Aula Citometria de Fluxo POp cd4 MS [Modo de Compatibilidade]

Procedimento
Operacional
QUANTIFICAÇÃO DAS
SUBPOPULAÇÕES
LINFOCITÁRIAS
CD4/CD8/CD3/CD45
PATRICIA VIANNA BONINI PALMA
Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto
Centro de Terapia Celular, CRH-HCFMRP-USP
Objetivo
POP CD4 - Objetivo
Identificação e enumeração de contagens absolutas e
porcentagem de células CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ em
amostras de sangue periférico humano de pacientes
portadores do vírus HIV utilizando citometria de fluxo.
POP CD4 – Aplicação
Os linfócitos, junto com outras células e moléculas, são essenciais na resposta imune do
organismo humano. Em condições fisiológicas, circulam no sangue periférico três populações
distintas de linfócitos: os linfócitos T, os linfócitos B e as células Naturais Killer (NK).
Os linfócitos T são responsáveis pela regulação da resposta imunológica e pela destruição de
células infectadas por vírus. Os linfócitos B produzem anticorpos e os linfócitos NK atuam na
destruição de células infectadas por vírus e algumas células tumorais.
É possível classificar e quantificar os linfócitos, identificando seus marcadores de superfície, ou
seja, moléculas específicas presentes na superfície dessas células.
As investigações atuais demonstram que os linfócitos T CD4+ ( Céls T auxiliadoras) são as
principais células alvo do HIV.
O fenômeno mais característico da infecção pelo HIV é a redução da quantidade de linfócitos T
CD4+.
A diminuição da população de linfócitos é o que leva à imunodeficiência e ao conseqüente
aparecimento das infecções oportunistas e dos neoplasmas característicos, por isso é
necessário determinar a quantificação exata e confiável das subpopulações linfocitárias
CD4/CD8, para que haja uma avaliação do sistema imune e no acompanhamento clínico do
indivíduo infectado, alertando, inclusive, para a possibilidade do aparecimento de doenças
oportunistas.
Princípios do Procedimento
Utiliza-se um tubo TruCount por paciente para a marcação com o reagente
Multitest (CD3/CD4/CD8/CD45). Quando a amostra de sangue é
adicionada ao reagente, anticorpos monoclonais marcados com
fluorocromos ligam-se especificamente em antígenos de superfície das
células. O botão (pellet) liofilizado do tubo truCount se dissolve soltando
um número conhecido de microesferas fluorescentes.
A solução de Facslysing é utilizada para a lise dos eritrócitos antes da
amostra ser adquirida.
Durante a análise o número absoluto de células CD3+/CD4+/CD8+/CD45+
da amostra poderá ser determinado pela divisão do número de eventos
celulares positivos pelo número de microesferas fluorescentes, então pela
multiplicação da concentração das microesferas
Reagentes
O Kit Multitest utilizado para quantificação das subpopulações linfocitárias
CD4+/CD8+ contém o reagente CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ e tubos
trucount suficientes para 50 testes. O reagente contém 0,5 ml de PBS com
gelatina bovina e 0,1% de azída sódica.
Os tubos Trucount contêm um botão liofilizado de microesferas de 4,2 µm
fluorescentes
O CD3 é o marcador exclusivo da linhagem T. O CD4 é o marcador da
subpopulação de linfócitos T auxiliares, mas também está presente em
baixa expressão nos monócitos e nos macrófagos e o CD8 é o marcador
da subpopulação de linfócitos T citotóxicos, mas também está presente em
baixa expressão nas células Natural Killer (NK).O CD45 é o marcador de
pan de leucócitos.
Precauções
Para uso in vitro. Não use para procedimentos terapêuticos.
Adição de um volume preciso de sangue é crítico. As pipetas deverão estar calibradas
para liberar a amostra exata de 50µl. Utilizar a técnica de pipetação reversa.
A contagem das microesferas varia de acordo com o lote dos tubos Trucount. É
•necessário
o uso do número de microesferas demonstrado no lote dos tubos Trucount
para o calculo correto da contagem absoluta de CD3+/CD4+/CD8+ Não misture os lotes.
Não congele os reagentes ou exponha-os à luz direta durante a estocagem ou
•incubação
com as células. Guardar os tubos de reagentes a seco.
•Não use o reagente se observar mudanças na aparência. Precipitação, descoloração
indica instabilidade ou deterioração.
Os reagentes contêm azída sódica como preservativo, contudo, cuidados deverão ser
•tomados
para evitar contaminações microbianas, as quais deverão causar resultados
errôneos.
Todo material biológico é considerado contaminado. Nunca pipetar com a boca. Usar
•luvas
e vestimentas apropriadas (EPI).
•A solução de Facslysing é utilizada e contém dietileno glycol e formoldeído.
•
•
ESTOCAGEM E MANUSEIO
• Estocar o anticorpo verticalmente entre 2º e 8ºC. Não usar após o vencimento.
Os tubos Trucount devem ser mantidos em sua embalagem original prateada de 2º à
•25ºC.
Para evitar uma condensação potencial, abrir a embalagem depois de ter alcançado
a temperatura ambiente e cuidado para fechar a embalagem imediatamente após ter
removido o tubo.
a cor da sílica, se o dissecante mudar do azul para a cor lavanda, descartar
•osExaminar
tubos.
Usar os tubos dentro de uma hora após removê-los
•embalagem
aberta, os tubos são estáveis por 2 meses.
• Não use após o vencimento indicado na embalagem.
da embalagem. Uma vez a
EQUIPAMENTO
• O reagente MULTITEST é desenvolvido para uso em um citometro de fluxo equipado
com computador e software apropriado. O citometro deverá estar equipado com um laser
488nm e 635nm e deverá ser capaz de detectar a dispersão da luz (frontal e lateral e ou
ortogonal) e fluorescência de quatro cores dos seguintes comprimentos de ondas: 515545nm (FL1), 562-607nm (FL2) , maior que 650nm (FL3 )e 650nm (FL4)
A BDIS recomenda o uso do citometro de fluxo Becton Dickinson tais como o
•Facscalibur,
equipados com o software Multiset, para aquisição e análise dos dados
automaticamente. Usar as microesferas calibrite 3 e APC beads e o software Facscomp
versão 2.0 ou maior, para colocar voltagens nos tubos fotomultiplicadores (PMTS) ,
compensação das fluorescências e para checar a sensitividade do instrumento. A escolha
da opção Lyse/no wash.
CONDIÇÕES GERAIS
Cada teste requer 50µl de amostra. Estocar o sangue com anticoagulante à temperatura
ambiente (20º à 25ºC) até a marcação. Corar amostras até 48 horas após a coleta.
Condições de Interferência
•Não usar amostras fixadas e estocadas.
• Amostra refrigerada antes da coloração poderá obter resultados aberrantes.
• Amostras hemolisadas ou coaguladas deverão ser rejeitadas
. PROCEDIMENTO
– MARCAÇÃO DAS CÉLULAS
Para cada amostra de doador, marcar 1 tubo Trucount. Nota: Antes do uso, verificar se o
•botão
de microesferas esta intacta e dentro da rede de metal. Se não estiver nas
condições ideais, descartar o tubo e pegar outro.
Pipetar 20ul do reagente de CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ dentro do tubo. Pipetar os
•reagentes
na parede do tubo e não tocar no botão de microesferas
Pipetar 50ul da amostra homogeneizada dentro de cada tubo usando uma pipeta
•calibrada.
•Utilizar a pipetação reversa.
•Pipetar na parede do tubo e usar para cada tubo uma ponteira nova.
•Agitar gentilmente o tubo e incubar por 15minutos no escuro à temperatura ambiente.
• Adicionar 450ul de solução Facslysing em cada tubo
•. Homogeneizar gentilmente e incubar por 15 minutos à TA.
.
OTIM IZAÇÃO DA AMOSTRA
os seguintes gráficos:
•Gerar
•FL3/SSC
•FL1/FL2
•FL1/SSC
•FL2/FL4
•Para começar a aquisição, utilizar o procedimento de calibração do citometro Lyse/NO
wash.
•Homogeneizar o tubo contendo a amostra corada com CD3+/CD4+/CD8+/CD45+ e
colocá-la no citometro.
•O software Multiset fará os ajustes automaticamente.
.
.
AQUISIÇÃO E ANÁLISE
Coletar de 10.000 a 20000 eventos totais, sendo necessários pelo menos 2000 células
•CD45+
(células CD45+ de baixa granularidade SSC.).
•Leitura máxima de 100000 eventos,
Se a amostra correr por mais que 5 minutos monitorar atentamente para o tubo não
•secar.
•Quando a aquisição da amostra já estiver completa, remova o tubo do citometro.
OBS: A BD recomenda guardar todos os dados em arquivos.
A analise é realizada automaticamente pelo software Multiset, permitindo
•apenas
que o operador realize acertos nas janelas (Gates).
.
.
CALCULOS
Cálculo para contagem absoluta
Utilizar a seguinte equação para calcular a contagem absoluta de células CD4+/CD8+
células CD4+
nº microesferas
X
Microesferas testes* = Células CD4+ ou Células CD8+
volume do teste
O número de células CD4+/CD8+ e microesferas são demonstrados na janela de
estatísticas.
.
Validação dos lots de tubos trucount
• Para qualidade é necessário fazer a validação dos
diferentes lots de tubos trucount .
• Escolhemos 10 amostras de sangue periferico de
pacientes que chegam na rotina com CD4 entre 200400, 401 -600 e acima de 600 e analisamos
simultaneamente com 9 tubos de trucount do novo lots
e comparamos os valores.
• Analisamos o desvio padrão e aceitamos a variação
de 5 a 10%, tanto para cima como para baixo.
Protocolo de Validação para os Exames de quantificação de
células CD4/CD8/CD3/CD45
Para análise da Precisão – foi descrito o seguinte:
• A Precisão de cada amostra será confirmada por medições
repetidas de amostras conhecidas em momentos diferentes.
• As amostras de sangue periférico de pacientes portadores do
virus HIV serão marcadas conforme o procedimento
operacional descrito
• As amostras serão analisadas em tempos diferentes, sendo
tempo Zero (momento que chegada ao lab),6h,24h,30h e
48hrs, isso para sangue total e para sangue marcado.
• Serão comparados os valores para CD4/CD8/CD3 e CD45
tanto para porcentagem como para número absoluto, em
sangue marcado e sangue total
Protocolo de Validação para os Exames de quantificação de
células CD4/CD8/CD3/CD45
1) Critérios de aceitação:– foi descrito o seguinte:
• Serão aceitos valores iguais ou até 10% de variação
abaixo ou acima em relação ao tempo zero.
Validação dos lots de tubos trucount
LABORATÓRIO CITOMETRIA DE FLUXO - Validação / Setembro 2012 Lotes 11527 - 11529
LOTE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CD4
CV CD4
11527
503
11529
594
11527
650
11529
664
11527
522
11529
570
11527
1043
11529
1074
11527
526
11529
545
11527
701
11529
872
11527
477
11529
483
11527
503
11529
464
11527
992
11529
990
11527
682
11529
689
% CD4
CV % CD4
27,00
-18,09
28,00
27,00
-3,70
27,00
3,57
33,00
0,00
16,00
8,33
24,00
0,00
25,00
7,69
21,00
3,85
47,00
0,00
32,00
-11,67
2066
1785
614
832
2,08
860
-8,91
1062
-1,96
41
40
61
-40,22
48
2,38
32
-2,56
38
-3,39
41
-4,35
50
1460
2541
2721
2799
-3,23
1130
-6,65
1331
-10,77
1850
-8,06
1780
-1,27
69
78
80
-36,87
75
2,82
59
0,00
61
-1,27
88
0,00
83
2116
-9,64
3241
-10,35
3392
-5,93
3726
-35,94
1861
-1,72
1911
-2,69
2375
-1,67
2187
7,92
2049
0,00
84
-0,68
-4,53
2741
88
-2,32
2422
3202
60
6,60
-13,42
2937
58
-4,73
2130
1930
75
1768
0,00
80
CV CD45
2317
79
1808
-2,50
-1,19
78
1425
-2,70
85
CD45
1878
71
1079
50
-0,85
-4,89
2045
40
-5,39
1930
CV %CD3
79
2518
37
5,13
-15,81
2294
31
-7,53
1817
%CD3
84
1369
46
1053
0,00
52
CV CD3
1840
59
816
32,00
-1,03
1282
-1,89
39
877
48,00
0,20
-6,59
571
21,00
7,75
857
54
CD3
1569
42
1273
26,00
-1,26
-6,55
1897
26,00
-24,39
1252
CV % CD8
51
1148
16,00
-3,61
-15,98
804
36,00
-2,97
1154
%CD8
53
1175
27,00
-9,20
CV CD8
995
28,00
-2,15
CD8
2101
-2,54
2104
1,19
2140
-1,71
Validação dos Pop- Sangue total - Hemocentro
Tempo
CD4
0
1
CD3
CV CD3
1679
%CD3
CV %CD3
82
CD45
CV CD45
2051
36
5,56
821
-8,89
45
2,22
1539
-9,10
84
2,38
1828
-12,20
33
-3,03
828
-7,97
45
2,22
1509
-11,27
81
-1,23
1859
-10,33
30 horas
680
-3,53
32
-6,25
958
6,68
45
2,22
1742
3,62
83
1,20
2109
2,75
48 horas
618
-13,92
33
-3,03
1089
17,91
46
4,35
1869
10,17
82
0,00
1951
-5,13
257
17
859
56
1123
73
1547
6 horas
261
1,53
17
0,00
819
-4,88
58
3,45
1052
-6,75
75
2,67
1403
24 horas
236
-8,90
15
-13,33
912
5,81
58
3,45
1162
3,36
74
1,35
1575
1,78
30 horas
235
-9,36
17
0,00
860
0,12
57
1,75
1153
2,60
75
2,67
1539
-0,52
231
-11,26
15
-13,33
977
12,08
57
1,75
1326
15,31
74
1,35
1628
4,98
48 horas
724
19
2144
55
2995
77
-10,26
3885
6 horas
754
3,98
19
0,00
2009
-6,72
58
5,17
2742
-9,23
79
2,53
3483
24 horas
733
1,23
18
-5,56
2299
6,74
57
3,51
3142
4,68
78
1,28
4022
30 horas
796
9,05
19
0,00
2415
11,22
57
3,51
3352
10,65
79
2,53
4237
8,31
48 horas
741
2,29
18
-5,56
2333
8,10
58
5,17
3192
6,17
80
3,75
4011
3,14
125
12
902
59
783
77
3,41
1018
6 horas
133
6,02
13
7,69
879
-2,62
62
4,84
801
2,25
79
2,53
1018
0,00
24 horas
145
13,79
13
7,69
889
-1,46
59
0,00
796
1,63
79
2,53
1006
-1,19
30 horas
131
4,58
13
7,69
852
-5,87
63
6,35
849
7,77
83
7,23
1029
1,07
48 horas
144
13,19
14
14,29
650
-38,77
63
6,35
836
6,34
81
4,94
1028
0,97
915
28
1453
44
2495
76
3304
6 horas
992
7,76
29
3,45
1559
6,80
43
-2,33
2693
7,35
75
-1,33
3588
7,92
24 horas
912
-0,33
29
3,45
1403
-3,56
44
0,00
2479
-0,65
78
2,56
3194
-3,44
30 horas
995
8,04
31
9,68
1435
-1,25
42
-4,76
2608
4,33
77
1,30
3379
2,22
48 horas
831
-10,11
28
0,00
1324
-9,74
45
2,22
2266
-10,11
76
0,00
2964
-11,47
1054
35
934
31
2123
71
2990
6 horas
979
-7,66
36
2,78
891
-4,83
33
6,06
1922
-10,46
71
0,00
2693
-11,03
24 horas
1046
-0,76
36
2,78
947
1,37
33
6,06
2119
-0,19
73
2,74
2903
-3,00
30 horas
1114
5,39
37
5,41
890
-4,94
30
-3,33
2146
1,07
72
1,39
2974
-0,54
48 horas
1118
5,72
35
0,00
1067
12,46
34
8,82
2329
8,84
73
2,74
3171
5,71
1703
38
1539
35
3338
75
4441
6 horas
1588
-7,24
37
-2,70
1581
2,66
37
5,41
3231
-3,31
76
1,32
4249
24 horas
1568
-8,61
39
2,56
1402
-9,77
34
-2,94
3041
-9,77
75
0,00
4064
-9,28
30 horas
1602
-6,30
38
0,00
1468
-4,84
35
0,00
3162
-5,57
75
0,00
4204
-5,64
1586
-7,38
39
2,56
1393
-10,48
34
-2,94
3074
-8,59
75
0,00
4074
-9,01
48 horas
0
8
CV % CD8
44
-6,83
0
7
%CD8
-8,14
0
6
CV CD8
894
659
0
5
CD8
651
0
4
CV % CD4
34
24 horas
0
3
% CD4
6 horas
0
2
CVCD4
704
731
39
455
24
1229
66
-4,52
1869
6 horas
781
6,40
39
0,00
528
13,83
25
4,00
1380
10,94
66
0,00
2078
10,06
24 horas
778
6,04
41
4,88
491
7,33
25
4,00
1346
8,69
68
2,94
1968
5,03
30 horas
775
5,68
41
4,88
438
-3,88
23
-4,35
1276
3,68
68
2,94
1888
1,01
48 horas
853
14,30
42
7,14
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