Atividade apoptótica sobre osteoclastos, antimicrobiana e
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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA PAULO JOSÉ LIMA JUIZ ATIVIDADE APOPTÓTICA SOBRE OSTEOCLASTOS, ANTIMICROBIANA E ANTITUMORAL DE PLANTAS MEDICINAIS CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO Feira de Santana, BA 2013 2 PAULO JOSÉ LIMA JUIZ ATIVIDADE APOPTÓTICA SOBRE OSTEOCLASTOS, ANTIMICROBIANA E ANTITUMORAL DE PLANTAS MEDICINAIS CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro Co-orientador: Profa. Dra. Angélica Maria Lucchese Feira de Santana, BA 2013 3 TERMO DE APROVAÇÃO PAULO JOSÉ LIMA JUIZ ATIVIDADE APOPTÓTICA SOBRE OSTEOCLASTOS, ANTIMICROBIANA E ANTITUMORAL DE PLANTAS MEDICINAIS CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO Tese aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Biotecnologia, Universidade Estadual de Feira de Santana, pela seguinte banca examinadora: Profa. Dra Ana Paula Trovatti Uetanabaro Doutora em Ciências de alimentos, Universidade de Campinas (UNICAMP) Universidade Estadual de Santa Cruz Prof. Dr. George Mariane Soares Santana Doutor em Patologia, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) Universidade Federal do Recôncavo da Bahia Prof. Dr. Lucas Miranda Marques Doutor em Ciências Biológicas, Universidade de São Paulo (USP) Universidade Federal da Bahia Profa Dra. Silvia Lima Costa Doutora em Neurociências, Université de Paris XII (Paris-Val-de-Marne) Universidade Federal da Bahia Profa Dra Soraya Castro Trindade Doutora em Imunologia, Universidade Federal da Bahia (UFBA) Universidade Estadual de Feira de Santana Feira de Santana, 19 de junho de 2013 4 A Ofélia e José, pais amados, meus primeiros mestres. Reinaldo, companheiro de vida. 5 AGRADECIMENTOS A Deus, por ter colocado em meu caminho cada um daqueles que neste momento agradeço. À minha família, em especial aos meus pais, que tornaram leves as dificuldades encontradas. A Reinaldo. Que palavras usar neste momento ? Palavras não expressariam a tamanha gratidão que sinto. Obrigado pelo incentivo, por compreender a minha ausência, pelo companheirismo, pelo carinho dado naqueles momentos mais difíceis, por ter me reapresentado o mundo acadêmico e acendido em mim a vocação para pesquisa científica. À minhas orientadoras Ana Paula Uetanabaro e Angélica Lucchese, sempre muito receptivas e atenciosas, não mediram esforços para o meu crescimento profissional. Aos colaboradores Dra. Edna Peralta, Dra. Serly Santiago, Dra. Franceli Silva, Dr. Mario Júlio Ávila Campos, Dr. Roberto Gambari, Dra. Roberta Piva, Dra. Letizia Penolazi, Dra. Eleonora Brognara, Dra Luiza Fonseca que contribuíram imensamente para conclusão deste trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por ter me concedido bolsa de estudo na Universidade de Ferrara – Itália. Além do crescimento como profissional, estudar no exterior foi uma experiência enriquecedora e gratificante, da maior importância para o meu crescimento como ser humano. Ao secretário Helton, pela competência com que desenvolve o seu trabalho e contribuições para o Programa de Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana. Aos colegas de curso, e por que não dizer de caminhada nesta jornada científica. Vocês foram o braço lúdico deste doutorado. Aos funcionários da UFRB, LAPEM, LAPRON, Laboratório de Anaeróbios da USP e Laboratório de Bioquímica e Biologia molecular da UNIFE. Tão importante quanto o trabalho de ponta, está aquele dos bastidores. A vocês meu muito obrigado! 6 “A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê. ” Arthur Schopenhauer 7 RESUMO A doença periodontal é uma patologia de etiologia multifatorial, onde a resposta imune ao desafio microbiano resulta em ativação de osteoclastos e reabsorção do osso alveolar, culminando com a perda do elemento dental. Com o objetivo de estudar a atividade antimicrobiana e controle da ativação de osteoclastos, compostos extraídos de plantas medicinais (Ocimum americanum L., Ocimum basilicum L., Mentha x villosa Huds, Chenopodium ambrosioides L., Lippia alba (Mill) N.E.Br.) cultivadas no Recôncavo da Bahia foram estudados neste trabalho. A atividade antimicrobiana frente aos microorganimsos Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida CCMB 261, Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina CCMB 262, Staphylococcus aureus resistente à novobiocina CCMB 263, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Bacteroides fragilis (ATCC 25285) foi avaliada por meio da determinação da concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima segundo metodologia proposta pelo CLSI, com modificações. As concentrações de trabalho utilizadas para os ensaios com osteoclastos foram determinadas por meio de estudos prévios de atividade antiproliferativa frente as linhagens tumorais K562 (leucemia), MCF-7 e MDA-231 (câncer de mama). A avaliação da apoptose em osteoclastos foi feita pelo teste TUNEL e por imunocitoquímica para receptor Fas. Os resultados mostraram que os óleos essenciais das plantas estudadas foram mais efetivos em inibir o crescimento dos microorganismos que os extratos metanólicos, sendo as maiores concentrações inibitórias mínimas (CIM) registradas para bactéria E. coli. Entre os periodontopatógenos, as menores CIM foram registradas para bactéria P.gingivalis e as maiores para A. actinomycetemcomitans. Os óleos essenciais do gênero Ocimum não foram tóxicos para células humanas e foram capazes de inibir o crescimento de P.gingivalis e F.nucleatum, porém não apresentaram atividade antiosteoclástica. Os extratos metanólicos extraídos das plantas do gênero Ocimum, na concentração de 300 µg.mL-1, foram capazes de induzir apoptose em 100% dos osteoclastos tratados. Os compostos atóxicos limoneno e citral na concentração de 5 µg.mL-1 induziram apoptose em respectivamente, 80% e 100% de osteoclastos. Na concentração de 50 µg.mL-1, os compostos citral, limoneno, carvona, linalol foram capazes de induzir apoptose em osteoclastos. Este trabalho também mostrou que os compostos extraídos das plantas medicinais estudadas apresentaram atividade antiproliferativa, sendo o composto citral mais ativo frente a linhagem K562 (IC50 8,61 ± 1,29 µg.mL-1) e MDA-231 (IC50 41,98 ± 7,45 µg.mL-1) e o composto linalol mais efetivo frente a linhagem MCF-7 (IC50 18,86 ± 1,32 µg.mL-1). Os compostos testados não foram capazes de induzir diferenciação eritróide em células K562, sendo os extratos metanólicos das plantas do gênero Ocimum aqueles que mostraram as melhores atividades antiproliferativas contra a linhagem K562. As plantas medicinais estudadas mostraram potencial biotecnológico para uso em odontologia, no entanto as concentrações dos compostos extraídos das plantas M. villosa e C. ambrosioides, foram consideradas tóxicas, portanto para estas plantas estudos em menores concentrações poderão revelar atividades biológicas promissoras. Ainda, ensaios in vivo são necessários para comprovar as atividades biológicas apresentadas neste trabalho. Palavras-chave: extratos, óleo essencial, osteoclasto, periodontopatógenos, plantas medicinais. 8 ABSTRACT Periodontal disease is a multifactorial disease, where the immune response to microbial challenge results in activation of osteoclasts and alveolar bone resorption, resulting in the loss of the dental element. Aiming to study the antimicrobial activity and control of activation of osteoclasts, compounds extracted from medicinal plants grown in the Reconcavo of Bahia (Ocimum americanum L., Ocimum basilicum L., Mentha x villosa, Chenopodium ambrosioides L., Lippia alba (Mill) N.E.Br.) were studied in this work. To test the antimicrobial activity against Escherichia coli sensitive to trimethoprim and resistant to sulfonamid CCMB 261, Staphylococcus aureus resistant to streptomycin and dihydrostreptomycin CCMB 262, Staphylococcus aureus resistant to novobiocin CCMB 263, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Bacteroides fragilis (ATCC 25285), minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration were determined according to the methodology proposed by CLSI, with modifications. Working concentrations for apoptosis assays were determined through previous studies of antiproliferative activity on K562 (leukemia), MCF-7 and MDA-231 (breast cancer) tumor cell lines. TUNEL methodology and immunocytochemistry to Fas receptor were used to evaluate apoptosis in osteoclasts. The results showed that the essential oils of plants studied were more effective in inhibiting the growth of microorganisms than the methanolic extracts. Higher minimum inhibitory concentrations (MIC) were shown to E. coli. Among the periodontal pathogens, P. gingivalis was the most sensitive to the action of the compounds and A. actinomycetemcomitans was the most resistant. The essential oils of the genus Ocimum were not toxic to normal human cells and were able to inhibit the growth of P. gingivalis and F.nucleatum, but did not show any activity in osteoclasts. The methanolic extracts derived from plants of the genus Ocimum were able to induce apoptosis in 100% of treated osteoclasts in a concentration of 300 μg.mL-1. The compounds limonene and citral at a concentration of 5 μg.mL-1 were able to induce apoptosis in, respectively, 80% and 100% of osteoclasts. At the concentration of 50 μg.mL-1, compounds citral, limonene, carvone, linalool were able to induce apoptosis in osteoclasts. This work also showed that compounds extracted from medicinal plants studied showed antiproliferative activity; citral was active against K562 cells (IC50 8.61 ± 1.29 μg.mL-1) and MDA-231 (IC50 41.98 ± 7.45 μg.mL-1) and linalool was most effective against MCF-7 lineage (IC50 18.86 ± 1.32 μg.mL-1). Compounds tested were not able to induce erythroid differentiation in K562 cells, and methanol extracts of genus Ocimum plants showed the best antiproliferative activity against K562 cells. Medicinal plants studied showed biotechnological potential for use in dentistry, although studied concentrations of M. villosa and C. ambrosioides were considered toxic, so that lower concentrations could show promising biological activities. Besides, in vivo assays are needed to confirm the activities of the compounds studied. Keywords: essential oil, extract, medicinal plants, osteoclasts, periodontopathogens 9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATCC American Type Culture Collection BHI Infusão cérebro curacao CAPE Ácido caféico fenetil éster CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CBM Concentração bactericida mínima CCMB Coleção de cultura de micro-organismo da Bahia CCS Centro de Ciências da Saúde CDT Toxina distensora citoletal c-FLIP Proteína inibidora de FLICE CG/EM Cromatografia gasosa / Espectrometria de massas CIM Concetração inibitória mínima CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute CO2 Dióxido de carbono DC-STAMP Proteína transmembrana específica de células dendríticas DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimetil sulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico DO Densidade óptica EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária ER Receptor para estrógeno FADD Adaptador para domínio de morte presente em Fas FAK Quinase de adesão focal FBS Soro fetal bovino FCS Soro fetal de bezerro HACEK Haemophilus Cardiobacterium spp., Aggregatibacter actinomycetemcomitans, hominis, Eikenella corrodens, Kingella spp. HRP Peroxidase Horseradish HSV Herpes vírus HUEFS Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana IAP Proteína inibidora de apoptose IC50 Concentração inibitória 50 10 IFNγ Interferon gama IkB Inibidor de NFkB IL Interleucina LAPEM Laboratório de Pesquisa em Microbiologia LPS Lipopolissacarídeo LTx Leucotoxina MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno MCS-F Fator estimulante de colônias para macrófagos MIP Proteína inflamatória de macrófagos MMP Metaloproteinase de matriz MUC2 Mucina 2 NAIP Proteína inibidora de apoptose neuronal NFATc1 Fator nuclear ativado Toll c1 NFkB Fator nuclear kappa B OMS Organização Mundial da Saúde OMV Vesículas de membrana externa OPG Osteoprotegerina PAL Lipoproteína associada a peptideoglicano PBMC Células mononucleares de sangue periférico PGE2 Prostaglandina E2 PI3K Quinase de fosfatidil inositol 3 PTEN Fosfatase homóloga deletada no cromossomo 10 PTH Paratormônio RANKL Receptor ativador de ligante do fator nuclear Kappa B RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro RPMI Roswell Park Memorial Institute SOFAT Fator secretado para osteoclastogênese de células T ativadas SPSS Programa estatístico para ciências sociais TNF Fator de necrose tumoral TNFR Receptor de fator de necrose tumoral TRAIL Ligante indutor de apoptose relacionado a TNF TRAP Fosfatase resistente ao tartarato TUNEL Transferase desoxinucleotidil terminal mediada por marcação dUTP UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana. 11 UESC Universidade de Santa Cruz UFC Unidade formadora de colônia UFRB Universidade Federal do Recôncavo da Bahia USP Universidade de São Paulo XIAP Inibidor de proteína apoptótica ligada ao X 12 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Anatomia do periodonto 19 Figura 2. Representação clínica e esquemática da evolução da doença periodontal 26 Figura 3. Estrutura de um osteoclasto 28 Figura 4. Mecanismos de ativação do osteoclasto 29 Artigo I: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE Lippia alba (Mill) N.E.Br. Figura 1. Porcentagem de células viáveis após exposição ao óleo essencial de folhas 52 -1 e flores de Lippia alba nas concentrações de 5, 50 e 500 µg.mL Figura 2. Porcentagem de células viáveis após exposição aos compostos citral, 53 limoneno e carvona presentes no óleo essencial de Lippia alba nas concentrações de 5, 50 e 300 µg.mL-1 Figura 3. Porcentagem de células viáveis após exposição ao extrato metanólico de 53 -1 Lippia alba nas concentrações de 5, 50, 300 e 500 µg.mL Figura 4. Atividade apoptótica do composto citral nas concentrações 5 µg.mL-1 e 54 50 µg.mL-1, sobre cultura de osteoclastos humanos Figura 5. Atividade apoptótica do composto limoneno nas concentrações 5 µg.mL-1, 55 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos Figura 6. Atividade apoptótica do composto carvona nas concentrações 5 µg.mL-1, -1 56 -1 50 µg.mL e 300 µg.mL sobre cultura de osteoclastos humanos Artigo II: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE PLANTAS DO GÊNERO Ocimum Figura 1. Porcentagem de células viáveis após exposição ao óleo essencial de folhas 78 e flores de Ocimum americanum nas concentrações de 5, 50 e 500 µg.mL-1 Figura 2. Porcentagem de células viáveis após exposição ao óleo essencial de folhas e flores de Ocimum basilicum nas concentrações de 5, 50 e 500 µg.mL-1 79 13 Figura 3. Porcentagem de células viáveis após exposição aos compostos linalol, 79 cariofileno e metil cinamato presentes no óleo essencial das plantas do gênero Ocimum nas concentrações de 5, 50 e 300 µg.mL-1 Figura 4. Porcentagem de células viáveis após exposição aos extratos metanólicos 80 das plantas do gênero Ocimum nas concentrações de 5, 50, 300 e 500 µg.mL-1 Figura 5. Atividade apoptótica do composto linalol nas concentrações 5 µg.mL-1, 81 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos Figura 6. Atividade apoptótica do extrato metanólico de Ocimum americanum L. 82 nas concentrações 10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos Figura 7. Atividade apoptótica do extrato metanólico de Ocimum basilicum nas 83 concentrações 10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos Figura 8. A. Cultura de PBMC após 24 horas de indução com M-CSF e RANKL. B. 84 Cultura de PBMC após 5 dias de indução com M-CSF e RANKL na presença dos compostos. C. Cultura de PBMC após 15 dias de indução com M-CSF e RANKL na presença dos compostos. Artigo III: ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS E CITOTÓXICA DAS PLANTAS Mentha x villosa Huds e Chenopodium ambrosioides L. Figura 1. Porcentagem de células viáveis após exposição aos extratos metanólicos 107 -1 de M. villosa e C. ambrosioides nas concentrações de 5, 50, 300 e 500 µg.mL Figura 2. Porcentagem de células viáveis após exposição aos óleos essenciais de M. 108 villosa e C. ambrosioides nas concentrações de 5, 50, 500 µg.mL-1 Artigo IV: ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE PLANTAS MEDICINAIS CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO FRENTE AS LINHAGENS CELULARES K562, MCF-7 e MDA-231 Figura 1 . Teste de indução de diferenciação eritróide em linhagem K562 144 14 LISTA DE TABELAS Artigo I: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE Lippia alba (Mill) N.E.Br. Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima 51 -1 (CBM) dadas em mg.mL do óleo essencial e extrato metanólico de Lippia alba frente a E. coli e S. aureus. Tabela 2. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima 51 (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Lippia alba frente a micro-organismos anaeróbios estritos. Tabela 3. Análise da composição química do óleo extraído da planta Lippia alba. 52 ArtigoII: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE PLANTAS DO GÊNERO Ocimum Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima -1 (CBM) dadas em mg.mL 76 do óleo essencial e extrato metanólico de Ocimum americanum e Ocimum basilicum frente a E. coli e S.aureus. Tabela 2. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima 76 (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Ocimum americanum e Ocimum basilicum frente a micro-organismos anaeróbios estritos. Tabela 3. Análise da composição química do óleo essencial extraído da planta 77 Ocimum americanum. Tabela 4. Análise da composição química do óleo essencial extraído da planta 77 Ocimum basilicum. Artigo III: ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS E CITOTÓXICA DAS PLANTAS Mentha x villosa Huds e Chenopodium ambrosioides L. Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima 105 (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Mentha x villosa e Chenopodium ambrosioides Tabela 2. Análise da composição química do óleo extraído da planta Mentha x villosa. 106 15 Tabela 3. Análise da composição química do óleo extraído da planta C. ambrosioides. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA CULTIVADAS NO RECÔNCAVO DE BAIANO PLANTAS FRENTE AS 107 MEDICINAIS LINHAGENS CELULARES K562, MCF-7 e MDA-231. Tabela 1. Atividade antiproliferativa dos compostos sobre linhagens de células tumorais expressas em média da IC50 ± desvio padrão. 145 16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL 18 2 REVISÃO DE LITERATURA 19 2.1 PERIODONTOPATÓGENOS P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans E F. 20 nucleatum E SUA PARTICIPAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA PERIODONTAL 2.2 DOENÇA PERIODONTAL: PATOGÊNESE E PARTICIPAÇÃO DOS 25 RESISTÊNCIA DOS PERIODONTOPATÓGENOS AOS ANTIMICROBIANOS: 30 OSTEOCLASTOS NA REABSORÇÃO ÓSSEA 2.3 UM PROBLEMA DE SAÚDE PÚBLICA 2.4 USO DE PLANTAS MEDICINAIS COMO COADJUVANTE NO 32 TRATAMENTO DA DOENÇA PERIODONTAL 3 OBJETIVOS 40 3.1 OBJETIVO GERAL 40 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 40 4 DESENHO DO ESTUDO 41 5 PRODUTOS DA TESE 42 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E 43 APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE Lippia alba (Mill) N.E.Br. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E 67 APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE PLANTAS DO GÊNERO Ocimum. ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, APOPTÓTICA EM 98 OSTEOCLASTOS E CITOTÓXICA DAS PLANTAS Mentha x villosa Huds e Chenopodium ambrosioides L. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE PLANTAS MEDICINAIS 139 17 CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO FRENTE AS LINHAGENS CELULARES K562, MCF-7 e MDA-231 6 CONCLUSÃO GERAL 117 REFERÊNCIAS 119 APÊNDICE A – Registro fotográfico do Horto de plantas medicinais do CCS- 133 UFRB e composição química do solo feita pela EMBRAPA. APÊNDICE B – Esquemas e registros fotográficos dos ensaios de atividade 134 antimicrobiana para aeróbios facultativos (E. coli e S. aureus). APÊNDICE C - Registros fotográficos dos ensaios de atividade antimicrobiana 135 para anaeróbios estritos (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, F. nucleatum e B. fragilis). APÊNDICE D – Registros fotográficos das exsicatas depositadas no HUEFS. 136 APÊNDICE E – Registros fotográficos dos ensaios com osteoclastos 137 APÊNDICE F – ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE PLANTAS 139 MEDICINAIS CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO FRENTE AS LINHAGENS CELULARES K562, MCF-7 e MDA-231 18 1 INTRODUÇÃO GERAL Dentre as patologias mais comuns na cavidade bucal encontra-se a doença periodontal. È uma infecção predominantemente polimicrobiana, cuja principal consequência é a perda dentária, acompanhada de problemas estéticos, fonéticos, mastigatórios, com relevante comprometimento psicossocial (LINDHE, 1999). Existem evidências que relacionam as doenças periodontais como possíveis fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (SHOJI et al., 2011), acidente vascular cerebral (WU et al., 2000), infecções pulmonares (MACEDO et al., 2010), nascimento de bebês com baixo peso (CRUZ et al., 2005; ERCAN et al., 2013), contribuindo também para o controle glicêmico inadequado em diabéticos (TUNES, 2006), o que torna a doença periodontal um importante problema de saúde pública. Em relação à epidemiologia da doença periodontal no Brasil, a porcentagem de pessoas com algum problema periodontal nas faixas etárias de 15 a 19, 35 a 44 e 65 a 74 anos de idade, no ano de 2003, era respectivamente 53,8%, 78,1% e 92,1% (BRASIL, 2008). Os resultados do Projeto Saúde Bucal do Brasil 2010 indicaram que o percentual de indivíduos com algum problema periodontal foi de 37% para a idade de 12 anos, 49,1% para a faixa de 15 a 19 anos, 82,2% para adultos de 35 a 44 anos e 98,2% para idosos de 65 a 74 anos (BRASIL, 2011). Analisando os resultados dos levantamentos realizados em 2003 e 2010, percebe-se a necessidade de políticas públicas voltadas para melhoria na condição de saúde periodontal da população brasileira. O procedimento clínico mais usado para tratar a doença periodontal e/ou limitar os danos causados pela destruição óssea alveolar é a raspagem e alisamento radicular, associado ao uso de antimicrobianos, porém pesquisas relatam resistência dos periodontopatógenos aos antibióticos. Embora com resultados comprovados, o antisséptico a base de gluconato de clorexidina, largamente utilizado para controle de crescimento do biofilme dental, apresenta efeitos adversos que comprometem o seu uso por períodos prolongados. O objetivo deste estudo foi estudar a atividade antimicrobiana de plantas medicinais frente aos periodontopatógenos Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum e controle da atividade de osteoclastos, que poderá resultar em novas formas terapêuticas para controle da doença periodontal, uma 19 doença cujo tratamento reabilitador, principalmente para as formas mais graves, se restringe a limitação dos danos causados pela destruição óssea alveolar e do ligamento periodontal. 2 REVISÃO DE LITERATURA O aparelho de inserção periodontal (Figura 1), constituído pelo ligamento periodontal, cemento radicular e osso alveolar, é responsável por ancorar o dente aos maxilares. O ligamento periodontal, que une o dente ao alvéolo dentário, consiste de numerosos feixes de fibras colágenas, organizadas em grupos e separadas por tecido conjuntivo frouxo, que contém vasos sanguíneos, linfáticos e nervos. O cemento radicular é um tecido duro com substância intercelular calcificada e organizado em camadas em torno da raiz. Durante a formação do dente, as fibras colágenas do ligamento periodontal ficam incorporadas a ele, ligando o dente ao processo alveolar, osso fino e compacto, perfurado por inúmeros orifícios, através dos quais passam nervos e vasos sanguíneos e linfáticos (GENCO et al., 1997). Doenças que acometem os tecidos de suporte e sustentação do dente são conhecidas como doenças periodontais. Figura 1. Anatomia do periodonto Löe et al. (1986) no clássico estudo da história natural da doença periodontal no homem, avaliaram longitudinalmente em 15 anos, em cinco momentos distintos, uma população - faixa etária 14 aos 46 anos – de plantadores de chá no Sri Lanka, que não possuíam hábitos adequados de higiene bucal ou atendimento profissional. Os autores 20 mostraram que a patogênese da doença periodontal é representada por uma complexa interação parasito-hospedeiro na qual, além da presença do patógeno, diversos outros fatores poderiam contribuir para o desenvolvimento da doença. A doença periodontal deve portanto ser descrita como um conjunto de processos inflamatórios e infecciosos que acometem os tecidos periodontais, de etiologia multifatorial, podendo ser agravada por Diabetes mellitus insulino dependente, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana, tabagismo (GENCO et al., 1997; YOSHIMITUS et al., 1998; LINDHE, 1999), alterações neutrofílicas (PAGE e KORNMAN, 1997) e predisposição genética (LOOS et al., 2008). A resposta imune direcionada ao desafio bacteriano em indivíduos geneticamente suscetíveis parece ser um dos principais fatores responsáveis por desencadear a destruição dos tecidos periodontais. O processo inflamatório é desencadeado e perpetuado por periodontopatógenos, que são bactérias anaeróbias Gram-negativas, como Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus, Treponema denticola e Eikenella corrodens que colonizam o biofilme dental subgengival (DARVEAU et al., 1997). 2.1 PERIODONTOPATÓGENOS P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans E F. nucleatum E SUA PARTICIPAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA PERIODONTAL A bactéria Porphyromonas gingivalis pertence ao gênero Porphyromonas, família Bacteroidaceae. É um coco-bacilo Gram-negativo anaeróbio estrito, imóvel e não formador de esporos (CARDOSO JORGE, 2007; SHOJI et al., 2011). A forma pela qual a bactéria P. gingivalis coloniza o sulco gengival é bastante discutida. Imediatamente após a entrada na cavidade oral, liga-se a moléculas contidas na saliva (produtos bacterianos, componentes da dieta, componentes do exsudato do fluido crevicular, células epiteliais descamadas). Contudo, esta interação poderá ser inibida por componentes do sistema imune inato, como por exemplo: pelo efeito bactericida da histatina, inibição do crescimento e atividade proteolítica da cistatina, inibição do crescimento pela 21 lactoferrina, atividade bactericida da glicoproteína MG2 e lisozima (LAMONT e JENKINSON, 2000). No entanto, a espécie é produtora de fatores de virulência como: fímbrias (FimA), hemaglutininas, lipopolissacarídeos (LPS), que permitem a colonização (CARVALHO e CABRAL, 2007) e proteases, que permitem a invasão bacteriana e inativação de componentes do sistema imune (complemento, imunoglobulina A), sempre na dependência de uma atmosfera com baixa tensão de oxigênio produzida principalmente por micro-organismos formadores do biofilme dental supragengival, incluindo: Streptococcus gordonii, S. mutans, S. sanguis, S. oralis, S. mitis, S. cristatus e Actinomyces naeslundii e disponibilidade de hemina (NAGATA et al., 1990 apud LAMONT e JENKINSON, 2000). Além disso, micro-organismos que colonizam o biofilme dental tardiamente como Fusobacterium nucleatum, Treponema denticola, Treponema medium, Tannerella forsythia também interagem com P. gingivalis, a qual está implicada no surgimento e progressão da doença periodontal (LAMONT e JENKINSON, 2000) e infecções endodônticas (CARDOSO JORGE, 2007). Segundo Aruni et al. (2011) a capacidade de colonizar a bolsa periodontal e interagir com outros micro-organismos pode ser atribuída a ação sinérgica das sialidases e sialopeptidases, enzimas que também participam ativamente do crescimento da bactéria P. gingivalis, visto que são importantes na clivagem de glicoproteínas. Algumas cepas de Porphyromonas gingivalis possuem a capacidade de invadir e infectar o epitélio oral e células musculares lisas, bem como alterar a função de células endoteliais (DOLGILEVICH et al., 2011). Além disso, é descrito que a gingipaína Rs, uma arginina-cisteína protease produzida por P. gingivalis tem a capacidade de inibir o sistema imune, degradar tecidos, sendo também considerada uma potente ativadora do sistema de coagulação, estimulando a agregação plaquetária e ativação dos fatores de coagulação II, IX e X. Esta característica associada a uma intensa resposta inflamatória decorrente da bacteremia, contribui para o desenvolvimento de aterosclerose e trombose, como consequência da periodontite crônica (BRODALA et al., 2005; SKOTTRUP et al., 2011). A capacidade invasiva intrínseca do patógeno P. gingivalis facilita a bacteremia e colonização em sítios extraorais. Da mesma forma, extrações dentárias, cirurgias periodontais, raspagem e alisamento radicular ou até mesmo a simples escovação dentária e uso do fio dental, poderão inocular o micro-organismo na circulação sistêmica (LI et al, 2002). 22 Dentre os periodontopatógenos de importância clínica, destaca-se também a bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans, anteriormente conhecida como Actinobacillus actinomycetemcomitans, um micro-organismo Gram-negativo, membro da família Pasteurellaceae, de forma cocobacilar, capnofílico, imóvel e não formador de esporos. Em meio de cultura seletivo ágar TSBV apresentam colônias com formato de estrela. São microorganismos catalase-positivos, produtores de fosfatase ácida e alcalina, fermentadores de frutose, glicose e manose. O principal habitat é o sulco gengival humano, podendo colonizar mucosa oral e orofaringe. Seu principal fator de virulência é a leucotoxina A (LtxA), que possui capacidade de lisar neutrófilos, monócitos e linfócitos T (CARDOSO JORGE, 2007), também foram descritos bacteriocinas, fator inibidor de quimiotaxia, colagenases, proteases para imunoglobulina G (IgG), fímbrias (O’BRIEN SIMPSON et al., 2004). O A. actinomycetemcomitans libera para o meio extracelular uma gama de proteínas, incluindo a leucotoxina A, toxina distensora citoletal (CDT), GroEL, lipoproteína associada a peptideoglicano (PAL) e lipopolissacarídeo (LPS). Foi demonstrado que este microorganismo pode disseminar fatores de virulência no organismo do hospedeiro, via vesículas (OMV- vesículas de membrana externa) ou até mesmo secretar componentes solúveis da parede celular na ausência de OMVs. Tanto as OMVs, quanto os fatores solúveis são abundantemente produzidos no biofilme dental e contribuem para o desenvolvimento da resposta imune em uma bacteremia (ZIJNGE et al., 2012). Diversas proteínas participam da patogenicidade do A. actinomycetemcomitans. As genotoxinas CdtA, CdtB, CdtC podem induzir uma parada do ciclo celular na fase G2 e apoptose em células do sistema imune (GUERRA et al., 2011 apud ZIJNGE et al., 2012). A invasão em células do epitélio gengival é mediada pela Omp29 (KAJIYA et al., 2011) e Segundo Maeda et al. (2009) a proteína inflamatória de macrófagos (MIP) está envolvida na sobrevivência intracelular deste patógeno e tem sido estudada como candidata a formulação de vacina antimeningocócica (HUNG et al., 2011 apud ZIJNGE et al., 2012). O A. actinomycetemcomitans é um patógeno associado ao desenvolvimento de periodontite agressiva. Foi descrito que o patógeno tem a capacidade de colonizar o interior de células epiteliais, porém a invasão não é uma capacidade intrínseca do micro-organismo. O que de fato ocorre é a internalização da bactéria pela célula, em decorrência de modificações estruturais dos componentes do citoesqueleto promovida pela Omp100 do A. actinomycetemcomitans e participação da Omp29, a qual induz remodelação de filamentos de actina pela ativação de FAK-PI3 kinase ou cascata de sinalização mediada por Rho-GTPase, para internalização da bactéria por queratinócitos (KAJIYA et al., 2011). 23 Dispersina B (DspB) também conhecida como ChB é uma desidrogenase com capacidade para degradar poli-N-acetilglicosamina, o principal componente da matriz extracelular que compõe o biofilme dental. Por ter a capacidade de degradar a matriz, esta desidrogenase participa ativamente do processo de disseminação do patógeno A. actinomycetemcomitans pela saliva, na qual é protegido da ação de lisozimas pela proteína OapB (CALLEWAERT et al., 2008; KAPLAN, 2010). Desta forma, o micro-organismo pode colonizar diversos outros tecidos e ser responsável pelo desenvolvimento de infecções extraorais. O A. actinomycetemcomitans foi primeiramente descrito por Kliger em 1912 e tem sido relatada a presença deste patógeno em infecções extraorais, sendo a endocardite a mais frequente (RAHAMAT-LANGENDOEN et al., 2011). Rahamat-Langendoen et al. (2011) descreveram um caso de abscesso cerebral associado a presença de A. actinomycetemcomitans, a princípio confundido com um tipo incomum de tumor, em um paciente de 42 anos de idade, tabagista e etilista, com doença periodontal, cárie e perda de vários elementos dentais, caracterizando um paciente com maus hábitos de higiene bucal. O paciente apresentava também candidíase oral, dosagem de proteína C reativa moderadamente elevada (34 mg.L-1), e não foram descritas alterações cardiovasculares, renais e hepáticas. O A. actinomycetemcomitans é um patógeno pertencente ao grupo HACEK (Haemophilus spp., A. actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens e Kingella spp.), grupo de micro-organismos Gram-negativos considerados incomuns em casos de endocardite (3 a 8% dos casos). As bactérias deste grupo são caracterizadas pela sua presença na microbiota normal, baixa virulência, alta prevalência em indivíduos com história recente de tratamento dentário e com infecções de válvulas cardíacas. Os indivíduos que albergam estes patógenos em válvulas cardíacas apresentam sintomatologia por diversas semanas, com risco de embolias e parada cardíaca em função do diagnóstico tardio (TIEN et al., 2012). A possível relação deste patógeno com doenças coronarianas também tem sido documentada. Segundo Spahr et al. (2006) a identificação de periodontopatógenos por meio de técnicas de biologia molecular em amostras de fluido crevicular de pacientes portadores de periodontite, com idade entre 43 a 73 anos, revelou uma associação positiva entre o desenvolvimento de doenças coronarianas e a presença de A. actinomycetemcomitans. Pussinen et al. (2007) reportaram uma associação entre os níveis aumentados de anticorpos da classe IgG contra A. actinomycetemcomitans e doenças coronarianas. Um aumento dos níveis 24 de anticorpo contra este patógeno significa destruição das estruturas periodontais e bacteremia. Segundo Ueno et al. (2012), indivíduos que albergam este patógeno tem um risco aumentado de desenvolvimento de complicações cardíacas, principalmente indivíduos jovens. O periodontopatógeno Fusobacterium nucleatum, filo Fusobacteria, família Fusobacteriaceae, é um bastonete Gram-negativo anaeróbico, comensal, com extremidades afiladas, conferindo-lhe a forma de fuso, não formam esporos e são imóveis, são numericamente dominantes no biofilme dental e importantes em doenças infecciosas no homem (CARDOSO JORGE, 2007). Existem cinco subespécies reconhecidas de Fusobacterium nucleatum: polymorphum, nucleatum (ATCC25586), vincentii, fusiform e animalis (KARPATHY et al., 2007). O F. nucleatum é um dos primeiros micro-organismos a colonizar o biofilme dental, sendo uma espécie com papel central na interação entre bactérias Gram-positivas (Streptococcus e Actinomyces, reconhecidas como colonizadores iniciais do biofilme pela capacidade de adesão a película adquirida) e Gram-negativas (Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, reconhecidas como colonizadoras tardias) (MERRIT et al., 2009). O hábitat principal do F. nucleatum é a gengiva marginal e sulco gengival, correlacionado com casos de gengivite e periodontite (CARDOSO JORGE, 2007). Acredita-se que o F. nucleatum atue como uma ponte entre micro-organismos Grampositivos e negativos e facilite a formação de um ambiente com baixas tensões de oxigênio, ideal para o desenvolvimento de micro-organismos anaeróbios (KARPATHY et al., 2007). Segundo Jewett et al. (2000), a bactéria F. nucleatum tem a capacidade de induzir apoptose em polimorfonucleares (via Fas e TNF-R) e linfócitos (KAPLAN et al., 2010) favorecendo a colonização do biofilme dental por outras espécies bacterianas. É um patógeno identificado em infecções extraorais em sítios como: sangue, cérebro, pulmão, fígado, articulações e infecções abdominais, ginecológicas e obstétricas (KARPATHY et al., 2007). A bacteremia transitória provocada pela periodontite pode facilitar a disseminação de bactérias orais para outros órgãos do corpo humano. Estudos mostraram que injeções intravenosas de F. nucleatum (isolados do fluido amniótico e infecções oropulmonares) em camundongos gestantes, resultaram em aborto. Os autores mostraram que 72 horas após a inoculação bacteriana, micro-organismos viáveis foram isolados da decídua basal da placenta, no líquido amniótico, útero e no próprio feto. O estudo também sugeriu que adesão a tecidos e invasão tecidual são mecanismos de virulência importantes do F. nucleatum (HAN et al., 2004). 25 A propriedade invasiva do F. nucleatum parece estar associada a capacidade que este micro-organismo possui de utilizar pró-metaloproteinases (mais especificamente a MMP-9), produzidas por neutrófilos para degradação dos componentes da matriz extracelular, incluindo, colágeno, fibronectina e proteoglicanos, o que poderia explicar a relação entre este micro-organismo e doenças cardiovasculares, respiratórias, bem como a sua presença no líquido amniótico (GENDRON et al., 2004). A ação de 80 cepas de F. nucleatum orais, isoladas de pacientes adultos com periodontite, indivíduos sadios e macacos Cebus apella sobre camundongos isogênicos Balb/c foi reportada por Gaetti-Jardim et al. (2000). Os resultados do estudo apontaram que os isolados induziram perda de peso, perda dos movimentos coordenados, alterações patológicas no fígado, sistema nervoso central, coração, rins, congestão vascular e até mesmo a morte dos camundongos em 48 h. Dharmani et al. (2011) estudaram cepas invasivas (ATCC 25586) de F. nucleatum. Em sua pesquisa, os autores mostraram que cepas com potencial invasivo são capazes de estimular a produção de mucinas (MUC2) e citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral (TNFα), comprometendo a homeostase na mucosa intestinal por interferir no equilíbrio existente entre a microbiota normal residente no trato digestório e o hospedeiro, bem como por estimular o desenvolvimento de doenças inflamatórias. A capacidade de invasão intracelular também foi reportada por Uitto et al. (2005), os autores ainda relataram que o aumento da expressão de colagenase III induzida pelo microorganismo e a influência do F. nucleatum sobre a migração de células epiteliais reforçam a ideia da participação direta do micro-organismo na formação da bolsa periodontal e no desenvolvimento da periodontite. 2.2 DOENÇA PERIODONTAL: PATOGÊNESE E PARTICIPAÇÃO DOS OSTEOCLASTOS NA REABSORÇÃO ÓSSEA Na doença periodontal, bactérias e os produtos do metabolismo microbiano como os ácidos butírico e propiônico interagem com o epitélio juncional, possibilitando a invasão no tecido conjuntivo subjacente. Esta invasão ativa uma resposta imune com consequente produção de mediadores pró-inflamatórios sintetizados pelo epitélio juncional, como interleucina-1 (IL-1), prostaglandina E2 (PGE2), que ativam células endoteliais e aumentam a 26 permeabilidade do plexo vascular adjacente, o que possibilita a evasão de um grande número de leucócitos, especialmente neutrófilos, que migram através do epitélio juncional para o sulco gengival e bolsa periodontal (TONETTI et al., 1997). A Figura 2 mostra a representação clínica e esquemática da evolução da doença periodontal. Clinicamente a periodontite caracteriza-se por perda de inserção do ligamento periodontal, perda óssea alveolar, existência de bolsas periodontais e inflamação gengival. Também podem estar presentes recessão gengival, sangramento gengival após sondagem, aumento da mobilidade, migração e esfoliação dentária (SOCRANSKY et al., 1984; LÖE et al., 1986; JEFFCOAT e REDDY, 1991). As características histopatológicas da periodontite incluem localização do epitélio juncional apicalmente à junção cemento-esmalte, perda das fibras colágenas subjacentes ao epitélio da bolsa, perda óssea, numerosos leucócitos polimorfonucleares no epitélio juncional e no epitélio da bolsa e um denso infiltrado celular inflamatório com presença de plasmócitos, linfócitos e macrófagos (SELVIG, 1966). 12 mm A 9 mm 6 mm 6 mm Gengiva e Osso saudáveis B 3 mm Inflamação gengival e Destruição óssea devido à infecção periodontal Ilustração do biofilme dental subgengival causando inflamação Figura 2. Representação clínica e esquemática da doença periodontal. A- Periodonto saudável. B- Acúmulo de biofilme dental supra e subgengival induzindo inflamação. (Fonte: http://www.senado.gov.br/portaldoservidor/jornal/jornal64/diabetes.aspx) Citocinas, quimiocinas, prostaglandinas têm sido identificadas como reguladores da resposta imune na doença periodontal, a qual apresenta um infiltrado inflamatório de 27 linfócitos ativados, macrófagos, neutrófilos e mediadores pró-inflamatórios secretados, incluindo IL-1 e PGE2, além de TNFα produzido por linfócitos T presentes na intimidade da bolsa periodontal. Todos estes mediadores promovem a diferenciação e ativação de osteoclastos, culminando com a reabsorção óssea alveolar e consequente perda do dente (ISHIKAWA, 2007). A homeostase do sistema esquelético está na dependência de uma remodelação óssea equilibrada, ou seja, da dinâmica balanceada entre a atividade de osteoblastos, células que formam o osso, e osteoclastos, células que reabsorvem o osso. Se este balanço inclinar-se a favor dos osteoclastos, a consequência será uma reabsorção óssea patológica, como a que acontece na doença periodontal (TAKAYANAGI et al., 2005). Os osteoblastos são células mononucleadas, de origem mesenquimal, com núcleo esférico e citoplasma basófilo. São cubóides ou ligeramente alongadas e formam uma camada celular sobre a superfície óssea que está sendo formada. São as células responsáveis pela produção da matriz orgânica do osso e sua mineralização (KATCHBURIAN et al., 2004). À medida que os osteoblastos secretam a matriz óssea, eles ficam aprisionados em seu interior, em lacunas, diminuindo a atividade metabólica e sendo agora chamados osteócitos, os quais também tem participação na remodelação óssea, visto que a apoptose de osteócitos ativam osteoclastos (BOABAID et al., 2001) e ainda osteócitos regulam a disponibilidade de cálcio e atividade de osteoblastos e osteoclastos (DALLAS et al., 2013). Os osteoclastos (Figura 3) são células gigantes, multinucleadas, formadas pela fusão de células mononucleadas da linhagem hematopoiética. Caracterizam-se, citoquimicamente, por apresentar fosfatase ácida resistente ao tartarato, adenosina ácida trifosfatada vanadato sensitiva, isozima anidrase carbônica II, entre outras enzimas e receptores para calcitonina. Os osteoclastos são responsáveis pela reabsorção óssea, em função da liberação de prótons e atividade enzimática, especialmente MMPs, promovendo escavações na superfície óssea denominadas lacunas de Howship (KATCHBURIAN et al., 2004). Possuem importante participação na doença periodontal, osteoporose e artrite reumatóide (OCHI et al., 2007). O osso é constituído de uma parte orgânica (colágeno, proteoglicanas, glicoproteínas adesivas) e outra inorgânica (íons fosfato, cálcio, bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato). A união do fosfato e do cálcio forma cristais com estrutura de hidroxiapatita que, associados às fibras colágenas, fornecem a resistência e dureza características do tecido ósseo. Há ainda proteínas derivadas do sangue, fluidos teciduais e um importante grupo de glicoproteínas chamadas proteínas ósseas morfogenéticas responsáveis pela indução da formação óssea (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). O tecido ósseo está continuamente 28 sofrendo remodelação e este processo está intimamente relacionado à função do sistema imune, o qual agindo mais sobre os osteoclastos, poderá resultar em uma reabsorção óssea patológica. Receptores para calcitonina Receptores para vitronectina Anidrase carbônica II Enzimas lisosomais Catepsina K Bordas em forma de onda Enzimas lisosomais Catepsina K Figura 3. Estrutura de um osteoclasto. Receptores para calcitonina são responsáveis por regular a função dos osteoclastos. Receptores para vitronectina são responsáveis pela adesão dos osteoclastos na matriz óssea. Anidrase carbônica catalisa a rápida conversão de CO 2 e H2O em ácido carbônico, prótons e bicarbonato. Catepsina K são proteases ativas em pH ácido. Enzimas lisosomais são responsáveis pela reabsorção óssea juntamente com catepsina K. TRAP – fosfatase ácida resistente ao tartarato (Adaptado de SUDA et al., 2008) O papel do sistema imune na diferenciação e ativação de osteoclastos é de fundamental importância, principalmente a participação de receptor ativador de ligante do fator nuclear Kappa B (RANKL) presente em osteoblastos e células do estroma da medula óssea, e fator estimulador de colônias para macrófagos (M-CSF) produzido pelo estroma da medula óssea, osteoblastos e linfócitos T ativados. O co-estímulo de RANKL e M-CSF é importante na diferenciação e ativação de osteoclastos, participando ativamente na homeostase do tecido ósseo (WOO et al., 2010). A Figura 4 mostra o mecanismo molecular de diferenciação e ativação de osteoclastos. Os componentes 1α,25 (OH)2D3, paratormônio (PTH) e IL-11 agem em osteoblastos e induzem a expressão de RANKL, que reconhece RANK em precursores de osteoclastos por um mecanismo envolvendo a interação célula-célula. M-CSF é também um fator essencial para proliferação e diferenciação, produzido por osteoblastos no tecido ósseo. Precursores de 29 osteoclastos se diferenciam em osteoclastos e são ativados, ambos os mecanismos mediados por RANKL. Quando a osteoprotegerina (OPG), produzida por osteoblastos, bloqueia RANKL, precursores de osteoclastos não podem mais interagir com RANKL, assim OPG atua como inibidora da ativação (SUDA et al., 2008). Precursores de osteoclastos Osteoclastos Diferenciação Ativação Osteoclastos ativados Receptor Osteoblastos Osso Lacuna de Howship Figura 4. Mecanismos de ativação do osteoclasto. Os componentes 1α,25 (OH)2D3, paratormônio (PTH) e IL-11 agem em osteoblastos e induzem a expressão de RANKL, que reconhece RANK em precursores de osteoclastos por um mecanismo envolvendo a interação célula-célula. Precursores de osteoclastos se diferenciam em osteoclastos e são ativados, ambos os mecanismos mediados por RANKL. OPG atua como inibidora da ativação (Adaptado de SUDA et al., 2008) Osteoclastos são células multinucleadas. Yagi et al. (2005) descreveram uma proteína chamada proteína transmembrana específica de células dendríticas (DC-STAMP) como um fator essencial envolvido na fusão de pré-osteoclastos mononucleares. Rifas e Weitzmann (2009) descreveram uma nova citocina chamada fator osteoclastogênico secretado de linfócitos T ativados (SOFAT), a qual induz produção de IL-6 e formação de osteoclastos na ausência de osteoblastos ou RANKL. A indução de IL-6 sugere que esta citocina tem um importante papel na reabsorção óssea durante o processo inflamatório. Segundo Jarry et al. (2013), a citocina SOFAT apresenta um importante papel no desenvolvimento da doença periodontal. Os autores mostraram um aumento significante na expressão de RNAm e dos níveis de proteína SOFAT no tecido gengival do grupo de camungondos acometidos por doença periodontal, quando comparado ao grupo controle (sem doença). Foi também descrita a participação de SOFAT na indução de osteoclastos no ligamento periodontal dos animais estudados. 30 Outra citocina importante no processo de osteoclastogênese é o fator de necrose tumoral alfa. O TNFα induz a formação de osteoclastos, pois atua aumentando a produção de RANKL e M-CSF pelo estroma da medula óssea, ainda aumentando a sensibilidade dos osteoclastos ao estímulo de RANKL (HOTOKEZAKA et al., 2007). O aumento na expressão de RANKL sob a influência de linfócitos T ativados produtores de IL-7 foi também descrito por Toraldo et al. (2003). 2.3 RESISTÊNCIA DOS PERIODONTOPATÓGENOS AOS ANTIMICROBIANOS: UM PROBLEMA DE SAÚDE PÚBLICA Segundo Veloo et al. (2012) o tratamento da doença periodontal envolve a redução da população microbiana subgengival por meio de métodos mecânicos de raspagem e alisamento radicular, entretanto o depósito bacteriano em bolsas periodontais profundas é frequentemente difícil de ser removido, necessitando assim de métodos cirúrgicos e antibioticoterapia associada. Muitos antimicrobianos são associados ao tratamento da doença periodontal, como metronidazol ou uma combinação de metronidazol e amoxicilina (HERRERA et al., 2002, MOMBELI et al., 2012), porém segundo van Winkelhoff et al. (2005) a suscetibilidade dos patógenos orais a antibioticoterapia varia consideravelmente entre países, além disso Walker et al. (1996) já afirmavam que a resistência a antibióticos destes patógenos estava aumentando, principalmente em pacientes com periodontite refratária. Três mecanismos básicos são responsáveis pela resistência de micro-organismos a antibióticos: 1) O micro-organismo pode bombear um antibiótico para o meio extracelular por meio de bombas de efluxo; 2) Mutações induzem mudanças no sítio de ligação da droga; 3) Capacidade de inativar a droga por meio de enzimas (MADIGAN et al., 2004). Um antibiótico largamente empregado no tratamento da periodontite é a tetraciclina e derivados, como doxiciclina e minociclina (GOODSON et al., 1982), porém pelo menos 27 diferentes genes de resistência para a tetraciclina têm sido descritos em espécies relacionadas ao desenvolvimento da doença periodontal, como Streptococcus oralis, Veilonella spp., Actinomyces spp., Peptostreptococcus anaerobius, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis (ROBERTS, 2002). Vale ressaltar que Rodrigues et al. 31 (2004) mostraram que o A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e T. forsythia apresentaram um perfil de resistência as tetraciclinas. Segundo Japoni et al. (2011), a bactéria P. gingivalis apresentou in vitro, sensibilidade aos antibióticos doxicilina, azitromicina e a associação amoxicilina com ácido clavulânico. Os autores sugerem que a resistência da bactéria P. gingivalis a amoxicilina é devido a produção de β-lactamase, visto que 12% das cepas testadas apresentaram resistência a amoxicilina sem associação de ácido clavulânico. O uso indiscriminado, a não utilização e a utilização profilática de antibióticos sem critérios são alguns dos fatores responsáveis pelo crescimento da resistência aos antimicrobianos apresentada pelos micro-organismos (ARDILA et al., 2010). Ardila et al. (2010) estudaram a suscetibilidade dos periodontopatógenos P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans isolados de pacientes com periodontite crônica não tratada. Os autores mostraram que a bactéria P. gingivalis foi altamente sensível a ação dos antibióticos moxifloxacina (Concentração inibitória mínima - CIM90 igual a 0,032 mg.mL-1) e amoxicilina (CIM50 igual a 0,125 mg.mL-1) associada a ácido clavulânico, contudo 23,52%, 21,56% e 25,49% dos isolados mostraram algum grau de resistência aos antibióticos clindamicina, metronidazol e amoxicilina respectivamente. A resistência a estes três últimos antibióticos foi também apresentada pelos isolados de A. actinomycetemcomitans. A penicilina é uma droga muito utilizada contra micro-organismos do grupo HACEK, mas de uma maneira geral os patógenos orais são resistentes a ação da penicilina. Segundo Kulik et al. (2008) apenas 12% dos patógenos orais são suscetíveis a ação da penicilina. Além da resistência apresentada pelos periodontopatógenos, cabe ressaltar que segundo Branda et al. (2005) a efetividade de um antimicrobiano pode ser influenciada pela presença de sangue, matéria orgânica, biofilmes intactos, os quais são menos suscetíveis a ação da droga, pois a matriz extracelular de exopolissacarídeos (carga elétrica negativa) poderia diminuir a penetração do antimicrobiano (frequentemente de carga elétrica positiva), por interações iônicas e eletrostáticas. O biofilme associado à progressão da doença periodontal é complexo, formado por diferentes camadas celulares, sendo as mais profundas habitadas por micro-organismos anaeróbios. A composição da microbiota na fase ativa da doença é principalmente formada pelas bactérias P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus e Treponema denticola, sendo as duas primeiras as mais evidentes (SBORDONE et al., 2011). 32 O crescimento in vivo da microbiota do biofilme subgengival é lento, o que acarretaria em menor eficácia de um antimicrobiano, pois segundo Madigan et al. (2004) a efetividade de um antimicrobiano é maior na fase log de crescimento, onde a taxa de replicação do ácido desoxirribonucléico (DNA) e o metabolismo são altos. O biofilme dental por ser uma estrutura bem organizada, também é responsável pela seleção de cepas resistentes aos antibióticos utilizados no tratamento da doença periodontal. Segundo Feres et al. (2002), os micro-organismos que colonizam em profundidade o complexo biofilme dental são protegidos da ação de antibióticos. Desta forma, tratamentos coadjuvantes ao uso de antibióticos poderiam ser úteis na terapia periodontal e neste contexto, plantas medicinais representam uma alternativa promissora. 2.4 USO DE PLANTAS MEDICINAIS COMO COADJUVANTE NO TRATAMENTO DA DOENÇA PERIODONTAL O Brasil possui a mais rica flora em todo o mundo, com mais de 56.000 espécies de plantas, cerca de 19% da flora mundial. Estimativas indicam aproximadamente 5 a 10 espécies de gimnosperma, 55.000 a 60.000 espécies de angiospermas, 3100 espécies de briófitas e 1200 a 1300 espécies de pteridófitas, e em torno de 525 espécies de algas marinhas (GIULIETTI et al., 2005). Esta biodiversidade pode ainda ser uma rica fonte de matéria-prima de produtos naturais com atividades biológicas a serem estudadas. Plantas medicinais poderiam ser úteis no tratamento e prevenção da doença periodontal, visto que o efeito inibitório no crescimento dos periodontopatógenos in vitro, quando se utiliza um fitoterápico, têm sido relatado por alguns autores (IAUK et al., 2003; LEE et al., 2004). Logo, é de extrema relevância social o estudo destas plantas sobre a microbiota periodontopatogênica e controle da ativação de osteoclastos, o que implicaria em um controle preventivo mais acessível à população, com custos reduzidos. Allium sativum tem mostrado conhecida propriedade antibacteriana, antifúngica e antiviral. A esse respeito Bakri et al. (2005) testaram o efeito desta planta sobre o crescimento e enzimas proteolíticas de Porphyromonas gingivalis. O extrato de Allium sativum inibiu o crescimento (CIM 17,8 – 1,1 mg.mL-1) e também mostrou um efeito bactericida (Concentração bactericida mínima - CBM 35,7-1,1 mg.mL-1) sobre o micro- 33 organismo testado. Ainda, 94,88% da atividade proteolítica da protease de P. gingivalis foi inibida. Estes dados sugerem que esta planta é um importante coadjuvante do tratamento em pacientes portadores de periodontite (BAKRI et al., 2005). Centella asiatica e Punica granatum são plantas medicinais que promovem regeneração tecidual e modulação da resposta imune. Estudos preliminares revelaram efeitos clínicos favoráveis, quando extratos das duas ervas foram impregnados em chips biodegradáveis, os quais foram introduzidos no sulco gengival de pacientes com doença periodontal, após raspagem e alisamento radicular. Amostra de fluido crevicular gengival foi obtida antes e depois da terapia periodontal, os resultados indicaram uma redução na produção da citocina pró-inflamatória IL-1β e baixa produção de IL-6, quando comparado ao grupo controle (SASTRAVAHA et al., 2005). A cavidade oral é habitada por mais de 500 espécies de bactérias em uma concentração aproximada de 108 – 109 micro-organismos por mililitro de saliva ou miligrama de placa bacteriana, a este respeito Takarada et al. (2004) fizeram um estudo comparativo da atividade antimicrobiana de óleos essenciais extraídos de plantas medicinais sobre a microbiota oral. Óleos de Leptospermum scoparium, Malaleuca alternifolia, Eucalyptus radiata, Lavandula officinalis e Rosmarinus officinalis foram obtidos no laboratório PhytoSun’Aroms (Ance, França). Segundo o estudo, a CIM de óleos extraídos de Malaleuca alternifolia, Eucalyptus radiata foi de 0,06 a 0,5% contra A. actinomycetemcomitans Y4, ATCC 29523, ATCC 29524 e P. gingivalis ATCC 33277, ATCC 53977, Su63 e W50 e F. nucleatum ATCC 25586. A exposição por 30 segundos das cepas de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, F. nucleatum submetidas a ação dos óleos de Leptospermum scoparium, Malaleuca alternifolia, Eucalyptus radiata na concentração de 0,2 a 0,5% mostrou atividade bactericida. Porém, o óleo da Lavandula officinalis não mostrou atividade contra nenhuma cepa testada (TAKARADA et al., 2004). A capacidade dos micro-organismos que causam a doença periodontal em aderir a superfície dental é considerada um fator de patogenicidade. Óleos essencias de Leptospermum scoparium, Malaleuca alternifolia, Eucalyptus radiata, Lavandula officinalis e Rosmarinus officinalis possuem a capacidade de inibir a formação do biofilme dental e não mostraram atividade citotóxica sobre as células humanas na concentração de até 0,2% (TAKARADA et al., 2004). Yemenitas e africanos do leste da África habitualmente mascam as folhas e ramos de Catha edulis, uma planta da família Celestraceae comumente conhecida como Khat. Em um estudo realizado in vivo foi mostrado que esta planta tem a capacidade de influenciar na 34 prevalência de periodontopatógenos localizados sub e supragengivalmente, induzindo um perfil na microbiota adequado à saúde periodontal. Testes de suscetibilidade foram executados segundo normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Os resultados indicaram que a maioria das cepas de periodontopatógenos testados, incluindo P. gingivalis, T. forsythia e A. actinomycetemcomitans foram sensíveis aos extratos de Catha edulis (CIM de 5-20 mg.mL-1). Apenas Campylobacter rectus e F. nucleatum mostraram resistência (AL-HEBSHI et al., 2005). Aloe vera é uma planta medicinal com propriedades anti-inflamatória e antimicrobiana. Segundo Fani et al. (2012), o gel de Aloe vera foi capaz de inibir isolados clínicos de Streptococcus mutans (CIM igual 12,5 µg.mL-1), A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e Bacteroides fragilis (CIM entre 25-50 µg.mL-1). Recentemente foi descrita uma alta prevalência de clones JP2 (produtores de leucotoxina) de A. actinomycetemcomitans em adolescentes de Ghanaian, ainda, nesta região, existe o hábito de mascar folhas de Psidium guajava (Guava) como forma de higiene bucal. Visando a comprovação científica do uso popular da planta Guava sobre o crescimento de patógenos orais, Kwamin et al. (2012) estudaram a ação de extratos da planta sobre a leucotoxina de A. actinomycetemcomitans. Os resultados apontaram que os extratos obtidos de folhas e frutos da planta foram capazes de neutralizar a leucotoxina, porém com mecanismo de ação ainda não elucidado. O extrato etanólico de folhas de Guava contém polifenóis, com propriedades anticâncer, anti-inflamatória, antioxidante, antialérgicas e ainda atividade antimicrobiana em função da presença de esteróides, flavonóides e taninos. A ação de flavonóides foi estudada por Cai et al. (2013), que reportaram o efeito antiaterosclerose da epigalocatequina-3-galato presente em chás verde. Os autores mostraram que o composto possui importante ação antioxidante e anti-inflamatória capaz de atenuar a formação de ateromas na aorta de camundongos infectados por P. gingivalis. O desenvolvimento tecnológico e industrial traz ao mercado diariamente produtos, como escovas elétricas, irrigadores elétricos que facilitam a higiene bucal e controle de placa. A esse respeito Pistorius et al. (2003) associaram a esta tecnologia um antisséptico bucal contendo extrato de ervas medicinais de Salvia officinalis, Mentha piperita, Matricaria chamomilla, Commiphora myrrha, Carvum carvi, Eugenia caryophyllus e Echinacea purpurea na concentração de 2,5 partes do agente em 100 partes de água, preparado pelos participantes do projeto. Esta inovação conseguiu reduzir o índice de sangramento gengival no grupo de pacientes com gengivite, resultado estatisticamente significante quando 35 comparado ao grupo controle, composto de pacientes que utilizavam irrigadores convencionais. Estudos mostram que plantas medicinais e produtos naturais derivados do metabolismo secundário destas plantas também podem regular a atividade de osteoclastos (PUTNAM et al., 2007). Com o objetivo de avaliar se o extrato de Stewartia koreana possuía efeitos sobre a diferenciação de osteclastos, Park et al. (2007) cultivaram pré-osteoclastos na presença de osteoblastos, Vitamina D3 e PGE2 e extrato da planta. Segundo estes autores, o extrato desta planta foi capaz de inibir a diferenciação em 80% dos osteoclastos, na concentração de 20 µg.mL-1. Este efeito inibitório foi devido a inibição da expressão do fator nuclear associado a Toll c1 (NFATc1) e c-Fos, porém não foi observado efeito no fator nuclear kappa B (NFκB). Um estudo com mulheres adultas da China revelou maior densidade óssea em mulheres que bebiam chá, do que naquelas que não tomavam (HEGARTY et al., 2000). Baseados nestas observações Oka et al. (2012) estudaram a atividade antiosteoclastogênica dos polifenóis extraídos de Camellia sinensis, nas concentrações de 10 a 100 µM. Os autores mostraram que os polifenóis foram capazes de inibir a formação de osteoclastos, suprimir as metaloproteinases MMP-2 e MMP-9 (necessárias pra degradação de fibras colágenas e migração de osteoclastos na superfície óssea) e impedir a formação do anel de actina do citoesqueleto de osteoclastos, o qual é necessário no processo de reabsorção óssea. Estudos epidemiológicos vêm mostrando que existe uma correlação positiva entre o consumo de frutas e verduras sobre a densidade óssea em humanos (NEW et al., 2000). A este respeito Muhlbauer et al. (2003) utilizaram os óleos essenciais de Oleum carvi, O. eucalypti, O. juniperi, O. pini, O. rosmarini, O. salviae e os monoterpenos tujona, eucaliptol, borneol, timol, mentol, alfa-pineno e beta-pineno em ensaios in vivo utilizando ratos da linhagem Wistar alimentados com os compostos, e ensaios in vitro em osteoclastos cultivados. Os resultados mostraram que os monoterpenos borneol e timol inibiram a atividade de osteoclastos na concentração de 1,0 mM. O borneol não diminuiu o número de osteoclastos na dose testada, diferente do timol que além de inibir a atividade, foi capaz de diminuir o número de osteoclastos na cultura. Para Crowell et al., (1991) a ação dos monoterpenos seria inibir a via do mevalonato e prenilação de proteínas como Ras, Rho e Rac. Com o objetivo de determinar o efeito de extratos de jixueteng sobre a reabsorção óssea alveolar na doença periodontal, Toyama et al. (2012) utilizaram camundongos C57BL/6N infectados com P. gingivalis ATCC 33277. Os autores dividiram os camundongos 36 em 3 grupos, sendo o grupo A, o controle do experimento (camundongos não infectados), o grupo B composto de camundongos infectados e o grupo C composto de camundongos infectados e tratados com o extrato da planta. Os resultados mostraram que concentrações abaixo de 0,1% da droga não foram tóxicas e que a perda óssea alveolar foi estatisticamente menor no grupo C (p < 0,01) quando comparado com o grupo B. O efeito da fração etil acetato do extrato de Cudrania tricuspidata (coletada em Jiri Mountain, Korea), em osteoclastos estimulados com IL-1 β e RANKL foi estudado por Lee et al. (2010). A fração foi capaz de inibir a diferenciação dos precursores de osteoclastos estimulados com IL-1β e RANKL de forma dose-dependente. O mecanismo de ação proposto pelos autores foi a inibição de c-Fos, NFATc1 e proteína quinase ativadora de mitose (MAPK). Os resultados também informaram que a fração não teve atividade sobre a expressão do fator de transcrição NFκB. Uma planta usada na medicina tradicional de Taiwan para tratamento de doenças pulmonares, dor abdominal, febre, hipertensão e mordida de cobras, chamada Anoectochilus formosanus foi estudada por Masuda et al. (2008). O extrato etanólico desta planta usado em camundongos ovariectomizados estabilizou a redução na porção esponjosa do osso femural e reduziu o número osteoclastos em 38%, quando o composto era usado na concentração de 12,5 µg.mL-1 e 26% a 25 µg.mL-1. O estudo mostrou que o composto não foi capaz de inibir a atividade de RANKL, porém ele foi capaz de suprimir a expressão de RANKL. Yin et al. (2004) demonstraram que extratos aquosos de Dioscorea spongiosa estimularam a proliferação de osteoblastos. Extratos de Psoralea corylifolia (WANG et al., 2001) e Cnidium monnieri (MENG et al., 2004) também apresentaram atividade sobre osteoblastos. Segundo Koyama et al. (2012) a administração de extrato de Terminalia catappa na concentração de 1 mg.Kg-1 durante 5 semanas preveniu a reabsorção óssea por osteoclastos, interferindo na diferenciação celular. A atividade do magnolol presente na planta Magnolia officinalis foi descrita por Lu et al. (2013). A administração, em camundongos com doença periodontal, de 100 mg. Kg-1 de magnolol foi capaz de inibir a reabsorção óssea alveolar, o número de osteoclastos na superfície óssea, a expressão de RANKL, MMP-1, MMP-9, NFκB, bem como mostrou atividade antimicrobiana frente a P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans e inibiu a diferenciação de macrófagos RAW 264.7 em osteoclastos. Percebe-se que controlar a formação, diferenciação e ativação de osteoclastos são mecanismos de ação desejáveis quando se estuda um composto natural que tenha como 37 objetivo controlar a reabsorção óssea mediada por osteoclastos. Esta regulação pode ser também conseguida pela indução de apoptose. Apoptose, ou morte celular programada, é um processo essencial para a manutenção do desenvolvimento dos seres vivos, sendo importante para eliminar células supérfulas ou defeituosas. Durante a apoptose, a célula sofre alterações morfológicas características desse tipo de morte celular. Tais alterações incluem a retração da célula, perda de aderência com a matriz extracelular e células vizinhas, condensação da cromatina, fragmentação internucleossômica do DNA e formação dos corpos apoptóticos. Muitas são as moléculas envolvidas no controle das vias de ativação da apoptose, dentre elas (GRIVICICH et al., 2007): a) Caspases: as caspases são sintetizadas como precursores inativos denominados zimogênios. Após um sinal de morte celular, as caspases são ativadas por clivagem proteolítica. São conhecidas 14 caspases humanas, sendo que seis (caspases -3, -6, -7, -8, -9, -10) participam da apoptose. b) Proteínas da Família Bcl-2: a família Bcl-2 é uma família de proteínas indutoras e repressoras de morte por apoptose que participam ativamente da regulação da apoptose. Os membros da família Bcl-2, como Bcl-2 e Bcl-XL inibem a apoptose, pois previnem a liberação de citocromo c e são chamados de reguladores antiapoptóticos. Por outro lado, Bax, Bid e Bak são proteínas pró-apoptóticas. c) Proteínas inibidoras da apoptose (IAP): são moléculas que exercem seu papel antiapoptótico por inibirem a atividade das caspases efetoras -3 e -7, da caspase iniciadora -9 e de modularem o fator de transcrição NFκB. A família c-FLIP (FLICE-like inhibitory protein - proteína inibidora de FLICE) também atua regulando a apoptose. Essa proteína inibe a apoptose ligando-se ao adaptador para domínio de morte presente em Fas (FADD), prevenindo assim a ativação da caspase-8/FLICE. Cinco diferentes membros das IAPs já foram descritos: proteína inibidora de apoptose neuronal (NAIP), inibidor de proteína apoptótica ligada ao X (XIAP), c-IAP-1, c-IAP-2 e survivina. d) Super família do TNF: inclui diversos receptores, entre eles o rTNFR-1, Fas/CD95, ligante indutor de apoptose relacionado a TNF (TRAIL). Os membros da família do rTNF têm por principal característica um domínio extracelular rico em cisteína. e) Proteína p53: participa da regulação do ponto de checagem de G1 que tem fundamental importância na manutenção da integridade do genoma, pois permite a 38 ação de mecanismos de reparo do DNA ou a remoção de células danificadas através do processo de apoptose. Danos no DNA promovem superexpressão e consequente ativação da p53, resultando na parada do ciclo celular em G1 e iniciando o reparo do DNA. O interesse por medicamentos fitoterápicos pela população vem crescendo cada vez mais no Brasil e isto tem estimulado diversos grupos de pesquisa científica a direcionarem esforços no intuito de desvendar as propriedades biológicas dos vegetais. No entanto, a execução de pesquisas envolvendo plantas medicinais exige estudos multidisciplinares. A metodologia adotada em pesquisas com plantas medicinais é certamente um dos pontos mais discutidos. O processo de seleção da planta a ser utilizada é certamente uma das etapas de maior importância. Vários métodos são empregados incluindo a seleção ao acaso, taxonomia química, ecologia química, emprego de conhecimentos etnofarmacológicos, sendo este último segundo a literatura, o que apresenta resultados mais promissores. Além disso, a classificação botânica correta da espécie selecionada é de fundamental importância. A escolha da parte da planta que será estudada e cuidados especiais com relação ao cultivo, época e local do cultivo e da colheita, método de secagem do material, transporte e armazenamento do material, processamento em laboratório e ensaios biológicos são também procedimentos indispensáveis (CALIXTO, 2003). Embora seja crescente a demanda do mercado por fitoterápicos, este tem sido atendido, na maioria das vezes, com matéria-prima sem padronização, de qualidade duvidosa e ainda fruto do extrativismo sem critérios. Tecnologias de produção, incluindo o cultivo da matéria-prima, são de extrema importância, considerando ainda a necessidade de se atender aos padrões exigidos pela legislação vigente nos campos da química, das indústrias farmacêutica e alimentícia. Os vegetais apresentam grande flexibilidade quimiossintética ao produzir micromoléculas, como as que compõem as misturas complexas que são, por exemplo os óleos essenciais. Para maximizar a produção destas substâncias, são necessários tanto a seleção de genes, quanto a de regimes ambientais. Sob o ponto de vista agronômico, as possibilidades de manejo são muitas (EMBRAPA, 2010). Li e Craker (1996) observaram que diferentes porcentagens de luz fornecida no crescimento de sálvia e tomilho influenciaram no crescimento e nos constituintes do óleo essencial, sendo que a planta em diferentes estágios de crescimento, tem diferente composição no seu óleo essencial, sugerindo a existência de uma enzima que depende de luz para catalizar 39 a reação de acumulação de monoterpenos. A influência de fatores ambientais sobre a síntese de constituintes químicos produzidos por plantas medicinais já é bem documentada. Os fatores ambientais podem ser divididos em bióticos e abióticos (EMBRAPA, 2010). Os fatores bióticos estão relacionados com as interações planta e micro-organismos, planta-planta e planta-herbívoros, e constituem respostas de defesa a essas relações ecológicas locais e imediatas, que resulta em alteração dos processos metabólitos do vegetal. Entre os diversos fatores abióticos encontram-se as variações climáticas ou edáficas. A diversidade de ambientes ecogeográficos do Brasil é um dos fatores responsáveis por sua enorme quantidade de espécies de plantas medicinais (EMBRAPA, 2010). Segundo Teles (2010), a adaptação às mais diversas condições ambientais apresenta desafios evolutivos incomuns. Plantas de uma mesma espécie podem responder de modo muito diferente a dado grau de tensão ambiental, o que explica a diversidade na atividade biológica de uma mesma planta cultivada em diferentes regiões. Dentre as condições ambientais, os fatores climáticos e a temperatura exercem função importante na sobrevivência do vegetal, por estarem ligados ao crescimento e desenvolvimento da planta. Espécies pouco adaptadas à temperatura de uma determinada região terão sérios problemas em produzir biomassa e princípios ativos, em decorrência de distúrbios no metabolismo primário e secundário durante o desenvolvimento do vegetal (MARTINS et al., 1995). Outro fator a ser considerado é o fotoperiodismo, relacionado a disponibilidade de luz solar. O fotoperiodismo exerce influência direta na determinação do ponto de colheita, produção de sementes e escolha da época de plantio (EMBRAPA, 2005). Estudos bioquímicos das fases de desenvolvimento de uma planta, evidenciam a necessidade em se conhecer o comportamento da espécie em função de sua adaptação ao meio ambiente, para seleção correta do melhor local de desenvolvimento, características de solo, horário de colheita e tipo de adubação necessários para o maior incremento de substâncias químicas ativas. Considerando a grande biodiversidade da flora brasileira e o potencial biotecnológico que ela representa para o desenvolvimento de fármacos no tratamento de diversas enfermidades, incluindo a doença periodontal, este trabalho se propôs a estudar a atividade de plantas medicinais sobre o crescimento do biofilme dental subgengival e controle da atividade de osteoclastos. 40 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais e extratos metanólicos de plantas medicinais cultivadas no Recôncavo da Bahia sobre o crescimento de periodontopatógenos e a indução de apoptose em osteoclastos. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Determinar o perfil cromatográfico dos óleos essenciais das plantas medicinais estudadas; 2) Determinar a concentração inibitória e bactericida mínima dos extratos metanólicos e óleos essenciais extraídos das plantas medicinais estudadas para Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida CCMB 261, Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina CCMB 262, Staphylococcus aureus resistente à novobiocina CCMB 263, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Bacteroides fragilis (ATCC 25285); 3) Avaliar in vitro a citotoxicidade de óleos essenciais, princípios ativos presentes nos óleos e extratos metanólicos extraídos das plantas medicinais; 4) Estabelecer in vitro as concentração de trabalho para os ensaios com osteoclastos por meio da atividade antiproliferativa dos compostos sobre linhagens de células tumorais K562 (leucemia), MDA-231 (câncer de mama) e MCF-7 (câncer de mama); 5) Analisar in vitro a atividade dos compostos atóxicos extraídos das espécies de plantas estudadas sobre a indução de apoptose em osteoclastos, bem como atividade antiosteoclastogênica dos compostos que não foram capazes de induzir apoptose; 6) Estudar in vitro a indução de diferenciação eritróide em células K562 tratadas com óleos essenciais, princípios ativos presentes nos óleos e extratos metanólicos extraídos das plantas estudadas. 41 4 DESENHO DO ESTUDO Esta pesquisa foi desenvolvida em caráter interinstitucional com a colaboração do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da Universidade Estadual de Feira de Santana - UEFS, Laboratório de Produtos Naturais (LAPRON) da UEFS, Laboratório de Anaeróbios da Universidade de São Paulo e Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade de Ferrara na Itália, com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Para a sua execução, foi observado o seguinte delineamento de estudo: Análise da composição química do solo Cultivo agroecológico das plantas medicinais Colheita Identificação botânica Separação das partes das plantas Partes aéreas (folhas, flores, sementes, frutos) Caule Secagem Perfil cromatográfico (CG/EM) Secagem Hidrodestilação (Óleo essencial) Preparo dos Extratos metanólicos Atividades biológicas Triagem das concentrações de trabalho em células tumorais Atividade antimicrobiana Concentração inibitória mínima Concentração bactericida mínima Cultura de osteoclastos Teste da Benzidina Teste TRAP Ensaio de citotoxicidade (MTT) Compostos tóxicos Atividade antiosteoclastogênica Compostos atóxicos Ensaios de apoptose celular (Teste TUNEL e Imunocitoquímica para Receptor Fas) 42 5 PRODUTOS DA TESE Esta Tese resultou na elaboração de quatro artigos, que são apresentados em sequência. Registros fotográficos dos ensaios, diagramas dos experimentos e artigo IV encontram-se nos apêndices. I - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE Lippia alba (Mill) N.E.Br. II - ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE PLANTAS DO GÊNERO Ocimum III - ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA, APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS E CITOTÓXICA DAS PLANTAS Mentha x villosa Huds e Chenopodium ambrosioides L. As concentrações de trabalho utilizadas nos ensaios com osteoclastos foram obtidas a partir de ensaios prévios com linhagens celulares de câncer de mama (MCF-7 e MDA-231) e leucemia (K562). Esta triagem foi realizada para avaliar o comportamento dos compostos sobre linhagens conhecidas, visto que são escassos na literatura dados sobre a atividade das plantas estudadas em osteoclastos. Este trabalho resultou no artigo (Apêndice F) intitulado: IV - ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE PLANTAS MEDICINAIS CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO FRENTE AS LINHAGENS CELULARES K562, MCF-7 e MDA-231 43 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA SOBRE PERIODONTOPATÓGENOS E APOPTÓTICA EM OSTEOCLASTOS DE COMPOSTOS ISOLADOS DE Lippia alba (Mill) N.E.Br. Paulo Juiz, Mário Ávila Campos, Roberto Gambari, Roberta Piva, Letizia Penolazi, Franceli Silva, Angélica Lucchese e Ana Paula Uetanabaro. Resumo A doença periodontal é uma patologia de etiologia multifatorial, onde a resposta imune ao desafio microbiano resulta em ativação de osteoclastos e reabsorção do osso alveolar, culminando com a perda do elemento dental. Técnicas mecânicas (raspagem e alisamento radicular) e cirúrgicas, associadas ao uso de antibióticos e antissépticos são procedimentos adotados para limitar os danos causados e eliminar a microbiota patogênica. Neste contexto, o uso de plantas medicinais como terapia auxiliar tem merecido destaque. Com o objetivo de estudar a atividade antimicrobiana e controle da ativação de osteoclastos, compostos extraídos de Lippia alba (Mill) N.E.Br. foram estudados neste trabalho. Para ensaios de atividade antimicrobiana frente a Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida (CCMB 261), Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina (CCMB 262), Staphylococcus aureus resistente à novobiocina (CCMB 263), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Bacteroides fragilis (ATCC 25285) foi utilizada a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM). Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito por Matsuzaki et al. (1999), sendo posteriormente tratados com os compostos. A avaliação da apoptose em osteoclastos foi feita pelo teste TUNEL e por imunocitoquímica para receptor Fas. Os resultados de atividade antimicrobiana mostraram que os óleos essenciais das plantas estudadas foram mais efetivos em inibir o crescimento dos micro-organismos do que os extratos metanólicos, sendo os maiores valores de CIM registrados para bactéria E. coli. Entre os periodontopatógenos, os menores valores de CIM foram registrados para bactéria P. gingivalis e os maiores para A. actinomycetemcomitans. O óleo de L. alba foi considerado tóxico, embora os compostos carvona, limoneno e citral foram atóxicos e induziram apoptose em osteoclastos. Este trabalho mostrou que L. alba possui potencial biotecnológico para uso em odontologia, sendo ainda necessários ensaios in vivo para comprovar a atividade dos compostos estudados. Palavras-chave: carvona, citral, limoneno, Lippia alba, osteoclasto, periodontopatógenos. 44 1 Introdução Dentre as patologias mais comuns na cavidade bucal encontra-se a doença periodontal. É uma infecção predominantemente polimicrobiana, cuja principal consequência é a perda dentária, acompanhada de problemas estéticos, fonéticos, mastigatórios, com relevante comprometimento psicossocial. Existem evidências que relacionam as doenças periodontais como possíveis fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (SHOJI et al., 2011), acidente vascular cerebral (WU et al., 2000), infecções pulmonares (MACEDO et al., 2010), nascimento de bebês com baixo peso (CRUZ et al., 2005), contribuindo também para o controle glicêmico inadequado em diabéticos (TUNES, 2006), o que torna a doença periodontal um importante problema de saúde pública. O processo inflamatório na doença periodontal é desencadeado e perpetuado por periodontopatógenos, que são bactérias anaeróbias Gram-negativas, como Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum (DARVEAU et al., 1997). Mediadores pró-inflamatórios (IL-1, PGE2, TNFα) produzidos por linfócitos T presentes na intimidade da bolsa periodontal promovem a diferenciação e ativação de osteoclastos, culminado com a reabsorção óssea alveolar e consequente perda do dente (ISHIKAWA, 2007). O procedimento clínico mais usado para tratar a doença periodontal e/ou limitar os danos causados pela destruição óssea alveolar é a raspagem e alisamento radicular, associado ao uso de antimicrobianos, porém pesquisas relatam resistência dos periodontopatógenos aos antibióticos (ROBERTS, 2002; ARDILA et al., 2010; JAPONI et al., 2011). Ainda, embora com resultados comprovados, o antisséptico a base de gluconato de clorexidina apresenta efeitos adversos que comprometem o seu uso por períodos prolongados. Neste aspecto, o uso de plantas medicinais poderia ser uma alternativa promissora. Lippia alba é um planta da família Verbenaceae, conhecida popularmente como ervacidreira, chá-de-tabuleiro, cidrila, alecrim-selvagem, cidreira-brava, falsa-melissa, ervacidreira-de-campo, salva, salva-do-brasil, salva-limão, alecrim-do-campo, salva-brava, sálvia (LORENZI, 2008). Esta planta foi considerada a segunda mais utilizada na Bahia, sendo que em Cruz das Almas/BA, é usada como sedativa, para hipertensão, flatulência e dor (RODRIGUES e GUEDES, 2006), em Itacaré/BA, é usada para dor de estômago e problemas digestivos (PINTO et al., 2006). Com relação as atividades biológicas da L. alba, Abad et al. (1997) relataram propriedade anti-HSV-1. Segundo Hennebelle (2006), L. alba apresenta efeito 45 neurosedativo, analgésico, anti-inflamatório e antitumoral. O objetivo deste trabalho foi estudar a atividade da L. alba sobre periodontopatógenos e osteoclastos. 2 Material e Métodos 2.1 Obtenção das amostras vegetais O cultivo de Lippia alba foi feito nos meses de março a junho do ano 2010, no Horto de Plantas medicinais da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia localizado no município de Santo Antônio de Jesus, Latitude 12° 57′ 59.2”, Longitude 039° 15′ 49.4” LO. Todo o tratamento convencional de herborização seguiu o descrito por Mori et al. (1989). O material botânico coletado foi depositado no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana e identificado por especialista como Lippia alba (Mill) N.E.Br. (Verbenaceae) HUEFS 167949, pelo sistema de classificação de Cronquist (1981). 2.2 Extração de óleo essencial A técnica de hidrodestilação por arraste a vapor foi utilizada para obtenção dos óleos essenciais a partir de folhas e flores secas da planta. O processo de extração foi conduzido durante 3 horas. A composição química do óleo essencial foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), em cromatógrafo Shimadzu CG-2010 acoplado a Espectrômero de Massas CG/MS-QP 2010 Shimadzu, coluna WCOT de sílica fundida, 30 m x 0,25 µm, injetor CP-1177, temperatura do injetor 220oC, gás de arraste Hélio (1mL/min), temperatura da interface de 240oC, temperatura da fonte de ionização de 240oC, energia de ionização 70 eV, corrente de ionização 0,7 kV e programa de temperatura do forno 60oC a 240oC (3oC/min), 240oC (20min). Os componentes foram identificados através da comparação dos espectros de massas obtidos com os da biblioteca do equipamento e por comparação dos Índices de Kovats (IK) calculados com a literatura (ADAMS, 1995) empregando uma série homóloga de hidrocarbonetos. 2.3 Preparo dos extratos metanólicos O caule seco foi pulverizado em moinho de faca e as extrações foram realizadas por meio de maceração em recipientes de vidro, utilizando-se metanol, na proporção material/solvente de 1:5. O produto da maceração foi concentrado em evaporadores rotatórios (40-42°C, sob pressão reduzida) para obtenção dos extratos metanólicos. 46 2.4 Determinação da atividade antimicrobiana sobre bactérias aeróbias facultativas As amostras de extratos metanólicos e óleos voláteis da planta estudada foram testadas em uma triagem inicial contra os micro-organismos Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida CCMB 261, Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina CCMB 262, Staphylococcus aureus resistente a novobiocina CCMB 263 fornecidos pela Coleção de Culturas de Micro-organismos da Bahia (CCMB), usados como micro-organismos controle do experimento e com o objetivo de avaliar a atividade dos compostos frente a bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Uma alçada de uma cultura de 20h foi utilizada para preparo da suspensão bacteriana, em solução salina a 0,45%, na concentração de 1,5 x 106 UFC.mL-1. Para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) os extratos metanólicos foram solubilizados em uma solução de DMSO 50% e os óleos essenciais em uma solução de Tween80 10% de modo a obter uma concentração inicial de 200 mg.mL-1. Os compostos foram esterilizados em filtro Millipore de 0,22 µm. Foi utilizado o ensaio de suscetibilidade por microdiluição em caldo recomendado pelo CLSI (2002), com modificações, sendo que todos os testes foram realizados em caldo Müeller Hinton autoclavado em triplicata. Foram preparadas diluições seriadas na ordem de 100 mg.mL-1 a 0,0488 mg.mL-1 dos compostos testados em placas de microtitulação de 96 poços. Em seguida, cada poço recebeu 10 μL da suspensão de micro-organismo teste na concentração de 1,5 x 106 UFC.mL-1. As placas foram incubadas à 37ºC por 24 horas e a determinação da CIM foi feita pelo método colorimétrico utilizando 30 µL de resazurina 0,01%. Como controle foram usados: cloranfenicol 10 mg.mL-1, controle de viabilidade dos micro-organismos, esterilidade do meio e influência dos solventes (Tween e DMSO) sobre o crescimento microbiano. Cinco microlitros do conteúdo dos poços que mostraram atividade foram inoculados em ágar Müeller Hinton para determinação da concentração bactericida mínima (CBM). O crescimento bacteriano no meio de cultura contido na placa de Petri caracterizou o composto como tendo atividade bacteriostática, a ausência de crescimento, atividade bactericida. 2.5 Determinação da atividade antimicrobiana sobre bactérias anaeróbias estritas Os testes de suscetibilidade microbiana aos extratos metanólicos e óleos essenciais foram realizados segundo o método de macrodiluição em caldo do CLSI M11-A5, com modificações. Cepas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), 47 Bacteroides fragilis (ATCC 25285), preservadas em Skim-milk (10%) a -80oC foram ativadas em ágar sangue com 5% de sangue de carneiro desfibrinado suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1) e incubadas em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 72 horas para serem utilizadas na realização dos testes de suscetibilidade. O inóculo bacteriano teste foi preparado suspendendo colônias da cultura recente em 5 mL de caldo BHI (Brain Heart Infusion) suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1), seguido de incubação em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC durante 48 horas. Após o período de incubação, o inóculo bacteriano foi ajustado pelo método visual à escala 0.5 de McFarland (1,5 x 108 UFC.mL-1). Soluções estoques de 50 mg.mL-1 (de extratos e óleos essenciais) esterilizadas por filtração em membrana de 0,22 µm, foram preparadas utilizando como solvente: Tween80 10% para óleos essenciais e DMSO 50% para extratos metanólicos. Para os testes foram usadas concentrações crescentes dos compostos na ordem de 0,00625 a 3,2 mg.mL-1. A cada tubo de ensaio preparado foram adicionados 40 μL do inóculo bacteriano ajustado na turvação correspondente a escala 0.5 de McFarland. O material foi incubado em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 48 horas. Após o período de incubação (48h) foi feita a leitura pelo método visual, observando a turvação do meio e/ou a presença de sedimento no fundo do tubo de ensaio como indicativo de crescimento microbiano e ausência de atividade antimicrobiana. Como controle foram utilizados: gluconato de clorexidina 0,12% (Periogard Colgate®), controle de viabilidade dos micro-organismos, esterilidade do meio e influência dos solventes (Tween e DMSO) sobre o crescimento microbiano. Toda a metodologia foi feita em triplicata. Para aqueles tubos de ensaio com ausência visível de crescimento na etapa de determinação da CIM, 10 μL foram semeados em ágar sangue, suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1) e incubados em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 72 horas para determinação da CBM. 2.6 Indução de apoptose em osteoclastos 2.6.1 Cultura de osteoclastos Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito por Matsuzaki et al. (1999), com pequenas modificações. Sangue periférico foi coletado de voluntários saudáveis após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (aprovação do Comitato Etico dell'Arcispedale S.Anna, parecer n.11/2006). Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram obtidas de sangue periférico diluído (1:2 em solução de Hanks) e separadas por uma solução de polissacarose 5,7 g.dL-1 e diatrizoato de sódio 9,0 g.dL-1 (Histopaque 48 1077®-Sigma, St. Louis, MO, USA). As células mononucleares foram ressuspensas em D-MEM com alta concentração de glicose (Sigma, St.Louis, MO, USA), 50 U.mL-1 de penicilina e 50 U.mL-1 de estreptomicina, suplementado com 10% de FBS (Soro fetal bovino). 960.000 PBMC/poço foram cultivadas em placas de 96 poços e 2,4 x 106 PBMC/poço foram cultivadas em chamber slides por 2 horas. Os poços foram lavados para remoção de células não-aderentes e as células aderidas foram cultivadas na presença de MCSF (25 ng.mL-1), RANKL (30 ng.mL-1) e mantidas a 37°C em atmosfera com 5% CO2 por 14 dias. O meio de cultura era renovado a cada 3 dias. As células foram utilizadas nos experimentos descritos abaixo, quando existiu uma predominância de células multinucleadas na cultura. 2.6.2 Coloração para TRAP (Fosfatase ácida resistente ao tartarato) A coloração para TRAP foi feita segundo o que preconiza Villanova et al. (1999). Seis poços da placa de 96 poços contendo cultura de células multinucleares foram destinados para esta etapa do trabalho. Os poços foram lavados com tampão de ácido cacodílico 0.1 M , pH 7.2 (0.1 M de cacodilato de sódio e 0.0025% CaCl2) e fixadas em formaldeído 37% por 15 minutos, sendo posteriormente coradas para TRAP, segundo protocolo proposto pelo fabricante do Acid Phosphatase Kit n. 386 (Sigma, St. Louis, MO, USA). Após lavagem com água destilada e secagem, células multinucleadas com coloração violeta, contendo mais do que três núcleos incolores (osteoclastos), foram consideradas TRAP positivas (Apêndice E). 2.6.3 Ensaio de Citotoxicidade Após a confirmação, pelo teste TRAP, da presença de osteoclastos na cultura, os osteoclastos foram incubados por mais 3 dias na presença dos extratos metanólicos (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1, 500 µg.mL-1), óleos essenciais (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 500 µg.mL-1) e compostos majoritários citral, limoneno e carvona (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1), como controle negativo empregou-se uma solução de metanol/DMSO 3%, a qual foi utilizada para solubilizar os compostos. A determinação das células viáveis foi feita pelo ensaio do MTT. Após 72 h de um tratamento feito em triplicata, 25 μL de MTT foi adicionado a cada poço contendo células tratadas, seguido por um período de incubação de 2h/37°C. Após incubação, os cristais de MTT foram solubilizados com 100 μL de solução de lise pH 4.7 por 3 horas/37°C. A leitura da densidade óptica (DO) foi feita por espectrofotometria a 570 nm, usando a solução de lise como branco da reação. Foram 49 considerados não tóxicos os compostos que permitiram uma viabilidade celular maior ou igual a 90%. 2.6.4 Ensaio de apoptose O ensaio de apoptose foi determinado in vitro, por meio do teste TUNEL (Transferase desoxinucleotidil terminal mediada por marcação dUTP) em cultura de osteoclastos humanos cultivados em chamber slides e tratados com compostos considerados atóxicos (extrato metanólico extraídos de L. alba e compostos majoritários, presentes no óleo essencial, adquiridos da empresa Sigma Aldrich: limoneno, citral e carvona) pelo ensaio do MTT. Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito no ítem 2.6.1 Cultura de osteoclastos e após confirmação da osteoclastogênese pelo teste TRAP, as células foram tratadas por 72 h com os compostos atóxicos. As células foram lavadas duas vezes com solução de PBS e fixadas por 25 minutos com formalina 10%, a temperatura ambiente. Células apoptóticas foram detectadas pelo sistema DeadEnd Colorimetric Apoptosis Detection System (Promega) de acordo com orientação do fabricante. O sistema HRP estreptavidina/substrato presente no Kit foi usado para identificar células apoptóticas. A avaliação da apoptose foi calculada como uma porcentagem de núcleos apoptóticos (núcleos escurecidos, amarronzados) versus núcleos de células multinucleadas TRAP positivas, observadas em triplicatas. As lâminas foram montadas em glicerol/TBS 9:1 e observadas em microscópio Leitz. 2.6.5 Análise Imunocitoquímica A análise imunocitoquímica foi feita para avaliar a expressão de receptor Fas em osteoclastos cultivados em chamber slides e tratados com os compostos que foram capazes de induzir apoptose. Para realização dos ensaios laboratoriais foi utilizado o kit Ultraystain Polyvalent-HRP Immunostaining, segundo orientações do fabricante. Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito no ítem 2.6.1 Cultura de osteoclastos e após confirmação da osteoclastogênese pelo teste TRAP, os osteoclastos humanos foram tratados por 72 h com os compostos que foram capazes de induzir apoptose e fixados em metanol frio a 100%. Após lavagem com TBS 1X, pH 7,5, as células foram incubadas por 10 minutos em H2O2 3% para inativação da peroxidase endógena. O bloqueio para evitar o reconhecimento inespecífico de epítopos antigênicos foi feito com o reagente de bloqueio do kit Ultraystain Polyvalent-HRP Immunostaining. Após a reação com os anticorpos primários (diluição 1:500) específicos para o receptor Fas, o material foi incubado por um período de 16h/ 4°C. A reação foi identificada pelo uso de anticorpos antipolivalentes secundários (ImmPRESS Univeral Reagent Anti- 50 mouse/Rabbit Ig Peroxidase No.MP-7500 – VECTOR Laboratories) e uso do substrato cromogênico (ImmPACT TM DAB Peroxidase Substrate – VECTOR Laboratories) presente no kit. As lâminas foram montadas em glicerol/TBS 9:1 e observadas usando um microscópio Leitz. 3 Análise estatística Para análise estatística da atividade apoptótica foi adotado o teste de amostras para igualdade de proporções sem correção de continuidade, por meio do programa R version 2.10.1 Copyright Foundation for Statistical Computing ISBN 3-900051-07-0. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Para avaliação da atividade antimicrobiana foi feita uma análise descritiva dos resultados. 4 Resultados 4.1 Atividade antimicrobiana Os solventes utilizados no experimento não mostraram atividade antimicrobiana, com exceção da solução de DMSO para as cepas de Staphylococcus aureus. Foi constatado que na concentração de 25% a solução de DMSO inibiu o crescimento deste micro-organismo, desta forma foi desconsiderada para fins de avaliação a concentração de 50 mg.mL-1 dos extratos metanólicos para S. aureus. A tabela 1 mostra o resultado da atividade antimicrobiana do óleo essencial e extrato metanólico de Lippia alba frente as bactérias E. coli e S.aureus. No geral, o óleo essencial das flores de L. alba foi mais efetivo contra a bactéria S. aureus. Foram observados valores maiores de concentração inibitória mínima em relação a atividade do óleo essencial para bactéria E. coli quando comparada ao micro-organismo S. aureus, sendo o óleo essencial extraído de flores de L. alba mais efetivo para E. coli (CIM igual 12,5 mg.mL-1) que o óleo de folhas (CIM igual 25 mg.mL-1). Ambas as cepas de S. aureus utilizadas na determinação da CIM apresentaram sensibilidade na ordem de 0,78 mg.mL-1 a 1,56 mg.mL-1 para o óleo essencial e CIM 3,125 mg.mL-1 para o extrato metanólico. A tabela 2 mostra os resultados da atividade antimicrobiana frente aos anaeróbios estritos. Entre os micro-organismos anaeróbios estritos, foram observados valores menores de concentração inibitória mínima para bactéria P. gingivalis em relação a atividade do óleo extraído das folhas de L. alba (CIM 0,00625 mg.mL-1), quando comparado com a atividade 51 para os micro-organismos A. actinomycetemcomitans (CIM maior que 3,2 mg.mL-1), F. nucleatum (CIM 0,8 mg.mL-1) e B. fragilis (CIM 0,4 mg.mL-1). Em relação ao óleo essencial extraído das flores, foram observados valores menores de concentração inibitória mínima para bactéria P. gingivalis (CIM 0,0125 mg.mL-1), quando comparado a atividade para os microorganismos A. actinomycetemcomitans (CIM maior que 3,2 mg.mL-1), B. fragilis (CIM 1,6 mg.mL-1) e F. nucleatum (CIM 0,8 mg.mL-1). Com relação a atividade do extrato metanólico, os micro-organismos anaeróbios estritos mostraram-se resistentes as concentrações testadas, com CIM maior que 3,2 mg.mL-1, com exceção da bactéria P. gingivalis, cuja CIM foi 1,6 mg.mL-1. Tabela 1. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Lippia alba frente a E. coli e S. aureus. COMPOSTOS ÓLEOS ESSENCIAIS Lippia alba (folhas) Lippia alba (flores) EXTRATO METANÓLICO Lippia alba (caule) CONTROLE Cloranfenicol CIM 25 12,5 E.coli CBM 50 12,5 12,5 12,5 MICRO-ORGANISMOS S.aureus* CIM CBM 0,78 25 0,78 0,78 CIM 1,56 1,56 3,125 3,125 3,125 S.aureus** CBM 6,25 1,56 3,125 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Tween80 10% S.E S.E S.E S.E S.E S.E DMSO 12,5% S.E S.E S.E S.E S.E S.E *S. aureus CCMB262 (resistente a estreptomicina e dihidroestreptomicina), ** S. aureus CCMB263 (resistente a novobiocina), S.E – Sem Efeito. Tabela 2. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Lippia alba frente a micro-organismos anaeróbios estritos. COMPOSTOS ÓLEO ESSENCIAL B.fragilis CIM CBM 0,4 0,4 1,6 1,6 A.a* CIM > 3,2 > 3,2 Lippia alba (folhas) Lippia alba (flores) EXTRATO METANÓLICO Lippia alba (caule) > 3,2 > 3,2 > 3,2 CONTROLE Clorexidina 0,0075 0,0075 0,0075 Tween80 10% S.E S.E S.E DMSO 50% S.E S.E S.E * Aggregatibacter actinomycetemcomitans. S.E – Sem Efeito. MICRO-ORGANISMOS P.gingivalis CBM CIM CBM > 3,2 0,00625 0,00625 > 3,2 0,0125 0,0125 F.nucleatum CIM CBM 0,8 1,6 0,8 0,8 > 3,2 1,6 1,6 >3,2 > 3,2 0,0075 S.E S.E 0,001875 S.E S.E 0,001875 S.E S.E 0,00375 S.E S.E 0,00375 S.E S.E 4.2 Perfil cromatográfico dos óleos essenciais A tabela 3 mostra a composição química do óleo essencial de L. alba. Os resultados apontaram como princípios ativos majoritários, o citral (mistura de neral e geranial) 52 perfazendo 18,2% do óleo de folhas e 19,2% do óleo de flores, o limoneno 15,7% em folhas e 16,7% em flores e a carvona perfazendo 33,7% do óleo de folhas e 36,8% do óleo de flores. O quimiotipo de L. alba estudado foi considerado quimiotipo III, segundo classificação de Hennebelle et al. (2006a). Tabela 3. Análise da composição química do óleo extraído da planta Lippia alba. Composto IKlit IKcalc Folhas % Flores % α-Tujeno 1-Octen-3-ol 6-Metil-5-hepten-2-ona Mirceno Limoneno Z-β-Ocimeno E-β-Ocimeno Linalool Nerol Neral Carvona Geraniol Geranial E-Cariofileno Germacreno D Total Não identificados 930 979 985 990 1029 1037 1050 1096 1229 1238 1243 1252 1267 1419 1485 931 977 985 992 1029 1040 1051 1101 1231 1246 1250 1256 1272 1427 1488 0,2 0,4 1,8 8,3 15,7 0,2 0,5 1,1 2,2 11,7 33,7 2,9 6,5 2,9 3,4 91,4 8,6 0,6 0,7 1,0 7,8 16,7 0,2 1,3 0,2 0,6 11,6 36,8 2,5 7,6 1,6 2,7 91,9 8,1 IKlit- Indíce de Kovats na literatura. IKcalc – Índice de Kovats calculado 4.3 Citotoxicidade As figuras 1, 2 e 3 mostram os resultados do ensaio de citotoxicidade. O óleo essencial de L. alba foi considerado tóxico pelo ensaio do MTT. Não foram considerados tóxicos o extrato metanólico de L. alba em concentrações abaixo de 300 µg.mL-1, o citral em concentrações abaixo de 50 µg.mL-1 e o limoneno e carvona em concentrações abaixo de 300 µg.mL-1. % de células viáveis 80 Óleo essenci al de folhas de… 60 40 20 0 -1 5 50 500 µg.mL Figura 1. Porcentagem de células viáveis após exposição ao óleo essencial de folhas e flores de Lippia alba nas concentrações de 5, 50 e 500 µg.mL-1 53 160 140 % de células viáveis 120 100 Citral 80 60 Limon eno 40 20 0 -1 5 Figura 2. 50 300 µg.mL Porcentagem de células viáveis após exposição aos compostos citral, limoneno e carvona presentes no óleo essencial de Lippia alba nas concentrações de 5, 50 e 300 µg.mL-1 % de células viáveis 110 Extrato metanólico de Lippia alba 100 Extrato metanóli co de… 90 80 -1 5 50 300 500 µg.mL Figura 3. Porcentagem de células viáveis após exposição ao extrato metanólico de Lippia alba nas concentrações de 5, 50, 300 e 500 µg.mL-1 4.4 Atividade apoptótica em osteoclastos As figuras 4, 5 e 6 mostram a percentagem de núcleos apoptóticos em osteoclastos observados nas concentrações atóxicas apenas dos compostos que apresentaram atividade. Os resultados mostraram 100% de núcleos apoptóticos para citral nas concentrações de 5 a 50 µg.mL-1; aproximadamente 80% de núcleos apoptóticos para limoneno nas concentrações de 5 a 50 µg.mL-1; 88,57% de núcleos apoptóticos para limoneno na concentração de 300 µg.mL-1; 33% de núcleos apoptóticos para carvona na concentração de 5 µg.mL-1; 80% de núcleos apoptóticos para carvona na concentração de 50 µg.mL-1; 92% de núcleos apoptóticos para carvona na concentração de 300 µg.mL-1. Quando comparamos as atividades dos compostos atóxicos que induziram apoptose em osteoclastos, podemos constatar estatisticamente que na concentração de 5 µg.mL-1: A) o citral foi mais ativo que a carvona (p < 0,05) e o limoneno foi mais ativo que a carvona (p < 0,05). As concentrações 54 estudadas e que foram capazes de induzir apoptose em osteoclastos foram também capazes de induzir a expressão de receptor Fas em osteoclastos. A % de núcleos apoptóticos A µg.mL-1 B 50 µg.mL-1 5 µg.mL-1 Controle TUNEL 20µm 20µm 20µm C Fas 20µm 20µm 20µm Figura 4. Atividade apoptótica do composto citral nas concentrações 5 µg.mL-1 e 50 µg.mL-1, sobre cultura de osteoclastos humanos. A. Percentagem de núcleos apoptóticos em cultura de osteoclastos após 72 horas de tratamento. B. Detecção de osteoclastos em processo apoptótico (núcleos amarronzados apontados por setas vermelhas) pelo Teste TUNEL após 72h de tratamento. C. Imunocitoquímica representando a expressão do receptor Fas em osteoclastos humanos (células multinucleadas com coloração marrom) em processo apoptótico. 55 A % de núcleos apoptóticos Limoneno 100 80 Controle 60 5 40 50 20 300 0 Controle 5 50 300 µg.mL-1 B 5 µg.mL-1 Controle 50 µg.mL-1 300 µg.mL-1 TUNEL 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm C Fas 20µm 20µm Figura 5. Atividade apoptótica do composto limoneno nas concentrações 5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos. A. Percentagem de núcleos apoptóticos em cultura de osteoclastos após 72 horas de tratamento. B. Detecção de osteoclastos em processo apoptótico (núcleos amarronzados apontados por setas vermelhas) pelo Teste TUNEL após 72h de tratamento. C. Imunocitoquímica representando a expressão do receptor Fas em osteoclastos (células multinucleadas de coloração marrom) em processo apoptótico. 56 A Carvona % de núcleos apoptóticos 100 80 Controle 60 5 40 50 20 300 0 Controle 5 50 300 µg.mL-1 B Controle 5 µg.mL-1 50 µg.mL-1 300 µg.mL-1 TUNEL 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm C Fas Figura 6. Atividade apoptótica do composto carvona nas concentrações 5 µg.mL-1,50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos. A. Percentagem de núcleos apoptóticos em cultura de osteoclastos após 72 horas de tratamento. B. Detecção de osteoclastos em processo apoptótico (núcleos amarronzados apontados por setas vermelhas) pelo Teste TUNEL após 72h de tratamento. C. Imunocitoquímica representando a expressão do receptor Fas em osteoclastos humanos (células multinucleadas de coloração marrom) em processo apoptótico. 57 5 Discussão Este trabalho mostrou que nas concentrações testadas, utilizando-se a determinação da CIM e CBM, o óleo essencial extraído de folhas e flores de L. alba foi capaz de inibir especialmente o crescimento de S. aureus e P. gingivalis, porém não mostrou atividade frente a cepa de A. actinomycetemcomitans. Provavelmente a maior sensibilidade de P. gingivalis a ação dos compostos foi em decorrência do crescimento lento, in vitro, deste micro-organismo, visto que entre os anaeróbios estritos testados neste trabalho, a bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717) dotada de crescimento rápido in vitro, foi o microorganismo mais resistente entre os anaeróbios estritos estudados, com CIM superior a 3,2 mg.mL-1 e a bactéria com o crescimento mais lento, P. gingivalis, foi considerada a mais sensível. Segundo He et al. (2013), o uso de bochecho com um antisséptico contendo óleo essencial em sua composição, associado ao procedimento de raspagem e alisamento radicular, foi capaz de inibir significativamente os níveis de F. nucleatum e P. gingivalis no biofilme supra e subgengival, quando comparado ao grupo controle composto de indivíduos saudáveis que também fizeram uso do antisséptico. Cabe ressaltar que o procedimento de raspagem e alisamento radicular por si só é capaz de reduzir os níveis de periodontopatógenos no biofilme dental, porém a associação de um antisséptico, cuja composição apresenta compostos extraídos de plantas medicinais, pode ser um tratamento coadjuvante à terapia periodontal. Os óleos essenciais exercem um efeito letal sobre os micro-organismos por induzirem a lise da parede celular e inibirem a atividade enzimática, reduzindo o crescimento bacteriano e maturação do biofilme dental (KUBERT et al., 1993). Estudos clínicos mostraram que os óleos essenciais possuem atividade anti-placa dental e anti-gengivite (BRECX et al., 1992). Segundo Fine et al. (2007), os níveis de P. gingivalis, F. nucleatum, espécies de Veillonella e o número total de anaeróbios em pacientes com periodontite, foi significativamente menor após o uso diário por 14 dias, de uma solução contendo óleo essencial. Em relação aos micro-organismos aeróbios facultativos, foram observadas valores maiores de concentração inibitória mínima para bactéria E.coli (micro-organismo Gramnegativo). Segundo Madigan et al. (2004), a maior resistência de bactérias Gram-negativas a determinadas drogas, quando comparadas a bactérias Gram-positivas, é explicada em função da barreira seletiva apresentada pela membrana externa nas Gram-negativas. Embora já esteja bem documentada a maior resistência de bactérias Gram-negativas, este trabalho mostrou que os micro-organismos P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans e 58 F.nucleatum foram mais sensíveis ou tão sensíveis a ação dos compostos que a bactéria Gram-positiva S. aureus, possivelmente em função da determinação da CIM para periodontopatógenos ter sido realizada em anaerobiose, pois segundo Semprebom (2007), condições de anaerobiose parecem potencializar a ação de drogas. A referida autora comprovou que a CIM da clorexidina frente a Candida albicans foi de 2,34 µg.mL-1 a 37,5 µg.mL-1, quando o fungo foi cultivado na presença do antisséptico em anaerobiose, e 150 µg.mL-1 a 1200 µg.mL-1, na presença do oxigênio. Os óleos essenciais mostraram atividade antibacteriana superior aos extratos metanólicos. A maior atividade dos óleos poderia ser explicada pela presença do limoneno, carvona e citral na composição química do óleo essencial. Este trabalho mostrou que o óleo de L. alba com 15,7% de limoneno no óleo essencial extraído de folhas e 16,7% no óleo de flores, apresentou atividade principalmente frente a P. gingivalis e S.aureus. Segundo Shapira et al. (2006), o óleo de citrus com alta concentração de limoneno conseguiu inibir o crescimento de P. gingivalis e esta propriedade aumentou quando os autores associaram cloreto de magnésio ao óleo, o que resultou não somente na maior diminuição do crescimento bacteriano, como também menor expressão de citocinas pro-inflamatórias por células do sistema imune. O uso de princípios ativos encontrados em óleos essenciais de plantas medicinais no desenvolvimento de produtos farmacêuticos vem ganhando espaço no cenário da biotecnologia. A esse respeito Behan et al. (2006) depositaram o pedido de patente US20060153959A, onde os autores reivindicam uma composição química constituída, dentre outras substâncias, o citral. Segundo os autores, este novo medicamento teria a capacidade de inibir o crescimento e proteases de P. gingivalis. O óleo de L. alba neste estudo apresentou, além do limoneno, 18,2% de citral no óleo essencial extraído de folhas e 19,2% no óleo de flores, este óleo mostrou atividade contra P. gingivalis e merece um estudo mais aprofundado como um agente promissor na formulação futura de antissépticos bucais. No presente trabalho o citral foi capaz de induzir 100% de apoptose em osteoclastos nas concentrações de 5 µg.mL-1 a 50 µg.mL-1. Segundo Chaouki et al. (2009), o citral (3,7dimetil-2,6-octadienal) é capaz de ativar caspase-3 e induzir parada do ciclo celular na fase G2/M com consequente indução de apoptose. O citral é um vinil aldeído β-substituído presente em folhas e frutos de muitas plantas, em função de seu sabor e odor, é muito usado na indústria alimentícia e cosmética. É classificado como um agente químico seguro. Estimase que diariamente ingerimos 5 mg.Kg-1 de citral, além da exposição por contato com a pele 59 (OPDYKE, 1979 apud RESS et al., 2003). Em função da grande exposição diária ao citral, Ress et al. (2003) decidiram realizar um estudo in vivo com ratos e camundongos para testar o efeito tóxico deste composto. Os autores mostraram principalmente lesões renais relacionadas ao uso de citral, porém também ressaltaram que as doses administradas foram o equivalente a 10 vezes o consumo normal diário pelos seres humanos (RESS et al., 2003). O presente estudo mostrou que o citral foi considerado um composto com grande potencial biotecnológico para ser usado no tratamento da doença periodontal, visto que mostrou ser atóxico pelo ensaio do MTT, foi identificado em alta concentração no óleo essencial de L. alba com atividade antibacteriana frente a P. gingivalis e ainda foi capaz de induzir apoptose em 100% dos osteoclastos. Além do citral, os composto limoneno e carvona mostraram-se promissores. Este trabalho identificou 15,7% de limoneno no óleo essencial de folhas de L. alba, 16,7% de limoneno no óleo de flores de L. alba, 33,7% de carvona no óleo essencial de folhas de L. alba e 36,8% no óleo de flores desta planta. Embora o óleo de L. alba tenha sido considerado tóxico em concentrações inferiores a 500 µg.mL-1, o limoneno e a carvona foram considerados atóxicos em concentrações abaixo de 300 µg.mL-1. A baixa toxicidade do limoneno e da carvona também foram descritas por Yu et al. (2008) e Mesa-Arango et al. (2009) em seus estudos com L. alba, onde mostraram toxicidade para células Vero em concentrações acima de 200 µg.mL-1 para o quimiotipo de L. alba rico em carvona, resultados que se aproximam daqueles encontrados no presente estudo. Em relação a atividade do limoneno e carvona sobre osteoclastos, o limoneno mostrou uma atividade superior que a carvona na concetração de 5 µg.mL-1 (p < 0,05). O limoneno (1-metil-4-prop-1-en-2-il-ciclohexeno) e a carvona (2-metil-5-(1-metiletenil)-2- ciclohexenona) são dois monoterpenos derivados da via do mavalonato (CROWELL, 1999), possuem fórmula estrutural quase idêntica, onde a única diferença é a presença de um grupamento cetona na carvona, que modifica sua solubilidade e a torna um pouco menos efetiva que o limoneno (YU et al., 2008). Avaliando a ação dos compostos estudados, sobre osteoclastos, percebe-se que a atividade apoptótica parece estar relacionada com a expressão do receptor Fas. Por estar expresso em diversas células, incluindo osteoblasto, terapias cujo alvo molecular é o receptor Fas podem ser acompanhadas de efeitos colaterais. Kovacic et al. (2010) mostraram que a perda óssea observada pela deficiência de estrógeno está relacionada com ativação do receptor Fas em osteoblastos, sendo assim, a reabsorção óssea na osteoporose é o resultado da ativação da osteoclastogênese, associada a apoptose mediada por Fas em osteoblastos. Por 60 isso, quando se busca o receptor Fas como alvo molecular em terapias, é importante estudar fatores como a sensibilidade da célula a apoptose, que vai depender da presença e atividade de moléculas anti-apoptóticas. O uso de produtos naturais no tratamento de doenças traz novas perspectivas terapêuticas e a baixos custos para a população. Os compostos que mostraram atividade neste estudo poderiam ser usados na formulação de um antisséptico bucal, ou mesmo serem impregnados em chips biodegradáveis para inserção no sulco gengival de indivíduos acometidos pela doença periodontal, após raspagem e alisamento radicular. A opção pelos princípios ativos isolados das plantas parece ser uma melhor alternativa na escolha do composto a ser usado para formulação de um antisséptico que o uso de óleos e extratos, visto que fatores ambientais, como sazonalidade e fatores relacionados a técnica de cultivo da planta medicinal podem alterar a composição química de óleos essenciais e extratos, com o aumento ou diminuição de um determinado componente químico, o que poderia acarretar em um efeito sinérgico ou antagônico, potencializando ou diminuindo a atividade do óleo essencial e extratos produzidos, além de influenciar na toxicidade do produto final. Este trabalho mostrou que a planta L. alba, largamente utilizada na medicina popular, tem um potencial biotecnológico para formulação de medicamentos. Estudos in vivo são necessários para comprovar este potencial. A ideia primordial na indicação das plantas como candidatas a formulação de fitoterápicos não é substituir medicamentos registrados, comercializados e com atividade comprovada, mas sim aumentar a opção terapêutica para os profissionais da saúde. Em relação a odontologia, estudos epidemiológicos estimam que 90% da população apresenta alguma forma de doença periodontal (MORRIS et al., 2001; BORREL et al., 2002). Atualmente, a importância nos cuidados com a higiene bucal, tem ultrapassado o limite do chamado “dente saudável”, transpondo para uma visão, onde saúde periodontal significa saúde sistêmica e bem estar social, desta forma todas as pesquisas que tenham como objetivo o tratamento da periodontite, quer seja a nível microbiológico, genético, imunológico ou ambos, deverão ser sempre apontadas como pesquisas relevantes na busca por métodos terapêuticos curativos e/ou adjuvantes para doença periodontal. 6 Conclusão Comparando-se a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais extraídos das plantas estudadas com a atividade dos extratos metanólicos, pode-se concluir que os óleos 61 apresentaram uma melhor atividade. Avaliando a atividade de óleos essenciais e extratos metanólicos frente aos micro-organismos controles E. coli e S. aureus, percebe-se que valores maiores de CIM foram registrados para a atividade frente a bactéria E.coli. Em uma avaliação geral, os micro-organismos anaeróbios estritos foram considerados mais sensíveis a ação dos óleos e extratos, quando comparados com os micro-organismos aeróbios facultativos (E. coli e S. aureus). Entre os anaeróbios estritos, a bactéria Porphyromonas gingivalis foi considerada o micro-organismo mais sensível, sendo que maiores valores de concentração inibitória mínima foram observados para bactéria Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Foram considerados compostos capazes de induzir apoptose em osteoclastos: citral nas concentrações de 5 a 50 µg.mL-1; limoneno na concentração de 5 a 300 µg.mL-1; carvona na concentração de 50 a 300 µg.mL-1. Foi concluído que a atividade apoptótica dos compostos atóxicos testados parece estar relacionada com a expressão do receptor Fas. Estudos in vivo e sobre a formação do biofilme dental serão necessários para comprovar as atividades descritas neste estudo. Referências ABAD, M. 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A atividade antimicrobiana frente aos micro-organismos Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida (CCMB 261), Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina (CCMB 262), Staphylococcus aureus resistente à novobiocina (CCMB 263), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Bacteroides fragilis (ATCC 25285) foi avaliada por meio da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM). A avaliação da apoptose em osteoclastos foi realizada pelo teste TUNEL e por imunocitoquímica para receptor Fas. Os resultados mostraram que foram registrados maiores valores de CIM para a bactéria E. coli. Entre os periodontopatógenos, os menores valores de CIM foram observados para a atividade antimicrobiana frente a bactéria Porphyromonas gingivalis, sendo os maiores valores registrados para A. actinomycetemcomitans. O composto linalol nas concentrações de 50 a 300 µg.mL-1 induziu 75% de núcleos apoptóticos em osteoclastos, já o extrato metanólico a 300 µg.mL-1 foi capaz de induzir 100% de apoptose. Este trabalho mostrou que as plantas medicinais do gênero Ocimum estudadas apresentaram potencial biotecnológico para uso em odontologia, no entanto ensaios in vivo são necessários para comprovar a atividade dos compostos estudados. Palavras-chave: extrato, linalol, óleo essencial, Ocimum, osteoclasto, periodontopatógenos 68 1 Introdução O gênero Ocimum, família Lamiaceae, compreende mais de 64 espécies herbáceas e subarbustivas encontradas em regiões tropical e subtropical da Ásia, África, América Central e América do Sul. As plantas deste gênero apresentam grande diversidade de espécies, sendo conhecidas, popularmente, como alfavacas e manjericões (BLANK et al., 2002; LORENZI e MATOS, 2002). Diversas propriedades biológicas têm sido comprovadas para as espécies de Ocimum, como as atividades hipoglicemiante, anti-inflamatória, antinociceptiva, antileishmania, tripanossomicida (RABELO et al., 2003; UEDA-NAKAMURA et al., 2006), atividade antibacteriana e antifúngica (SUPPAKUL et al., 2003). Ocimum americanum L. da família Lamiaceae, é originária da Ásia e África e se adaptou a América tropical, onde é encontrada vegetando espontaneamente. É conhecida popularmente pelos nomes de alfavaca-de-vaqueiro, manjericão branco e anão, remédio-devaqueiro, alfavaca-do-campo (MATASYOH et al., 2006). Ao contrário das outras espécies de manjericões, não é utilizado com frequência na culinária, apresentando maior uso como planta medicinal (VIEIRA et al., 2003) para tratar asma, febre, tosse, gripe, bronquite e indigestão (AGRA et al., 2008; CHOWDHURY et al., 2008). Na Índia o extrato das folhas secas é usado para tratar eczema ou outras infecções epidérmicas (KOCHE et al., 2008) e no Kenya é usado como repelente (SEYOUM et al., 2002). Vieira et al. (2003) identificaram no extrato de O. americanum 19 flavonóides. A espécie é rica em óleos essenciais que podem possuir como constituintes majoritários metil cinamato (VIEIRA e SIMOM, 2000), eugenol e metilchavicol (SHADIA et al., 2007), dependendo do local de colheita. Os óleos essenciais e extratos dessa espécie apresentam diversas atividades biológicas, podendo-se destacar atividade antioxidante (HAKKIM et al., 2008), antimalárica (CLARKSON et al., 2004), repelente (SEYOUM et al., 2002), inseticida (SHADIA et al., 2007), antifúngica contra fitopatógenos (PANDEY e DUBEY, 1992) e antibacteriana frente a Propionibacterium acnes (VIYOCH et al., 2006). Da família Lamiaceae, o Ocimum basilicum L. é um subarbusto aromático anual, ereto, muito ramificado, de 30-50 cm de altura, nativo da Ásia tropical e introduzido no Brasil pela colônia italiana. Popularmente conhecida como alfavaca, alfavaca-cheirosa, alfavaca-daamérica, alfavaca-do-mato, alfavacão, basilicão, basilicum-grande, erva-real, manjericão, manjericão-de-flor-branca, quioiô, remédio-de-vaqueiro (LORENZI, 2008). Na medicina tradicional indiana o O. basilicum é usado como calmante, para asma e diabetes, além do seu uso como cosmético (LIN e KAN, 1990) e em Uighur é usado como cardiotônico, 69 antidiarréico e para aliviar dores abdominais (UPUR et al., 2004). O O. basilicum é usado pela indústria farmacêutica em função de suas propriedades espasmolíticas, carminativas, hepatoprotetoras, diuréticas (BARITAUX et al., 1992). Estudos científicos mostraram que o O. basilicum possui atividade antioxidante, antimicrobiana, antifúngica (BOZIN et al., 2006), anticâncer (MANOSROI et al., 2006), nematicida (de ALMEIDA et al., 2007), efeitos hipoglicêmicos (VATS et al., 2002), diminui a agregação plaquetária e trombos em camundongos (TOHTI et al., 2006). A análise química do chá de O. basilicum revelou a presença de taninos, flavonóides, saponinas, cânfora e no óleo essencial a presença de timol, metil-cinamato, linalol, eugenol, cineol e pireno (PANIZZA, 1988). Este trabalho teve como objetivo estudar a atividade antimicrobiana frente aos periodontopatógenos Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Fusobacterium nucleatum e atividade apoptótica em osteoclastos de óleos essenciais e extratos metanólicos extraídos de O. americanum e O. basilicum, para avaliar o potencial biotecnológico do uso de plantas do gênero Ocimum no tratamento da doença periodontal, uma doença de etiologia multifatorial, na qual a resposta imune direcionada aos periodontopatógenos resulta em reabsorção óssea alveolar por osteoclastos e perda dentária. 2 Material e Métodos 2.1 Obtenção das amostras vegetais O cultivo das plantas foi feito nos meses de março a junho do ano 2010, no Horto de Plantas medicinais da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, localizado no município de Santo Antônio de Jesus, Latitude 12° 57′ 59.2”, Longitude 39° 15′ 49.4” LO. Todo o tratamento de herborização seguiu o protocolo descrito por Mori et al. (1989). O material botânico coletado foi depositado no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS) e identificado por especialista pelo sistema de classificação de Cronquist (1981) como Ocimum americanum L. (HUEFS 167947) e Ocimum basilicum L. (HUEFS 167950), ambos da família Lamiaceae. 2.2 Extração de óleo essencial A técnica de hidrodestilação por arraste a vapor foi utilizada para obtenção do óleos essenciais a partir de folhas e flores secas das plantas. O processo de extração foi conduzido durante 3 horas. A composição química do óleo essencial foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), em cromatógrafo Shimadzu CG-2010 70 acoplado a Espectrômero de Massas CG/MS-QP 2010 Shimadzu, coluna WCOT de sílica fundida, 30 m x 0,25 µm, injetor CP-1177, temperatura do injetor 220oC, gás de arraste Hélio (1mL/min), temperatura da interface de 240oC, temperatura da fonte de ionização de 240oC, energia de ionização 70 eV, corrente de ionização 0,7 kV e programa de temperatura do forno 60oC a 240oC (3oC/min), 240oC (20min). Os componentes foram identificados através da comparação dos espectros de massas obtidos com os da biblioteca do equipamento e por comparação dos Índices de Kovats (IK) calculados com a literatura (ADAMS, 1995) empregando uma série homóloga de hidrocarbonetos. 2.3 Preparo dos extratos metanólicos O caule seco foi pulverizado em moinho de faca e as extrações foram realizadas por meio de maceração em recipientes de vidro, utilizando-se metanol, na proporção material/solvente de 1:5. O produto da maceração foi concentrado em evaporadores rotatórios (40-42°C, sob pressão reduzida). 2.4 Determinação da atividade antimicrobiana sobre bactérias aeróbias facultativas As amostras de extratos metanólicos e óleos voláteis das plantas estudadas foram testadas em uma triagem inicial contra os micro-organismos Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida CCMB 261, Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina CCMB 262, Staphylococcus aureus resistente a novobiocina CCMB 263 fornecidos pela Coleção de Culturas de Micro-organismos da Bahia (CCMB) usados como micro-organismos controle do experimento e para avaliar o efeito dos compostos em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Uma alçada de uma cultura de 20 h foi utilizada para preparo da suspensão bacteriana, em solução salina a 0,45%, na concentração de 1,5 x 106 UFC.mL-1. Para determinação da Concentração inibitória mínima (CIM) os extratos metanólicos foram solubilizados em uma solução de DMSO 50% e os óleos essenciais em uma solução de Tween80 10% de modo a obter uma concentração inicial de 200 mg.mL-1. Os compostos foram esterilizados por filtração em membrana de 0,22 µm. Foi utilizado o ensaio de suscetibilidade por microdiluição em caldo recomendado pelo CLSI (2002), com modificações, sendo que todos os testes foram realizados em caldo Müeller Hinton esterilizado em triplicata. Foram preparadas diluições seriadas dos compostos testados, na ordem de 100 mg.mL-1 a 0,0488 mg.mL-1 em placas de microtitulação de 96 poços. Em seguida, cada poço recebeu 10 μL da suspensão de micro-organismo teste na 71 concentração de 1,5 x 106 UFC.mL-1. As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e a determinação da CIM foi feita pelo método colorimétrico utilizando 30 µL de resazurina 0,01%. Como controle foram usados: cloranfenicol 10 mg.mL-1, controle de viabilidade dos micro-organismos, esterilidade do meio e influência dos solventes (Tween e DMSO) sobre o crescimento microbiano. Cinco microlitros do conteúdo dos poços que mostraram atividade foram inoculados em ágar Müeller Hinton para determinação da Concentração bactericida mínima (CBM). O crescimento bacteriano no meio de cultura contido na placa de Petri caracterizou o composto como tendo atividade bacteriostática, a ausência de crescimento, atividade bactericida. 2.5 Determinação da atividade antimicrobiana sobre bactérias anaeróbias estritas Os testes de suscetibilidade microbiana aos extratos metanólicos e óleos essenciais foram realizados segundo o método de macrodiluição em caldo do CLSI M11-A5, com modificações. Cepas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) e o micro-organismo controle Bacteroides fragilis (ATCC 25285), preservadas em Skim-milk (10%) a -80oC todas doadas pelo laboratório de anaeróbios da Universidade de São Paulo foram ativadas em ágar sangue com 5% de sangue de carneiro desfibrinado, suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1) e incubadas em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 72 horas para serem utilizadas na realização dos testes de suscetibilidade. O inóculo bacteriano teste foi preparado suspendendo colônias da cultura recente em 5 mL de caldo BHI (Brain Heart Infusion) suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1), seguido de incubação em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC durante 48 horas. Após o período de incubação, o inóculo bacteriano foi ajustado pelo método visual a escala 0.5 de McFarland (1,5 x 108 UFC.mL-1). Soluções estoques (de extratos e óleos essenciais) esterilizadas por filtração em membrana de 0,22 µm, com concentração de 50 mg.mL-1 foram preparadas utilizando como solvente: Tween80 10% para óleos essenciais e DMSO 50% para extratos metanólicos. Para os testes foram usadas concentrações crescentes dos compostos na ordem de 0,00625 a 3,2 mg.mL-1. A cada tubo de ensaio preparado foram adicionados 40 μL do inóculo bacteriano ajustado na turvação correspondente a escala 0.5 de McFarland. O material foi incubado em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 48 horas. Após o período de incubação (48h) foi feita a leitura pelo método visual, observando a turvação do meio e/ou a presença de sedimento no fundo do tubo de ensaio como indicativo de crescimento microbiano e ausência de atividade 72 antimicrobiana. Como controle foram utilizados gluconato de clorexidina 0,12% (Periogard Colgate®), controle de viabilidade dos micro-organismos, esterilidade do meio e influência dos solventes (Tween e DMSO) sobre o crescimento microbiano.Toda a metodologia foi feita em triplicata. Para aqueles tubos de ensaio com ausência visível de crescimento na etapa de determinação da CIM, 10 μL foram semeados em ágar sangue suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1) e incubados em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 72 horas para determinação da CBM. 2.6 Indução de apoptose em osteoclastos 2.6.1 Cultura de osteoclastos Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito por Matsuzaki et al. (1999), com pequenas modificações. Sangue periférico foi coletado de voluntários saudáveis após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (aprovação do Comitato Etico dell'Arcispedale S.Anna, parecer n.11/2006). Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram obtidas de sangue periférico diluído (1:2 em solução de Hanks) e separadas por uma solução de polissacarose 5,7 g.dL-1 e diatrizoato de sódio 9,0 g.dL-1 (Histopaque 1077®-Sigma, St. Louis, MO, USA). As células mononucleares foram ressuspensas em D-MEM com alta concentração de glicose (Sigma, St. Louis, MO, USA), 50 U.mL-1 de penicilina e 50 U.mL-1 de estreptomicina, suplementado com 10% de FCS (Soro fetal de bezerro). 960.000 PBMC/poço foram cultivadas em placas de 96 poços e 2,4 x 106 PBMC/poço foram cultivadas em chamber slides por 2 horas. Os poços foram lavados para remoção de células não-aderentes e as células aderidas foram cultivadas na presença de MCSF (25 ng.mL-1), RANKL (30 ng.mL-1) e mantidas a 37°C em atmosfera com 5% CO2 por 14 dias. O meio de cultura era renovado a cada 3 dias. As células foram utilizadas nos experimentos descritos abaixo, quando existiu uma predominância de células multinucleadas na cultura. 2.6.2 Coloração para TRAP (Fosfatase ácida resistente ao tartarato) A coloração para TRAP foi feita segundo o que preconiza Villanova et al. (1999). Seis poços da placa de 96 poços contendo cultura de células multinucleadas foram destinados para esta etapa do trabalho. Os poços foram lavados com tampão de ácido cacodílico 0.1 M , pH 7.2 (0.1 M de cacodilato de sódio e 0.0025% CaCl2) e fixadas em formaldeído 37% por 15 minutos, sendo posteriormente coradas para TRAP, segundo protocolo proposto pelo Acid Phosphatase Kit n. 386 (Sigma, St. Louis, MO, USA). Após lavagem com água destilada e 73 secagem, células multinucleadas com coloração violeta, contendo mais do que três núcleos incolores (osteoclastos), foram consideradas TRAP positivas (Apêndice E). 2.6.3 Ensaio de Citotoxicidade Após a confirmação da presença de osteoclastos na cultura pelo Teste TRAP, os osteoclastos foram incubados por mais 3 dias na presença dos extratos metanólicos (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1, 500 µg.mL-1), óleos essenciais (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 500 µg.mL-1) e compostos majoritários metil cinamato, cariofileno e linalol (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1), como controle uma solução de metanol/DMSO 3%, a qual foi utilizada para solubilizar os compostos. A determinação das células viáveis foi feita pelo ensaio do MTT. Após as 72 h de um tratamento feito em triplicata, 25 μL de MTT foi adicionado a cada poço contendo células tratadas, seguido por um período de incubação de 2h/37°C. Após incubação, os cristais de MTT foram solubilizados com 100 μL de solução de lise pH 4,7 por 3 horas/37°C. A leitura da densidade óptica foi feita por espectrofotometria a 570 nm, usando a solução de lise como branco da reação. Foram considerados não tóxicos os compostos que permitiram uma viabilidade celular maior ou igual a 90%. 2.6.4 Ensaio de apoptose O ensaio de apoptose foi determinado in vitro, por meio do teste TUNEL (Transferase desoxinucleotidil terminal mediada por marcação dUTP) em cultura de osteoclastos humanos tratados com compostos considerados atóxicos (extratos metanólicos nas concentrações 10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1, óleos essenciais nas concentrações 5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 500 µg.mL-1 e compostos majoritários metil cinamato, cariofileno na concentração de 5 µg.mL-1 e linalol a 5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1) pelo ensaio do MTT. Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito no ítem 2.6.1 Cultura de osteoclastos e após confirmação da osteoclastogênese pelo teste TRAP, as células foram tratadas por 72 h com os compostos atóxicos. Após tratamento de 72 h, as células foram lavadas duas vezes com solução de PBS e fixadas por 25 minutos com formalina 10%, a temperatura ambiente. Células apoptóticas foram detectadas pelo sistema DeadEnd Colorimetric Apoptosis Detection System (Promega) de acordo com orientação do fabricante. O sistema HRP estreptavidina/substrato presente no Kit foi usado para identificar células apoptóticas. A avaliação da apoptose foi calculada como uma porcentagem de núcleos apoptóticos (núcleos escurecidos, amarronzados) versus núcleos de células multinucleadas 74 TRAP positivas, observadas em triplicatas. As lâminas foram montadas em glicerol/TBS 9:1 e observadas em microscópio Leitz. 2.6.5 Análise Imunocitoquímica A análise imunocitoquímica foi feita para avaliar a expressão de receptor Fas em osteoclastos tratados com os compostos que foram capazes de induzir apoptose. Para realização dos ensaios laboratoriais foi utilizado o kit Ultraystain Polyvalent-HRP Immunostaining, segundo orientações do fabricante. Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito no ítem 2.6.1 Cultura de osteoclastos e após confirmação da osteoclastogênese pelo teste TRAP, os osteoclastos humanos foram tratados por 72 h, com os compostos que foram capazes de induzir apoptose, e fixados em metanol frio a 100%. Após lavagem com TBS 1X, pH 7,5, as células foram incubadas por 10 minutos em H2O2 3% para inativação da peroxidase endógena. O bloqueio para evitar o reconhecimento inespecífico de epítopos antigênicos foi feito com o reagente de bloqueio do kit Ultraystain Polyvalent-HRP Immunostaining. Após a reação com os anticorpos primários (diluição 1:500) específicos para o receptor Fas, o material foi incubado por um período de 16h/ 4°C. A reação foi identificada pelo uso de anticorpos antipolivalentes secundários (ImmPRESS Univeral Reagent Antimouse/Rabbit Ig Peroxidase No.MP-7500 – VECTOR Laboratories) e uso do substrato cromogênico (ImmPACT TM DAB Peroxidase Substrate – VECTOR Laboratories) presente no kit. As lâminas foram montadas em glicerol/TBS 9:1 e observadas usando um microscópio Leitz. 2.6.6 Ensaio de atividade antiosteoclastogênica Células mononucleares de sangue periférico foram cultivadas como descrito no tópico 2.6.1 cultura de osteoclastos deste trabalho, na presença dos compostos atóxicos que não foram capaz de induzir apoptose. O tratamento era refeito a cada três dias. Como controle foram utilizados 3 poços da placa de cultura sem tratamento e 3 poços com células tratadas com o solvente usado para solubilizar os compostos (metanol/DMSO 3%). Ao final do processo a coloração para TRAP foi feita para avaliar a presença ou ausência de osteoclastos. O objetivo desta etapa foi avaliar se aqueles compostos que não foram capazes de induzir apoptose em osteoclastos formados, seriam capazes de impedir a formação e diferenciação de precursores de osteoclastos. 75 3 Análise estatística Para análise estatística da atividade apoptótica foi adotado o teste de amostras para igualdade de proporções sem correção de continuidade, por meio do programa R version 2.10.1 Copyright Foundation for Statistical Computing ISBN 3-900051-07-0. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Para avaliação da atividade antimicrobiana foi feita uma análise descritiva. 4 Resultados 4.1 Atividade antimicrobiana Os solventes utilizados no experimento não mostraram atividade antimicrobiana, com exceção da solução de DMSO para as cepas de Staphylococcus aureus. Foi constatado que na concentração de 25% a solução de DMSO inibiu o crescimento deste micro-organismo, desta forma foi desconsiderada para fins de avaliação a concentração de 50 mg.mL-1 dos extratos metanólicos para S. aureus. A tabela 1 mostra o resultado da atividade antimicrobiana do óleo essencial e extrato metanólico de Ocimum americanum e Ocimum basilicum frente às bactérias E. coli e S.aureus. Foram observados valores maiores de concentração inibitória mínima para a atividade dos óleos essenciais de ambas as plantas frente ao micro-organismo E. coli, sendo a CIM registrada de 50 mg.mL-1 para o óleo extraído das folhas e CIM de 100 mg.mL-1 para o óleo extraído das flores de O. americanum, e CIM registrada maior que 100 mg.mL-1 para os óleos de O. basilicum. O S.aureus resistente a estreptomicina foi mais sensível a ação dos compostos, quando comparado ao S. aureus resistente a novobiocina, sendo o óleo essencial extraído das folhas de O. americanum e O. basilicum, aquele que mostrou a melhor atividade frente a S. aureus (CIM 1,56 mg.mL-1 e CIM 0,78 mg.mL-1, respectivamente). Foi considerado bactericida para E. coli, o óleo essencial extraído de flores de O. americanum (CBM 100 mg.mL-1) e para cepa de Staphylococcus aureus CCMB 263, o óleo essencial extraído de flores de O. basilicum (CBM 50 mg.mL-1). Todos os extratos metanólicos mostraram atividade bactericida. A tabela 2 mostra os resultados da atividade antimicrobiana frente aos anaeróbios estritos. Os óleos essenciais extraídos de folhas e flores, tanto de O. americanum quanto de O. basilicum mostraram destacada ação contra P. gingivalis (CIM 0,0125 mg.mL-1 e 0,00625 76 mg.mL-1, para óleo de folha e flores de O. americanum, respectivamente e 0,00625 mg.mL-1 e 0,0125 mg.mL-1 para óleo de folha e flores de O. basilicum, respectivamente). Os extratos metanólicos do caule também foram mais efetivos contra P. gingivalis, com valor de CIM igual 0,4 mg.mL-1 para os extratos de O. americanum e O.basilicum. Valores de CIM maior que 3,2 mg.mL-1 para todos os compostos testados foram registrados para o micro-organismo A. actinomycetemcomitans. Em geral, os óleos e extratos testados apresentaram atividade bactericida nos mesmos valores de sua CIM. Tabela 1. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Ocimum americanum e Ocimum basilicum frente a E. coli e S. aureus. COMPOSTOS ÓLEOS ESSENCIAIS E.coli O.americanum (folhas) O.americanum (flores) O.basilicum (folhas) O.basilicum (flores) EXTRATO METANÓLICO O.americanum (caule) O.basilicum (caule) CONTROLE Cloranfenicol CIM 50 100 S.E S.E CBM 100 100 S.E S.E 12,5 6,25 12,5 6,25 MICRO-ORGANISMOS S.aureus* CIM CBM 1,56 50 3,125 100 0,78 25 6,25 12,5 CIM 12,5 6,25 6,25 50 S.aureus** CBM 50 50 25 50 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 6,25 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Tween 10% S.E S.E S.E S.E S.E S.E DMSO 12,5% S.E S.E S.E S.E S.E S.E *S. aureus CCMB262 (resistente a estreptomicina e dihidroestreptomicina), ** S. aureus CCMB263 (resistente a novobiocina). S.E- Sem Efeito Tabela 2. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Ocimum americanum e Ocimum basilicum frente a microorganismos anaeróbios estritos. COMPOSTOS ÓLEO ESSENCIAL B.fragilis CIM CBM 0,8 0,8 0,4 0,4 0,4 0,4 0,2 0,2 CIM >3,2 >3,2 >3,2 >3,2 A.a* CBM >3,2 >3,2 >3,2 >3,2 O. americanum (folhas) O. americanum (flores) O. basilicum (folhas) O. basilicum (flores) EXTRATO METANÓLICO O. americanum (caule) 3,2 > 3,2 > 3,2 O. basilicum (caule) > 3,2 > 3,2 > 3,2 CONTROLE Clorexidina 0,0075 0,0075 0,0075 Tween 10% S.E S.E S.E DMSO 50% S.E S.E S.E * Aggregatibacter actinomycetemcomitans, S.E – Sem Efeito MICRO-ORGANISMOS P.gingivalis CIM CBM 0,0125 0,0125 0,00625 0,00625 0,00625 0,00625 0,0125 0,0125 F.nucleatum CIM CBM 0,4 0,4 0,4 0,4 3,2 3,2 >3,2 >3,2 > 3,2 > 3,2 0,4 0,4 0,4 0,4 >3,2 > 3,2 > 3,2 > 3,2 0,0075 S.E S.E 0,001875 S.E S.E 0,001875 S.E S.E 0,00375 S.E S.E 0,00375 S.E S.E 77 4.2 Perfil cromatográfico dos óleos essenciais As tabelas 3 e 4 mostram a composição química do óleo essencial de Ocimum americanum e Ocimum basilicum. Os resultados apontaram como princípio ativo majoritário do óleo essencial de O. americanum o E-metil cinamato, perfazendo 45,5% do óleo essencial extraído de folhas e 54,4% do óleo extraído de flores de O. americanum (Tabela 3). Tabela 3. Análise da composição química do óleo essencial extraído da planta Ocimum americanum. Composto IKlit IKcalc Folhas % Flores % α-Pineno Sabineno β-pineno Mirceno Limoneno 1,8-Cineol E-β-Ocimeno Fenchona Linalol Cânfora Terpinen-4-ol Metil chavicol Z-Cinamato de metila E-Cinamato de metila E-Cariofileno Germacreno D Total Não identificados 939 975 979 990 1029 1031 1050 1092 1096 1146 1177 1196 1299 1378 1419 1485 939 977 982 992 1033 1036 1051 1086 1100 1150 1182 1200 1305 1388 1427 1489 1,0 0,5 1,1 0,6 1,2 10,4 1,6 1,2 3,0 2,1 2,3 9,7 6,5 45,5 0,9 1,0 88,6 11,4 0,7 0,3 0,7 0,3 0,6 6,7 1,3 0,5 5,6 2,0 1,8 6,8 4,6 54,4 1,1 1,1 88,5 11,5 IKlit- Indíce de Kovats na literatura. IKcalc – Índice de Kovats calculado O óleo essencial de folhas de O. basilicum apresentou 18% de metil eugenol, 12,0% de cariofileno, 11,2% de 1,8-cineol e o óleo de flores 15,9% de linalol, 13,4% de 1,8-cineol 12,5% de cariofileno (Tabela 4). Tabela 4. Análise da composição química do óleo essencial extraído da planta Ocimum basilicum. Composto IKlit IKcalc Flores % Folhas % α-Pineno Sabineno β-pineno Mirceno Limoneno 1,8-Cineol Z-β-Ocimeno Linalol Eugenol β-Elemeno 939 975 979 990 1029 1031 1037 1096 1359 1390 939 977 982 992 1033 1036 1044 1100 1359 1396 0,9 0,5 1,8 0,6 0,4 13,4 3,1 15,9 2,9 6,4 0,5 0,4 1,3 0,5 0,5 11,2 5,1 2,2 9,3 2,7 78 Continuação Tabela 4 Metileugenol Cariofileno α-Humuleno β-Selineno Biciclogermacreno α-Bulneseno Elimicina Espatulenol Total Não identificados 1403 1419 1454 1490 1500 1500 1557 1578 1403 1427 1461 1492 1502 1502 1558 1584 2,1 12,5 3,5 1,7 14,6 2,8 2,1 1,8 87,0 13,0 18,0 12,0 2,6 2,2 4,7 4,1 14,6 1,8 93,7 6,3 IKlit- Indíce de Kovats na literatura. IKcalc – Índice de Kovats calculado 4.3 Citotoxicidade As figuras 1, 2, 3 e 4 mostram os resultados do ensaio de citotoxicidade. Foram considerados atóxicos aqueles compostos que permitiram uma viabilidade celular maior ou igual a 90%. Os resultados apontaram que o óleo essencial extraído de folhas e flores de O. americanum em concentrações menores ou iguais a 50 µg.mL-1, o óleo essencial extraído de folhas de O. basilicum em concentrações menores ou iguais a 50 µg.mL-1 , os extratos das plantas em concentrações menores que 300 µg.mL-1 e o óleo essencial extraído de flores de O. basilicum em concentrações menores ou iguais a 5 µg.mL-1 não foram tóxicos. Com relação a toxicidade apresentada pelos compostos majoritários presentes nos óleos essenciais, o linalol presente no óleo de O. basilicum foi considerado atóxico em concentrações menores ou iguais a 300 µg.mL-1, seguido do metil cinamato presente no óleo essencial de O. americanum e cariofileno presente no óleo essencial de O. basilicum, ambos com concentrações atóxicas inferiores ou iguais a 5 µg.mL-1. % de células viáveis 140 120 100 Óleo essencial de folhas de Ocimum american um 80 60 40 20 0 5 50 500 µg.mL Figura 1. Porcentagem de células viáveis após exposição ao óleo essencial de folhas e flores de Ocimum americanum nas concentrações de 5, 50 e 500 µg.mL-1 79 120 % de células viáveis 100 80 Óleo essencial de folhas de Ocimum basilicu m 60 40 20 0 5 50 500 -1 µg.mL Figura 2. Porcentagem de células viáveis após exposição ao óleo essencial de folhas e flores de Ocimum basilicum nas concentrações de 5, 50 e 500 µg.mL-1 140 % de células viáveis 120 Linalol 100 80 Cariofilen o 60 Metil cinamato 40 20 0 5 50 300 -1 µg.mL Figura 3. Porcentagem de células viáveis após exposição aos compostos linalol, cariofileno e metil cinamato presentes no óleo essencial das plantas do gênero Ocimum nas concentrações de 5, 50 e 300 µg.mL-1 80 % de células viáveis 110 105 Extrato metanólico de Ocimum americanu m 100 95 90 85 5 50 300 500 -1 µg.mL Figura 4. Porcentagem de células viáveis após exposição aos extratos metanólicos das plantas do gênero Ocimum nas concentrações de 5, 50, 300 e 500 µg.mL-1 4.4 Atividade apoptótica em osteoclastos A percentagem de núcleos apoptóticos, avaliada pelo teste TUNEL, em cultura de osteoclastos após 72 horas de tratamento com os compostos e imunocitoquímica representando a expressão do receptor Fas em osteoclastos humanos em processo apoptótico estão representados nas Figuras 5, 6 e 7. Foram representados apenas os compostos que mostraram atividade apoptótica. Os resultados apontaram 11% de núcleos apoptóticos para o extrato metanólico de O. americanum na concentração de 50 µg.mL-1; 100% de núcleos apoptóticos para o extrato metanólico de O. americanum na concentração de 300 µg.mL-1; 18% de núcleos apoptóticos para extrato metanólico de O. basilicum na concentração de 50 µg.mL-1; 93% de núcleos apoptóticos para extrato metanólico de O. basilicum na concentração de 300 µg.mL-1 e aproximadamente 75% de núcleos apoptóticos para linalol nas concentrações de 50 a 300 µg.mL-1. Os óleos essenciais de O. americanum e O. basilicum, bem como os compostos majoritários metil cinamato e cariofileno não foram capazes de induzir apoptose. Os compostos que induziram apoptose foram capazes de induzir a expressão de receptor Fas em osteoclastos. Quando comparamos as atividades dos compostos atóxicos que induziram apoptose em osteoclastos, podemos constatar estatisticamente que na concentração de 50 µg.mL-1 o linalol foi mais ativo que o extrato metanólico de O. americanum (p < 0,05) e O. basilicum (p < 0,05). Os compostos (óleo essencial extraído de flores e folhas de O. americanum e O. 81 basilicum, e os compostos metil cinamato, cariofileno e linalol na concentração de -1 5 µg.mL ), em suas concentrações atóxicas, que não induziram apoptose também não foram capazes de impedir a formação de osteoclastos (Figuras 8). A Linalol % de núcleos apoptóticos 80 70 60 Controle 50 5 40 30 20 50 µg/mL µg/mL 300 10 0 Controle 5 50 300 µg.mL-1 B Controle 5 µg.mL-1 50 µg.mL-1 300 µg.mL-1 TUNEL 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm C Fas Figura 5. Atividade apoptótica do composto linalol nas concentrações 5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos. A. Percentagem de núcleos apoptóticos em cultura de osteoclastos após 72 horas de tratamento. B. Detecção de osteoclastos em processo apoptótico (núcleos amarronzados apontados por setas vermelhas) pelo Teste TUNEL após 72h de tratamento. C. Imunocitoquímica representando a expressão do receptor Fas em osteoclastos humanos (células de coloração marrom) em processo apoptótico. 82 % de núcleos apoptóticos A Extrato metanólico de Ocimum americanum L. 120 100 80 Controle 60 10 40 50 20 300 0 C Controle 10 50 300 µg.mL-1 B 10 µg.mL-1 Controle 50 µg.mL-1 300 µg.mL-1 TUNEL 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm C Fas Figura 6. Atividade apoptótica do extrato metanólico de Ocimum americanum L. nas concentrações 10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos. A. Percentagem de núcleos apoptóticos em cultura de osteoclastos após 72 horas de tratamento. B. Detecção de osteoclastos em processo apoptótico (núcleos amarronzados apontados por setas vermelhas) pelo Teste TUNEL após 72h de tratamento. C. Imunocitoquímica representando a expressão do receptor Fas em osteoclastos humanos (células de coloração marrom) em processo apoptótico. 83 % de núcleos apoptóticos A Extrato metanólico de Ocimum basilicum 100 80 Controle 60 10 40 50 20 300 0 Controle 10 50 300 µg.mL-1 B 10 µg.mL-1 Controle 50 µg.mL-1 300 µg.mL-1 TUNEL C 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm 20µm C Fas Figura 7. Atividade apoptótica do extrato metanólico de Ocimum basilicum nas concentrações 10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1 e 300 µg.mL-1 sobre cultura de osteoclastos humanos. A. Percentagem de núcleos apoptóticos em cultura de osteoclastos após 72 horas de tratamento. B. Detecção de osteoclastos em processo apoptótico (núcleos amarronzados apontados por setas vermelhas) pelo Teste TUNEL após 72h de tratamento. C. Imunocitoquímica representando a expressão do receptor Fas em osteoclastos humanos (células multinucleadas de coloração marrom) em processo apoptótico. 84 A B C Figura 8. A. Cultura de PBMC após 24 horas de indução com M-CSF e RANKL. B. Cultura de PBMC após 5 dias de indução com M-CSF e RANKL na presença dos compostos. Observar prolongamentos citoplasmáticos indicando início do processo de fusão citoplasmática para formação de células multinucleadas (setas). C. Cultura de PBMC após 15 dias de indução com M-CSF e RANKL na presença dos compostos. Observar a presença de osteoclastos (seta). Registro fotográfico realizado com máquina digital modelo Samsung SL102. 85 5 Discussão Os solventes utilizados no experimento não mostraram atividade antimicrobiana, com exceção da solução de DMSO para as cepas de Staphylococcus aureus. Foi constatado que na concentração de 25% a solução de DMSO inibiu o crescimento deste micro-organismo, desta forma foi desconsiderada para fins de avaliação a concentração de 50 mg.mL-1 dos extratos metanólicos para S. aureus. A concentração de trabalho do Tween deve variar entre 0,5% a 20% quando se trabalha com óleos essenciais (NASCIMENTO et al., 2007), porém para Hood et al. (2003) a concentração ideal de trabalho do Tween80 é 0,02%, segundo estes autores, nesta concentração este detergente não tem ação antimicrobiana. Este trabalho mostrou que é possível trabalhar com Tween80 a 10% quando se deseja determinar a CIM de óleos essenciais frente as cepas de Staphylococcus aureus CCMB 262 e CCMB 263, Escherichia coli CCMB 261, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) e Bacteroides fragilis (ATCC 25285). Não existe um consenso sobre o nível de inibição para produtos naturais quando comparados com antibióticos padrões. Aligianis et al. (2001) propuseram uma classificação da atividade antimicrobiana, para compostos extraídos de plantas medicinais, com base em resultados de CIM, considerando: forte inibição CIM até 0,5 mg.mL-1, inibição moderada CIM entre 0,6 mg.mL-1 e 1,5 mg.mL-1, fraca atividade CIM acima de 1,6 mg.mL-1, porém esta classificação foi discutida por Roersch (2012), em função da falta de embasamento. Segundo Holetz et al. (2002), a atividade de um composto extraído de plantas medicinais deve ser considerada ótima quando a CIM é menor que 1,0 mg.mL-1. Ainda em relação aos controles positivos, utilizamos os micro-organismos E. coli como representante Gram-negativo e S. aureus como representante Gram-positivo, ambos com crescimento em aerobiose. Estes micro-organismos foram utilizados com o objetivo de comparar o efeito inibitório dos compostos entre bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. Também foi utilizada, como controle positivo, a bactéria B. fragilis como representante Gram-negativo com crescimento em anaerobiose. A escolha da bactéria B. fragilis como micro-organismo controle se deve a alta resistência a agentes antimicrobianos, tradicionalmente usados no tratamento de infecções causadas por anaeróbios, apresentada por este patógeno (NAKANO et al., 2011). 86 Foram observadas valores maiores de concentração inibitória mínima para bactéria E.coli em relação a atividade dos óleos essenciais extraídos de folhas e flores de O. americanum e O. basilicum. Segundo Mounia (2006) bactérias Gram-negativas são menos suscetíveis a ação dos óleos essenciais, pois a membrana externa restringe a difusão de componentes hidrofóbicos em função do lipopolissacarídeo presente na membrana externa. Não só Mounia (2006), mas também Ali et al. (2001), afirmaram que as bactérias Gramnegativas são mais resistentes a ação dos óleos essenciais. A CIM registrada para os óleos essenciais da planta O. americanum, frente a E.coli, foi 50 mg.mL-1 para o óleo extraído das folhas e CIM de 100 mg.mL-1 para o óleo extraído das flores. Estes resultados estão de acordo com os encontrados por Dhale et al. (2010), que registraram CIM de 100 mg.mL-1 para os extratos de folhas de O. americanum contra E.coli. Em relação aos micro-organismos anaeróbios estritos, foram observadas valores menores de concentração inibitória mínima para bactéria P. gingivalis, considerada a mais sensível a ação do óleo essencial de O. americanum. Da mesma forma, Thaweboon et al. (2012) utilizando a técnica ágar difusão para determinar a CIM, mostraram que P. gingivalis foi sensível a ação do óleo desta planta; os autores registraram CIM igual 0,35 mg.mL-1 para este patógeno (THAWEBOON et al., 2012). Também o presente estudo mostrou que P.gingivalis foi o micro-organismo mais sensível a ação do óleo essencial de O. americanum, porém, foi registrada uma sensibilidade maior (CIM 0,0125 mg.mL-1) que a descrita por Thaweboon et al. (2012). A diferença nos resultados poderia ser explicada pela diferente composição do óleo essencial da planta cultivada em diferentes condições ou até mesmo em função da técnica usada para determinação da CIM, pois sendo um composto hidrofóbico, a difusão do óleo essencial no ágar estaria dificultada, o que poderia influenciar na atividade antimicrobiana registrada por Thaweboon. Segundo He et al. (2013), o uso de bochecho com um antisséptico contendo óleo essencial em sua composição, associado ao procedimento de raspagem e alisamento radicular, foi capaz de inibir significativamente os níveis de F. nucleatum e P. gingivalis no biofilme supra e subgengival, quando comparado ao grupo controle composto de indivíduos saudáveis, que também fizeram uso do antisséptico. Cabe ressaltar, que o procedimento de raspagem e alisamento radicular por si só é capaz de reduzir os níveis de periodontopatógenos no biofilme dental, porém a associação de um antisséptico cuja composição apresenta compostos extraídos de plantas medicinais pode ser um tratamento coadjuvante à terapia periodontal. Deve-se ter em mente que os testes de atividade antimicrobiana, no presente estudo, para os periodontopatógenos foram feitos para bactérias de vida livre e não na presença de 87 biofilme dental, o qual segundo Feres et al. (2002) tem a capacidade de proteger os microorganismos da ação de antimicrobianos. A este respeito Fine et al. (2001) estudaram a ação de óleos essenciais sobre o biofilme e sobre bactérias planctônicas. Os autores mostraram que de fato o biofilme confere uma maior resistência a ação de drogas, visto que foram mais suscetíveis a ação dos óleos, apenas aquelas bactérias de vida livre. O S.aureus resistente a estreptomicina foi mais sensível a ação dos compostos, quando comparado ao S. aureus resistente a novobiocina, sendo o óleo essencial extraído das folhas de O. basilicum, aquele que mostrou a melhor atividade, entre as plantas do gênero Ocimum, frente a S. aureus (CIM 0,78 mg.mL-1). Duarte et al. (2006) em seus estudos com 80 espécies de plantas medicinais, observou que o O. basilicum cultivado em Campinas – São Paulo, não teve potencial antimicrobiano contra S. aureus, diferente deste estudo, onde o óleo essencial extraído de folhas de O. basilicum cultivado no Recôncavo da Bahia, apresentou CIM de 0,78 mg.mL-1 contra S. aureus. Por outro lado, os resultados deste estudo corroboram os resultados encontrados por Soares et al. (2006), Opalchenova et al. (2003), que descreveram alta sensibilidade do S.aureus ao óleo extraído de folhas de O. basilicum. O extrato metanólico produzido a partir do caule de O. basilicum não apresentou um resultado satisfatório contra E.coli, S.aureus (CCMB263), A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum, B. fragilis. Alzoreky et al. (2003) apud Soares et al. (2006) também consideraram o extrato desta planta inativo contra S. aureus, enquanto Diaz et al. (2001) apud Soares et al. (2006) afirmaram em seus estudos, que o extrato apresentou alta atividade. A atividade do óleo de O. basilicum poderia ser explicada pela presença de linalol na composição química do óleo, pois segundo Randrianarivelo et al. (2009) o monoterpeno linalol apresentou atividade antibacteriana contra S. aureus (CIM 0,18 mg.mL-1) e E. coli (CIM 1,47 mg.mL-1). O presente estudo mostrou que o óleo essencial de O. basilicum apresentou CIM de 0,78 mg.mL-1 frente a cepa CCMB 262 de S. aureus, porém não teve atividade sobre o crescimento de E. coli. Como a determinação da concentração inibitória mínima foi feita apenas para os óleos e extratos das plantas e não para os princípios ativos, não é possível afirmar se a atividade antibacteriana encontrada frente a cepa CCMB 262 foi de fato determinada pela presença do linalol no óleo essencial. Segundo Alviano et al. (2005), o linalol presente no óleo de Croton cajucara foi capaz de inibir o crescimento de P. gingivalis em pacientes portadores de aparelho ortodôntico, o que constitui uma importante atividade, visto que o aparelho ortodôntico funciona como um meio propício para o acúmulo de biofilme dental. 88 O efeito antibacteriano do linalol também foi mostrado por Park et al. (2012) frente a cepa ATCC 33277 de P. gingivalis (CIM 0,8 mg.mL-1), ATCC25586 de F. nucleatum (CIM 0,2 mg.mL-1), ATCC43717 de A. actinomycetemcomitans (CIM 0,1 mg.mL-1). Neste trabalho, o óleo essencial extraído de flores de O. basilicum apresentou 15,9% de linalol e CIM de 0,0125 mg.mL-1 para P. gingivalis (ATCC 33277), CIM maior que 3,2 mg.mL-1 para F. nucleatum (ATCC 25586) e CIM maior que 3,2 mg.mL-1 para A. actinomycetemcomitans (ATCC 43717). Comparando os resultados de Park et al. (2012) com os achados do presente estudo, percebe-se que o efeito antimicrobiano do linalol isoladamente parece ser alterado quando o mesmo está presente no óleo essencial, possivelmente por interações com outros princípios ativos presentes no óleo. Com relação ao linalol, o presente trabalho mostrou que este composto isoladamente tem baixa toxicidade sobre células mononucleares de sangue periférico, porém de acordo com Venâncio (2006), o óleo essencial de O. basilicum com alta concentração de linalol foi altamente tóxico quando injetado intraperitoneal em camundongos, com DL50 igual a 0,532 g.Kg-1. Cabe ressaltar, que Venâncio (2006) avaliou o efeito do óleo essencial de O. basilicum e não do linalol isoladamente. Em relação a toxicidade do óleo essencial de O. basilicum, o presente estudo considerou o óleo extraído de flores tóxico em concentrações acima de 5 µg.mL-1 e de folhas, acima de 50 µg.mL-1. O linalol foi capaz de induzir apoptose em osteoclastos e foi observado um aumento da expressão de receptor Fas em osteoclastos tratados com este composto. Esta atividade é importante para controlar a reabsorção óssea mediada por osteoclastos na patogênese da doença periodontal, embora a remodelação óssea seja um processo necessário para manter a homeostase do tecido ósseo, ela é a consequência de uma atividade balanceada entre a reabsorção óssea mediada por osteoclastos e a aposição óssea mediada por osteoblastos. Quando existe um desequilíbrio a favor da atividade osteoclástica, reabsorções patológicas comprometem a saúde do indivíduo e doenças como artrite reumatóide, osteoporose, doença periodontal podem surgir. Ainda, a atividade apoptótica em osteoclastos apresentada pelo linalol poderá trazer novas perspectivas para o tratamento de outras doenças, como a osteoporose, reduzindo por exemplo os efeitos colaterais advindos da reposição hormonal com estrógenos e do uso de drogas como risedornato de sódio e ácido zoledrônico (KHAJURIA et al., 2011). Em relação aos efeitos colaterais, deve ser ressaltado que em função da capacidade do linalol em induzir expressão de receptor Fas, o uso deste composto em terapias pode também ser acompanhado de efeitos adversos, visto que diversas células, incluindo osteoblasto, expressam receptor Fas, 89 por isso quando se busca o receptor Fas como alvo molecular em terapias, é importante estudar fatores como a sensibilidade da célula a apoptose, que vai depender da presença e atividade de moléculas anti-apoptóticas. Um outro composto estudado no presente trabalho foi o cariofileno, o qual não foi capaz de induzir apoptose em osteoclastos e não mostrou atividade antiosteoclastogênica. Segundo Molina-Jasso et al. (2009) o cariofileno é considerado um composto químico seguro para uso em indústrias e com finalidade terapêutica. Esses autores estudaram o efeito clastogênico do cariofileno em animais submetidos a uma dieta com doses de 10, 100 e 1000 mg.kg-1 do composto. Não foi detectado morte ou sinais de toxicidade durante os 7 dias de tratamento e também não foram descritos efeitos genotóxicos. Em contrapartida, o presente trabalho considerou tóxica a concentração acima de 5 µg.ml-1 de cariofileno para células humanas. Segundo Skold et al. (2006), os hidroperóxidos são produtos do metabolismo de cariofileno, estes hidroperóxidos são rapidamente convertidos a óxido de cariofileno, um segundo composto pouco reativo e mais estável. Este processo metabólico associado ao sistema de reparo do DNA e detoxificação em camundongos, poderia explicar a ausência de efeitos genotóxicos nos estudos, in vivo, de Molina-Jasso et al.(2009) e a divergência com os resultados encontrados no presente estudo, onde os testes foram feitos in vitro, o que mostra a importância de estudos in vivo quando se deseja conhecer as atividades biológicas de um composto. Estudos com metil cinamato são escassos. Este trabalho não considerou eficaz a atividade deste composto sobre os osteoclastos, visto que em concentrações acima de 5 µg.mL-1, o metil cinamato foi tóxico para células humanas e não foi capaz de induzir apoptose em osteoclastos e também não mostrou atividade antiosteoclastogênica. O óleo essencial de O. americanum apresentou em torno de 55% de metil cinamato em sua composição, este óleo também não mostrou atividade sobre osteoclastos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que os óleos essenciais atóxicos de Ocimum americanum e O. basilicum não induziram apoptose em osteoclastos e não foram capazes de impedir a osteoclastogênese, porém o linalol presente no óleo essencial de O. basilicum e os extratos metanólicos de O. americanum e O. basilicum foram capazes de induzir apoptose em osteoclastos, com atividade que variou entre 11% a 100%. Não se deve descartar por completo aqueles compostos que apresentaram citoxicidade para células normais, pois novas avaliações em menores concentrações poderão ser feitas futuramente, o que poderá revelar um potencial terapêutico em baixíssimas concentrações, característica ideal de um medicamento que se propõe a ser usado em seres humanos. Além 90 disso, existe pouca informação na literatura sobre as atividades biológicas das plantas estudadas no tratamento da doença periodontal, desta forma este estudo abre espaço para futuras pesquisas sobre o uso destes compostos para o controle de crescimento do biofilme dental subgengival e atividade osteoclástica. 6 Conclusão Comparando-se a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais extraídos das plantas estudadas com a atividade dos extratos metanólicos, pode-se concluir que os óleos apresentaram uma melhor atividade. Avaliando a atividade de óleos essenciais e extratos metanólicos frente aos micro-organismos controles E. coli e S. aureus, percebe-se que maiores valores para CIM foram registrados para a bactéria E. coli, quando comparado ao micro-organismo S. aureus. Em uma avaliação geral, os micro-organismos anaeróbios estritos foram considerados mais sensíveis a ação dos óleos e extratos, quando comparados com os micro-organismos aeróbios facultativos (E. coli e S. aureus). Entre os anaeróbios estritos, menores valores de CIM foram observados para bactéria Porphyromonas gingivalis, sendo os maiores valores registrados para o micro-organismo A. actinomycetemcomitans. Foram considerados compostos capazes de induzir apoptose em osteoclastos: linalol nas concentrações de 50 a 300 µg.mL-1 e extratos metanólicos de O. americanum e O. basilicum na concentração de 300 µg.mL-1. Foi concluído que a atividade apoptótica dos compostos atóxicos testados parece estar relacionada com a expressão do receptor Fas. Estudos in vivo e sobre a formação do biofilme dental serão necessários para comprovar as atividades descritas neste estudo. Referências ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. Illinois: Allured Publishing Corporation, 1995. AGRA, M. F.; SILVA, K. N.; BASÍLIO, I. J. L. D.; FREITAS, P. F. J.; BARBOSA-FILHO, M. Survey of medicinal plants used in the region Northeast of Brazil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 3, p. 472-508, 2008. 91 ALI, N. A. A.; JULICH, W.; KUSNICK, C.; LINDEQUIST, U. Screening of Yemeni medicinal plants for antimicrobial and cytotoxic activities. J Ethnopharmacol., v. 74, p. 173179, 2001. ALIGIANIS, N.; KAULPOLTZAKIS, E.; MITAKU, S.; CHINOU, I. B. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of two Origanum species. J. Agric. 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Paulo Juiz, Mário Ávila Campos, Roberto Gambari, Roberta Piva, Letizia Penolazi, Franceli Silva, Angélica Lucchese e Ana Paula Uetanabaro. Resumo A utilização de espécies de plantas com finalidade terapêutica é hoje uma realidade mundial. O uso das espécies Mentha x villosa e Chenopodium ambrosioides, principalmente para doenças do trato digestório, na medicina popular é uma prática altamente difundida, a despeito dos efeitos adversos associados a esta prática. Outra atividade biológica destas plantas que poderia ser explorada seria no tratamento da doença periodontal, uma patologia de etiologia multifatorial, considerada um problema de saúde pública. Com o objetivo de estudar o potencial biotecnológico de óleos essenciais e extratos metanólicos de M. villosa e C. ambrosioides foram estudadas a atividade antimicrobiana e capacidade de indução de apoptose em osteoclastos. A atividade antimicrobiana frente aos micro-organismos Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida (CCMB 261), Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina (CCMB 262), Staphylococcus aureus resistente à novobiocina (CCMB 263), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Bacteroides fragilis (ATCC 25285) foi avaliada por meio da determinação da concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima. A avaliação da atividade apoptótica em osteoclastos do extrato metanólico de M. villosa (único composto considerado atóxico no ensaio do MTT) foi realizada pelo teste TUNEL e por imunocitoquímica para receptor Fas. Os resultados mostraram que as menores concentrações inibitórias, entre os periodontopatógenos foram registradas para a bactéria P. gingivalis e as maiores para A. actinomycetemcomitans. Os compostos testados não foram capazes de induzir apoptose em osteoclastos. As plantas estudadas mostraram atividade antimicrobiana, porém não exerceram atividade apoptótica em osteoclastos nas concentrações testadas. O uso popular difundido das plantas medicinais M. villosa e C.ambrosioides merece uma maior atenção, visto que este trabalho considerou estas plantas tóxicas. Palavras-chave: periodontopatógenos, osteoclasto, M. villosa, C. ambrosioides 99 1 Introdução O Brasil é detentor de uma rica flora e conhecido mundialmente pela variedade de produtos vegetais com ação medicinal. Assim, a biodiversidade brasileira representa uma fonte promissora e a baixos custos para formulação de novas drogas com potencial terapêutico, inclusive na área da odontologia (SOARES et al., 2006). O cenário dos medicamentos fitoterápicos dentro da odontologia merece atenção uma vez que dados do Ministério da Saúde indicam que o percentual de indivíduos com algum problema periodontal foi de 37% para a idade de 12 anos, 49,1% para a faixa de 15 a 19 anos, 82,2% para adultos de 35 a 44 anos e 98,2% para idosos de 65 a 74 anos (BRASIL, 2011). Na doença periodontal, o desafio de bactérias (periodontopatógenos) como Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum e a resposta imune direcionada a invasão bacteriana ativam a resposta imune do hospedeiro, com produção de citocinas pró-inflamatórias que ativam osteoclastos, resultando em reabsorção do osso alveolar (TONETTI, 1997). No aspecto terapêutico da doença periodontal, além de procedimentos cirúrgicos e terapia de raspagem e alisamento radicular, a necessidade do uso de colutórios durante e depois do tratamento é um importante coadjuvante para preservar a saúde dos tecidos periodontais, porém o que se observa é que embora extremamente eficiente, o antisséptico à base de clorexidina apresenta efeitos colaterais (FLÖTRA et al., 1971; ADDY et al., 1979; OKANO et al., 1989; CIANCIO,1995) e segundo Rodrigues et al. (2004) é crescente a resistência microbiana aos antissépticos e antibióticos, o que tem estimulado o desenvolvimento de pesquisas científicas voltadas para o uso de produtos naturais no controle químico do crescimento de micro-organismos. A Mentha x villosa é uma erva perene, híbrida, originada do cruzamento entre Mentha spicata e Mentha suaveolens realizado na Europa e hoje cultivada em vários países, inclusive no Brasil (LORENZI, 2008). Também conhecida como hortelã-comum, hortelã-de-tempero, hortelã-rasteira, mentrasto. Tem grande importância medicinal e social por sua ação contra microparasitas intestinais, espasmolítica, antivomitiva, carminativa, estomáquica, anti-helmíntica, antisséptica e antiprurido. O estudo químico de seu óleo essencial revela a presença de 30 a 90% de óxido de piperitenona (LORENZI, 2008). Chenopodium ambrosioides L. é uma erva perene ou anual muito ramificada, com até 1 metro de altura, popularmente conhecida como mastruço, erva-de-santa-maria, ambrisina, ambrósia-do-méxico, apazote, caácica, cambrósia, canudo, chá-do-méxico, chá-dos-jesuítas, 100 cravinho-do-mato, erva-das-cobras, erva-da-formigueira, mata-cobra, mentruz, quenopódio (LORENZI, 2008). Planta herbácea da família Chenopodiaceae foi usada durante décadas como vermífuga (MATOS, 2000). Extratos e derivados da planta são usados contra sífilis, sarampo e doenças intestinais (NOUMI e YOMI, 2001). Cabe ressaltar que o uso de plantas medicinais em saúde preventiva e curativa é cercado de recomendações rigorosas quando da sua utilização, pois segundo Veiga et al. (2005) muitas plantas têm mostrado efeitos adversos como irritação gástrica, lesões no sistema nervoso, hemorragias, irritação na mucosa bucal. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana, indução de apoptose em osteoclastos e citotoxicidade de compostos extraídos das plantas medicinais Mentha x villosa e Chenopodium ambrosioides como uma forma terapêutica alternativa para controle da doença periodontal, uma doença grave, cujo tratamento reabilitador, principalmente para as formas mais graves, se restringe a limitação dos danos causados pela destruição óssea alveolar e do ligamento periodontal. 2 Material e Métodos 2.1 Obtenção das amostras vegetais O cultivo das plantas foi feito nos meses de março a junho do ano 2010, no Horto de Plantas medicinais da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia localizado no município de Santo Antônio de Jesus, Latitude 12° 57′ 59.2”, Longitude 39° 15′ 49.4” LO. Todo o tratamento convencional de herborização seguiu o descrito por Mori et al. (1989). O material botânico coletado foi depositado no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana e identificado por especialista como Mentha x villosa Huds (Lamiaceae) - HUEFS 167948, Chenopodium ambrosioides L. (Amaranthaceae) – HUEFS 167951 pelo sistema de classificação de Cronquist (1981). 2.2 Extração de óleo essencial A técnica de hidrodestilação por arraste a vapor foi utilizada para obtenção do óleos essenciais a partir de folhas secas de M. villosa e sementes/frutos secos de C. ambrosioides. O processo de extração foi conduzido durante 3 h. A composição química do óleo essencial foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), em cromatógrafo Shimadzu CG-2010 acoplado a Espectrômero de Massas CG/MS-QP 2010 Shimadzu, coluna WCOT de sílica fundida, 30 m x 0,25 µm, injetor CP-1177, temperatura 101 do injetor 220oC, gás de arraste Hélio (1mL/min), temperatura da interface de 240oC, temperatura da fonte de ionização de 240oC, energia de ionização 70 eV, corrente de ionização 0,7 kV e programa de temperatura do forno 60oC a 240oC (3oC/min), 240oC (20min). Os componentes foram identificados através da comparação dos espectros de massas obtidos com os da biblioteca do equipamento e por comparação dos Índices de Kovats (IK) calculados com a literatura (ADAMS, 1995) empregando uma série homóloga de hidrocarbonetos. 2.3 Preparo dos extratos metanólicos O caule seco foi pulverizado em moinho de faca e as extrações foram realizadas por meio de maceração em recipientes de vidro, utilizando-se metanol, na proporção material/solvente de 1:5. O produto da maceração foi concentrado em evaporadores rotatórios (40-42°C, sob pressão reduzida). 2.4 Determinação da atividade antimicrobiana sobre bactérias aeróbias facultativas As amostras de extratos metanólicos e óleos voláteis das plantas estudadas foram testadas em uma triagem inicial contra os micro-organismos controle Escherichia coli sensível à trimetoprima e resistente à sulfonamida CCMB 261, Staphylococcus aureus resistente à estreptomicina e dihidrostreptomicina CCMB 262, Staphylococcus aureus resistente a novobiocina CCMB 263 fornecidos pela Coleção de Culturas de Microorganismos da Bahia (CCMB). Uma alçada de uma cultura de 20 h foi utilizada para preparo da suspensão bacteriana, em solução salina a 0,45%, na concentração de 1,5 x 106 UFC.mL-1. Para determinação da Concentração inibitória mínima (CIM) os extratos metanólicos foram solubilizados em uma solução de DMSO 50% e os óleos essenciais em uma solução de Tween80 a 10% de modo a obter uma concentração inicial de 200 mg.mL-1. Os compostos foram esterilizados por filtração em membrana de 0,22 µm. Foi utilizado o ensaio de suscetibilidade por microdiluição em caldo recomendado pelo CLSI (2002), com modificações, sendo que todos os testes foram realizados em caldo Müeller Hinton esterilizado em triplicata. Foram preparadas diluições seriadas na ordem de 100 mg.mL-1 a 0,0488 mg.mL-1 dos compostos testados em placas de microtitulação de 96 poços estéreis. Em seguida, cada poço recebeu 10 μL da suspensão de micro-organismo teste na concentração de 1,5 x 106 UFC.mL-1. As placas foram incubadas à 37ºC por 24 horas e a determinação da CIM foi feita pelo método colorimétrico utilizando 30 µL de resazurina 0,01%. Como controle 102 foram usados: cloranfenicol 10 mg.mL-1(concentração no poço inicial), controle de viabilidade dos micro-organismos, esterilidade do meio e influência dos solventes (Tween e DMSO) sobre o crescimento microbiano. Cinco microlitros do conteúdo dos poços que mostraram resultados positivos de atividade antimicrobiana foram inoculados em ágar Müeller Hinton para determinação da Concentração bactericida mínima (CBM). O crescimento bacteriano no meio de cultura contido na placa de Petri caracterizou o composto como tendo atividade bacteriostática, a ausência de crescimento, atividade bactericida. 2.5 Determinação da atividade antimicrobiana sobre bactérias anaeróbias estritas Os testes de suscetibilidade microbiana aos extratos metanólicos e óleos essenciais foram realizados segundo o método de macrodiluição em caldo do CLSI M11-A5, com modificações. Cepas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Bacteroides fragilis (ATCC 25285), preservadas em Skim-milk (10%) a -80oC foram ativadas em ágar sangue com 5% de sangue de carneiro desfibrinado suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1) e incubadas em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 72 h para serem utilizadas na realização dos testes de suscetibilidade. O inóculo bacteriano teste foi preparado suspendendo colônias da cultura recente em 5 mL de caldo BHI (infusão cérebro coração) suplementado com hemina (5 µg.mL-1) e menadiona (vitamina K, 1 µg.mL-1), seguido de incubação em anaerobiose (90% N2 e 10 % CO2) a 37oC durante 48 h. Após o período de incubação, o inóculo bacteriano foi ajustado pelo método visual à escala 0.5 de McFarland (1,5 x 108 UFC.mL-1). Soluções estoques (de extratos e óleos essenciais) esterilizadas por filtração em membrana de 0,22 µm, com concentração de 50 mg.mL-1 foram preparadas utilizando como solvente: Tween80 a 10% para óleos essenciais e DMSO 50% para extratos metanólicos. Para os testes foram usadas concentrações crescentes dos compostos na ordem de 0,00625 a 3,2 mg.mL-1. A cada tubo de ensaio preparado foram adicionados 40 μL do inóculo bacteriano ajustado na turvação correspondente a escala 0.5 de McFarland. O material foi incubado em anaerobiose (90% N2 e 10 % CO2) a 37oC por 48 horas. Após o período de incubação (48 h) foi feita a leitura pelo método visual, observando a turvação do meio e/ou a presença de sedimento no fundo do tubo de ensaio como indicativo de crescimento microbiano e ausência de atividade antimicrobiana. Como controle foram utilizados gluconato de clorexidina 0,12% (Periogard Colgate®), controle de viabilidade dos micro-organismos, esterilidade do meio e influência dos solventes (Tween e DMSO) sobre o crescimento microbiano.Os ensaios foram feitos em 103 triplicata. Para aqueles tubos de ensaio com ausência visível de crescimento na etapa de determinação da CIM, 10 μL foram semeados em ágar sangue suplementado com hemina (5µg/mL) e menadiona (vitamina K, 1 µg/mL) e incubados em anaerobiose (90% N2 e 10% CO2) a 37oC por 72 h para determinação da CBM. 2.6 Indução de apoptose em osteoclastos 2.6.1 Cultura de osteoclastos Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito por Matsuzaki et al. (1999), com pequenas modificações. Sangue periférico foi coletado de voluntários saudáveis após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (aprovação do Comitato Etico dell'Arcispedale S.Anna, parecer n.11/2006). Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram obtidas de sangue periférico diluído (1:2 em solução de Hanks) e separadas por uma solução de polissacarose 5,7 g.dL-1 e diatrizoato de sódio 9,0 g.dL-1 (Histopaque 1077®-Sigma, St. Louis, MO, USA). As células mononucleares foram ressuspensas em DMEM com alta concentração de glicose (Sigma, St.Louis, MO, USA), 50 U.mL-1 de penicilina e 50 U.mL-1 de estreptomicina, suplementado com 10% de FCS (soro fetal de bezerro). 960.000 PBMC/poço foram cultivadas em placas de 96 poços e 2,4 x 106 PBMC/poço foram cultivadas em chamber slides por 2 horas. Os poços foram lavados para remoção de células não-aderentes e as células aderidas foram cultivadas na presença de MCSF (25 ng.mL-1), RANKL (30 ng.mL-1) e mantidas a 37°C em atmosfera com 5% CO2 por 14 dias. O meio de cultura era renovado a cada 3 dias. As células foram utilizadas nos experimentos descritos abaixo, quando existiu uma predominância de células multinucleadas na cultura. 2.6.2 Coloração para TRAP (Fosfatase ácida resistente ao tartarato) A coloração para TRAP foi feita segundo o que preconiza Villanova et al. (1999). Seis poços da placa de 96 poços contendo cultura de células multinucleadas foram destinados para esta etapa do trabalho. Os poços foram lavados com tampão de ácido cacodílico 0.1 M , pH 7.2 (0.1 M de cacodilato de sódio e 0.0025% CaCl2) e fixadas em formaldeído 37% por 15 minutos, sendo posteriormente coradas para TRAP, segundo protocolo proposto pelo Acid Phosphatase Kit n. 386 (Sigma, St. Louis, MO,USA). Após lavagem com água destilada e secagem, células multinucleadas com coloração violeta, contendo mais do que três núcleos incolores(osteoclastos), foram consideradas TRAP positivas (Apêndice E). 104 2.6.3 Ensaio de Citotoxicidade Após a confirmação da presença de osteoclastos na cultura pelo Teste TRAP, os osteoclastos foram incubados por mais 3 dias na presença dos extratos metanólicos (10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1) e óleos essenciais (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1, 500 µg.mL-1). Como controle uma solução de metanol/DMSO 3%, a qual foi utilizada para solubilizar os compostos. A determinação das células viáveis foi feita pelo ensaio do MTT. Após as 72 h de um tratamento feito em triplicata, 25 μL de MTT foi adicionado a cada poço contendo células tratadas, seguido por um período de incubação de 2h/37°C. Após incubação, os cristais de MTT foram solubilizados com 100 μL de solução de lise pH 4.7 por 3 horas/37°C. A leitura da DO foi feita por espectrofotometria a 570 nm, usando a solução de lise como branco da reação. Foram considerados não tóxicos os compostos que permitiram uma viabilidade celular maior ou igual a 90%. 2.6.4 Ensaio de apoptose O ensaio de apoptose foi determinado in vitro, por meio do teste TUNEL (Transferase desoxinucleotidil terminal mediada por marcação dUTP) em cultura de osteoclastos humanos tratados com o composto considerado atóxico (extrato metanólico extraídos de caule de M. villosa) pelo ensaio do MTT. Osteoclastos humanos foram obtidos como descrito no ítem 2.6.1 Cultura de osteoclastos e após confirmação da osteoclastogênese pelo teste TRAP, as células foram tratadas por 72 h com o extrato metanólico de M. villosa. As células foram lavadas duas vezes com solução de PBS e fixadas por 25 minutos com formalina 10%, a temperatura ambiente. Células apoptóticas foram detectadas pelo sistema DeadEnd Colorimetric Apoptosis Detection System (Promega) de acordo com orientação do fabricante. O sistema HRP estreptavidina/substrato presente no Kit foi usado para identificar células apoptóticas. A avaliação da apoptose foi calculada como uma porcentagem de núcleos apoptóticos (núcleos escurecidos, amarronzados) versus núcleos de células multinucleadas TRAP positivas, observadas em triplicatas. As lâminas foram montadas em glicerol/TBS 9:1 e observadas em microscópio Leitz. 3 Resultados 3.1 Atividade antimicrobiana A Tabela 1 mostra o resultado da atividade antimicrobiana do óleo essencial e extrato metanólico de Mentha x villosa e C. ambrosioides frente aos micro-organismos testados. 105 Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) dadas em mg.mL-1 do óleo essencial e extrato metanólico de Mentha x villosa e C. ambrosioides. COMPOSTOS ÓLEOS ESSENCIAIS E.coli S.aureus* S.aureus** CIM CBM CIM CBM CIM 6,25 6,25 1,56 3,125 3,125 6,25 12,5 25 6,25 25 12,5 Mentha x villosa 6,25 6,25 6,25 6,25 C. ambrosioides 12,5 12,5 12,5 2,5 2,5 2,5 Mentha x villosa (folhas) C. ambrosioides (sementes/frutos) CBM MICRO-ORGANISMOS B.fragilis A.a*** CIM P.gingivalis CBM CIM CBM 0,1 0,1 > 3,2 > 3,2 50 0,1 0,1 > 3,2 6,25 6,25 > 3,2 > 3,2 12,5 12,5 12,5 > 3,2 2,5 2,5 2,5 CIM F.nucleatum CBM CIM CBM 0,00625 0,00625 0,8 0,8 > 3,2 0,00625 0,00625 0,1 0,1 > 3,2 > 3,2 0,8 0,8 >3,2 > 3,2 > 3,2 > 3,2 > 3,2 0,8 0,8 >3,2 > 3,2 0,0075 0,0075 0,0075 0,0075 0,001875 0,001875 0,00375 0,00375 EXTRATOS METANÓLICOS CONTROLES Cloranfenicol Clorexidina Tween80 10% S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E DMSO 12,5% S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E DMSO 50% S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E S.E *S. aureus CCMB262 (resistente a estreptomicina e dihidroestreptomicina), ** S. aureus CCMB263 (resistente a novobiocina), *** Aggregatibacter actinomycetemcomitans, S.E – Sem Efeito. Os solventes utilizados no experimento não mostraram atividade antimicrobiana, com exceção da solução de DMSO para as cepas de Staphylococcus aureus. Foi constatado que na concentração de 25% a solução de DMSO inibiu o crescimento deste micro-organismo, desta forma foi desconsiderada para fins de avaliação a concentração de 50 mg.mL-1 dos extratos metanólicos para S. aureus. Foram observados maiores valores de concentração inibitória mínima para o micro-organismo E. coli em relação a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de M. villosa e C. ambrosioides, sendo a CIM registrada de 6,25 mg.mL-1 para o óleo extraído das folhas de M. villosa e 12,5 mg.mL-1 para o óleo extraído de sementes/frutos de C. ambrosioides. O S. aureus resistente a estreptomicina foi mais sensível a ação do óleo essencial (CIM 1,56 mg.mL-1 para o óleo de M. villosa e 6,25 mg.mL-1 para o óleo de C. ambrosioides), quando comparado ao S. aureus resistente a novobiocina (CIM 3,125 mg.mL-1 para o óleo de M. villosa e 12,5 mg.mL-1 para o óleo de C. ambrosioides). A CIM registrada para o extrato metanólico tanto para E. coli, quanto para S. aureus foi 6,25 mg.mL-1 para M. villosa e 12,5 mg.mL-1 para C. ambrosioides. O óleo essencial de Mentha x villosa extraído de folhas apresentou atividade bactericida frente E. coli na concentração de 6,25 mg.mL-1. O mesmo valor de CBM (6,25 106 mg.mL-1) foi obtido dos extratos metanólicos do caule seco da planta, tanto para E. coli, como para S. aureus. Apenas os extratos metanólicos do caule seco de C. ambroisioides, tanto para E. coli, como para S. aureus foram bactericidas (CBM 12,5 mg.mL-1). A atividade antimicrobiana do óleo essencial extraído de folhas de M. villosa e sementes/frutos de C. ambrosioides sobre bactérias anaeróbias mostrou que maiores valores de CIM foram observados para a atividade frente ao micro-organismo A. actinomycetemcomitans (CIM maior que 3,2 mg.mL-1) e menores valores para P. gingivalis (CIM 0,00625 mg.mL-1). Já em relação aos extratos metanólicos, todas as CIM registradas foram maiores que 3,2 mg.mL-1, com exceção da CIM registrada para P. gingivalis, de 0,8 mg.mL-1. Todas as concentrações registradas para os extratos, com atividade sobre o crescimento de micro-organismos anaeróbios estritos, foram classificadas como bactericidas. 3.2 Perfil cromatográfico dos óleos essenciais As Tabelas 2 e 3 mostram as composições químicas dos óleos essenciais de Mentha x villosa e C. ambrosioides. Os resultados apontaram como princípio ativo majoritário do óleo de M. villosa, o óxido de piperitenona perfazendo 57,2% da composição do óleo essencial. Em relação a composição química do óleo essencial de C. ambrosioides, os resultados apontaram como princípio ativo majoritário o Z-ascaridol, perfazendo 65,9% da composição química do óleo. Tabela 2. Análise da composição química do óleo extraído da planta Mentha x villosa Composto IKlit IKcalc Folhas % α-Pineno Sabineno β-pineno Mirceno Limoneno Z-β-Ocimeno Octen-1-ol, acetato Oxido de piperitenona α-Gurgujeno Cariofileno β-Farneseno cis-muurola-4(14),5-dieno Germacreno D α-Cadinol Total Não identificados 939 975 979 990 1029 1037 1112 1376 1409 1419 1456 1466 1485 1654 939 978 982 992 1033 1040 1111 1368 1407 1430 1455 1471 1489 1661 1,2 1,6 1,3 1,1 2,8 1,0 1,3 57,2 2,5 3,2 1,4 2,0 9,4 0,9 86,9 13,1 IKlit- Indíce de Kovats na literatura. IKcalc – Índice de Kovats calculado 107 Tabela 3. Análise da composição química do óleo extraído da planta C. ambrosioides Composto IKlit IKcalc Sementes e frutos % α-Terpineno p-cimeno Z-Ascaridol E-ascaridol Total Não identificados 1017 1024 1237 1020 1029 1247 1307 5,3 18,5 65,9 8,1 97,8 2,2 IKlit- Indíce de Kovats na literatura. IKcalc – Índice de Kovats calculado 3.3 Citotoxicidade As figura 1 e 2 mostram os resultados do ensaio de citotoxicidade. Para o ensaio do MTT (ensaio para determinar a citotoxicidade de óleos e extratos), foram considerados atóxicos aqueles compostos que permitiram uma viabilidade celular maior ou igual a 90%. Os resultados apontaram que o óleo essencial extraído de folhas de M. villosa foi considerado tóxico em todas as concentrações testadas (5, 50, 300 e 500 µg.mL-1), enquanto o extrato metanólico desta planta foi considerado atóxico em concentrações abaixo de 300 µg.mL-1. Em relação a planta C. ambrosioides, os resultados apontaram que tanto o óleo essencial como o extrato metanólico estudados foram considerados tóxicos em todas as concentrações testadas (5, 50, 300 e 500 µg.mL-1). 100 90 Extrato metanólico de Mentha x villosa % de células viáveis 80 70 60 50 Extrato metanólico de Chenopodium ambrosioides 40 30 20 10 0 5 Figura 1. 50 300 500 µg.mL-1 Porcentagem de células viáveis após exposição aos extratos metanólicos de M. villosa e C. ambrosioides nas concentrações de 5, 50, 300 e 500 µg.mL-1 108 50 45 Óleo essencial de folhas de Mentha x villosa % de células viáveis 40 35 30 25 Óleo essencial de sementes/frutos de C. ambrosioides 20 15 10 5 0 5 50 500 µg.mL-1 Figura 2. Porcentagem de células viáveis após exposição aos óleos essenciais de M. villosa e C. ambrosioides nas concentrações de 5, 50, 500 µg.mL-1 3.4 Atividade apoptótica em osteoclastos Os testes de indução de apoptose em osteoclastos foram feitos apenas para os compostos atóxicos no teste do MTT. O extrato metanólico atóxico de M. villosa foi capaz de induzir apenas 4% de núcleos apoptóticos em osteoclastos na concentração de 50 µg.mL-1 e 12% na concentração de 300 µg.mL-1. Estes resultados mostraram que o extrato não foi capaz de induzir apoptose em osteoclastos. 4 Discussão Os solventes utilizados no experimento não mostraram atividade antimicrobiana, com exceção da solução de DMSO a 25% para as cepas de Staphylococcus aureus. Segundo Nascimento et al. (2007) a concentração de trabalho do Tween deve variar entre 0,5% a 20% quando se trabalha com óleos essenciais, porém para Hood et al. (2003) a concentração ideal de trabalho do Tween80 é 0,02%, segundo estes autores, nesta concentração este detergente não tem ação antimicrobiana. Este trabalho mostrou que é possível trabalhar com Tween80 a 10% quando se deseja determinar a CIM de óleos essenciais frente as cepas de Staphylococcus aureus CCMB 262 e CCMB 263, Escherichia coli CCMB 261, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43717), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277) e Bacteroides fragilis (ATCC 25285). Não existe um consenso sobre o nível de inibição para produtos naturais quando comparados com antibióticos padrões. Aligianis et al. (2001) propuseram uma classificação 109 da atividade antimicrobiana, para compostos extraídos de plantas medicinais, com base em resultados de CIM, considerando: forte inibição CIM até 0,5 mg.mL-1, inibição moderada CIM entre 0,6 mg.mL-1 e 1,5 mg.mL-1, fraca atividade CIM acima de 1,6 mg.mL-1, porém esta classificação foi discutida por Roersch (2012), em função da falta de embasamento. Segundo Holetz et al. (2002), a atividade de um composto extraído de plantas medicinais deve ser considerada ótima quando a CIM é menor que 1,0 mg.mL-1. Os óleos essenciais e extratos das plantas medicinais M. villosa e C. ambrosioides mostraram atividade antimicrobiana contra P.gingivalis e CIM igual 0,1 mg.mL-1 para B. fragilis (micro-organismo anaeróbico controle). Embora os compostos estudados não tenham apresentado capacidade de induzir apoptose em osteoclastos, as atividades descritas representam um passo inicial para estudos futuros na área de biotecnologia voltados para odontologia, principalmente para a espécie Mentha, atualmente muito explorada para formulação de cremes dentais. Segundo Pistorius et al. (2003), o desenvolvimento tecnológico e industrial de escovas elétricas, irrigadores elétricos associados a um antisséptico bucal contendo extrato de ervas, incluindo Mentha piperita, foi capaz de reduzir o índice de sangramento gengival no grupo de pacientes com gengivite, resultado estatisticamente significante quando comparado ao grupo controle, composto de pacientes que utilizavam irrigadores convencionais. Além dos periodontopatógenos estudados, foram utilizados neste trabalho os microorganismos E. coli como representante Gram-negativo e S. aureus como representante Gram-positivo, com o objetivo de comparar o efeito inibitório dos compostos entre bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, visto que na literatura (Ali et al., 2001; Mounia, 2006) é informada a maior resistência aos antimicrobianos para bactérias Gram-negativas devido a presença de uma barreira física, representada pela membrana externa. Porém, no presente estudo, a CIM registrada para o óleo de C. ambrosioides, tanto para E.coli como para S. aureus resistente a novobiocina, foi 12,5 mg.mL-1. Embora eficientes em inibir o crescimento bacteriano, os óleos essenciais de M. villosa e C. ambrosioides foram considerados tóxicos pelo ensaio do MTT, o que restringiu seu uso nas concentrações tóxicas testadas, comprometendo a utilização de óleos e extratos destas plantas na odontologia. Cabe ressaltar que o uso de plantas medicinais em saúde preventiva e curativa é cercado de recomendações rigorosas quando da sua utilização, pois segundo Veiga et al. (2005) muitas plantas têm mostrado efeitos adversos como irritação gástrica, lesões no sistema nervoso, hemorragias, irritação na mucosa bucal, portanto mesmo sendo capazes de inibir o crescimento microbiano, o efeito tóxico observado para M. villosa e 110 C. ambrosioides poderia causar injúrias na mucosa oral e estruturas do ligamento periodontal, bem como efeitos sistêmicos importantes com prejuízo para saúde do paciente. Possivelmente, a toxicidade do óleo de C. ambrosioides foi devido a presença de ascaridol como composto majoritário. Também Muhayimana et al. (1998) e Lorenzi (2008) descreveram que a composição química de extratos e óleo essencial de C. ambrosioides foi principalmente de alfa-terpineno e ascaridol, onde folhas fornecem, por arraste de vapor, até 9,2% de óleo essencial com até 60% de ascaridol, enquanto dos frutos se obtêm até 20% deste óleo com 80 a 90% de ascaridol, o princípio ativo com atividade vermífuga presente no óleo da planta. Em contrapartida, Onocha et al. (1999), em amostras da planta na Nigéria, identificaram alfa-terpineno (56%), acetato de alfa-terpenila (15,7%) e p-cimeno (15,5%). Gupta et al. (2002) examinaram a composição do óleo essencial de C. ambrosioides da Índia e identificaram alfa-terpineno (64%), p-cimeno (19%) e ascaridol (7%). Em Cuba, foi descrita a seguinte composição: alfa-terpenila (73,9%) e p-cimeno (4,3%) (PINO et al., 2003). Em relação a composição química do óleo essencial, mesmo variações genéticas intraespecíficas do vegetal podem alterar o teor do princípio ativo presente no óleo. Ademais, outros fatores, como clima, solo, época e forma de plantio, adubação, uso de agrotóxicos, irrigação, tempo e condições ambientais, técnicas de secagem do material da planta, técnica de extração dos compostos e colheita, padrões de variação geográfica (latitudes e longitudes) afetam a composição química dos óleos, podendo resultar em alterações na atividade antimicrobiana (FRANCO et al., 2005; CARVALHO-FILHO et al., 2006; SEFIDKON et al., 2007), o que mostra a necessidade de uma rigorosa padronização dos métodos para obtenção de óleo essencial com finalidade industrial. A ação anti-helmíntica e citotóxica do ascaridol já é bem documentada (MC DONALD, 2004), porém em função do efeito desejável que o óleo de C. ambrosioides possui como antiparasitário, surgiu um interesse pelo produto e novas pesquisas mostraram também o efeito do óleo sobre fungos (GADANO , 2006). Entretanto, a produção comercial do óleo de C. ambrosioides encontrou barreiras em função da citotoxicidade. Gadano (2006) mostrou que o óleo de Chenopodium apresenta efeito irritante para mucosa intestinal e genotoxicidade, com efeitos também para o sistema nervoso central, gastroenterite, intoxicação podendo até mesmo causar a morte. Contudo, esta planta é ainda utilizada na medicina tradicional. Monzote (2009) estudou a interação de ascaridol sintetizado em laboratório com mitocôndrias humanas. Segundo o autor, o ascaridol sintético apresentou baixa toxicidade 111 sobre mitocôndras quando testado isoladamente e a toxicidade do composto sobre macrófagos foi de 5,5 ± 1,4 µg.mL-1. O presente trabalho mostrou que o óleo de C. ambrosioides contendo 65,9% de ascaridol mostrou ser tóxico em concentrações maiores ou iguais a 5 µg.mL-1. A toxicidade do óleo essencial de C. ambrosioides já é bem descrita na literatura (MC DONALD, 2004; GADANO, 2006; MONZOTE, 2009), porém poucos relatos sobre a toxicidade do óleo essencial de M. villosa sobre células humanas normais foram encontrados. O presente estudo mostrou que 57,2% do óleo essencial de M. villosa é composto de óxido de piperitenona, o que pode explicar a toxicidade reportada para este óleo. O potencial larvicida de óleos essenciais contendo altas concentrações de óxido de piperitenona foi descrito por Tripathi et al. (2004) e Koliopoulos et al. (2010). Os resultados do presente estudo e daqueles descritos na literatura servem como um alerta sobre o uso popular tão difundido da M. villosa com fins medicinais. Entretanto, não se deve descartar por completo aqueles compostos que apresentaram toxicidade elevada, pois novas avaliações em menores concentrações poderão ser feitas futuramente, o que poderá revelar um potencial terapêutico a baixíssimas concentrações, característica ideal de um medicamento que se propõe a ser usado em seres humanos. 5 Conclusão O extrato de M. villosa foi mais efetivo contra os aeróbios facultativos que o extrato metanólico de C. ambrosioides. Entre os anaeróbios estritos, foram registrados menores valores de CIM para bactéria Porphyromonas gingivalis e maiores valores para o micro-organismo Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Os extratos metanólicos das plantas estudadas não foram ativos contra B. fragilis, A. actinomycetemcomitans e F. nucleatum. Com exceção do extrato de M. villosa, todos os compostos estudados das duas plantas foram considerados tóxicos, e embora atóxico o extrato de M. villosa não foi capaz de induzir apoptose em osteoclastos. Os resultados apontaram para o cuidado na utilização dos óleos essencias e extratos metanólicos de M. villosa e C. ambrosioides, em função da atividade tóxica descrita, portanto novos estudos em concentrações menores que as estudadas são necessários para comprovar a citotoxicidade e atividades biológicas dos compostos extraídos das plantas. 112 Referências ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. 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Entre os micro-organismos anaeróbios estritos, os menores valores de CIM foram registrados para bactéria Porphyromonas gingivalis e maiores valores foram observados para Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Os óleos essenciais extraídos de flores de Ocimum americanum e folhas de Ocimum basilicum, Lippia alba e Mentha x villosa e sementes/frutos de Chenopodium ambrosioides foram considerados os mais efetivos frente a bactéria P.gingivalis. Em relação a toxicidade dos compostos, não foram considerados tóxicos os óleos essenciais das plantas do gênero Ocimum (especialmente de O. americanum e de folhas de O. basilicum), os extratos metanólicos de todas as plantas, com exceção do extrato de C. ambrosioides e os compostos majoritários citral, limoneno, carvona, linalol. Citral, limoneno, carvona, linalol e extratos metanólicos das plantas do gênero Ocimum são compostos capazes de induzir apoptose em osteoclastos, possivelmente por induzir a expressão do receptor Fas. Os resultados apontaram para o cuidado na utilização dos óleos essencias e extratos metanólicos de Mentha x villosa e C. ambrosioides, em função da atividade tóxica descrita, portanto novos estudos em concentrações menores que as estudadas são necessários para comprovar a citotoxicidade e atividades biológicas dos compostos extraídos das plantas. Em relação a atividade antitumoral (Apêndice F), a atividade antiproliferativa dos óleos essenciais sobre as linhagens tumorais foi maior que a atividade mostrada pelos extratos metanólicos e na maioria dos casos menor que a apresentada pelos princípios ativos testados isoladamente, sendo a linhagem de adenocarcinoma mamário MDA-231 considerada a mais resistente diante da ação dos compostos, quando comparada a linhagem MCF-7 e K562. 118 O citral foi considerado um composto promissor para uso em biotecnologia na formulação de futuros quimioterápicos com finalidade antitumoral. Em função das atividades registradas para o linalol e limoneno, estudos futuros utilizando estes compostos como adjuvantes de drogas antitumorais são necessários. Os compostos testados não foram capazes de induzir diferenciação eritróide em células K562. Estudos in vivo e sobre a formação do biofilme dental são necessários para comprovar as atividades apresentadas neste trabalho. 119 REFERÊNCIAS AL-HEBSHI, N.; AL-HARONI, M.; SKAUG, N. In vitro antimicrobial and resistancemodifying activities of aqueous crude khat extracts against oral microorganisms. Archives of Oral Biology, 2005. Disponível em <http:// www.sciencedirect.com>. Acesso em 23 mar. 2011. ARDILA, C. M.; LÓPEZ, M. A.; GUZMÁN, I. C. High resistance against clindamycim, metronidazole and amoxicillin in Porphyromonas gingivalis and Aggregatibacter actinomycetemcomitans isolates of periodontal disease. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, v. 15, n. 6, p. 947-951, 1 nov. 2010. 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CBM CIM Poços com colaração azul indicando morte bacteriana ou inibição do metabolismo bacteriano e poços com coloração rosa indicativos de células viáveis. CIM (Concentração Inibitória Mínima). CBM (Concentração Bactericida Mínima) 135 APÊNDICE C - Registros fotográficos dos ensaios de atividade antimicrobiana para anaeróbios estritos (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, F. nucleatum e B. fragilis). CIM Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para aneróbios. Tubos de 1 a 7 com crescimento visível de micro-organismos (tubos com meio turvo). Tubos de 8 a 10 com ausência de crescimento (tubos com meio límpido). A B Representação da determinação da CBM para anaeróbios. A. Composto com atividade bacteriostática (setas apontam crescimento bacteriano). B. Composto com atividade bactericida 136 APÊNDICE D – Registros fotográficos das exsicatas depositadas no HUEFS. B A D C E Exsicatas preparadas pelo Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana. A. Ocimum americanum L., B. Lippia alba (Mill) N.E.Br., C. Mentha x villosa Huds, D. Ocimum basilicum L., E. Chenopodium ambrosioides L. 137 APÊNDICE E – Registros fotográficos dos ensaios com osteoclastos 20µm Teste TRAP. Células multinucleadas de coloração lilás representativas de osteoclastos. Os núcleos incolores são apontados por setas vermelhas. Teste TUNEL. Célula multinucleada com núcleo em coloração lilás representando osteoclasto sem processo apoptótico. Registro fotográfico realizado com máquina digital modelo Samsung SL102. 138 Teste TUNEL. Célula multinucleada com núcleo em coloração marrom representando osteoclasto em processo apoptótico. Registro fotográfico realizado com máquina digital modelo Samsung SL102. 20µm Imunocitoquímica para receptor Fas. Osteoclastos de coloração marrom indicando expressão de receptor Fas. 139 APÊNDICE F – Artigo IV ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE PLANTAS MEDICINAIS CULTIVADAS NO RECÔNCAVO BAIANO FRENTE AS LINHAGENS CELULARES K562, MCF-7 e MDA-231 Paulo Juiz, Roberto Gambari, Roberta Piva, Eleonora Brognara, Franceli Silva, Angélica Lucchese, Ana Paula Uetanabaro Resumo Mais de 60% dos agentes anticâncer usados atualmente são derivados, direta ou indiretamente de produtos naturais, entretanto, o potencial do uso das plantas medicinais como fonte de descoberta de novas drogas antitumorais ainda é pouco explorado, por isso este trabalho teve como objetivo estudar a atividade antitumoral de óleos essenciais, compostos presentes nos óleos essenciais (metil cinamato, citral, linalol, cariofileno, limoneno e carvona) e extratos metanólicos das plantas Ocimum americanum, Ocimum basilicum, Chenopodium ambrosioides, Mentha x villosa e Lippia alba sobre linhagens celulares MCF-7 e MDA-231 de câncer de mama e K562 de leucemia. As linhagens tumorais foram cultivadas na presença dos compostos para determinação da capacidade antiproliferativa. Os resultados mostraram que a atividade antiproliferativa dos óleos essenciais foi maior que a atividade mostrada pelos extratos metanólicos e na maioria dos casos menor que a apresentada pelos princípios ativos testados isoladamente, sendo a linhagem MDA-231 considerada a mais resistente, quando comparada a linhagem MCF-7 e K562. Todas as concentrações inibitórias registradas para os óleos essenciais foram consideradas tóxicas, entretanto os compostos majoritários presentes nos óleos essenciais, com exceção do cariofileno e metil cinamato, mostraram atividade antitumoral em concentrações atóxicas. O composto citral foi considerado mais ativo frente a linhagem K562 (IC50 8,61 ± 1,29 µg.mL-1) e MDA-231 (IC50 41,98 ± 7,45 µg.mL-1), já o composto linalol foi mais efetivo frente a linhagem MCF-7 (IC50 18,86 ± 1,32 µg.mL-1). Os compostos testados não foram capazes de induzir diferenciação eritróide em células K562, sendo os extratos metanólicos das plantas do gênero Ocimum aqueles que mostraram as melhores atividades antiproliferativas contra a linhagem K562. Palavras-chave: plantas medicinais, antiproliferativa, câncer de mama, leucemia 140 1 Introdução O câncer é uma doença caracterizada por um crescimento desordenado de células transformadas, com ruptura da membrana basal, invasão tecidual, podendo levar o indivíduo a morte (INCA, 2012). Segundo estimativas do Instituto Nacional do Câncer para o biênio 2012 – 2013, espera-se 52.680 novos casos de câncer de mama, com um risco estimado de 69 casos a cada 100 mil habitantes para a região sudeste, 65 / 100 mil para região sul, 48 / 100 mil para região centro – oeste, 9 / 100 mil para região norte e 32 / 100 mil para região nordeste. Com relação a incidência de leucemia, espera-se 4570 novos casos para o sexo masculino e 3940 para o sexo feminino, com um risco estimado de 5 casos para cada 100 mil homens e 4 a cada 100 mil para mulheres (INCA, 2012). Existem limitações no tratamento do câncer, com frequente efeito tóxico sobre células normais, além disso tumores sólidos são relativamente resistentes a quimioterapia, visto que o medicamento não consegue ser efetivo contra células localizadas no cerne do tumor (MELO et al., 2011). Em função disso, terapias alternativas e/ou coadjuvantes devem ser pesquisadas. O potencial do uso de produtos naturais como agentes anticâncer foi reconhecido em 1950 pelo National Cancer Institute dos Estados Unidos e desde então este campo de pesquisa tem contribuído de forma significativa para a descoberta de agentes antitumorais que ocorrem naturalmente. Em 2001, 25% das drogas mundialmente prescritas era de origem vegetal (isolados diretamente ou produzidos por síntese a partir de um precursor vegetal) sendo que nos Estados Unidos, entre 1983 e 1994, 60% dos medicamentos antitumorais aprovados tinham como origem compostos derivados do metabolismo secundário de vegetais superiores. Entretanto, o potencial do uso das plantas como fonte de descoberta de novas drogas ainda é pouco explorado e estima-se que das 250-500 mil espécies de plantas somente 5 - 15% foram estudadas do ponto de vista farmacológico (CRAAG e NEWMAN, 1999). A diversidade das plantas medicinais é uma fonte promissora de novas moléculas para formulação de medicamentos. Por exemplo, a espécie Catharanthus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae) é produtora dos alcalóides vincristina e vimblastina, que possuem atividade antitumoral (SANTOS et al., 1999). Taxus brevifolia Nutt. produz um alcalóide diterpênico conhecido como taxol, que mostrou ser efetivo contra câncer de ovário (GUCHELAAR et al., 1994). β-lapachona e lapachol extraídos do caule de Tabebuia impetiginosa (Mart. ex DC.), uma planta nativa do Brasil, mostraram também atividade antitumoral (ALMEIDA et al., 2009). 141 Neste sentido, esta pesquisa se propôs a estudar a atividade antitumoral de óleos essenciais, compostos presentes nos óleos essenciais (metil cinamato, citral, linalol, cariofileno, limoneno e carvona) e extratos metanólicos das plantas Ocimum americanum, Ocimum basilicum, Chenopodium ambrosioides, Mentha x villosa e Lippia alba sobre linhagens celulares MCF-7 e MDA-231 de câncer de mama e K562 de leucemia. 2 Material e métodos 2.1 Obtenção das amostras vegetais O cultivo das plantas foi feito nos meses de março a junho do ano 2010, no Horto de Plantas medicinais da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia localizado no município de Santo Antônio de Jesus, Latitude 12° 57′ 59.2”, Longitude 39° 15′ 49.4” LO. Todo o tratamento convencional de herborização seguiu o descrito por Mori et al. (1989). O material botânico coletado foi depositado no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana e identificado por especialista como Chenopodium ambrosioides L. (Amaranthaceae) - HUEFS 167951; Lippia alba (Mill) N.E.Br. (Verbenaceae) - HUEFS 167949; Mentha x villosa (Lamiaceae) - HUEFS 167948; Ocimum americanum L. (Lamiaceae) - HUEFS 167947 e Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) - HUEFS 167950, pelo sistema de classificação de Cronquist (1981). 2.2 Extração de óleo essencial A técnica de hidrodestilação por arraste a vapor foi utilizada para obtenção do óleos essenciais a partir de folhas, flores, sementes/frutos secos das plantas. O processo de extração foi conduzido durante 3 horas. A composição química do óleo essencial foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), em cromatógrafo Shimadzu CG-2010 acoplado a Espectrômero de Massas CG/MS-QP 2010 Shimadzu, coluna WCOT de sílica fundida, 30 m x 0,25 µm, injetor CP-1177, temperatura do injetor 220oC, gás de arraste Hélio (1mL/min), temperatura da interface de 240 oC, temperatura da fonte de ionização de 240oC, energia de ionização 70eV, corrente de ionização 0,7 kV e programa de temperatura do forno 60oC a 240oC (3oC/min), 240oC (20min). Os componentes foram identificados através da comparação dos espectros de massas obtidos com os da biblioteca do equipamento e por comparação dos Índices de Kovats (IK) calculados com a literatura (ADAMS, 1995) empregando uma série homóloga de hidrocarbonetos. Os 142 compostos majoritários identificados (metil cinamato, cariofileno, citral, linalol, limoneno e carvona) foram adquiridos da empresa Sigma Aldrich. 2.3 Preparo dos extratos metanólicos O caule seco foi pulverizado em moinho de faca e as extrações foram realizadas por meio de maceração em recipientes de vidro, utilizando-se metanol, na proporção material/solvente de 1:5. O produto da maceração foi concentrado em evaporadores rotatórios (40-42°C, sob pressão reduzida). 2.4 Ensaio de Citotoxicidade Sangue periférico foi coletado de voluntários saudáveis após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (aprovação do Comitato Etico dell'Arcispedale S.Anna, parecer n.11/2006). Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram obtidas de sangue periférico diluído (1:2 em solução de Hanks) e separadas por uma solução de polissacarose 5,7 g.dL-1 e diatrizoato de sódio 9,0 g.dL-1 (Histopaque 1077®-Sigma, St. Louis, MO, USA). As células mononucleares foram ressuspensas em D-MEM com alta concentração de glicose (Sigma, St.Louis, MO, USA), 50 U.mL-1 de penicilina e 50 U.mL-1 de estreptomicina, suplementado com 10% de FBS (Soro fetal bovino). 960.000 PBMC/poço foram cultivadas em placas de 96 poços por 2 horas. Os poços foram lavados para remoção de células não-aderentes e as células foram posteriormente incubadas por 3 dias na presença dos extratos metanólicos (10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1), óleos essenciais (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 500 µg.mL-1) e compostos majoritários metil cinamato, cariofileno, citral, linalol, limoneno e carvona (5 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 300 µg.mL-1), como controle uma solução de metanol/DMSO 3%, a qual foi utilizada para solubilizar os compostos. A determinação das células viáveis foi feita pelo ensaio do MTT. Após 72 h de um tratamento feito em triplicata, 25 μL de MTT foi adicionado a cada poço contendo células tratadas, seguido por um período de incubação de 2 h / 37 °C. Após incubação, os cristais de MTT foram solubilizados com 100 μL de solução de lise pH 4.7 por 3 h / 37 °C. A leitura da DO foi feita por espectrofotometria a 570 nm, usando a solução de lise como branco da reação. Foram considerados não tóxicos os compostos que permitiram uma viabilidade celular maior ou igual a 90%. 143 2.5 Atividade antiproliferativa Para avaliação da atividade antiproliferativa dos compostos foram utilizadas as linhagens de células tumorais K562 (leucemia), MCF-7 (câncer de mama) e MDA-231 (câncer de mama). As células foram cultivadas em flask de 25 cm3 utilizando meio RPMI (para linhagem K562) e DMEM (para linhagens MCF-7 e MDA-231), com 50 U.mL-1 de penicilina, 50 U.mL-1 de estreptomicina, suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS-Gibco serum), até atingirem uma confluência de 90%, a contagem do número de células foi determinada utilizando um contador automático de células (Coulter Electronics, Hialeah, FL,USA). Para a linhagem K562 foi utilizada uma semeadura inicial de 20.000 cels/ml (em placas de 24 poços). Os compostos extraídos das plantas foram solubilizados em metanol/DMSO 3%, esterilizados por filtração em membrana de 0,22 µm e usados nas seguintes concentrações: a) Concentrações usadas para os extratos metanólicos: 1 µg.mL-1, 10 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 100 µg.mL-1, 300 µg.mL-1, 500 µg.mL-1, 1000 µg.mL-1. b) Concentrações usadas para os óleos essenciais: 1 µg.mL-1, 5 µg.mL-1, 10 µg.mL-1, 30 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 100 µg.mL-1, 200 µg.mL-1, 400 µg.mL-1. c) Concentrações usadas para os compostos adquiridos da Sigma Aldrich: 5µg.mL-1, 10 µg.mL-1, 30 µg.mL-1, 50 µg.mL-1, 100 µg.mL-1, 300 µg.mL-1. A avaliação da capacidade antiproliferativa para células K562 foi determinada no terceiro, quarto e quinto dia após o tratamento, sendo o experimento feito em três repetições independentes. Como controles foram utilizados 3 poços sem tratamento, 3 poços com células tratadas com metanol/DMSO 3% e 3 poços com o antitumoral arabinosina citoside 1 µM (usado como controle positivo para o teste de diferenciação eritróide). Para as linhagens MCF-7 e MDA-231 foi utilizada como semeadura inicial, um volume que permitisse uma confluência inicial de 25% e o tratamento inicial foi feito após 2 horas do cultivo, de modo a permitir que as células aderissem a superfície da placa. As concentrações dos compostos foram as mesmas utilizadas para a linhagem K562. Como controles foram utilizados 3 poços sem tratamento, 3 poços com células tratadas com metanol/DMSO 3%. A avaliação da capacidade antiproliferativa foi determinada com 48 h para a linhagem MDA-231 e 72 h para linhagem MCF-7, sendo os experimentos feitos com 3 repetições de forma independente. 144 A análise por regressão linear foi usada para determinação da concentração que inibiu 50% da proliferação celular (IC50) utilizando o programa Microsoft EXCEL 2010 e os resultados foram expressos em média ± desvio padrão. 2.6 Triagem de compostos que induzem diferenciação eritróide em células K562 A linhagem K562 é um modelo celular usado para testes de diferenciação. Algumas drogas com atividade antiproliferativa sobre K562 podem também induzir diferenciação eritróide e síntese de hemoglobinas. Esta característica celular permite a triagem de drogas com potencial de induzir a expressão de hemoglobina fetal em indivíduos portadores de doença falciforme. A indução de hemoglobina fetal é um mecanismo desejável, visto que poderia melhorar sobremaneira a qualidade de vida de portadores de doença falciforme. Após os 7 dias de proliferação celular da linhagem K562 na presença dos compostos em suas diversas concentrações de trabalho, foi avaliado se os compostos induziram diferenciação eritróide por meio do ensaio da benzidina. 90 µL de benzidina a 0,2% (em 0,5 M de ácido acético glacial) foram homogeneizados em 10 µL de H2O2 10%, desta solução, 5 µL foram depositados sobre 5 µL de uma amostra da cultura celular. Como controle positivo da reação utilizamos 5 µL da cultura de células K562 na presença do antitumoral arabinosina citoside 1 µM e como controle negativo, células K562 não tratadas. Os resultados foram avaliados em microscópio óptico. Células com coloração azul (Figura 1B) representavam células com diferenciação eritróide. Os resultados foram expressos em percentagem, como sendo a média dos valores obtidos na contagem em três campos distintos. A B Figura 1 . Teste de indução de diferenciação eritróide em linhagem K562. A. Células K562 tratadas com os compostos sem sinal de diferenciação eritróide (incolores). B. Células K562 coradas em azul (controle positivo) pelo teste da benzidina, indicando que houve diferenciação eritróide. Registro fotográfico realizado com máquina digital modelo Samsung SL102. 145 4 Análise estatística Para análise estatística da atividade antiproliferativa foi aplicado o teste KolmogorovSmirnov para avaliar a distribuição normal das variáveis, seguido do Teste paramétrico ANOVA e post-hoc de Tukey, por meio do programa SPSS versão 17.0. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. 5 Resultados A Tabela 1 mostra os resultados das IC50 dos óleos essenciais, extratos metanólicos e compostos majoritários presentes nos óleos (citral, linalol, limoneno, carvona, metil cinamato e cariofileno) expressas em µg.mL-1 com seus respectivos desvios padrões. Tabela 1. Atividade antiproliferativa dos compostos sobre linhagens de células tumorais expressa em média da IC50 ± desvio padrão. COMPOSTOS K562 MÉDIA IC50 (µg.mL-1) ± Desvio Padrão MDA-231 MCF-7 Óleos essenciais Ocimum americanum (folhas) Ocimum americanum (flores) Ocimum basilicum (folhas) Ocimum basilicum (flores) Chenopodium ambrosioides (sementes e frutos) Lippia alba (folhas) Lippia alba (flores) Mentha x villosa (folhas) 191,29±2,13 89,02±6,88 140,21±9,14 44,48±4,22 85,90±7,45 576,18±28,36 524,27±28,71 475,35±22,98 211,59±3,21 148,86±8,67 274,33±16,69 251,61±16,22 142,34±1,66 115,69±5,69 64,35±10,12 51,03±7,79 125,02±18,13 4,67±1,30 163,78±29,40 135,17±11,44 179,28±7,72 67,49±7,61 66,05±15,63 56,87±2,85 63,75±10,20 355,62±20,32 228,20±9,19 80,55±5,84 240,25±21,42 495,38±22,3 835,02±9,46 637,10±6,00 657,60±5,02 724,26±12,68 201,18±3,86 910,10±3,64 639,26±21,38 628,98±4,50 743,56±9,50 Citral 8,61±1,29 41,98±7,45 Linalol 36,32±6,02 87,05±5,15 Limoneno 76,73±5,50 176,60±12,50 Carvona 79,84±10,15 190,89±10,52 Metil cinamato 43,43±6,44 283,98±28,59 Cariofileno 52,42±14,11 132,35±3,06 IC50 – Concentração capaz de inibir 50% do crescimento celular 49,52±11,12 18,86±1,32 96,26±5,74 84,91±11,78 27,08±8,42 114,08±8,40 Extratos metanólicos (caule) Ocimum americanum Mentha x villosa Chenopodium ambrosioides Ocimum basilicum Lippia alba Princípios ativos 146 Os resultados apontaram que a linhagem MDA-231 foi a mais resistente diante da ação dos compostos, seguida das linhagens MCF-7 e K562 (p < 0,05). A atividade antiproliferativa dos óleos essenciais foi maior que a atividade mostrada pelos extratos metanólicos e na maioria dos casos menor que a apresentada pelos princípios ativos testados isoladamente (p < 0,05), porém todas as concentrações inibitórias registradas para os óleos essenciais, capazes de inibir a proliferação das linhagens celulares, foram consideradas tóxicas. Foram considerados atóxicos aqueles compostos que permitiram uma viabilidade celular maior ou igual a 90%. Os resultados apontaram que os óleos essenciais extraídos de folhas e flores de O. americanum, folhas de O. basilicum em concentrações menores ou iguais a 50 µg.mL-1, o óleo essencial extraído de flores de O. basilicum em concentrações menores ou iguais a 5 µg.mL-1, citral em concentrações menores ou iguais a 50 µg.mL-1 e carvona, limoneno e linalol em concentrações menores ou iguais a 300 µg.mL-1 não foram tóxicos, sendo tóxicos os óleos essenciais de C. ambrosioides, L. alba e M. villosa em todas as concentrações estudadas e os compostos metil cinamato e cariofileno em concentrações maiores que 5 µg.mL-1. Com exceção do extrato metanólico de C. ambrosioides, todos os extratos estudados foram atóxicos. Embora considerado tóxico pelo ensaio do MTT, o óleo essencial que mostrou a menor concentração inibitória para a linhagem MDA-231 foi o óleo extraído de flores de L. alba (IC50 135,17 ± 11,44 µg.mL-1). A análise cromatográfica mostrou que 16,7%, 36,8% e 19,2% da composição do óleo essencial de flores de L. alba era respectivamente de limoneno, carvona e citral (mistura de neral e geranial), estes compostos testados isoladamente foram considerados atóxicos. A menor concentração inibitória para a linhagem MDA-231 foi registrada para o citral (IC50 41,98±7,45 µg.mL-1), houve diferença estatisticamente significante (p < 0,05) entre as atividades antiproliferativas apresentadas pelo óleo quando comparada com a atividade do citral, bem como em relação a atividade do citral quando comparada a atividade do limoneno (IC50 176,60±12,50 µg.mL-1) e carvona ((IC50 190,89±10,52 µg.mL-1). Não houve diferença estatística entre a atividade antiproliferativa registrada, frente a linhagem MDA-231, para o óleo de L. alba extraído de flores quando comparada com a atividade dos óleos: de folhas L. alba, folhas de M. villosa, sementes / frutos de C. ambrosioides. 147 Com relação aos extratos metanólicos atóxicos, a melhor atividade antiproliferativa registrada frente a linhagem MDA-231 foi para o extrato de O. americanum (IC50 495,38 ± 22,30 µg.mL-1). Com relação a linhagem MCF-7, a menor concentração inibitória foi registrada para o óleo essencial extraído de folhas de M. villosa (IC50 56,87 ± 2,85 µg.mL-1), cuja composição química mostrou a presença de 57,2% de óxido de piperitenona, porém este óleo foi também considerado tóxico. Contudo, o extrato metanólico obtido desta planta foi considerado o menos ativo, com IC50 igual a 910,10 ± 3,64 µg.mL-1, sendo o extrato mais ativo aquele extraído da planta O. americanum (IC50 201, 18 ± 3,86 µg.mL-1). Para a linhagem MCF-7, não houve diferença estatística entre as concentrações registradas para o óleo de M. villosa em comparação com as concentrações dos óleos de L. alba e C. ambrosioides. Entre os compostos majoritários identificados nos óleos essenciais, o citral, limoneno, carvona e linalol mostraram atividade antiproliferativa em concentrações atóxicas frente a linhagem MCF-7, sendo este último considerado o mais ativo (IC50 18,86 ± 1,32 µg.mL-1). Houve diferença estatisticamente significante (p < 0,05), entre as atividades apresentadas pelo linalol em relação aos compostos limoneno (IC50 96,26 ± 5,74 µg.mL-1) e carvona (IC50 84,91± 11,78 µg.mL-1). A linhagem celular K562 foi considerada a mais sensível a ação dos compostos. Nenhum óleo essencial estudado, frente a esta linhagem, mostrou atividade antiproliferativa em concentrações atóxicas, entretanto o óleo essencial extraído de folhas de M. villosa mostrou atividade na concentração de 4,67 ± 1,30 µg.mL-1. Entre os extratos, aqueles obtidos das plantas do gênero Ocimum foram considerados os mais ativos (IC50 do extrato de O. americanum 63,75 ± 10,20 µg.mL-1; O. basilicum 80,55 ± 5,84 µg.mL-1), não houve diferença estatística entre as atividades registradas para os extratos das plantas deste gênero. Da mesma forma, o limoneno, carvona, linalol e citral mostraram atividade antiproliferativa em concentrações atóxicas frente a linhagem K562, sendo o citral o mais ativo (IC50 8,61 ± 1,29 µg.mL-1). Houve diferença estatisticamente significante (p < 0,05), entre as atividades apresentadas pelo citral em relação ao composto limoneno (IC50 76,73 ± 5,50 µg.mL-1). O cariofileno foi identificado como um dos compostos presente no óleo essencial de O. basilicum, perfazendo 12,0% do óleo de folhas e 12,5% do óleo de flores e o metil cinamato representou 45,5% da composição do óleo essencial de folhas de O. americanum e 148 54,0% do óleo de flores desta planta. As IC50 registradas para o metil cinamato e cariofileno foram consideradas tóxicas pelo ensaio do MTT. Com relação aos resultados do teste da benzidina, nenhum composto testado foi capaz de induzir diferenciação eritróide em células K562. 6 Discussão Os resultados apontaram que a linhagem MDA-231 foi a mais resistente diante da ação dos compostos. Segundo Rochefort et al. (2003), a linhagem MCF-7 é caracterizada por ser ER+ (estrogen receptor positive) e a linhagem MDA-231, caracterizada por ser ER(estrogen receptor negative); linhagens ER- são mais resistentes e mais agressivas do que ER+, os autores afirmaram que o prognóstico de tratamento em pacientes com adenocarcinoma ER- é pior do que para ER+. Wu et al. (2011b) estudaram a ação do produto natural CAPE (Ácido caféico fenetil éster) sobre as linhagens MDA-231 e MCF-7 e mostraram que após um tratamento de 72 h, o CAPE a 40 µM foi capaz de induzir 28,5% de apoptose em MDA-231. Já em relação a MCF-7, menores concentrações (20 µM) induziram 66% de apoptose, confirmando que de fato a linhagem MDA-231 é mais resistente. Embora o óleo essencial extraído de flores de L. alba, com a melhor atividade antiproliferativa frente a linhagem MDA-231, tenha sido considerado tóxico, os constituintes majoritários presentes neste óleo, e que foram testados isoladamente, mostraram atividade antiproliferativa e foram considerados atóxicos. Segundo Simões e Spitzer (2007), os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, nesta mistura a atividade dos diferentes componentes pode ser sinérgica, ou seja a atividade do óleo é potencializada, ou antagônica quando esta atividade é reduzida. A maior toxicidade do óleo essencial encontrada no presente estudo, quando comparada a dos compostos majoritários testados isoladamente, pode ser explicada pelo efeito sinérgico entre os componentes do óleo, quando presentes na mistura. Este estudo mostrou que 12,5% do óleo essencial extraído de flores de O. basilicum é composto de cariofileno e parece existir uma ação sinérgica entre o cariofileno e os outros componentes químicos presentes neste óleo. Tanto o cariofileno, quanto o óleo foram considerados tóxicos em concentrações acima de 5 µg.mL-1 e não houve diferença estatisticamente significante entre a atividade antiproliferativa apresentada pelo cariofileno (IC50 114,08 ± 8,40 µg.mL-1), frente a linhagem MCF-7, em comparação com a atividade do 149 óleo essencial de flores de O. basilicum (115,69 ± 5,69 µg.mL-1). Também Tundis et al. (2009) mostraram que a IC50 do cariofileno para a linhagem MCF-7 foi maior que 50 µg.mL-1. Cabe ressaltar, que o cariofileno foi considerado atóxico apenas em concentrações abaixo de 5 µg.mL-1, esta toxicidade para células também foi reportada por Loizzo et al. (2007), que dentre os compostos testados, mostraram que o trans-cariofileno exibiu a maior citotoxicidade contra melanoma e adenocarcinoma renal. Sibanda (2004) descreveu IC50 de 100 µg.mL-1 para o óxido de cariofileno frente a linhagem MCF-7, resultado próximo ao apresentado por este estudo (IC50 de 114,08 ± 8,40 µg.mL-1). No entanto, segundo MolinaJasso et al. (2009) o cariofileno é considerado um composto químico seguro para uso em indústrias e com finalidade terapêutica. Esses autores estudaram o efeito clastogênico do cariofileno em animais submetidos a uma dieta com doses de 10, 100 e 1000 mg.kg-1 do composto. Não foi detectado morte ou sinais de toxicidade durante os 7 dias de tratamento e também não foram descritos efeitos genotóxicos. Cabe salientar, que segundo Sköld et al. (2006), os hidroperóxidos são produtos do metabolismo de cariofileno, estes hidroperóxidos são rapidamente convertidos a óxido de cariofileno, um segundo composto pouco reativo e mais estável. Este processo metabólico associado ao sistema de reparo do DNA e detoxificação em camundongos, poderia explicar a ausência de efeitos genotóxicos nos estudos, in vivo, de Molina-Jasso et al.(2009) e a divergência com os resultados encontrados no presente estudo, onde os testes foram feitos in vitro, o que mostra a importância de estudos in vivo quando se deseja conhecer as atividades biológicas de um composto. O óleo essencial extraído de flores de L. alba é composto de 19,2% de citral e parece existir uma ação antagônica entre o citral e os outros componentes químicos presentes neste óleo, visto que, isoladamente o citral foi mais ativo que o óleo essencial frente as linhagens MDA-231 e K562, bem como o citral foi considerado atóxico, enquanto o óleo essencial de L. alba foi tóxico em todas as concentrações testadas. Embora o presente estudo não tenha estudado o mecanismo de ação dos compostos frente as linhagens tumorais, segundo Chaouki et al. (2009), o citral é capaz de ativar caspase-3 e induzir parada do ciclo celular na fase G2/M com consequente indução de apoptose. Outro composto identificado no óleo essencial de L. alba estudado foi o limoneno. Limoneno é um dos terpenos mais comuns, encontrado em diversas espécies vegetais e o óleo essencial de L. alba estudado mostrou em sua composição 15,7% de limoneno no óleo extraído de folhas e 16,7% no óleo de flores. Não houve diferença estatisticamente 150 significante entre as atividades antiproliferativas registradas para o limoneno testado isoladamente e o óleo essencial de L. alba, no entanto, assim como descrito por Sun (2007), o limoneno foi considerado um composto com baixa toxicidade. Este estudo mostrou que o limoneno é um composto promissor para ser usado no tratamento de câncer de mama e leucemia. Ainda, segundo Ravizza et al. (2008), o limoneno tem a capacidade de potencializar a ação de drogas antitumorais. Bardon et al. (1998) estudaram o efeito de monoterpenos, incluindo o limoneno sobre linhagens de adenocarcinoma mamário (MCF-7 e MDA-231). Segundo os autores, este composto mostrou atividade antitumoral por reduzir os níveis citoplasmáticos de ciclina D1. A carvona, também presente no óleo essencial de L alba, mostrou valores para IC50 muito próximos do limoneno, presente no mesmo óleo. Da mesma forma, não houve diferença estatística entre a atividade antiproliferativa apresentada para carvona em relação a atividade do óleo essencial de L. alba. Os resultados do presente estudo mostraram que a atividade antiproliferativa destes compostos (limoneno e carvona) não difere estatisticamente, mas o limoneno foi um pouco mais efetivo contra todas as linhagens testadas, exceto para a linhagem MCF-7, este fato pode ser explicado em função do limoneno (1-metil-4-prop-1-en2-il-ciclohexeno) e carvona (2-Metil-5-(1-metiletenil)-2-ciclohexenona) serem dois monoterpenos derivados da via do mavalonato (CROWELL, 1999b) e possuírem fórmula estrutural quase idêntica, onde a única diferença é a presença de um grupamento cetona na carvona, que modifica sua solubilidade e a torna um pouco menos efetiva que o limoneno (YU et al., 2008). Aydin et al. (2013) mostraram que um tratamento por um período de 24 h com carvona em concentrações superiores a 100 mg.ml-1 apresentou atividade anticâncer para a linhagem N2a de neuroblastoma. Ravizza et al. (2008) mostraram que o linalol apresentou uma fraca atividade antiproliferativa (IC50 igual a 200,48 ± 48,31 µM) contra a linhagem MCF-7, quando testado isoladamente, porém potencializou os efeitos da droga doxorubicina, favorecendo a permanência desta última dentro da célula, principalmente contra a linhagem MCF-7 portadora de bombas de efluxo. O linalol associado a doxorubicina foi capaz de prolongar a fase G2/M do ciclo celular e induziu apoptose. A fraca atividade antitumoral do linalol, apresentada por Ravizza et al. (2008), também foi descrita por Kubo e Morimitsu (1995). No entanto, o presente trabalhou mostrou uma atividade melhor que a descrita por estes autores, sendo registrada uma IC50 de 18,86 ± 1,32 µg.mL-1 para o linalol contra a linhagem MCF-7, 151 IC50 87,05 ± 5,15 µg.mL-1 para a linhagem MDA-231 e 36,32 ± 6,02 µg.mL-1 para a linhagem K562. O linalol é um monoterpeno acíclico encontrado em diversas plantas como o O. basilicum. Este trabalho descreveu uma concentração de 15,9% para o linalol no óleo essencial extraído de flores de O. basilicum e houve uma diferença estatisticamente significante entre a atividade antiproliferativa do linalol em comparação com a atividade do óleo essencial de flores de O. basilicum frente as linhagens MCF-7 e K562. Além disso, o linalol foi considerado menos tóxico que o óleo essencial, o que mostra ser mais seguro e eficaz o estudo futuro do composto de forma isolada. O linalol mostrou um potencial biotecnológico na formulação de futuros quimioterápicos e segundo Edris (2007), este composto possui atividade antibacteriana, antiviral, anti-inflamatória, analgésica, anestésica e antitumoral. A célula K562, uma linhagem celular de leucemia, foi considerada a mais sensível a ação dos compostos, sendo o citral considerado o mais efetivo. Também Mesa-Arango et al. (2009) mostraram atividade antileucêmica para o citral, que foi considerado, no presente estudo, um dos compostos mais promissores. Entre os extratos metalólicos, aqueles que mostraram as melhores atividades contra a linhagem K562, foram os extratos do gênero Ocimum, principalmente da espécie O. americanum. Segundo Wu et al. (2012) a atividade antileucêmica de O. americanum está relacionada a presença de ácido ursólico, os autores mostraram que o ácido ursólico inibe proliferação celular de K562 por regular a atividade de PI3K. A linhagem K562 é um modelo celular usado para testes de diferenciação. Algumas drogas com atividade antiproliferativa sobre K562 podem também induzir diferenciação eritróide e síntese de hemoglobinas. Esta característica celular permite a triagem de drogas com potencial de induzir a expressão de hemoglobina fetal em indivíduos portadores de doença falciforme. A indução de hemoglobina fetal é um mecanismo desejável, visto que poderia melhorar sobremaneira a qualidade de vida de portadores de doença falciforme. Atualmente a hidroxiuréia é o medicamento usado para esta finalidade, porém os efeitos colaterais que acompanham o tratamento, por vezes contra indicam o seu uso (THORNBURG et al., 2011). Com relação aos resultados do teste da benzidina, do presente estudo, nenhum composto testado foi capaz de induzir diferenciação eritróide em células K562. Pesquisas sobre a atividade antiproliferativa do composto metil cinamato sobre as linhagens celulares estudadas são escassos. Embora as concentrações inibitórias registradas tenham sido consideradas tóxicas, a avaliação das atividades antiproliferativas mostradas 152 neste estudo é um trabalho pioneiro na área e indica um potencial deste composto como antitumoral. O metil cinamato representou 45,5% da composição do óleo essencial de folhas de Ocimum americanum e 54,0% do óleo de flores desta planta e deveria ser mais explorado em pesquisas futuras. Embora considerado tóxico, o óleo essencial que mostrou a melhor atividade antiproliferativa foi o óleo de M. villosa, porém o extrato metanólico desta planta foi considerado o que apresentou a pior atividade antiproliferativa. Há na literatura vários relatos da utilização de M. villosa pela população devido às suas propriedades medicinais. Esta espécie destaca-se pelo uso culinário na forma de chás com efeito medicinal, sendo comumente utilizada como espasmolítica, antivomitiva, carminativa, estomáquica e anti-helmíntica (LORENZI, 2002). Porém, o presente estudo mostrou que o óleo essencial de M. villosa foi tóxico e este fato serve como um alerta sobre o uso popular tão difundido desta planta com fins medicinais. Uma outra planta estudada no presente estudo e que mostrou atividade antiproliferativa foi o C. ambrosioides, cuja composição química do óleo essencial apresentou 65,9% de ascaridol, o que pode explicar a citotoxicidade apresentada pelo óleo desta planta. Segundo Gadano (2006), o óleo de C. ambrosioides rico em ascaridol mostrou ser irritante para mucosa intestinal, com efeitos também para o sistema nervoso central, gastroenterite, intoxicação podendo até mesmo causar a morte, embora seja um composto com reconhecida atividade anti-helmíntica. Não se deve descartar por completo aqueles compostos que apresentaram citoxicidade para células normais, pois novas avaliações em menores concentrações poderão ser feitas futuramente para outras linhagens celulares, o que poderá revelar um potencial terapêutico em baixíssimas concentrações, característica ideal de um medicamento que se propõe a ser usado em seres humanos. Além disso, existe pouca informação na literatura sobre as atividades biológicas das plantas estudadas como antitumorais, desta forma este estudo abre espaço para futuras pesquisas sobre o uso destes compostos para o controle da proliferação de células tumorais. 6 Conclusão A atividade antiproliferativa, sobre as linhagens tumorais, dos óleos essenciais foi maior que a atividade mostrada pelos extratos metanólicos e na maioria dos casos menor que a apresentada pelos princípios ativos testados isoladamente, sendo a linhagem de 153 adenocarcinoma mamário MDA-231 considerada a mais resistente diante da ação dos compostos, quando comparada a linhagem MCF-7 e K562. Todas as concentrações inibitórias registradas para os óleos essencias foram tóxicas para células normais. Parece existir um efeito químico antagônico entre os componentes presentes no óleo essencial e os compostos majoritários estudados, fazendo com que a atividade antiproliferativa dos compostos, quando testados isoladamente, seja maior. O composto citral foi considerado mais ativo frente a linhagem K562 (IC50 8,61 ± 1,29 µg.mL-1) e MDA-231 (IC50 41,98 ± 7,45 µg.mL-1), já o composto linalol foi mais efetivo frente a linhagem MCF-7 (IC50 18,86 ± 1,32 µg.mL-1). O citral foi considerado um composto promissor para uso em biotecnologia na formulação de futuros quimioterápicos com finalidade antitumoral. Em função das atividades registradas para o linalol, limoneno e carvona, estudos futuros utilizando estes compostos como adjuvantes de drogas antitumorais são necessários. Os compostos testados não foram capazes de induzir diferenciação eritróide em células K562, sendo os extratos metanólicos das plantas do gênero Ocimum aqueles que mostraram as melhores atividades antiproliferativas contra a linhagem K562. Estudos in vivo são necessários para comprovação dos resultados. Referências ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. Illinois: Allured Publishing Corporation, 1995. ALMEIDA, E. R. Preclinical and Clinical studies of lapachol and β-lapachone. The Open Natural Products Journal, v. 2, p. 42 – 47, 2009. AYDIN, E.; TÜRKEZ, H.; KELES, M. S. Potential anticancer activity of carvone in N2a neuroblastoma cell line.Toxicol Ind Health. 3 abr. 2013. [Epub ahead of print] BARDON, S.; PICARD, K.; MARTEL, P. Monoterpenes inhibit cell growth, cell cycle progression and cyclin D1 gene expression in human breast cancer cell lines. Nutr Cancer., v. 32, n. 1, p. 1-7, 1998. 154 CHAOUKI, W.; LEGER, D. 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