Trabalho

XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
ANÁLISE CITOGENÉTICA COM CMA/DAPI REVELA PEQUENOS
HETEROMORFISMOS EM ACESSOS DE Allium Sativum L. (o alho)
Polyanna Araújo Alves Bacelar1, Genialdo Ramos dos Santos2, Lidiane de Lima Feitoza3, Reginaldo de Carvalho4, Ana
Paula Peron5, Ângela Celis de Almeida Lopes6
Introdução
O gênero Allium possui centro de diversidade na Ásia Central, segundo Vavilov (1992), e distribuição por diversos
continentes abrangendo mais de 800 espécies (Fritsch et al., 2010). Entre elas está Allium sativum L., o alho comum,
uma das olerícolas mais apreciadas no mundo devido suas propriedades medicinais, como a capacidade antibiótica,
antifúngica, antiviral, dentre outras (Marchiori, 2003), além de suas qualidades nutricionais que o faz ser utilizado na
culinária de diversos continentes. É uma planta herbácea com altura variando de 40 a 60 cm, folhas lanceoladas, limbo
mede de 20 a 30 cm de comprimento e o sistema radicular é fasciculado. Sob condições climáticas favoráveis, as gemas
do caule desenvolvem-se formando cada uma um bulbinho de formato ovoide arqueado envolto pelas brácteas que em
seu conjunto, formam o bulbo (Trani et al., 1997). É apomítica obrigatória com reprodução assexuada (Block, 2010).
Devido à restrição reprodutiva, sua variabilidade genética é limitada pela ocorrência de mutações gênicas e alterações
cromossômicas estruturais acumuladas ao longo das gerações (Puiatti & Ferreira, 2005).
Em programas de melhoramento é crucial a caracterização da diversidade genética existente e a citogenética tem
sido utilizada em bancos de germoplasma para esse fim (Pereira, 2010). Além disso, a citogenética tem sido usada para
outros propósitos tais como a identificação de alterações cromossômicas numéricas e estruturais, mapeamento físico
cromossômico, descrição cariotípica de variedades ou cultivares para a inclusão em esquema de cruzamento e controle
na obtenção de híbridos ou poliplóides. Essas informações possibilitam que o melhorista tenha maior capacidade de
manipulação do genótipo e melhor possibilidade na tomada de decisões. Uma das técnicas citogenéticas que podem ser
empregadas para estudo da variabilidade genética é o bandeamento com coloração CMA/DAPI. Essa técnica informa a
constituição da heterocromatina detalhando o padrão de distribuição das bases pelo uso do fluorocromo cromomicina
A3 (CMA) e 4’6-diamidino-2-phenilindol (DAPI), que coram preferencialmente regiões ricas em GC (CMA) e AT
(DAPI) (Guerra, 2000). Muitos estudos têm sido desenvolvidos sobre as propriedades farmacológicas e nutricionais de
Allium sativum L, mas poucas informações são encontradas sobre os eventos cromossômicos desta espécie e nenhuma
pesquisa citogenética ou sobre a estruturação genômica em banco de germoplasma de alho tem sido realizada no Brasil.
Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi caracterizar a diversidade genética existente em alguns acessos de
Allium sativum L., pelo bandeamento cromossômico CMA/DAPI para uma análise prévia do cariótipo (número e
morfologia) e da sua constituição de sequências ricas em CG ou AT.
Material e métodos
A. Material Vegetal
Os três acessos analisados foram cedidos pelo Banco Ativo de Germoplasma de Alho da Escola Superior de
Agricultura ‘Luiz de Queiroz’- Universidade de São Paulo (ESALQ-USP). Esse material foi proveniente das seguintes
localidades: o genótipo Santo Antonio de Lisboa – Piauí (PI) foi coletado junto aos agricultores em área de cultivo,
feiras e mercados populares na Microrregião de Picos-PI e incorporadas posteriormente à Coleção de Germoplasma de
Alho da Universidade Federal do Piauí (UFPI) e ao Banco Ativo de Germoplasma de Alho da ESALQ-USP; o genótipo
Branco Mineiro – PI é de uma subamostra cedida pelo Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças da Empresa Brasileira
de Pesquisa e Agropecuária (EMBRAPA – CNPH), que corresponde a um material oriundo de coleta de germoplasma
no Piauí, em 1976; o genótipo Cateto Roxo 99 foi cedido pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC).
1
Mestranda do Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Piauí, Centro de Ciências Agrárias, Rua Dirce
de Oliveira, 3597, Bairro Socopo, Teresina, PI, CEP 64048-550. E-mail: [email protected]
Mestrando do Programa de Pós-graduação em Botânica, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manoel de Medeiros s/n, Recife,
PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
3
Pesquisadora associada do Departamento de Biologia/Genética , Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manoel de Medeiros s/n,
Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected].
4
Professor do Departamento de Biologia/Genética, Programa de Pós-graduação em Botânica, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua
Dom Manoel de Medeiros s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
5
Professora do Curso de Biologia/UFPI-CSHNB , Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Piauí,
Centro de Ciências Agrárias, Rua Dirce de Oliveira, 3597, Bairro Socopo, Teresina, PI, CEP 64048-550. E-mail: [email protected]
6
Professora do Curso de Biologia/UFPI , Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do Piauí, Centro de
Ciências Agrárias, Rua Dirce de Oliveira, 3597, Bairro Socopo, Teresina, PI, CEP 64048-550.
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XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
B. Obtenção da raiz e preparação da lâmina
Os bulbos de alho foram separados em bulbinhos que foram sutilmente cortados na região basal do caule, onde
nascem as raízes. Esta região ficou em contato com água para o crescimento radicular que durou em média três dias.
As raízes jovens foram coletadas às 17 horas, pré-tratadas com colchicina a 0,2% por 18 horas a 10ºC, fixadas com
solução de etanol e ácido acético (3:1 v/v) e estocadas em freezer a -20ºC. As raízes fixadas foram lavadas em água
destilada três vezes por cinco minutos cada, a região meristemática foi isolada com auxílio da lupa e o tecido
permaneceu sob ação da solução enzimática celulase 2% (Onozuka) e pectinase 20% (Sigma) em câmara úmida em
estufa a 37°C por uma hora. Em seguida as lâminas foram preparadas pelo método de esmagamento em uma gota de
ácido acético 45% e as lamínulas foram retiradas submetidas ao vapor do nitrogênio líquido. As lâminas foram secas ao
ar e envelhecidas por três dias à temperatura ambiente.
C. Bandeamento com fluorocromos CMA/DAPI
As lâminas envelhecidas por três dias foram coradas com CMA (cromomicina A3), mantidas em câmara úmida por
uma hora no escuro. Após este período, as lâminas foram lavadas com jatos de água destilada e seca com bomba de ar.
Posteriormente foram coradas com DAPI (4’,6-diamidino-2-phenilindol) por 30 minutos, lavadas, secas e montadas em
tampão McIlvaine-glicerol (1:1 v/v).
Resultados e Discussão
Todos os acessos analisados apresentaram número cromossômico 2n=16, corroborando a contagem prévia realizada
por Konvicka & Levan (1972). De uma forma geral, a fórmula cariotípica encontrada foi 6M+2SM. Os cromossomos
apresentaram padrão de condensação uniforme, cariótipo simétrico, tamanho cromossômico variando de 7,16 a 13,46
µm e núcleo interfásico do tipo reticulado. A dupla coloração com os fluorocromos cromomicina A3 e 4’,6-diamidino2-phenilindol revelou bandas CMA+/DAPI- bastante reduzidas e não foi observado a presença de bandas DAPI+. As
bandas CMA apresentaram diferentes intensidades de coloração, recebendo o símbolo + de acordo com a magnitude do
sinal emitido. Além do mais, os menores blocos ficaram ainda mais discretos em cromossomos com alto nível de
compactação, que só pôde ser confirmado observando-se os cromocentros, que são formados em parte pela
heterocromatina, dos núcleos interfásicos ou no cromossomo mais distendido em prófase. O genótipo Santo Antonio de
Lisboa – PI apresentou uma banda CMA++ intercalar no braço curto dos pares cromossômicos cinco (metacêntrico) e
sete (submetacêntrico), além de uma banda CMA+ adicional na região terminal do braço curto do par cinco. O par sete
apresentou heteromorfismo para posição do centrômero, com um dos cromossomos ligeiramente mais submetacêntrico
com presença de uma pequena banda CMA+ na região terminal do braço curto, sugerindo que esse genótipo vem
sofrendo modificações estruturais em seu cariótipo. Entretanto, em espécies com cromossomos grandes sabe-se que são
muito comuns eventos de deleções, duplicações, inversões e fissões e fusões do tipo Robertsonianas. O genótipo Branco
Mineiro – PI mostrou pequenos gaps, semelhantes a bandas negativas de um ou outro fluorocromo, mas que na verdade
são sulcos formados pela condensação. Neste acesso, o par cinco apresentou uma banda CMA++ intercalar no braço
curto. O par cromossômico seis apresentou uma pequena diferença no tamanho e de posição do centrômero e o par sete
apresentou polimorfismo de intensidade nos blocos CMA+, indicando uma possível duplicação (ou deleção) das
sequencias GC neste segmento ao longo da evolução. No genótipo Cateto Roxo 99 foi possível observar três pares
heteromórficos para posição do centrômero e blocos CMA+. O par cinco apresentou uma banda CMA++ intercalar no
braço curto e uma pequena banda CMA+ na região distal do braço longo, antecedendo o telômero. No seu homólogo só
foi possível a visualização da banda distal do braço longo, sugerindo mais uma vez uma possível deleção ou
translocação do segmento CMA+ intercalar. O par cromossômico seis mostrou pequena diferença no tamanho e na
posição do centrômero com presença de uma pequena banda CMA+ na região intercalar do braço longo em um dos
cromossomos. No par sete observou-se um bloco CMA++ intercalar no braço curto em um cromossomo e um bloco
CMA+ no homólogo. O padrão de heteromorfismo para posição do centrômero no par seis é igual paras os três
genótipos, no entanto, apresentaram diferenças entre cariótipos e entre cromossomos de cada cariótipo para bandas
CMA+ nos pares cromossômicos cinco, seis e sete. De acordo com a literatura, diferenças estruturais entre cariótipos de
espécies próximas ou correlatas, ou genótipos de mesma espécie, se devem ao acúmulo de pequenos eventos genéticos
pela ocupação de ambientes distintos. No presente estudo, os acessos analisados foram provenientes de diferentes
localidades e provavelmente estejam sujeitos a diferentes tipos de forças evolutivas, resultando no acúmulo de pequenas
diferenças estruturais nos cromossomos. Acredita-se que os cromossomos heteromórficos observados com os
fluorocromos possam ser utilizados como marcadores citológicos na identificação e comparação de diferentes acessos,
entretanto, esses trabalhos são muito iniciais e outras técnicas, como a FISH (Fluorescent in situ Hybridization) e a
imunocoloração de proteínas, deverão ser utilizadas para uma compreensão mais segura dos principais eventos
citológicos ocorrentes no alho.
Agradecimentos
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
Ao Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento – UFPI e ao Laboratório de Citogenética Vegetal da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE).
Referências
Block, E. Garlic and other Alliums: The lore and the science. Cambridge, UK: Royal Society of Chemistry. 434p. 2010.
Fritsch R.M.; Blattner, F. R.; Gurushidze, M. New classification of Allium L. subg. Melanocrommyum (Webb &
Berthel) Rouy (Alliaceae) based on molecular and morphological characters. Phyton. p. 145-220.2010.
Guerra, M. Patterns of heterochromatin in plant chromosomes. Genetics and Molecular Biology, v.23, n.4, p. 10291041. 2000.
Konvicka, O.; Levan, A. Chromosome studies in Allium sativum. Hereditas, 72. p. 129–148. 1972.
Marchiori,
V.
F.
Propriedades
funcionais
do
alho
(Allium
www.esalq.usp.br/siesalq/pm/alho_revisado.pdf. Acesso em: 29 de setembro de 2013.
sativum
L.)
2005
Pereira, T. N. S. Germoplasma: conservação, manejo e uso no melhoramento de plantas. 1ª edição. Viçosa, MG: editora
Arca. 250p. 2010.
Puiatti, M.; Ferreira, F. A. Cultura do alho. In: FONTES, P. C. R. (Ed.). Olericultura: teoria e prática, Viçosa: Suprema,
p. 299-322. 2005.
Trani, P. E.; Tavares, M.; Siqueira, W. J.; Santos, R. R.; Bisão, L. G.; Lisbão, R. S.Cultura do alho: recomendações para
seu cultivo no estado de São Paulo. Bolteim técnico 170, CDD 635.262. Campinas, Instituto Agronômico, 39p. 1997.
Vavliov, N. I. Centro de origem das plantas cultivadas. Jaboticabal: Funep, 1992.