Estudar as moléculas de DNA e RNA

Estudar as moléculas de DNA e
RNA
Características físicas e químicas dos
ácidos nucleicos, importantes para o
seu estudo
Estabilidade da molécula de DNA
• Pontes de hidrogénio (entre as cadeias)
• Forças de Van der Walls (entre as bases empilhadas)
Emparelhamento de bases, devido à
complementaridade entre as bases
tem um papel importante nas
Técnicas de hibridação
(manipulação dos ácidos nucleicos)
Medição da concentração da dos ácidos
nucleicos em solução
As propriedades de absorção da luz
podem ser usadas para:
- detecção
- quantificação
- teste de pureza
Medição da concentração da dos ácidos
nucleicos em solução
As bases aromáticas são
menos acessíveis à luz UV
quando em DNAds
Bases aromáticas absorvem UV a 260 nm (cdo máximo). Pu>Py
RNA absorve mais luz
logo
o valor de absorção para
uma dada e mesma concentração
de DNA e RNA,
é maior para o RNA
DO260 (DNA)= 1
50µ
µg/ml
DO260 (RNA)= 1
40µ
µg/ml
Nucleic acids purity
- Pure dsDNA has
A260/A280 = 1,8
> 1,8
<1,8
- Pure RNA has
A260/A280 = 2
RNA contamination
Protein contamination
Renaturação da molécula de DNA
Denaturation
Renaturation
Desnaturação dos ácidos nucleicos
Tm- temperatura de fusão
Tm (melting temperature)- temperatura à qual metade da sequência de bases de determinada
molécula de DNA, está desnaturada.
Melting point ou temperatura de fusão dos ácidos nucleicos
% G/C em diferentes organismos
Factores que afectam a
desnaturação/renaturação da dupla hélice
•
•
•
•
•
•
% G/C
Sequência do DNA (DNA repetitivo)
% incompatibilidade de pb
Dimensão da molécula
Concentração do DNA
Força iónica (Na+, neutraliza P-; logo quando a concentração
salina é mais baixa, a dupla hélice fica mais instável, logo maior a
restringência quando se realizam hibridações)
• Agentes desnaturantes (formamida, ureia, etc)
Alguns agentes de desnaturação dos ácidos
nucleicos
• Temperatura (calor)- altera o estado tautomérico das
bases, ionizando-as e rompendo ligações por pontes de H
• Soluções alcalinas (NaOH)
• Formamida
• Ureia
Agentes químicos
que destabilizam
pontes de H
Acção de ácidos, bases e sais sobre a
molécula dos DNA
Bases:
-Alteram estado tautomérico das bases, rompendo as
interacções por ponte de H, desnaturando a dupla hélice,
ou estruturas secundárias dos ácidos nucleicos
Ácidos:
-Hidrolizam os ácidos nucleicos nos seus componentes:
bases, açúcares e fosfatos.
Soluções ácidas moderadas, clivam ligações glicosídicas,
glicosídicas
gerando locais apurínicos
Sais:
- Estabilizam os grupos fosfato com carga negativa
(tautomeric forms)
keto
enol
C=O
C-OH
keto
enol
amino
imino
-NH2
=NH
amino
imino
Isolar DNA
(ex.)
Grande variedade de técnicas consoante o tipo de estrutura que envolve o DNA:
vírus, célula bacteriana, fungos e leveduras, células de eucariotas superiores (plantas e animais).
O álcool exclui as moléculas de água do DNA, precipitando-o
Exemplo de um método de separação e purificação das
diferentes conformações da molécula de DNA
Protein and
membrane
Linear and nicked
circular DNA
Covalently closed
circular DNA
RNA
Ethidium bromide allows DNA visualization on
agarose gels
Visualização do DNA
Restrição do DNA
Electroforese em gel de agarose
DNA restriction
CÁTODO
pólo ou eléctrodo negativo para onde se
dirigem os catiões (iões de carga positiva)
Ânodo
Pólo ou eléctrodo positivo para onde se
dirigem os aniões (iões de carga negativa)
Electroforese em gel de agarose
Restriction of a DNA fragment and migration
on agarose gel of resulting products
Marcadores de peso molecular
DNA migration on agarose gel: DNA fragments
dimension vs agarose concentration