Genética Molecular em Medicina Transfusional

Cuidados Básicos no Laboratório de
Genética Molecular
Cuidados Básicos no
Laboratório de Genética Molecular
PROTEGER A AMOSTRA
• DNAses/RNAses
EVITAR CONTAMINAÇÕES
•
•
•
•
Pontas de filtro
Luvas
3 Zonas Distintas
Descontaminar bancas...
– Luvas
– Cobertas de banca
– Materiais M.B.
Grade
PRECISÃO MÁXIMA
– Descontaminar
• Confirmar volumes
bancas...
• Tempos e Temperaturas
exactos
PREPARAÇÃO DE
DNA E RNA
• DNAses e RNAses
– Omnipresentes em todo o material
biológico:
• Função biológica essencial
– Presentes em todo o material de vidro e de
plástico não tratado convenientemente
– Presentes em químicos não
“Mol.Biol.Grade”
– Presentes nas mãos de todo o pessoal de
laboratório
Descontaminar bancas
e equipamento
Pontas para
múltiplos
volumes
Pontas com marcas de volume
Pontas para tubos longos
Pontas para Geis
Pontas para DNA Genómico
Os tubos eppendorf:
Preparação
de
Ácidos Nucleicos
Preparação das células:
pulverização pós congelação
Preparação das células:
homogeneização
Preparação das células do sangue:
Centrifugação em gradiente
descontínuo de densidade (Ficoll)
Preparação das células
do sangue:
Lise dos eritrócitos
PREPARAÇÃO DE
DNA E RNA
• DNA e RNA de mamiferos:
– Lise suave e solubilização do DNA/RNA
– Destruição enzimática das proteínas
(proteases)
– Destrição e precipitação quimica das
proteínas (fenol/clorofómio/ácido isoamilico)
– Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato
de amónio / Acetato de sódio / Cloreto de
sódio)
– Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia
remoção de sais)
Método do
fenol/
clorofórmio
Método do
salting-out
PREPARAÇÃO DE
DNA E RNA
• DNA e RNA bacteriano
– Como a dos mamíferos, mas é necessário
ser eficaz na separação de polissacáridos,
muito abundantes em algumas bactérias:
• CsCl
• Enzimas:
–Lisozima
–Lisostafina
–etc
Ultracentrifugação em
gradiente de densidade
(CsCl)
Separação de ácidos nucleicos por
cromatografia de troca iónica
Eluição dos vários ácidos nucleicos em
função do pH
Colunas de sílica (ex. Qiagen)
Sílica Magnética
MagnaLyser