Genética Molecular em Medicina Transfusional
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A Genética Molecular em Análises Clínicas 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Cuidados Básicos no Laboratório PROTEGER A AMOSTRA EVITAR CONTAMINAÇÕES Pontas de filtro DNAses/RNAses Luvas Luvas 3 Zonas Distintas Cobertas de banca Descontaminar bancas... Materiais M.B. Grade Descontaminar PRECISÃO MÁXIMA bancas... • Confirmar volumes • Tempos e Temperaturas exactos PREPARAÇÃO DE DNA E RNA DNAses e RNAses Omnipresentes em todo o material biológico: Função biológica essencial Presentes em todo o material de vidro e de plástico não tratado convenientemente Presentes em químicos não “Mol.Biol.Grade” Presentes nas mãos de todo o pessoal de laboratório Descontaminar bancas e equipamento Pontas para múltiplos volumes Pontas com marcas de volume Pontas para tubos longos Pontas para Geis Pontas para DNA Genómico Os tubos eppendorf: A Genética Molecular em Análises Clínicas Preparação de Ácidos Nucleicos 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética Preparação das células: pulverização pós congelação Preparação das células: homogeneização Preparação das células do sangue: Centrifugação em gradiente descontínuo de densidade (Ficoll) Preparação das células do sangue: Lise dos eritrócitos PREPARAÇÃO DE DNA E RNA DNA e RNA de mamiferos: Lise suave e solubilização do DNA/RNA Destruição enzimática das proteínas (proteases) Destrição e precipitação quimica das proteínas (fenol/clorofómio/ácido isoamilico) Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio) Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia remoção de sais) Método do fenol/ clorofórmio Método do salting-out PREPARAÇÃO DE DNA E RNA DNA e RNA bacteriano Como a dos mamíferos, mas é necessário ser eficaz na separação de polissacáridos, muito abundantes em algumas bactérias: CsCl Enzimas: • Lisozima • Lisostafina • etc Ultracentrifugação em gradiente de densidade (CsCl) Separação de ácidos nucleicos por cromatografia de troca iónica Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do pH Colunas de sílica (ex. Qiagen) Formato de 96 poços DNA Genómico Vacuo Versus Centrifugação Qiagen Biorobot 9600 Qiagen Biorobot 9604 Método de Boom Sample + Lysis buffer GuSCN Nucleic acid Silica Wash Proteins and Lipids Elution buffer processing time 10 samples/1.5h Centrifugation Purified Nucleic acid “Boom” compatible Sample Types Faeces Full Blood Throat swabs Serum/plasma Dermal lesions PBMC/PBL swabs Sputum Cerebro spinal Urine fluids Brain tissue Cervical smears Spleen tissue Pus samples Foodmatrices Liver tissue Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), 495-503, 1990 Nuclisens Extractor Unidade Principal Baía dos reagentes Cartridge modules As cartridges MagnaPure (Roche) MagnaLyser Outros sistemas automáticos
