativa, nos ajudando de
todas as formas possíveis.
Aos meus colegas de Mestrado, que alegraram meus dias no PPGO e fizeram
deles muito mais agradáveis.
v
ÍNDICE
RESUMO
vii
ABSTRACT
ix
LISTA DE FIGURAS
x
LISTA DE TABELAS
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
xiii
1
INTRODUÇÃO
1
2
REVISÃO DE LITERATURA
5
3
JUSTIFICATIVA
25
4
HIPÓTESE
26
5
PROPOSIÇÃO
27
6
MATERIAIS E MÉTODOS
28
7
RESULTADOS
32
8
DISCUSSÃO
39
9
CONCLUSÃO
44
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
45
11 ANEXOS
55
vi
RESUMO
Objetivo: Comparar a expressão imunoistoquímica da proteína ki-67, do fator
de crescimento transformante beta 1 (TGF-β1) e da molécula de adesão
intercelular 1 (ICAM-1) em cistos perirradiculares inflamatórios e cistos
residuais.
Materiais e Métodos: A partir da amostra composta de 25 cistos
perirradiculares inflamatórios e 25 cistos residuais, foram realizadas reações
imunoistoquímicas utilizando anticorpos anti-ICAM-1, TGF-β1 e ki-67. Ao final,
as
informações
clínicas,
radiográficas,
macroscópicas,
histológicas
e
imunoistoquímicas foram tabuladas em uma planilha para análise descritiva e
comparativa entre os parâmetros. Os dados foram analisados por meio do
programa SPSS e as diferenças foram consideradas estatisticamente
significativas quando p < 0.05%.
Resultados: Os resultados da imunoistoquímica mostraram que não ocorreram
diferenças entre os grupos dos cistos perirradiculares inflamatórios e dos cistos
residuais quando comparados à expressão de ICAM-1 (p=0,239) e TGF-β1
(p=0,258). Em relação ao ki-67, ocorreu uma marcação maior nos cistos
residuais quando comparados aos cistos perirradiculares (p=0,017).
Conclusão: Os resultados do presente estudo sugerem que os estímulos
inflamatórios
específicos
dos
cistos
residuais
possam
mecanismos de etiopatogênese, crescimento e reparo.
vii
modular
seus
Palavras-chave: Cisto perirradicular inflamatório; cisto residual; fator de
crescimento transformante beta 1 (TGF-β1); molécula de adesão intercelular 1
(ICAM-1); ki-67.
viii
ABSTRACT
Aim: To compare the immunohistochemical expression of ki-67, transforming
growth factor beta 1 (TGF-β1) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)
in inflammatory perirradicular cysts and residual cysts.
Materials and Methods: From the study sample composed by 25 perirradicular
cysts and 25 residual cysts, immunohistochemical reactions were carried out
using antibodies directed against ICAM-1, TGF-β1 and ki-67. Clinical,
radiological, gross, histological and immunohistochemical data were tabulated
for descriptive and comparative analysis of the parameters. Data were analyzed
using the SPSS and differences were considered statistically significant with p
<0.05%.
Results: The results of the immunohistochemical analysis showed that there
were no differences between the expression of ICAM-1 (p = 0.239) and TGF-β1
(p = 0.258) when comparing both groups. ki-67 labeling index was higher in
residual cysts when comparing with perirradicular cysts (p = 0.017).
Conclusion: Results from the present study suggest that some specific
inflammatory stimuli on residual cysts would modulate their mechanisms of
etiopathogenesis, growing and repair.
Key Words: Perirradicular cyst; residual cyst; transforming growth factor beta 1
(TGF-β1); intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1); ki-67.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A. Presença de parúlide na mucosa alveolar vestibular na altura dos
dentes 21 e 22. B. Cisto perirradicular inflamatório apresentando-se como área
radiolúcida unilocular de contornos mal definidos associada a região periapical
dos dentes 21 e 22 (mesmo caso que A). C. Cisto perirradicular inflamatório de
grandes dimensões associado aos restos radiculares do dente 46. D. Cisto
residual na região do dente 43 caracterizado por área radiolúcida unilocular
bem delimitada.
34
Figura 2. A. Expressão de ICAM-1 no epitélio e nas células inflamatórias em
um cisto residual (Imunoperoxidase, 10x). B. Detalhe do epitélio expressando
ICAM-1 em um cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). C. Células inflamatórias
e células endoteliais expressando ICAM-1 em um cisto perirradicular
inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). D. Plasmócitos expressando ICAM-1 em
um cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). E. Expressão de
ICAM-1 no infiltrado inflamatório contendo macrófagos xantomatosos em um
cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de ICAM-1 em células
gigantes multinucleadas circundando fendas de cristais de colesterol em um
cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x).
36
Figura 3. A e B. Expressão de TGF beta 1 especialmente em fibroblastos na
cápsula de tecido conjuntivo fibroso de Cistos residuais (A e B Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de TGF beta 1 em fibroblastos,
células endoteliais e em algumas células inflamatórias na cápsula de tecido
x
conjuntivo fibroso de Cistos residuais (C e D - Imunoperoxidase, 40x). E.
Expressão de TGF beta 1 em macrófagos próximos a fendas de cristais de
colesterol em um Cisto residual (Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de TGF
beta 1 em fibroblastos e em células compatíveis com mastócitos na cápsula de
tecido conjuntivo fibroso de um Cisto residual (Imunoperoxidase, 40x).
37
Figura 4. A e B. Expressão de ki-67 no núcleo das células epiteliais das
camadas basal e suprabasal em dois cistos perirradiculares inflamatórios
mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (A e B
- Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de ki-67 no núcleo das células
epiteliais das camadas basal e suprabasal em dois cistos residuais, um deles
mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (C Imunoperoxidase, 40x) e outro mostrando inflamação mais evidente associada
a exocitose (D - Imunoperoxidase, 40x).
xi
38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Anticorpos primários que foram utilizados na avaliação dos cistos
perirradiculares inflamatórios e cistos residuais, com seus respectivos clones,
fabricantes e diluições.
30
Tabela 2. Distribuição comparativa dos parâmetros clínicos e demográficos dos
cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.
32
Tabela 3. Distribuição dos parâmetros histológicos e de imunoistoquímica nos
cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.
xii
35
LISTA DE ABREVIATURAS
ICAM-1
Molécula de Adesão Intercelular 1
TGF-β1
Fator de Crescimento Transformante Beta 1
CP
Cisto Perirradicular Inflamatório
CR
Cisto Residual
IL
Interleucina
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral Alfa
Células Natural Killer
Células NK
IFN-γ
Interferon Gama
ELAM-1
Molécula de Adesão de Leucócitos 1
EGF
Fator de Crescimento Epidérmico
FoxP3
Forkhead Box P3
SPSS
Statistical Program for Social Sciences
xiii
1
INTRODUÇÃO
Uma parte especialmente complexa da patologia cirúrgica oral e
maxilofacial é aquela que se refere a lesões císticas e tumorais. São os
profissionais de saúde oral que têm o papel mais importante no diagnóstico
destas lesões. Os cistos odontogênicos representam um grupo diverso e
extenso de patologias que afetam os maxilares e a mucosa oral. Têm sido
extensivamente estudados e relatados ao longo dos anos na literatura
científica.
Os cistos odontogênicos são as lesões osteodestrutivas mais comuns no
esqueleto humano, com origem a partir de remanescentes do epitélio
odontogênico, mas com comportamentos clínicos diferentes. O mecanismo de
crescimento dessas lesões ainda é controverso. Alguns autores relatam que
sua expansão e seu crescimento envolvem a invasão e a destruição da matriz
extracelular e da membrana basal, que é influenciada tanto pela proliferação do
epitélio cístico como pela velocidade de destruição do tecido ósseo subjacente
(SILVEIRA et al., 2007). Um estudo retrospectivo com 9.723 casos de lesões
radiolúcidas na maxila e mandíbula revelou que granulomas e cistos
radiculares ocorrem a taxas semelhantes e juntos somaram 73% de todas as
lesões. Por outro lado, os cistos residuais somaram aproximadamente apenas
2% de todas as lesões radiolúcidas (KOIVISTO et al., 2012).
As lesões periapicais crônicas do tipo granuloma e cisto perirradicular
inflamatório (CP) representam entidades comuns na clínica odontológica, tendo
a cárie dentária como principal fator etiológico. As endotoxinas bacterianas,
bem como as citocinas originadas do processo imunoinflamatório parecem ter
1
influência no desenvolvimento de tais lesões, contribuindo para a reabsorção
do osso alveolar ao redor do ápice do dente envolvido. Os CPs originam-se da
indução dos restos epiteliais de Malassez, surgindo a partir de granulomas
perirradiculares, e são caracterizados por uma cavidade patológica revestida
internamente por epitélio pavimentoso estratificado não queratinizado contendo
material fluido ou semi-fluido, sendo circundada externamente por um tecido
fibroso (SANTOS et al., 2007; FUKADA et al., 2009).
O cisto residual (CR) é uma lesão cística que é originada de um CP,
persistente após a exodontia do dente envolvido. Sua patogenia, etiologia e
forma de tratamento são muito discutidas na literatura. O seu diagnóstico é
dado entre a correlação entre os exames clínico, radiográfico e histopatológico.
É mais comumente encontrado em pacientes do sexo masculino, sem
predileção quanto à localização (DIMITROULIS & CURTIN, 1998; JAMDADE et
al., 2012).
O papel da resposta imune e da reabsorção óssea na formação das
lesões perirradiculares tem sido extensivamente estudado. No entanto, pouco
se sabe sobre como o conjunto de citocinas envolvidas no desenvolvimento e
na manutenção dos processos inflamatórios crônicos é regulado e como o perfil
destas citocinas é correlacionado com a composição do infiltrado inflamatório e
a apresentação clínica destas lesões (ČOLIŠ et al., 2007).
A migração de vários tipos de leucócitos a partir da circulação para
locais de infecção é mediada não só por receptores de quimiocinas específicas,
mas também por moléculas de adesão. A molécula de adesão intercelular-1
(ICAM-1) é expressa por vários tipos de células, incluindo leucócitos e células
2
endoteliais. ICAM-1 no endotélio desempenha um papel importante na
migração de leucócitos ativados para os locais de inflamação e é também
importante na imunidade adaptativa. Algumas moléculas de adesão e
receptores de quimiocinas já foram encontrados em tecidos periapicais doentes
(DE ROSSI et al., 2008).
O Fator de crescimento transformante beta-1 (TGF-β1) regula uma
grande quantidade de processos biológicos como proliferação, sobrevivência,
diferenciação, reconhecimento, apoptose e migração celular, e produção de
matriz extracelular, apresentando assim funções importantes nas respostas
imunológicas, angiogênese, cicatrização de lesões, desenvolvimento do
organismo e metabolismo ósseo. Sendo assim, devido à grande diversidade de
processos nos quais TGF-β1 está envolvido, fica clara a grande importância
desta citocina durante a embriogênese e na manutenção da homeostase de
tecidos durante a vida (JANSSENS et al., 2005; EHNERT et al., 2010). No caso
de lesões inflamatórias periapicais, o TGF-β1 tem sido relacionado a
modulação da resposta inflamatória e ao processo de reparo das mesmas
(TYLER et al., 1999; DANIN et al., 2000).
O antígeno ki-67 é uma proteína humana localizada no núcleo com
expressão associada a células em proliferação, ou seja, ausente em células
quiescentes (GERDES et al., 1984). O ki-67 é amplamente utilizado para
avaliar o potencial proliferativo de células saudáveis, assim como de lesões
pré-neoplásicas e neoplásicas (GÜLER et al., 2012). Alguns trabalhos
indicaram a superioridade do ki-67 sobre outros marcadores de proliferação
3
celular, por este não receber tantas influências de fatores externos e internos
ao ciclo celular (ARISAWA et al., 1999).
O CR é uma entidade pouco conhecida e um número limitado de
estudos tem direcionado seus objetivos à avaliação comparativa entre os
fenômenos biológicos que modulam o comportamento biológico e a
patogênese desta entidade com o CP.
4
2
2.1
REVISÃO DE LITERATURA
Cistos perirradiculares inflamatórios
Cistos perirradiculares inflamatórios (CP) são cistos inflamatórios
localizados nos ápices ou na porção lateral das raízes de dentes infectados
com polpas necróticas. O termo cisto é derivado da palavra grega Kystis e
significa bexiga (NAIR, 1998). A iniciação da lesão exige que micro-organismos
estejam presentes nos sistemas de canais radiculares (infecção intra-radicular)
dos dentes afetados (KAKEHASHI et al., 1965; NAIR et al., 1996).
Segundo LIN et al. (2007) existem três teorias que explicam a formação
dos CP: a primeira é a teoria da deficiência nutricional, na qual por meio de um
estímulo inflamatório, ocorre uma proliferação epitelial na região, e as células
mais centrais sofrem necrose, formando a cavidade cística. Outra teoria
defende que a proliferação celular é consequência da formação de um
abscesso, formando cordões que o revestem. A terceira teoria afirma que a
formação de cordões de tecido epitelial ocorre devido a proliferação dos restos
epiteliais de Malassez, que se fusionam, originando a cavidade cística. A
descamação de restos celulares conduz a um aumento do conteúdo proteico
no interior da cavidade, levando a entrada de líquido e consequente expansão
da lesão.
Quanto à etiopatogênese, a teoria mais aceita é de que o CP seja
sempre originado de um granuloma perirradicular, muito embora seja consenso
que nem todo granuloma necessariamente progrida para um CP. A origem do
epitélio que reveste internamente o CP são remanescentes embrionários da
bainha epitelial radicular de Hertwig, conhecidos como restos epiteliais de
5
Malassez (BINNIE, 1999; SIQUEIRA et al., 2010). Acredita-se que estes restos
celulares iniciem sua proliferação em resposta aos estímulos inflamatórios
derivados da infecção situada no interior do sistema de canais radiculares
(NAIR, 1998). Mantida a causa, a proliferação epitelial progride e há a
formação de áreas centrais de degeneração no interior das ilhas de células
epiteliais, as quais dão origem à cavidade central que caracteriza os CP. Tal
mecanismo reforça a ideia de que estas lesões são resultado de uma infecção
endodôntica de longa duração (NAIR, 1998; LIN et al., 2007; SIQUEIRA et al.,
2010).
Diversos tipos celulares e mediadores inflamatórios estão envolvidos na
patogênese e na formação e desenvolvimento dos CP. Tanto as defesas
humoral e celular, quanto os eventos bioquímicos e celulares da inflamação,
assim como os moduladores da deposição e reabsorção da matriz extracelular
contribuem para o desenvolvimento de lesões crônicas como os granulomas e
CP (SANTOS et al., 2009). Várias teorias tentam explicar a formação da loja
cística, sendo a mais plausível a que sugere o envolvimento do sistema imune,
baseando-se na presença de elementos da resposta imunológica adaptativa na
lesão, como linfócitos T e B, plasmócitos, macrófagos, células natural killer
(NK), anticorpos e componentes do sistema complemento (SIQUEIRA et al.,
2010).
Histologicamente, o CP consiste em uma cavidade patológica contendo
material fluido ou semissólido no seu interior, composto principalmente por
células epiteliais degeneradas, células e produtos inflamatórios e hemorragia.
Essa loja é revestida por epitélio pavimentoso estratificado de espessura
6
variável, podendo apresentar áreas de hiperplasia e áreas de atrofia (VIER &
FIGUEIREDO, 2002; SIQUEIRA et al., 2010). O CP pode ser classificado em
dois subtipos (“verdadeiro” e “em bolsa”), dependendo da relação da loja cística
com o canal radicular via forame apical ou lateral (NAIR, 1998; SIQUEIRA et
al., 2010). No primeiro, o cisto apresenta-se como uma cavidade fechada
separada do ápice radicular associado e no segundo há uma abertura na
parede cística por meio da qual há comunicação direta do ápice radicular com
a cavidade cística. Além do componente epitelial, os CP possuem uma cápsula
de tecido conjuntivo fibroso permeado por um tecido de granulação que, à
semelhança do que é evidenciado nos granulomas perirradiculares, é
constituído de macrófagos, linfócitos, plasmócitos, neutrófilos, fibroblastos e
vasos neoformados. Mais externamente nesta cápsula encontra-se um tecido
conjuntivo fibroso denso composto basicamente de fibras colágenas com
presença menos abundante de componentes inflamatórios, e que separa o CP
do osso alveolar adjacente (SANTOS et al., 2006; SIQUEIRA et al., 2010).
Corpos hialinos de formas e tamanhos variados e eventualmente calcificados
(chamados de corpúsculos de Rushton) podem ser observados no epitélio e na
cápsula fibrosa dos CP, assim como é frequente a presença de grande número
de macrófagos espumosos. Em virtude da degeneração celular que ocorre
durante o desenvolvimento dos CP, podem ser observadas fendas negativas
de cristais de colesterol, as quais estão frequentemente associadas a uma
reação de corpo estranho com a presença de células gigantes multinucleadas.
Em virtude do grande número de plasmócitos que caracteriza o infiltrado
inflamatório nos CP, é comum a observação de depósitos eosinofílicos de
7
imunoglobulinas no tecido conjuntivo, chamados de corpúsculos de Russel
(BINNIE, 1999; SIQUEIRA et al., 2010).
Os CP são geralmente assintomáticos, o que faz com que a maioria dos
casos
seja
descoberta
em
radiografias
de
rotina.
CP
grandes
ou
secundariamente traumatizados ou infectados podem produzir alterações locais
como abaulamento e ruptura de corticais, drenagem purulenta e dor
(KOSEOGLU et al., 2004; VARINAUSKAS et al., 2006). Mostram predileção
por pacientes do sexo masculino, pela terceira década de vida e pela maxila
(JONES et al., 2006; GROSSMAN et al., 2007; OCHSENIUS et al., 2007).
Radiograficamente, os achados associados aos CP podem ser
indistinguíveis
daqueles
observados
em
granulomas
perirradiculares
(SIQUEIRA et al., 2010). A imagem radiográfica parece ter valor apenas
sugestivo no diagnóstico diferencial entre CP e granulomas perirradiculares e
seu diagnóstico preciso somente é obtido com o exame histopatológico (VIER
& FIGUEIREDO, 2002). Como a teoria mais aceita para sua patogênese
envolve a presença de um granuloma prévio, é natural considerar que os CP
habitualmente apresentem tamanho médio maior que os granulomas. Os CP
apresentam-se como áreas radiolúcidas uniloculares, habitualmente com forma
redonda ou ovoide, localizados em associação com a porção radicular de um
dente desvitalizado. Podem ser limitados por uma borda esclerótica radiopaca
fina e ininterrupta de osso cortical ou podem apresentar limites pouco definidos
e apresentam tamanho variável, podendo oscilar de alguns milímetros a vários
centímetros. Em virtude de sua associação com a infecção no sistema de
canais radiculares, observa-se um abaulamento do espaço correspondente ao
8
ligamento periodontal no local da saída do canal radicular associado. Na
maioria dos casos estão associados a um dente com uma restauração
profunda ou grande lesão de cárie ou a um remanescente radicular (SCHOLL
et al., 1999).
CP são entidades frequentes e estudos analisando a frequência e a
distribuição epidemiológica de cistos dos maxilares (odontogênicos e não
odontogênicos) têm mostrado que estes cistos representam 60% dos cistos
diagnosticados (GROSSMAN et al., 2007). Dentro do grupo dos cistos
odontogênicos, estima-se que CP representem cerca de 50% dos cistos
diagnosticados (JONES et al., 2006; OCHSENIUS et al., 2007). Acredita-se
que estes percentuais são subestimados visto que não contemplam os CP que
não são tratados cirurgicamente e que respondem ao tratamento endodôntico
isolado. Dentro das lesões perirradiculares inflamatórias crônicas, os CP
apresentam frequências variáveis, podendo oscilar de 6 a 55% (NAIR, 1998).
SIMON (1980) estudando 35 lesões perirradiculares, observou 27 (77%)
granulomas perirradiculares, 6 (17%) CP (incluindo 3 “verdadeiros” e 3 “em
bolsa”) e 2 (6%) abscessos. NAIR et al. (1996) analisaram 256 lesões
perirradiculares inflamatórias e observaram que 127 (50%) eram granulomas
(55% não epiteliados e 45% epiteliados), 90 (35%) eram abscessos
perirradiculares e 39 (15%) eram CP, incluindo 24 (61%) cistos “verdadeiros” e
15 (39%) cistos “em bolsa”. Cabe ressaltar que as discrepâncias entre as
frequências encontradas podem ser motivadas por vários fatores, em especial:
o fato de que a correta diferenciação entre granulomas e CP só pode ser
conseguida com a análise histológica das lesões, restringindo a avaliação às
9
lesões tratadas cirurgicamente; à fragmentação dos espécimes submetidos à
avaliação histológica; e às diferenças na interpretação microscópica por parte
dos patologistas responsáveis.
O tratamento dos CP inclui obrigatoriamente a remoção do agente
causador, ou seja, o tecido pulpar necrótico. Para isso, habitualmente indica-se
o tratamento endodôntico convencional, por vezes associado à cirurgia
perirradicular (SIQUEIRA et al., 2010). Nos casos onde há indicação de
remoção do dente associado (restos radiculares, fraturas dentárias, etc.),
habitualmente realiza-se a exodontia e a remoção conservadora do CP no
mesmo tempo cirúrgico.
2.2
Cisto Residual
Cisto residual (CR) é a denominação utilizada para caracterizar um CP
que permaneceu no local após a remoção do dente associado ou a esfoliação
espontânea da raiz residual associada à lesão, sem os cuidados necessários
de curetagem e enucleação da lesão subjacente. Trata-se, portanto, da
persistência de um CP (DIMITROULIS & CURTIN, 1998; BINNIE, 1999;
NEVILLE et al., 2009). Como tal, a etiopatogenia do CP é a mesma do CR, e
as duas entidades são distinguidas apenas pela presença ou não do dente ou
da raiz associada ao cisto no momento do diagnóstico. No CP, acredita-se que
o crescimento da lesão possa ocorrer por dois mecanismos: estímulo
inflamatório pela persistência do dente com necrose pulpar e a extensão do
processo ao periápice e diferença de pressão osmótica entre o líquido
intersticial e o líquido cístico (atraindo fluido para o interior da cavidade). Não
10
se sabe ao certo se no CR o processo de crescimento da lesão é mantido,
estabiliza ou regride. Acredita-se que, embora não exista mais o estímulo da
persistência do dente no CR, o processo de crescimento cístico continue por
osmose, pelo desequilíbrio de pressões entre o meio interno e o externo
(OEHLERS, 1970, NEVILLE et al., 2009). OEHLERS (1970) cita que a maioria
dos CR mantém-se intactos e estáveis durante anos, mas aqueles que estão
localizados mais superficialmente e que estão expostos a fatores tais como
trauma e infecção secundária, poderiam estar submetidos a maior diferença de
pressão osmótica, culminando em progressão do seu tamanho.
Com relação à frequência, estudos analisando a epidemiologia de cistos
odontogênicos e não odontogênicos dos maxilares têm mostrado que os CR
representam entre 4% e 11% de todos os cistos diagnosticados (JONES et al.,
2006; OCHSENIUS et al., 2007; PROCKT et al., 2008). KHOSRAVI et al.
(2013) determinaram a prevalência de cistos odontogênicos de acordo com
idade, sexo e área afetada no Irã durante um período de 23 anos. De um total
de 7.412 lesões diagnosticadas entre 1988 e 2010, 21,6% eram cistos
odontogênicos, dos quais 48,7% eram inflamatórios e 51,3% eram cistos de
desenvolvimento. Os quatro cistos odontogênicos mais frequentes foram CP
(35,1%), cistos dentígeros (25,8%), queratocistos odontogênicos (22,6%) e CR
(13%). A taxa de CR nesse estudo foi maior comparada a outros estudos
(OCHSENIUS et al., 2007; NUNEZ-URRUTIA et al., 2010), mas menor que um
estudo realizado na Malásia, no qual a porcentagem de CR foi de 21,4%
(RENGASWAMY, 1977), mostrando a heterogeneidade da frequência mundial
desta entidade.
11
Segundo a maioria dos autores os CR ocorrem, sobretudo, em pacientes
do sexo masculino (HIGH & HIRSCHMANN, 1988; DIMITROULIS & CURTIN,
1998; BATAINEH et al., 2004; JONES et al., 2006; MENINGAUD et al., 2006;
OCHSENIUS et al., 2007; PROCKT et al., 2008). As faixas etárias mais
frequentes no momento do diagnóstico dos CR envolvem pacientes entre a
quarta e a oitava décadas de vida (PROCKT et al., 2008). Por definição, o CR
ocorre em uma região onde previamente existia um dente que foi extraído e
considera-se que o epicentro da lesão seja posicionado numa localização
periapical. Sua localização mais frequente pode ser variável quando se
comparam
os
estudos
publicados
na
literatura,
incluindo
a
maxila
(OCHSENIUS et al. 2007), a mandíbula (BATAINEH et al., 2004) ou uma
frequência equivalente entre ambas (MENINGAUD et al., 2006). Considera-se
a região anterior dos maxilares como o sítio de predileção para o CR.
Os CR são geralmente assintomáticos e diagnosticados através de um
exame radiográfico de rotina. No entanto, quando atingem tamanhos maiores,
podem provocar tumefação e ruptura das corticais ósseas, e nesses casos a
presença de infecção secundária e de dor é comum (HIGH & HIRSCHMANN,
1986; DIMITROULIS & CURTIN, 1998; NEVILLE et al., 2009; JAMDADE et al.,
2012).
Radiograficamente apresentam-se como área radiolúcida unilocular, de
formato oval ou arredondado, de tamanho variável, circunscrita por uma borda
esclerótica radiopaca. Embora a estrutura interna seja tipicamente radiolúcida,
pequenos focos de calcificação distrófica podem ser visualizados em CR com
longo tempo de evolução (JAMDADE et al., 2012). Podem causar
12
deslocamento e reabsorção radicular dos dentes adjacentes e, em casos
isolados e extensos, podem projetar-se para o antro maxilar ou causar
afastamento do canal alveolar inferior (JAMDADE et al., 2012). Para realizar o
diagnóstico diferencial de um CR é particularmente relevante conhecer a
história clínica e observar radiografias anteriores, sem os quais é difícil a
diferenciação entre os CR e outros cistos e pseudocistos dos maxilares
(COURTEN et al., 2002; BOEDDINGHAUS & WHYTE, 2008).
Os critérios histológicos de diagnóstico do CR são idênticos aos que são
utilizados para o CP (HIGH & HIRSCHMANN, 1986). O epitélio de revestimento
dos CR tende a ser mais regular e uniforme pelo fato de estar menos exposto
aos efeitos do processo inflamatório, visto que este apresenta usualmente
intensidade menor que a encontrada nos CP. A cápsula de tecido conjuntivo
fibroso tende a ser mais espessa e densa, podendo inclusive ser observados
focos de mineralização (HIGH & HIRSCHMANN, 1986; BINNIE, 1999;
JAMDADE et al., 2012). Há autores que sugerem que os CR possam diminuir
de tamanho com sua evolução e outros que podem ainda mostrar remissão
completa (OEHLERS, 1970; HIGH & HIRSCHMANN, 1986; BINNIE, 1999),
mas evidências conclusivas sobre estas suposições ainda não foram
demonstradas.
O tratamento do CR é realizado por meio da enucleação cirúrgica da
lesão, respeitando as limitações e adequações da técnica de acordo com o
tamanho e a localização da lesão (NEVILLE et al., 2009).
MUGLALI et al. (2008) avaliaram o nível das citocinas e quimiocinas no
fluido dos CP e CR, constatando que o fluido dos CP possui uma maior
13
concentração de interleucina 1α (IL-1α), fator de necrose tumoral α (TNF-α) e
proteína quimiotática para monócitos-1 quando comparado com os CR. Estas
citocinas estão envolvidas na expansão cística e, face a estes resultados,
sugeriu-se que apesar de possuírem origens semelhantes, os CP possuem
uma maior capacidade de expansão que os CR e que se o CP for
inadvertidamente deixado após uma extração, certo grau de inflamação pode
permanecer e desta forma contribuir para a expansão cística.
2.3
Molécula de adesão intercelular 1
A molécula de adesão intercelular (ICAM-1 ou CD54) é uma proteína da
superfície celular, com cinco domínios do tipo imunoglobulina que é expressa
nas células vasculares endoteliais, linfócitos e monócitos. Possui um segmento
transmembrana e uma cauda citoplasmática de aminoácidos. Devido a uma
curva fixa de 90 graus entre os domínios três e quatro, os monômeros de
ICAM-1 são em forma de L (LEBEDEVA et al., 2005).
ICAM-1 participa na adesão de células inflamatórias ao endotélio antes
de ocorrer a diapedese e também está relacionada com as funções efetoras de
leucócitos e apresentação de antígenos. A estimulação de uma variedade de
células, tais como as células endoteliais, células mesangiais e células epiteliais
dos brônquios, com citocinas inflamatórias, como a IL-1, o TNF-α e o interferon
gama (IFN-y), aumenta a expressão de ICAM-1 (LEBEDEVA et al., 2005).
A migração de vários tipos de linfócitos a partir da circulação para locais
de infecção não é mediada somente por receptores específicos de quimiocinas,
mas também por moléculas de adesão (HREN et al., 1999; KABASHIMA et al.,
2002). Algumas destas moléculas e receptores de quimiocinas já foram
14
encontrados em tecidos perirradiculares doentes, mas o seu papel na
patogênese destas lesões ainda permanece desconhecido (DE ROSSI et al.,
2008).
Citocinas com conhecida atividade inflamatória e osteolítica, tais como
IL-1, TNF-α, IL-6 e a IL-8 já foram localizadas por meio de imunoistoquímica
em CP. Os receptores de adesão celular ICAM-1 e a molécula de adesão de
leucócitos 1 (ELAM-1) também já foram encontrados. No mesmo estudo, todas
as amostras de CP mostraram marcação para ICAM-1 em células do epitélio,
endotélio e células mononucleares, fornecendo evidências de que os CP
contêm vasos sanguíneos ativados cujas células endoteliais expressam
receptores de adesão celular como ICAM-1 e ELAM-1 (BANDO et al., 1993).
SAWA et al. (1998) avaliaram a expressão de moléculas de adesão
sobre a polpa dentária saudável e inflamada por imunoistoquímica. Na polpa
dentária saudável nenhum vaso reagiu com ICAM-1, enquanto na polpa
inflamada um grande número de vasos reagiu fortemente ao ICAM-1. Isto
indica que o endotélio vascular da polpa dentária humana inflamada expressa
diversas moléculas de adesão para a migração de leucócitos dos vasos
sanguíneos para o tecido. A polpa dentária é rodeada pela dentina, como um
sistema in vitro, de modo que se torna um modelo atraente para o estudo das
moléculas de adesão no endotélio vascular na migração transendotelial de
leucócitos.
HREN et al. (1999) demonstraram um aumento significativo da
expressão de ICAM-1 em células T isoladas do granuloma periapical, em
comparação com os linfócitos do sangue periférico, reforçando as evidências
15
do seu papel na promoção do tráfego de linfócitos ativados a partir do sangue
para os tecidos inflamados. TAŞMAN et al. (1999) examinaram a expressão de
uma variedade de moléculas de adesão em células endoteliais da polpa
dentária humana, para obter evidências sobre a sua distribuição e função
nestes tecidos. Compararam amostras de dentes extraídos por indicação
ortodôntica com dentes extraídos devido à periodontite crônica e identificaram
a presença de ICAM-1 expressa tanto no controle quanto na periodontite
crônica. DE ROSSI et al. (2008) mostraram evidências que a deficiência de
ICAM-1 resulta em resposta imune comprometida refletindo uma maior
inflamação periapical e reabsorção óssea.
MOREIRA et al. (2006) demonstraram que ICAM-1 é efetivamente
envolvida na formação precoce de granuloma e participa na resistência à
infecção de ratos com o fungo Paracoccidioides brasiliensis. A ausência da
expressão de ICAM-1 resultou na diminuição do número de células T CD4 e
CD8 e um aumento da produção de IL-4 no local da inflamação.
2.4
Fator de crescimento transformante beta 1
A família dos fatores de crescimento transformante beta (TGF-β) faz
parte de uma superfamília de proteínas e pode existir em pelo menos três
isoformas chamadas TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3 (SHI et al., 2011). As três
isoformas apresentam grande similaridade no domínio C-terminal, com nove
resíduos de cisteína conservados. Porém, apesar dessa alta homologia de
sequência, estudos in vivo das funções dessas três isoformas, através de
genes
knockout,
revelaram
diferenças
16
impressionantes,
demonstrando
ausência de redundância das suas funções, sendo que de modo geral, TGF-β1
é a isoforma mais abundante (JANSSENS et al., 2005).
São citocinas que controlam a proliferação e a diferenciação celular,
funcionando como agentes de crescimento e de diferenciação de células
imunes e inflamatórias e atuando na formação da estrutura óssea. Interferem
na fisiopatologia do reparo tecidual favorecendo a expressão do gene de
colágeno tipo 1, fundamental para a manutenção da integridade tecidual
(SANTOS et al., 2009). O TGF-β é produzido por linfócitos T, macrófagos,
plaquetas e outros tipos celulares. Encontrado em grandes quantidades no
tecido ósseo, ele é um potente estimulador do crescimento e diferenciação de
osteoblastos. O TGF-β inibe tanto a proliferação dos precursores de
osteoclasto, quanto a função das células maduras. Ele inibe também a fusão
dos precursores mononucleares, necessária para a formação de osteoclastos
(SIQUEIRA, 2000b).
TGF-β1 é importante na regulação da inflamação e tem efeitos que são
principalmente imunossupressores. As substâncias microbianas e a resposta
do hospedeiro frente aos antígenos estimulam a produção dessa citocina. Nas
fases iniciais de inflamação, o TGF-β1 atua como um quimioatraente para
monócitos e linfócitos. No entanto, posteriormente exerce um potente efeito
supressor sobre a proliferação e diferenciação de linfócitos T e B. Além disso,
inibe a produção de IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α e IFN-γ. TGF-β1 também antagoniza
com as atividades biológicas dessas citocinas (WAHL, 1994; DANIN et al.,
2000).
17
LI et al. (1997) determinaram o padrão de expressão do TGF-α e TGF-β
e do fator de crescimento epidérmico (EGF) nos três tipos mais comuns de
cistos odontogênicos (queratocistos, cistos dentígeros e CP). TGF-β foi
encontrado tanto nas células (fibroblastos, células endoteliais e células
inflamatórias) quanto na matriz intercelular (matriz e espaço intravascular) na
parede do tecido conjuntivo fibroso em todos os tipos de cistos.
TYLER et al. (1999) identificaram que a grande maioria dos eosinófilos
presentes nos granulomas periapicais e CP demonstraram expressão de TGFβ e que outras células, incluindo linfócitos, fibroblastos, e monócitos também
produziram esta citocina. A presença de citocinas de reparo, tais como TGF-α e
TGF-β, sugere o mecanismo pelo qual a resposta inflamatória pode participar
na reparação e remodelação dos tecidos perirradiculares.
Estudos imunoistoquímicos mostraram que o TGF-β associado a
macrófagos é encontrado na proximidade do ápice radicular e em áreas com
reabsorção óssea durante as lesões ativas, ao passo que o TGF-β associado a
osteoblastos é detectado durante as fases crônicas da lesão perirradicular (30,
60 e 80 dias após a exposição pulpar em ratos). Estes resultados sugerem que
os macrófagos podem desempenhar papel importante na iniciação e
desenvolvimento de lesões periapicais e que o TGF-β pode desempenhar um
papel duplo, modulando tanto a reabsorção quanto a deposição óssea em
lesões perirradiculares (LIN et al., 2000).
PIATTELLI et al. (2004) avaliando a possibilidade da influência dessa
citocina no desenvolvimento de cistos odontogênicos, realizaram uma análise
imunoistoquímica da expressão de TGF-β1 em vasos sanguíneos, fibroblastos
18
e no epitélio pavimentoso estratificado destas lesões. Os autores encontraram
presença estatisticamente significante dessa proteína na camada suprabasal e
superficial do epitélio, bem como no estroma celular, de queratocistos
ortoqueratinizados e paraqueratinizados, em comparação com os CP e cistos
dentígeros.
GARLET et al. (2012) analisaram a expressão de genes associados ao
processo de cicatrização em granulomas perirradiculares de natureza
progressiva e estável, identificando que a expressão de TGF-β1 era cinco
vezes maior nos granulomas quando comparados ao grupo controle e maior
nos granulomas inativos comparados aos ativos.
ANDRADE et al. (2013) avaliaram a imunoexpressão de IL-17, TGF-β1 e
da proteína Forkhead Box P3 (FoxP3) em granulomas perirradiculares, CP e
CR e demonstraram que a expressão de TGF-β1 estava aumentada nas lesões
com maior infiltrado inflamatório, sendo mais comumente encontrado em
granulomas, seguidos de CP e por último CR. A razão pela qual os níveis de
TGF-β são elevados nas lesões periapicais ainda não está claro, mas parece
estar relacionada com a presença de grande número de células que produzem
esta citocina, incluindo macrófagos, fibroblastos, eosinófilos, osteoclastos,
osteoblastos e células Treg (DANIN et al., 2000).
TGF-β tem sido sugerido como sendo importante para cura periapical,
porque esta citocina é conhecida por inibir a atividade de reabsorção óssea e
promover a remodelação e reparo tecidual. Neste sentido, estudos indicaram
que o TGF-β estimula a síntese de colágeno, neovascularização e proliferação
de fibroblastos (TYLER et al.,1999).
19
EDWARDS et al. (2010) relataram que apesar da grande quantidade de
trabalhos que descrevem os efeitos do TGF-β no tecido ósseo, um consenso
sobre a verdadeira função dessa proteína na biologia das células ósseas e
remodelação do tecido ósseo ainda necessita ser estabelecido.
2.5
Antígeno ki-67
O antígeno ki-67 é uma proteína originalmente definida pelo protótipo do
anticorpo monoclonal ki-67 e que detecta um antígeno nuclear que está
presente apenas em células em proliferação (GERDES et al., 1984). É um
antígeno nuclear do tipo não histona que faz parte da estrutura proteica
conhecida como suporte cromossômico. A análise detalhada do ciclo celular
revelou que este antígeno estava presente no núcleo das células nas fases G1,
S e G2 do ciclo de divisão celular, como também na mitose. Células
quiescentes ou na fase G0 não expressam o antígeno ki-67 (GERDES et al.,
1984; SCHOLZEN & GERDES, 2000; GÜLER et al., 2012).
É uma proteína grande, com aproximadamente 395 kDa, codificada por
quase 30.000 pares de base dentro do genoma humano. A estrutura primária
de ki-67 já foi estabelecida. A proteína sofre fosforilação e desfosforilação
durante a mitose, é suscetível à proteases e sua estrutura indica que a sua
expressão é regulada por vias proteolíticas (BROWN & GATTER, 2002).
Sua utilização em técnicas imunoistoquímicas, aliando simplicidade,
facilidade de manuseio pelos patologistas e amplo uso para diagnóstico,
favorece a realização de estudos correlacionando os resultados obtidos à
gradação e ao prognóstico de neoplasias (YOSHIDA et al., 2001). Diversos
estudos já indicaram a superioridade do ki-67 como marcador de proliferação
20
celular, por não receber tantas influências de fatores externos e internos.
(ARISAWA et al., 1999).
Em virtude da observação do antígeno ki-67 em todas as células
proliferativas (saudáveis e tumorais), logo se tornou evidente que a presença
desta proteína é um excelente indicador para determinar a fração de
crescimento de uma dada população de células. Por esta razão, os anticorpos
contra a proteína ki-67 foram cada vez mais utilizados como ferramentas de
diagnóstico e de prognóstico em diferentes tipos de tumores (SCHOLZEN &
GERDES, 2000).
Vários fatores de ordem prática podem limitar a efetividade do ki-67
como indicador de prognóstico, particularmente em pequenas biópsias, tais
como: a expressão do ki-67 parece ser influenciada pelo suprimento nutricional,
portanto uma amostra retirada próxima à área central da neoplasia poderia
fornecer um valor, para o fator de crescimento, inferior incorreto. Outro fator é
que a maior parte das neoplasias apresenta linhagens de células heterogêneas
e com diferentes taxas de proliferação. Nesta circunstância, o índice do ki-67
não refletiria a taxa predominante de proliferação da neoplasia (ARISAWA et
al., 1999).
Cistos odontogênicos calcificantes foram histologicamente examinados
para delinear as características e subtipos destas lesões, incluindo a expressão
de ki-67 para avaliar sua atividade celular proliferativa. O índice de marcação
para ki-67 foi ligeiramente maior em cistos odontogênicos calcificantes com o
epitélio
de
revestimento
proliferativo
(nos
21
quais
haviam
áreas
com
características de ameloblastoma) quando comparados com os cistos que não
tinham essas características histológicas (YOSHIDA et al., 2001).
SUZUKI et al. (2005) investigaram o possível papel da morte celular por
apoptose
nas
lesões
inflamatórias
periapicais
mediante
a
análise
imunoistoquímica de fatores relacionados à apoptose e através da utilização de
um marcador de proliferação celular. Os autores utilizaram dezenove CP, cinco
CR e, como controle, espécimes de gengiva saudável excisada de sete
cadáveres. Foram analisados por imunoistoquímica com a utilização de
anticorpos monoclonais ou policlonais contra antígenos nucleares e do DNA e
ki-67. Os três tipos de amostra foram reativos para ki-67 nas células basais e
parabasais. A expressão de ki-67 em CP e CR foi um pouco maior do que na
gengiva. O ki-67 foi bem mais reativo em CP com intensa reação inflamatória
ou com epitélio de revestimento espesso, quando comparados aqueles com
menor intensidade inflamatória ou com epitélio de revestimento fino e aos CR.
ROSENSTEIN et al. (2001) estudaram uma série de ameloblastomas
císticos que apresentavam uma inesperada capacidade para destruição óssea
e recorrência. Foram avaliadas as taxas de proliferação, utilizando anticorpos
ki-67 para analisar se não havia qualquer correlação com o comportamento
biológico dessas lesões. Eles mostraram que a taxa de proliferação dos
ameloblastomas císticos foi de 4,3%, em comparação com tumores sólidos
(2,8%) e cistos dentígeros (6,6%), sugerindo que a agressividade dos
ameloblastomas císticos está mais relacionada a outros fatores do que com o
aumento da proliferação celular.
22
MEER et al. (2003), determinaram a atividade proliferativa in situ de
ameloblastomas sólidos e multicísticos e de ameloblastomas unicísticos
utilizando o PCNA e ki-67 para fornecer uma base científica para quaisquer
diferenças de comportamento biológico que pudessem existir entre estes dois
grupos de lesões. Os autores não encontraram uma correlação entre a
atividade proliferativa dessas proteínas e o comportamento biológico desses
dois tipos de lesões.
AYOUB et al. (2011) verificaram a imunoexpressão de ki-67 em CP e
queratocistos odontogênicos, concluindo que a natureza benigna dos CP e o
comportamento agressivo dos queratocistos poderiam ser explicados por meio
da expressão de ki-67 e que ele pode ser um marcador de proliferação celular
valioso para o melhor entendimento do comportamento biológico das lesões
císticas dos maxilares.
MARTINS et al. (2011), embora não tenham observado diferença
estatisticamente significativa na positividade para ki-67 entre CP e cistos
dentígeros, evidenciaram que a proteína foi encontrada em maior quantidade
em cistos associados à presença de infiltrado inflamatório intenso, sustentando
que o processo inflamatório pode influenciar no potencial proliferativo de
epitélios císticos.
TEKKEŞİN et al. (2012), analisaram as características de apoptose e o
potencial de proliferação dos queratocistos odontogênicos comparados com
ameloblastomas e CP, incluindo ki-67. Foi evidenciado que o epitélio de
revestimento do queratocisto odontogênico mostrou uma forte marcação para
ki-67, comparado ao ameloblastoma e ao CP. A alta expressão de ki-67 em
23
queratocistos odontogênicos conferem seu comportamento clínico agressivo e
uma alta taxa de recidiva.
GÜLER et al. (2012), investigaram a existência da associação entre o
processo inflamatório e a expressão de marcadores, incluindo ki-67, em
folículos dentários de dentes inclusos assintomáticos e cistos odontogênicos
(CP, cistos dentígeros queratocistos odontogênicos). Através de reações
imunoistoquímicas, os autores identificaram uma maior expressão de ki-67 em
queratocistos odontogênicos, seguido pelos CP, evidenciando a relação dessa
proteína com a intensidade do infiltrado inflamatório.
24
3
JUSTIFICATIVA
Muito embora o número de estudos buscando esclarecer a influência de
mediadores inflamatórios e de reparo tecidual na patogênese dos CP tenha
sofrido
grande
incremento nos últimos anos,
diversos
pontos ainda
permanecem controversos e desconhecidos. Um destes temas é a relação
existente entre a expressão imunoistoquímica de ICAM-1, TGF-β1 e ki-67 nos
CP e nos CR e sua associação com as diferenças morfológicas e estruturais
destas
duas
entidades.
Biologicamente,
acredita-se
que
a
influência
inflamatória menos evidente no CR possa justificar o aumento dos mecanismos
de reparo tecidual e a diminuição do potencial proliferativo do epitélio de
revestimento cístico. No entanto, não existem estudos na literatura que tenham
objetivado avaliar estas três moléculas de forma comparativa nestes dois tipos
de cistos.
25
4
HIPÓTESE
A expressão imunoistoquímica da proteína ki-67 e da ICAM-1 é menor
em CR quando comparada com a expressão em CP; de forma contrária, a
imunoexpressão de TGFβ-1 é maior em CR quando comparada a expressão
em CP.
26
5
PROPOSIÇÃO
Comparar a expressão imunoistoquímica da proteína ki-67, de TGFβ-1 e
de ICAM-1 em cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.
27
6
MATERIAIS E MÉTODOS
A amostra foi composta de 25 CP e 25 CR selecionados dos arquivos
dos laboratórios de Patologia Bucal da Universidade Estácio de Sá (localizado
na Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580 cobertura, Recreio dos Bandeirantes,
Rio de Janeiro/RJ, Brasil) e da Universidade do Estado do Rio de Janeiro
(situado no Boulevard 28 de setembro, 157 sala 503, Vila Isabel, Rio de
Janeiro/RJ, Brasil). As informações clínicas, radiográficas e macroscópicas de
cada caso foram obtidas por meio da revisão dos formulários de requisição
laboratorial em cada serviço específico.
Lâminas histológicas com cortes de 5µm coradas em hematoxilina e
eosina de cada um dos 50 casos que compuseram a amostra estudada foram
avaliadas em detalhe em microscópio óptico de luz acoplado a câmera digital
(Microscópico
histológicas
Leica,
avaliadas
modelo
DM500,
incluíram:
Alemanha).
espessura
do
As
epitélio
características
(atrófico
ou
hiperplásico), espessura da cápsula do tecido conjuntivo (fina ou espessa),
intensidade do
infiltrado
inflamatório
(focal/leve
ou moderado/intenso),
presença ou não de fendas de cristais de colesterol, tipo de infiltrado
inflamatório (crônico ou misto) e tipos celulares predominantes (linfócitos,
plasmócitos, macrófagos e neutrófilos). Estas observações foram feitas
simultaneamente pelos dois observadores e as avaliações finais foram obtidas
por consenso.
Adicionalmente foram feitos cortes histológicos de 3µm, a partir dos
blocos de parafina de todos os casos selecionados, em lâminas previamente
silanizadas com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma, ST. Louis, MO, EUA).
28
Para as reações imunoistoquímicas, os cortes foram desparafinizados por meio
de duas trocas de xilol por 10 minutos cada em temperatura ambiente,
seguidas de hidratação em soluções com concentrações decrescentes de
etanol (100%, 90%, 70% e 50%), e posterior lavagem em água corrente. A
recuperação antigênica foi feita por meio da imersão das lâminas em berços de
vidro em um recipiente contendo uma solução de tampão citrato a 10 mM (pH
6,0) levado ao forno de micro-ondas (Panasonic modelo NN7809BH, 850W) em
potência máxima durante um ciclo de 12 minutos. Após resfriamento das
lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente, a atividade da peroxidase
endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% em 5 banhos
consecutivos de 5 minutos, após os quais os cortes foram lavados em água
corrente e submetidos à incubação com leite desnatado por 5 minutos. As
lâminas foram então lavadas em água corrente e incubadas em solução salina
tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS: phosphate-buffered saline).
Os anticorpos primários utilizados foram então diluídos em PBS
contendo 1% de albumina sérica bovina (BSA, Sigma, ST. Louis, MO, EUA) e
os cortes foram incubados com os anticorpos primários, de acordo com suas
respectivas diluições, em câmara úmida por um período de 16 horas a 4°C.
Controles positivos (de acordo com a sugestão dos fabricantes) e negativos
(omissão do anticorpo primário) foram utilizados para todas as reações com
todos os anticorpos. A Tabela 1 mostra os anticorpos primários utilizados, com
seus respectivos clones, fabricantes e diluições.
29
Tabela 1. Anticorpos primários que foram utilizados na avaliação dos cistos perirradiculares
inflamatórios e cistos residuais, com seus respectivos clones, fabricantes e diluições.
Anticorpos primários
Clone
Fabricante
Diluição (µL)
ICAM-1
G-5
Santa Cruz Biotechnology
1:1000
TGF-β1
V
Santa Cruz Biotechnology
1:200
ki-67
MIB-1
DAKO
1:100
Após as 16 horas, os cortes foram lavados com três banhos de PBS e o
anticorpo secundário conjugado foi adicionado (LSAB, Dako, Carpinteria, CA,
EUA), durante trinta minutos a 37°C. Posteriormente os cortes foram
novamente lavados em PBS (3 trocas) e expostos ao sistema estreptavidinabiotina-peroxidase (LSAB, Dako, Carpinteria, CA, EUA) por mais 30 minutos.
Em seguida, após três lavagens com PBS, as reações foram evidenciadas com
solução de tetracloreto de 3,3’ diaminobenzidina por 5 minutos a temperatura
ambiente. Os cortes foram posteriormente lavados em água corrente e contracorados com hematoxilina de Carazzi por 2 minutos, seguindo-se nova
lavagem com água corrente para eliminar os excessos do corante,
desidratação em três banhos de álcool absoluto, diafanização em xilol e
montagem com Entelan.
A análise da positividade de cada caso e cada área tecidual para cada
marcador imunoistoquímico levou em conta a localização da marcação
reconhecida como positividade para cada antígeno. Para todos os anticorpos
foi feita a avaliação individual de cada marcador sob microscopia ótica para
cada caso e o padrão de marcação e a localização tecidual da marcação foi
tabulada em planilha específica para a análise dos dados. A quantificação das
células com positividade nuclear para ki-67 foi feita pelo índice de positividade,
que foi obtido por meio da leitura de 4 campos de grande aumento (40x) em
30
cada lâmina, sendo que a escolha da região foi determinada pela integridade
estrutural do tecido e positividade mais evidente. As células positivas e
negativas foram contadas e os resultados expressos em porcentagem de
células positivas por campo (índice de positividade).
Ao
final, as
informações clínicas,
radiográficas, macroscópicas,
histológicas e imunoistoquímicas foram tabuladas em uma planilha para análise
descritiva e comparativa entre os parâmetros e os grupos. Os dados foram
analisados no Statistical Program for Social Sciences (SPSS, versão 20) e as
diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05.
Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Estácio de Sá e aprovado com o parecer de número 650.018 (Anexos).
31
7
RESULTADOS
A análise demográfica, clínica e radiográfica dos 50 casos incluídos no
estudo (25 CP e 25 CR) mostraram que a média de idade dos pacientes do
grupo CP foi de 40,5 anos, variando dos 9 aos 67 anos de idade. Nos CR a
média de idade foi de 58,4 anos, variando de 31 aos 82 anos de idade,
havendo diferença significante entre os dois grupos (p≤ 0,0001). No grupo CP
12 casos (48%) foram diagnosticados em homens e 13 casos (52%) em
mulheres, e no grupo CR, 16 casos (64%) acometeram homens e 9 (36%)
mulheres (Tabela 2). Não houve diferença estatisticamente significativa quando
foram comparadas a presença de aumento de volume local e de sintomas entre
os grupos CP e CR (Tabela 2).
Tabela 2. Distribuição comparativa dos parâmetros clínicos e demográficos dos cistos
perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.
Parâmetros
Masculino
Cistos
Perirradiculares
12 (48%)
Cistos
Residuais
Valor de p
16 (64%)
Sexo
0,254
Feminino
13 (52%)
9 (36%)
Não
6 (43%)
11 (44%)
Aumento de
volume
0,945
Sim
8 (57%)
14 (56%)
Não
9 (60%)
19 (79%)
Sintomas
0,196
Sim
6 (40%)
5 (21%)
32
Em relação à região acometida, no grupo CP, 14 casos (56%) foram
diagnosticados na maxila anterior, 7 casos (28%) na mandíbula posterior, 2
casos (8%) na maxila posterior e 2 casos (8%) na mandíbula anterior. No grupo
CR, 12 casos (48%) foram diagnosticados na maxila anterior, 9 casos (36%) na
mandíbula posterior, 3 casos (12%) na maxila posterior e 1 caso (4%) na
mandíbula anterior. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a
distribuição anatômica das lesões nos dois grupos. O volume médio dos
espécimes recebidos no laboratório, calculado após sua análise macroscópica,
foi de 1984,5 mm3 (variando de 24 a 21000 mm3) no grupo CP e 1882,5 mm3
(variando de 108 a 12600 mm3) no grupo CR (p=0,919). Em relação ao maior
tamanho radiográfico das lesões, no grupo CP o tamanho médio foi de 26,1
mm (variando de 10 a 50 mm) e no grupo CR o tamanho médio foi de 21 mm
(variando de 10 a 45 mm) (p=0,107). No grupo CR, o intervalo de tempo médio
entre a exodontia e o diagnóstico do CR foi de 266 meses, variando de 36 a
504 meses. Quando comparados os tempos de evolução das lesões relatados
pelos pacientes, observou-se no grupo CP uma média de 21,3 meses (variando
de 4 a 60 meses) e no grupo CR uma média de 47,8 meses (variando de 1 a
204 meses) (p=0,397). A figura 1 mostra exemplos de imagens clínicas e
radiográficas dos CP e CR incluídos no estudo.
33
A
B
C
D
Figura 1. A. Presença de parúlide na mucosa alveolar vestibular na altura dos dentes 21 e 22.
B. Cisto perirradicular inflamatório apresentando-se como área radiolúcida unilocular associada
ao periápice dos dentes 21 e 22 (mesmo caso que A). C. Cisto perirradicular inflamatório de
grandes dimensões associado aos restos radiculares do dente 46. D. Cisto residual na região
do dente 43 caracterizado por área radiolúcida unilocular bem delimitada.
A análise dos parâmetros histológicos (intensidade do infiltrado
inflamatório e presença ou não de fendas de cristais de colesterol) e
imunoistoquímicos (expressão de ICAM-1 e TGFβ-1) mostraram que não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos
(Tabela 3). O índice médio de proliferação celular, medido pela expressão
imunoistoquímica de ki-67, foi de 1.25% nos CP (variação de 0% a 5.31%), em
comparação com a média de 3.51% encontrada no grupo CR (variação de 0%
a 16.3%) (p=0,017).
34
Tabela 3. Distribuição dos parâmetros histológicos e de imunoistoquímica nos cistos
perirradiculares inflamatórios e cistos residuais.
Parâmetros
Intensidade
do
infiltrado
Inflamatório
Fendas de
cristais de
colesterol
Focal / leve
Cistos
Perirradiculares
Cistos
Residuais
8 (32%)
12 (48%)
Valor de p
0,248
Moderado /
Intenso
17 (68%)
13 (52%)
Não
19 (76%)
16 (64%)
0,355
Sim
6 (24%)
9 (36%)
Focal / leve
7 (28%)
11 (44%)
ICAM-1
0,239
Moderado /
Intenso
18 (72%)
14 (56%)
Focal / leve
14 (56%)
10 (40%)
0,258
TGF-1
Moderado /
Intenso
11 (44%)
15 (60%)
As figuras 2, 3 e 4 mostram, respectivamente, imagens histológicas da
expressão de ICAM-1, TGFβ-1 e ki-67 nos componentes teciduais dos CP e
CR incluídos no estudo.
35
A
B
C
D
E
F
Figura 2. A. Expressão de ICAM-1 no epitélio e nas células inflamatórias em um cisto residual
(Imunoperoxidase, 10x). B. Detalhe do epitélio expressando ICAM-1 em um cisto residual
(Imunoperoxidase, 40x). C. Células inflamatórias e células endoteliais expressando ICAM-1 em
um cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). D. Plasmócitos expressando ICAM1 em um cisto perirradicular inflamatório (Imunoperoxidase, 40x). E. Expressão de ICAM-1 no
infiltrado inflamatório contendo macrófagos xantomatosos em um cisto residual
(Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de ICAM-1 em células gigantes multinucleadas
circundando fendas de cristais de colesterol em um cisto perirradicular inflamatório
(Imunoperoxidase, 40x).
36
A
B
C
D
E
F
Figura 3. A e B. Expressão de TGF beta 1 especialmente em fibroblastos na cápsula de tecido
conjuntivo fibroso de Cistos residuais (A e B - Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de
TGF beta 1 em fibroblastos, células endoteliais e em algumas células inflamatórias na cápsula
de tecido conjuntivo fibroso de Cistos residuais (C e D - Imunoperoxidase, 40x). E. Expressão
de TGF beta 1 em macrófagos próximos a fendas de cristais de colesterol em um Cisto residual
(Imunoperoxidase, 40x). F. Expressão de TGF beta 1 em fibroblastos e em células compatíveis
com mastócitos na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um Cisto residual (Imunoperoxidase,
40x).
37
A
B
C
D
Figura 4. A e B. Expressão de ki-67 no núcleo das células epiteliais das camadas basal e
suprabasal em dois cistos perirradiculares inflamatórios mostrando infiltrado inflamatório
discreto no tecido conjuntivo subjacente (A e B - Imunoperoxidase, 40x). C e D. Expressão de
ki-67 no núcleo das células epiteliais das camadas basal e suprabasal em dois cistos residuais,
um deles mostrando infiltrado inflamatório discreto no tecido conjuntivo subjacente (C Imunoperoxidase, 40x) e outro mostrando inflamação mais evidente associada a exocitose (D Imunoperoxidase, 40x).
38
8
DISCUSSÃO
No que se refere aos CP, em nosso estudo, a prevalência do sexo
feminino (52%) foi ligeiramente maior do que o sexo masculino (48%), estando
em acordo com outros autores (OCHSENIUS et al., 2007; PROCKT et al.,
2008), mas diferindo de outros estudos (KOSEOGLU et al., 2004; JONES et al.,
2006; MENINGAUD et al., 2006). A maior prevalência do sexo masculino
encontrada em vários trabalhos pode ser explicada pelo fato de que os homens
geralmente têm hábitos de higiene e cuidados orais mais pobres em
comparação às mulheres sendo mais suscetíveis a traumas e a cáries. De
acordo com a literatura, a região mais acometida é a maxila anterior
(LEDESMA-MONTES et al., 2000; JONES et al., 2006; OCHSENIUS et al.,
2007), em concordância com nossos resultados, que mostraram 56% dos CP
na maxila anterior. Segundo OCHSENIUS et al. (2007) o fato da maxila anterior
ser mais frequentemente afetada pode ser explicada por fatores estéticos, pois
os pacientes preservam seus dentes anteriores por mais tempo, ficando mais
suscetíveis a processos inflamatórios crônicos se não houver o tratamento
endodôntico adequado. Em relação à idade, a média encontrada para os CP foi
de 40.5 anos. Uma média parecida (37.3 anos) foi identificada no estudo de
JONES et al. (2006). No estudo de LEDESMA-MONTES et al. (2000), a
segunda e terceira década de vida foram mais prevalentes.
LEDESMA-MONTES et al. (2000) identificaram que os CR ocorreram
em mulheres com maior frequência, o que difere dos nossos resultados e de
outros estudos (BATAINEH et al., 2004; JONES et al., 2006; MENINGAUD et
al., 2006). Em relação à região mais acometida nos CR, nosso estudo mostrou
39
a maxila anterior como região mais prevalente (12 casos, 48%). JONES et al.
(2006) e OCHSENIUS et al. (2007) também identificaram que os CR foram
mais frequentemente encontrados na maxila anterior. A mandíbula foi
ligeiramente mais prevalente do que outras regiões no estudo de PROCKT et
al. (2008), mas sem localização anatômica específica determinada. O
diagnóstico dos CR foi mais prevalente em pacientes com mais de 80 anos de
idade no trabalho de PROCKT et al. (2008), enquanto que a terceira, quinta e
sexta décadas de vida foram mais frequentes nos estudos de LEDESMAMONTES et al. (2000), BATAINEH et al. (2004) e OCHSENIUS et al. (2007).
No presente estudo identificamos que uma média de 58,4 anos para o grupo
CR e de 40,5 anos no grupo CP, o que pode ser explicado pelo fato de que as
lesões císticas localizadas dentro da maxila, não causam nenhum sintoma
clínico após a extração do dente, sendo detectadas somente meses ou anos
mais tarde por causa de infecção secundária ou por tomada radiográfica
acidental.
Nossos
resultados
não
mostraram
diferença
estatisticamente
significativa entre os CP e CR com relação a expressão de ICAM-1. TAŞMAN
et al. (1999) compararam amostras de dentes extraídos por indicação
ortodôntica com dentes extraídos devido à periodontite crônica e identificaram
uma distribuição similar nos tecidos de ICAM-1 expressa tanto no controle
quanto na periodontite crônica. O estudo de SAWA et al. (1998), encontrou
resultados diferentes, pois na polpa dentária saudável, nenhum vaso reagiu ao
ICAM-1, enquanto na polpa inflamada um grande número de vasos reagiu
fortemente ao ICAM-1. Nossos resultados mostraram que, ao compararmos CP
40
e CR que apresentaram semelhante componente inflamatório, a expressão de
ICAM-1 foi semelhante sugerindo que esta molécula associa-se a presença ou
não de inflamação e não a características biológicas intrínsecas destes cistos.
ANDRADE et al. (2013) demonstraram que a expressão de TGF-β1
estava aumentada nas lesões perirradiculares com maior infiltrado inflamatório,
sendo mais comumente encontrado em granulomas, seguidos de CP e por
último CR, diferente dos resultados do presente estudo. TYLER et al. (1999)
encontraram TGF-β1 em cistos e granulomas periapicais e atribuíram a ele um
papel no processo de reparo da destruição periapical nas duas lesões. Por sua
vez, PIATTELLI et al. (2004) observaram maior expressão de TGF-β1 em
queratocistos odontogênicos do que em CP e cistos dentígeros, e associaram
esse fato ao maior potencial de crescimento dos queratocistos através da
intensa proliferação celular, que seria regulada pelo TGF-β1.
Nossos
resultados
não
mostraram
diferenças
estatisticamente
significativas entre os CP e CR com relação à expressão de TGFβ-1,
possivelmente pela presença semelhante do componente inflamatório nos
cistos estudados em ambos os grupos. Uma expressão similar de TGF-β1 em
granulomas e CP tem sido relatada em outros estudos (TYLER et al.,1999;
FUKADA et al., 2009; MARÇAL et al., 2010; SALUM et al., 2010). TGF-β1 tem
sido sugerido como importante fator para a cura periapical, pois esta citocina é
conhecida por inibir a atividade de reabsorção óssea e promover a
remodelação óssea e reparo tecidual. Neste sentido, estudos indicam que o
TGF-β1 estimula a síntese de colágeno, neovascularização, e proliferação de
fibroblastos (TYLER et al.,1999). Segundo SANTOS et al. (2007), a intensidade
41
do infiltrado inflamatório, não só está relacionada com um aumento na
quantidade de estímulos antigênicos, mas também a uma resposta exacerbada
de mecanismos de defesa do organismo, fato que pode justificar os resultados
encontrados em nossa amostra. No entanto, os resultados de ANDRADE et al.
(2013) confirmaram o possível papel de TGF-β1 na estabilização de lesões
periapicais através de sua imunossupressão e efeitos reguladores sobre a
inflamação, sendo observado uma maior imunomarcação para essa citocina
em lesões mais inflamadas.
SALUM et al. (2010), avaliando os níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e TGF-β
em CP e granulomas periapicais, observaram que os CP apresentaram
maiores níveis de IFN-γ, TNF-α e IL-4, enquanto que os granulomas
expressaram maiores níveis de TGF-β e menores de citocinas próinflamatórias. Os autores sugerem que os CP apresentaram reações
imunológicas Th1 e Th2 que se modulam reciprocamente (pois as lesões
positivas para IL-4 eram negativas para IFN-γ e TNF-α), e que os granulomas,
devido ao seu alto nível de TGF-β, consistiam em um ambiente com atividades
regulatórias, portanto com um maior potencial reparador.
Os resultados de AYOUB et al. (2011) avaliando a proliferação celular
no epitélio de revestimento de CP e cistos dentígeros demonstraram que a
expressão de ki-67 no epitélio cístico foi maior na presença de intenso infiltrado
inflamatório, sugerindo que o aumento da atividade proliferativa destes cistos
seria influenciado diretamente pela presença da inflamação. Nossos resultados
reforçam parcialmente esta possibilidade, visto que CR que apresentaram em
média a mesma intensidade de inflamação que CP apresentaram índices de
42
proliferação superiores a estes últimos. Estes dados reforçam a possibilidade
de que outros estímulos inflamatórios diferentes da inflamação pulpar tais como
superficialização do cisto por rompimento das corticais ou infecção secundária,
podem perpetuar o estímulo inflamatório nestas lesões, com potencial de
manter ou mesmo aumentar os índices de proliferação do epitélio cístico. No
estudo de MARTINS et al. (2011), o antígeno ki-67 foi detectado na camada
basal de CP e sua expressão foi significativamente mais elevada no epitélio
hiperplásico em comparação com o epitélio atrófico, similar aos achados de
SUZUKI et al. (2005). Os resultados do presente estudo sugerem que outros
fatores, a parte dos estímulos inflamatórios pulpares, devem ser estudados no
que diz respeito às características proliferativas dos CR, quando comparados
aos CP.
43
9
CONCLUSÃO
Os
resultados
do
presente
estudo
não
mostraram
diferenças
estatisticamente significativas na expressão imunoistoquímica de ICAM-1 e
TGF-β1 entre cistos perirradiculares inflamatórios e cistos residuais e o índice
de proliferação das células epiteliais (expressão de Ki-67) foi maior nos cistos
residuais em comparação com os perirradiculares inflamatórios. Estes achados
permitem supor que os estímulos inflamatórios específicos dos cistos residuais
possam modular seus mecanismos de etiopatogênese, crescimento e reparo.
44
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