RESPOSTA IMUNE CONTRA ARTRÓPODES - R1
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RESPOSTA IMUNE CONTRA ARTRÓPODES PARASITOS Cleber Oliveira Soares¹ Carlos Luiz Massard² Cesar A. Mora Hernandez³ Adivaldo Henrique da Fonseca4 ¹MsC, Doutorando do Curso de Pós-graduação em Medicina Veterinária - Parasitologia Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Km 47, Rod. Rio-São Paulo, Seropédica-RJ, 23890-000, e-mail: [email protected]; ²PhD, Professor Titular, Depto. de Parasitologia Animal, UFRRJ; ³PhD, Professor Adjunto, Universidade Centroamericana, Manágua, Nicarágua; 4PhD, Professor Titular, Depto. de Epidemiologia e Saúde Pública, UFRRJ. Página INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................................................... 1 HIPERSENSIBILIDADE ....................................................................................................................................................... 3 IMUNIDADE ADQUIRIDA ................................................................................................................................................... 3 IMUNIDADE INDUZIDA ...................................................................................................................................................... 6 VACINAS CONTRA ARTRÓPODES .................................................................................................................................. 8 NÍVEIS DE ANTICORPOS CONTRA CARRAPATOS .............................................................................................................. 10 EFEITO DOS IMUNÓGENOS SOBRE OS CARRAPATOS ........................................................................................... 13 EFEITO SOBRE A BIOLOGIA DO CARRAPATO .................................................................................................................... 13 ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS DO TRATO INTESTINAL ..................................................................................................... 15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................................................. 17 INTRODUÇÃO As respostas imunes contra os artrópodes são designadas, essencialmente, contra os antígenos presentes na saliva, os quais são inoculados no hospedeiro durante o repasto alimentar. Estas respostas podem ser de três tipos: 1 – Alguns antígenos salivares com baixo peso molecular (haptenos) se associam às proteínas da pele do hospedeiro para estimular uma resposta imune, de base celular. Numa exposição subseqüente estes haptenos estimulam uma reação de hipersensibilidade tardia. A dermatite alérgica a picadas de pulgas, no cão, é caracterizada por este tipo de resposta; 2 2 – Os antígenos salivares podem se ligarem às células de Langerhans presentes na epiderme e induzirem uma hipersensibilidade cutânea do tipo basofílica, associada à produção de imunoglobulina da classe G (IgG) e, com a infiltração basofílica; 3 – Os antígenos salivares estimulam a produção de IgE, desencadeando uma reação de hipersensibilidade do tipo I. Esta resposta induz a uma severa inflamação na pele, ocorrendo o prurido e a dor. Estes mecanismos imunológicos podem modificar a pele do hospedeiro, de maneira que o repasto do artrópode é prejudicado. Entretanto, os artrópodes são hábeis em evadir o sistema imune dos hospedeiros. As respostas imunes contra antígenos salivares são pouco eficientes, pois não determinam danos consideráveis no artrópode, são de curta duração e a saliva dos artrópodes possui efeito imunossupressor (Ribeiro et al., 1985; Tizard, 1995; Wikel, 1996). Os mecanismos de resposta imune aos artrópodes são similares entre os diferentes grupos destes parasitas. Os carrapatos são artrópodes ectoparasitas de diferentes grupos de animais. Estes possuem grande importância por determinarem injúrias aos hospedeiros, pelo hematofagismo, inoculação de toxinas, determinação de lesões e são responsáveis por transmitirem biológica e/ou mecanicamente a maior diversidade de agentes patogênicos. Consequentemente, este parasito tem sido alvo de trabalhos elucidativos para a compreensão da interrelação hospedeiro/ectoparasita. A expressão da resposta imune a estes parasitas é reconhecida desde o início do século, com estudos sobre a imunidade adquirida ao Boophilus microplus (Canestrini, 1887), segundo Johnston & Bancroft (1918). A resistência imunológica adquirida aos carrapatos é expressa, principalmente, sobre o estágio larval e se faz, especialmente, pela participação de células da inflamação e substâncias que produzem. Na resistência induzida, a expressão ocorre sobre o estágio adulto do ixodídeo, sendo este tipo de imunidade determinada por inoculação de antígenos brutos ou particulados (Willadsen, 1980). Uma grande variedade de imunógenos foram testados objetivando o controle de carrapatos e outros artrópodes: desde extratos brutos derivados de órgãos do ixodídeo; antígenos "ocultos" recombinantes, a partir de proteínas de células digestivas; até peptídeos sintetizados. Na resistência adquirida pouco se conhece sobre o mecanismo que determina a interrupção do repasto sangüineo do carrapato. Entretanto, na imunidade induzida, mais eficiente na atualidade, o principal mecanismo decorre da atuação dos anticorpos específicos, bloqueando a atividade endocítica das células digestivas (Kemp et al., 1986; Wikel, 1996). Baseado nos conhecimentos de expressão da imunidade dos animais aos ixodídeos, duas alternativas no controle imunológico foram propostas atualmente: uma através da seleção de indivíduos 3 imunocompetentes e outra pelo uso de antígenos purificados como indutor da resistência através da imunização direta. HIPERSENSIBILIDADE A resposta imune humoral dos vertebrados às repetidas infestações por artrópodes é constatada com a elevação dos níveis de IgM, IgG e IgE, sendo estas duas últimas envolvidas na reação de hipersensibilidade resultante das infestações. Durante as infestações há uma dinâmica celular, na pele, e a relação entre linfócitos T CD4 para T CD8 aumenta após suscessivas infestações (Mbow et al., 1994). A hipersensibilidade tipo I é um mecanismo associado à resistência ao carrapato, pois observase aumento de mastócitos degranulados e imunoglobulinas da classe E; aumento de infiltrado eosinofílico na pele e aumento da concentração de IgM e IgG. Ainda na hipersensibilidade, os antígenos salivares ativam a fração C5 do complemento, que tem função de anafilatoxina e quimiotática, importantes na reação inflamatória (Gordon & Allen, 1991). IMUNIDADE ADQUIRIDA O fenômeno de resistência imune adquirida a carrapatos tem como manifestação primária o decréscimo do número da população infestante que completa o ciclo após novos desafios (Roberts, 1968). O estágio de larva é o mais afetado neste tipo de imunidade (Willadsen, 1987). Os carrapatos encontram dificuldades ao realizarem o repasto em bovinos previamente infestados; apresentando estes artrópodes peso corporal inferior em relação àqueles alimentados em animais sem contato prévio (Kemp et al., 1976). A fixação dos carrapatos nos hospedeiros previamente infestados induz uma marcada reação de hipersensibilidade local, fenômeno importante na mediação da resistência (Willadsen, 1987) (Tabela 2). Nos sítios de alimentação dos carrapatos, em animais resistentes, desenvolvem-se reações cutâneas constituídas principalmente de basófilos e eosinófilos (Allen, 1973). Os basófilos possuem um papel importante na limitação do repasto sangüineo. A expressão da resistência adquirida pode ser reduzida pela administração de anticorpos anti-basófilos (Brown et al., 1982). A degranulação de basófilos ocorre durante repetidas infestações na presença de antígenos salivares, e outros tipos celulares degranulam durante a exposição primária e subseqüente, quando da formação do sítio alimentar (Brossard & Fivaz, 1982). Enzimas salivares do carrapato podem hidrolisar a membrana 4 celular causando a liberação de substâncias vasoativas (Sauer et al., 1995). Antígenos salivares, imunoglobulinas e complemento foram localizados na junção dermo-epidermal de animais resistentes (Allen et al., 1979), e a salivação contínua do carrapato permite a formação de complexos antígenoanticorpo circulantes que se depositam no sítio alimentar. Moléculas biorreativas oriundas de células da inflamação influenciam a biologia dos carrapatos, causando-lhes injúrias e alterações comportamentais. Histamina, leucotrienos, prostaglandinas, proteínas eosinofílicas, enzimas, fixação de complemento e outros mediadores da resposta imune e inflamatória contribuem na formação de lesão nos sítios de fixação, afetando o ingurgitamento (Wikel, 1996). Por outro lado, elevados níveis de substâncias vasoativas, induzidas pela salivação, aumentam a permeabilidade vascular, além de outras alterações endoteliais. As células de Langerhans são importantes na resistência adquirida dos animais aos carrapatos, pois estas decrescem de número durante a infestação primária e aumentam na fase inicial da infestação secundária. Atuam, ainda, como células acessórias apresentadoras de antígeno na expressão da resistência adquirida (Nithivthai & Allen, 1984). Anticorpos contra antígenos salivares não garantem imunidade sólida; visto que determinam proliferação de linfócitos e degranulação celular, além de serem glicoproteínas que possuem reações cruzadas interespecíficas (Wheeler et al., 1991) (Tabela 1). 5 Tabela 1: Principais formas de expressão de imunidade adquirida dos hospedeiros aos carrapatos. CARRAPATO HOSPEDEIRO CARRAPATO Ação: Efeito: Ação: Fixação Hipersensibilidade local N° de larvas Sítio de alimentação Basófilos e eosinófilos Limitação do repasto sanguíneo Antígenos salivares Degranulaçao de basófilos Limitação do repasto sanguíneo Enzimas salivares Liberação de substâncias vasoativas Limitação do repasto sanguíneo Salivação contínua imunocomplexos no sítio alimentar Ingurgitamento Saliva Moléculas biorreativas Injúrias e alterações comportamentais Saliva Permeabilidade vascular, alterações --- endoteliais Bos taurus infestados com adultos de Dermacentor andersoni, apresentaram linfócitos sangüíneos periféricos reativos in vitro com extrato de glândula salivar da mesma espécie de carrapatos (Wikel & Osburn, 1982). Enquanto que B. indicus infestados com Amblyomma americanum desenvolveram linfócitos menos responsivos, in vitro, ao extrato salivar deste carrapato (George et al.,1985). A resistência adquirida pelo bovino ao B. microplus, até certo grau, é hereditária, o que justifica a seleção de indivíduos menos susceptíveis (Hewetson, 1978). O uso de anticorpos anti-saliva para detectar a imunidade à carrapatos, quanto à resistência adquirida, é um erro potencial, pois estes apenas contribuem na expressão da resistência e muitos não são reativos com moléculas envolvidas nos processos biológicos do artrópode (Wikel, 1996). A saliva dos carrapatos possui substâncias farmacologicamente ativas com propriedades antiinflamatória, antihemostática e imunossupressiva o que reduz a defesa do hospedeiro (Ribeiro et al., 1985). A imunossupressão mediada por carrapatos contribui ao sucesso no estabelecimento de infecção por hematozoários transmitidos por estes ixodídeos (Urioste et al., 1994). A intensidade de fixação das larvas de B. microplus sobre animais resistentes está relacionada à hipersensibilidade e a prolongada irritação; além da existência da imunidade humoral, o que foi comprovado pela transfusão sérica de animais resistentes à animais susceptíveis (Oberen, 1984). Willadsen & Williams (1976) identificaram na saliva de B. microplus as enzimas esterase hidrolítica, enzima proteolítica e, as de inibição da coagulação sangüínea e de fixação do complemento. Todas estas enzimas contribuem na reação de hipersensibilidade imediata em diferentes níveis, de acordo a resistência individual (Willadsen, 1980). Pouco se conhece sobre o mecanismo da interrupção no 6 repasto sangüíneo do carrapato, prejudicando a produção de ovos e a viabilidade destes. As substâncias biologicamente ativas liberadas por basófilos, eosinófilos e outros tipos celulares são apenas fatores que podem contribuir no fenômeno da resistência. IMUNIDADE INDUZIDA Os primeiros avanços no conhecimento da imunidade induzida ao carrapatos foram reportados por Trager (1939), imunizando cobaios e coelhos com extratos brutos de D. variabilis. Este autor observou que larvas e ninfas submetidas aos desafios apresentavam menores índices de engurgitamento. A partir da década de 40 muitos estudos foram desenvolvidos relativos à resistência induzida aos ixodídeos. A redução no número de adultos de Hyalomma anatolicum excavatum foi observada em coelhos após inoculação com extrato de glândula salivar (Wikel, 1996). Garin & Grabarev (1972) obtiveram sucesso na imunização de coelhos e cobaios com extrato de glândula salivar de Rhipicephalus sanguineus. Em teste com cobaios imunizados com 1 - 4 mg de extrato de larva de Ixodes holocyclus, verificou-se, após três semanas, o percentual de rejeição para larvas de 29 68 % (Bagnall, 1978). O extrato de glândula salivar de B. microplus inoculado em bovinos é capaz de induzir resistência (Brossard, 1976). A purificação do alérgeno 2 (inibidor da enzima proteolítica e da coagulação sangüínea), a partir de larvas de B. microplus, quando inoculado em bovinos, demonstrou sucesso parcial na resposta imune, caracterizada pela reação de hiperssensibilidade. Assim, Willadsen et al. (1978) sugeriram a necessidade do encontro de antígenos internos que induzissem resposta imune satisfatória. Bovinos mestiços (B. indicus x B. taurus) foram imunizados com a combinação de antígenos solúveis e particulados, preparados de B. microplus, onde observou-se uma redução altamente significativa na carga parasitária (Johnston et al., 1986). Os melhores resultados na imunização contra os ixodídeos têm sido obtidos ao inocular-se nos animais antígenos derivados de porções dos carrapatos que não estão diretamente expostas no momento do repasto sangüíneo. Para estes antígenos foi proposta a denominação de "antígenos ocultos" ou "antígenos escondidos" (Ackerman et al., 1980). Diferente da imunidade adquirida à carrapato, a imunidade induzida por antígenos particulados, principalmente os “ocultos”, não apresenta reações de hipersensibilidade; atua principalmente sobre o estágio adulto do carrapato; os carrapatos sobreviventes são pequenos e apresentam sinais de lesões internas, com cor avermelhada e, ao exame histológico, 7 observa-se severas lesões no trato digestivo (Agbede & Kemp, 1986; Mora Hernandez et al.,1997) acompanhadas de redução no peso e postura das fêmeas que ingurgitam (Kemp et al., 1986; Massard et al., 1995). Assim, esta imunidade expressa seus efeitos principalmente nos sistemas digestivos e reprodutivos do carrapato (Tabela 2). Os antígenos do intestino médio de B. microplus são os que induziram melhores níveis de imunidade a infestação por estes carrapatos. Opdebeeck et al. (1988 a) observaram uma redução de 87% da carga parasitária de B. microplus em bezerros Hereford submetidos ao desafio com antígenos intestinais. Posteriormente, o intestino do B. microplus foi processado e fracionado em uma parte insolúvel (membranas) e outra solúvel e observou-se que a parte insolúvel conferiu 91% de proteção e a mistura de ambas 82%. A fração solúvel não induziu proteção significativa (Opdebeeck et al., 1988 b). Tabela 2: Comparação entre a imunidade adquirida e a imunidade induzida de bovinos ao carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887). EFEITOS TIPO DE IMUNIDADE ADQUIRIDA INDUZIDA Larva Adultos Variável, a maioria Usualmente grande redução Pequeno efeito Grande efeito 3. Peso da postura Não afeta Grande efeito 4. Viabilidade da postura Não afeta Algum efeito - Expressão da imunidade Rejeição das larvas pouco afetadas Severos danos e morte dos adultos - Mecanismo imunológico Primordialmente por hipersensibilidade imediata Principalmente por anticorpos - Estágio mais afetado - Efeitos da imunidade: 1. Número de carrapatos ingurgitados 2. Peso dos carrapatos ingurgitados Adaptado de: Willadsen, P. (1987). Inter. J. Parasitol., 17(2): 671-677. Alguns fatores podem interferir na resposta do hospedeiro à resistência ao carrapato, e dentre eles destacam-se: 1 - fatores externos que induzem ao estresse: de origem nutricional e ambiental; 2 - condição reprodutiva do hospedeiro e imunossupressão por drogas; 3 – infecção por hemoparasitos como Babesia sp., Anaplasma sp., e Trypanosoma sp., que podem aumentar a susceptibilidade aos carrapatos (Heller-Haupt et al., 1983; Oberen, 1984). 8 Os estudos na imunidade induzida passaram pela utilização de extratos brutos dos diferentes estágios dos carrapatos, extratos de glândulas salivares, extratos purificados, extratos de ovos embrionados e antígenos particulados a partir de diferentes tecidos, sendo o derivado do trato digestivo aquele que induziu melhor proteção (Wikel, 1996; Toro-Ortiz et al., 1997). Duas alternativas no controle imunológico de carrapatos foram resumidas e propostas por Willadsen (1987), sendo uma através da seleção de indivíduos imunocompetentes e outra pelo uso de antígenos purificados como indutor da resistência pela imunização direta. VACINAS CONTRA ARTRÓPODES Várias tentativas vêm sendo realizadas para a obtenção de vacinas contra artrópodes. O uso de antígenos particulados de Stomoxys calcitrans para induzir imunidade reduziu o grau de ingurgitamento deste muscídeo (Webster et al., 1992). A redução da fecundidade de Aedes aegypti foi observada quando estes insetos ingeriram sangue de animais imunizados com o extrato bruto deste culicídeo (Sutherland & Ewen, 1974). Pesquisas com Glossina morsitans (Otieno et al.,1984) e Hypoderma sp (Baron & Weintraub, 1986) foram desenvolvidas imunizando-se coelhos e bovinos, respectivamente, contra estes artrópodes. Utilizando extratos de membrana peritrófica de Lucilia cuprina, para imunizar ovinos, foi observado a inibição do crescimento da larva deste díptero no hospedeiro (East et al., 1993; Eisemann & Binnington, 1994). Mumcuoglu et al. (1996) localizaram antígenos no trato digestivo de Pediculus humanus que conferem imunidade ao homem. Os efeitos desses imunógenos são variados sobre os artrópodes, sendo observado interferência na fecundidade, oviposição, sobrevida, índices nutricionais e reprodutivos, ruptura de órgãos, paralisia e morte (Opdebeeck, 1994). Os antígenos vacinais são derivados de diferentes órgãos, tecidos ou células; como por exemplo para Ctenocephalides felis, onde a membrana intestinal está sendo utilizada como antígeno (Opdebeeck & Slacek, 1993). Diferentes tipos de antígenos “ocultos” de artrópodes têm sido utitlizados na tentativa de produção de imunógenos (Tabela 3). Para os imunógenos contra os artrópodes, os melhores resultados foram encontrados contra carrapatos (Opdebeeck, 1994); este fato pode estar relacionado, possivelmente, à digestão intracelular dos ixodídeos, enquanto nos insetos a digestão se processa na luz intestinal dentro da membrana peritrófica. 9 Tabela 3: Tentativas atuais de produção de vacinas contra insetos de importância Médico Veterinária. ARTRÓPODE TIPO DE ANTÍGENO Stomoxys calcitrans Antígenos particulados Aedes aegypti Extratos bruto Glossina morsitans Extrato intestinal Hypoderma sp Extrato bruto Lucilia cuprina Membrana peritrófica (extrato) Pediculus humanus Antígenos intestinais Ctenocephalides felis Membrana intestinal O uso de antígenos a partir de glândula salivar de carrapatos foi pouco expressivo como imunógenos (Wikel, 1988; 1996). Os estudos tenderam ao encontro de antígenos “ocultos” em órgãos internos dos ixodídeos que não estão em contato direto com o hospedeiro. Assim, foram identificados e quantificados os componentes séricos do hospedeiro, entre eles imunoglobulinas, haptoglobulinas, albumina, transferrinas e anticorpos específicos, na hemolinfa do ixodídeo; fato que contribuiu ao desenvolvimento de imunógenos (Ackerman et al., 1981; Tracey-Patte et al., 1987; Ben-Yakir, 1989). Fracionando antígeno bruto total de porções intestinais de B. microplus, a atividade protetora foi obtida com frações contendo proteínas entre 79 - 205 Kilodaltons (Kd) e com ponto isoelétrico de 5,1 5,6. A imunidade induzida por estas frações foi superior àquela obtida com o material bruto (Willadsen et al., 1988). Genes, responsáveis por estes antígenos, foram identificados, conseguindo-se purificar e caracterizar uma glicoproteína da superfície de membrana das células digestivas no intestino médio de B. microplus, a qual possui peso molecular de 89Kd com ponto isoelétrico entre 5,1 - 5,6, posteriormente denominada Bm 86 (Willadsen et al., 1989). A glicoproteína Bm 86 encontra-se em grande quantidade na superfície externa da membrana de células do “tipo digestivas” do trato intestinal do B. microplus (Figura 1). Figura 1a: Corte transversal do intestino médio de fêmea de Boophilus microplus: visão do conjunto de células digestivas, predomínio de células do “tipo digestivas”. Tricrômico de Masson, 250x. Figura 1b: Corte transversal do intestino médio de fêmea de Boophilus microplus: visão do conjunto de células digestivas: células secretoras S1, S2, células basofílicas, células basais e células do “tipo digestivas”. HematoxilinaEosina, 160x. 10 Outras proteínas foram isoladas e caracterizadas, de B. microplus, como a Bm 91, porém não conferiram imunidade satisfatória quando usada isoladamente (Wikel, 1996). Antígenos obtidos a partir do cultivo de células de A. americanum induziram significativo nível de imunidade às infestações de adultos de A. americanum e D. variabilis (Wikel, 1985), no entanto, pouco se sabe sobre estes tipos antigênicos. Clones de cDNA da glicoproteína Bm 86 foram isolados, purificados, homegeneizados, sendo determinado a seqüência de fragmentos peptídicos. A recombinação gênica foi expressa inicialmente em Escherichia coli (Rand et al, 1989). Posteriormente, a Bm 86 foi também recombinada aos fungos Aspergillus nidulans e A. niger (Turnbull et al., 1990) e em baculovírus (Richardson et al., 1993). Este antígeno recombinante induziu proteção ao mesmo nível que a rBm 86 em E. coli (Opdebeeck, 1994). Rodriguez et al. (1994) isolaram e amplificaram o gene que codifica a Bm 86, expressando-o em vários sistemas, incluindo a levedura metilotrófica Pichia pastoris. Esta expressão induziu um aumento no potencial imunogênico por ser secretada na forma glicosilada, originando partículas de 20 - 36 nm. Estas recombinações gênicas possuem a vantagem de apresentarem cadeias regulares de polipeptídeos do antígeno, as quais se dobram homogeneamente. Quanto a importância dos antígenos recombinantes, estes potencialmente diferem dos nativos tanto pela configuração, como pelos padrões no processo de glicosilação (Willadsen & Mckenna, 1991). O principal mecanismo de atuação dos anticorpos contra os antígenos recombinantes rBm 86 se dá pelo bloqueio da atividade endocítica das células digestivas do carrapato, associada por conseguinte às lesões (Kemp et al., 1986; Mora Hernandez et al.,1997). Os antígenos recombinantes da Bm 86 têm sido utilizados como imunógenos em alguns países da América Latina como Cuba, Brasil, Argentina, Colômbia, México e Nicarágua; e na Austrália, apresentando resultados satisfatórios (De La Fuente, 1995; Massard et al., 1995; Willadsen et al., 1995). Estes antígenos foram demonstrados e reconhecidos em diversas cepas de B. microplus (Penichet et al., 1994). Outro modelo de imunógenos, considerados eficazes contra carrapatos, são os peptídeos sintéticos, inicialmente testados por Sharp et al. (1990). Estes foram sintetizados, purificando oligopeptídeos a partir de cálculos preditivos da seqüência de aminoácidos da glicoproteína Bm 86. Ao avaliar os peptídeos em coelhos e bovinos, os anticorpos produzidos reconheceram as proteínas Bm 86 e rBm 86 pelo ensaio Imunoblotting. Níveis de Anticorpos Contra Carrapatos 11 Os níveis de anticorpos contra a glicoproteína Bm 86, recombinada em P. pastoris, foram avaliados em bovinos, através de um ensaio imunoenzimático (ELISA) (Rodriguez et al., 1994). Estes pesquisadores procederam o controle do B. microplus em populações de bovinos, a campo em Cuba, vacinados com a rBm 86, acompanhando sorologicamente durante 33 semanas. Observaram que os anticorpos surgem entre a primeira e segunda semana após a vacinação e atingem pico máximo por volta da décima semana, permanecendo detectáveis com títulos consideráveis até a 32ª semana (Rodriguez et al. 1995a). O mesmo modelo foi utilizado no Brasil, ao avaliar a imunidade de bovinos B. taurus puros e mestiços com B. indicus, frente ao antígeno recombinante. Os animais apresentaram perfil de anticorpos similar ao observado em Cuba (Rodriguez et al. 1995b). Na Argentina, Lamberti et al. (1995) observaram, através do ELISA, em bovinos mestiços imunizados com a rBm 86 uma curva de anticorpos próxima aos relatos de Rodriguez et al. (1995 a, b). Anticorpos monoclonais contra o B. microplus foram analisados quanto aos seus efeitos na eficiência reprodutiva do carrapato, através de ELISA e Imunoblotting (Toro-Ortiz et al., 1997). Modelos matemáticos por computador foram propostos e utilizados para avaliação da dinâmica populacional de B. microplus ao nível de campo, empregando acaricidas e imunógenos. Os dados determinados sorologicamente foram utilizados para a determinação das épocas ideais de vacinação (Floyd et al., 1995; Lodos et al., 1995). Uma metodologia prática foi desenvolvida por Machado & Santizo (1995), para determinar os níveis de anticorpos em bovinos imunizados com a proteína recombinante rBm 86, a campo. Esta técnica utiliza placas de poliestireno branco com escavações circulares sensibilizadas com o antígeno rBm 86. A análise sorológica está baseada em um imunoensaio indireto em fase sólida, que emprega sondas de ouro coloidal amplificadas com reveladores de prata. O conjugado adicionado contém proteína A (recombinante) marcada com ouro coloidal, para a detecção de imunocomplexos formados. A reação é amplificada pela adição de reveladores físicos, à base de íons de prata, produzindo reações in situ insolúveis, de cor marrom, cuja intensidade é proporcional à concentração de anticorpos presentes na amostra. Pesquisando anticorpos em bovinos no Brasil, imunizados com a rBm 86, Mora Hernandez et al. (1998), utilizaram o ensaio desenvolvido por Machado & Santizo (1995). Neste estudo, acompanhou-se o perfil de anticorpos durante 65 semanas, observando uma variação do negativo à títulos de 1:10240. Após o segundo inóculo (semana 4), verificou-se uma resposta imune crescente, que se manteve elevada durante as 65 semanas. O declínio dos níveis de anticorpos ocorreu próximo às revacinações, entretanto, estes níveis foram superiores à linha de corte adotada, não sendo relevante o 12 declínio. O comportamento da curva de anticorpos obtida por Mora Hernandez et al. (1998) no Brasil, pode ser visto na Figura 2, e foi similar ao descrito por Rodríguez et al. (1994; 1995a) quando avaliaram a resposta humoral de bovinos em Cuba por 12 e 32 semanas, respectivamente; e no Brasil durante 25 semanas (Rodriguez et al., 1995b). Este comportamento está de acordo, também, com as observações de Lamberti et al. (1995), por 11 semanas na Argentina. O sistema diagnóstico visual proposto por Machado & Santizo (1995), para monitoramento sorológico dos animais imunizados com o antígeno rBm 86 mostrou-se satisfatório na avaliação da resposta imune, sendo de uso prático e fácil operacionalidade. título de anticorpos semana 7000 título 0 0 4 1024 7 4096 12 5632 36 5376 6000 5000 título 4000 3000 2000 1000 0 0 4 7 12 36 44 57 65 semana 13 Figura 2. Curva dos níveis de anticorpos, média aritmética dos títulos, em bovinos mestiços leiteiros imunizados com o antígeno recombinante rBm 86, no Brasil. Avaliação durante 65 semanas. EFEITO DOS IMUNÓGENOS SOBRE OS CARRAPATOS Na relação hospedeiro-parasito hematófago, em especial nos carrapatos, é conhecido que o mecanismo que leva ao desenvolvimento de resistência adquirida está acompanhado de reações de hipersensibilidade (Koudstaal et al., 1978). Um fato importante da diferenciação entre a imunidade adquirida e a induzida é que, embora ambas atuem para elevar os níveis de imunidade frente aos carrapatos, a primeira age principalmente contra estágio larvar, enquanto a segunda sobre o estágio adulto (Tabela 2). O antígeno recombinante rBm 86 induz a formação de altos níveis de anticorpos e de outros componentes séricos que mediam a resposta imune dos bovinos, como o complemento. Os anticorpos específicos se fixam ao antígeno, in situ e, neste caso, à superfície de membrana das células digestivas de B. microplus, ocasionando severos danos morfofisiológicos, quando o sangue dos animais vacinados é ingerido pelos carrapatos adultos (Agbede & Kemp, 1986; Kemp et al., 1986). Estes danos manifestam-se principalmente das seguintes formas: 1 - na redução do número e tamanho das fêmeas alimentadas; 2 - na redução da ovoposição; 3 - na redução da fertilidade dos ovos; 4 - na diminuição do potencial reprodutivo dos carrapatos em gerações sucessivas, o que leva ao decréscimo das populações nas pastagens. Efeito Sobre a Biologia do Carrapato Pouco são os estudos referentes a influência de anticorpos anti-rBm 86 nos parâmetros biológicos dos carrapatos. Na fase parasitária tem-se observado, em diversas pesquisas, que as fêmeas na sua maioria encontram-se semi-ingurgitadas, mortas, aderidas à pele do hospedeiro, apresentando 14 aspecto "seco". As fêmeas sobreviventes possuem colorações anormais que variam do róseo ao azul escuro (Willadsen, 1987; Massard et al., 1995; Rodriguez et al., 1995b). Para a fase não parasitária, as avaliações sobre o efeito dos anticorpos anti-rBm 86 podem ser determinadas pelo período de pré postura, ovoposição, produção e incubação dos ovos, viabilidade da postura, peso das teleóginas, percentual de fêmeas que ovopositaram, índices nutricionais e reprodutivos, e sobrevivência e viabilidade das larvas. Os resultados obtidos, para estas análises por vários pesquisadores, são variados, porém todos concordam em buscar a eficiência do imunógeno, baseando-se na redução desses índices e parâmetros. Pouco são, no entanto, os registros sobre a sobrevivência e longevidade das larvas provenientes de fêmeas de carrapatos alimentadas em bovinos imunizados com diferentes antígenos de B. microplus, com a Bm 86 ou a rBm 86. Observações originais foram realizadas no Brasil, no que se refere à menor sobrevivência e longevidade das larvas, oriundas de fêmeas de B. microplus sobreviventes de animais imunizados (Mora Hernandez, 1996) (Figura 3). Hemoglobina Heme (Fe) + Globina 5 - 10% do Heme ingerido Oócitos (desenvolvimento) Ovos Heme + Proteína (do carrapato) Hemixodovina Hemolinfa Ovos, Embriões (proteína de reserva) Larvas (intestino como reserva energética) Proteína + Hematina (pela ação da digestão) Pigmento violeta-púrpuro 15 Figura 3. Seqüência do metabolismo da hemoglobina em Boophilus microplus. Aproximadamente, 5-10% da partícula heme ingerida pelas fêmeas do carrapato passa para o desenvolvimento dos oócitos. O complexo heme dos ovos é uma proteína diferente da hemoglobina do hospedeiro. Após a quebra da hemoglobina pela digestão, algumas partes da molécula de ferro e do heme passam à hemolinfa, ligando-se a proteínas específicas do carrapato (Kitaoka, 1961). Este novo tipo de composto, ferro-proteína, é denominado hemixodovina (Bremner, 1959). A hemixodovina tem a função de reserva protéica, durante a embriogênese, e de reserva energética nas larvas em jejum (Balashov, 1972). Outra possibilidade reportada por Mora Hernandez (1996) reside no fato de que, após o desprendimento das fêmeas ingurgitadas, o retículo endoplasmático rugoso das células intestinais começa a reorganizar-se, sintetizando grânulos, o que corrobora ao efeito dos componentes séricos sobre as células digestivas das teleóginas e o conseqüente efeito sobre a ovoposição (Coons et al., 1982; Agbede e Kemp, 1986). O material secretado por estas células de B. microplus, se faz nos espaços extracelulares das dobras basais, as quais estão em contato com a hemolinfa (Agbede e Kemp, 1987). Desta forma, pode ser relacionado o período de sobrevivência das larvas, descendentes de fêmeas que realizaram o repasto sangüineo em bovinos imunizados com o antígeno rBm 86. A redução na população de carrapato é decorrente da alteração dos processos biológicos, especialmente os processos metabólicos da digestão, afetando as gerações que se sucedem. Conseqüentemente, a reprodução torna-se menos eficiente e a capacidade de sobrevivência e o poder de fixação das larvas diminui substancialmente. As alterações nos parâmetros biológicos de B. microplus contribuem para a redução das populações deste carrapato nas pastagens. Alterações Histológicas do Trato Intestinal A estrutura histológica do intestino dos carrapatos está composta por uma membrana basal coberta de fibras musculares longitudinais e circulares, formando várias camadas (Balashov, 1972). Três tipos celulares para o epitélio intestinal de Hyalomma asiaticum foram descritos por Balashov (1972), os quais foram denominados como células de reserva, digestivas e secretoras, sugerindo que estas originam-se de uma única célula fonte. Entretanto, Tatchell (1964) e Chinery (1964) afirmaram que a parede do intestino destes artrópodes é constituida, essencialmente, por células epiteliais e suas 16 estruturas e funções variam de acordo com o nível de ingurgitamento e com as fases do ciclo biológico dos carrapatos. Agbede & Kemp (1985) concordaram com o critério de Balashov (1972) quanto a origem dos tipos celulares, acrescentando, no entanto, que as células basais encontram-se em todos os ínstares. Estes autores classificaram as células intestinais de B. microplus em cinco tipos celulares: célula basal, digestiva, secretora (S1), secretora (S2) e célula basofílica (Figura 1). Esta última persiste até a morte das fêmeas. O mecanismo de ação dos anticorpos anti-rBm 86 se dá pela fixação destes à membrana das células digestivas (Kemp et al., 1986). Os anticorpos, junto ao complemento e outros componentes séricos, provocam severos danos na ausência de leucócitos (Agbede & Kemp, 1986; Willadsen et al., 1989). O complemento pode ou não ser essencial, uma vez que foi demonstrado que o soro de bovinos imunizados reage com a superfície das células intestinais e que a intervenção de anticorpos contra as células digestivas resulta em uma marcante inibição de suas atividades endocíticas, precedendo lesões celulares detectáveis (Willadsen & Kemp, 1988). Severas alterações morfológicas no intestino de carrapatos alimentados, in vitro e in vivo, foram registradas três semanas após a terceira dose do imunógeno Bm 86; quando os níveis de anticorpos circulantes encontravam-se no pico máximo. Em B. microplus coletados 12 horas após iniciada a alimentação, verificou-se que ocorre um bloqueio das atividades endocíticas nas células digestivas (Agbede & Kemp, 1986; 1987). No Brasil, estudos histológicos foram realizados no trato digestivo de B. microplus alimentados em bovinos imunizados com a rBm 86, de fêmeas coletadas 30, 40, 50, 60 e 70 dias pós vacinação. Foi observado a destruição de células digestivas, das secretoras (S1 e S2) e, em casos mais severos, das células basofílicas, permanecendo apenas a lâmina basal. Ocorreu ainda erosão e ruptura da parede intestinal e extravasamento do conteúdo digestivo para a cavidade celomática (Mora Hernandez et al., 1997). Estas lesões incompatibilizam o processo de oogênese neste carrapato e interrompe seu ciclo vital (Figura 4). Figura 4a: Lesões no intestino médio de fêmea de Boophilus microplus pela ação de anticorpos anti-rBm 86: células digestivas com alterações citoplasmáticas e nucleares, células secretoras S1 e S2 em número reduzido com vacuolização citoplasmática, ausência de células do “tipo digestivas”. Hematoxilina-Eosina, 400x. Figura 4b: Lesões no intestino médio de fêmea de Boophilus microplus pela ação de anticorpos anti-rBm 86: acentuada destruição de células do “tipo digestivas”, células secretoras S1 e S2, células basofílicas e da lâmina basal. Hematoxilina-Eosina, 400x. 17 As alterações no intestino de B. microplus, pela ação dos anticorpos anti-rBm 86, justificam as observações macroscópicas encontradas em fêmeas mortas, ou parcialmente ingurgitadas aderidas à pele do hospedeiro (Massard et al., 1995; Mora Hernandez, 1996; Mora Hernandez et al., 1997). As lesões intestinais podem afetar a oviposição, por interrupção da digestão ou pelo bloqueio da síntese de vitelogenina nas células intestinais (Agbede & Kemp, 1986). O motivo das larvas não serem afetadas pelos anticorpos anti-rBm 86 deve-se ao fato de os componentes celulares do intestino deste ínstar serem constituídos apenas por células basais (Balashov, 1972; Agbede & Kemp, 1985). Também é conhecida a existência de enzimas inibidoras da proteólise, presentes, apenas, no estágio larval (Willadsen et al., 1989). A glicoproteína Bm 86 mantem-se conservada em diferentes cepas de B. microplus. Os anticorpos de bovinos imunizados com a rBm 86 protegem e atuam contra distintas cepas de B. microplus, mesmo as cepas resistentes a acaricidas como os organofosforados (Penichet et al., 1994). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACKERMAN, S.; FLOYD; M. & SONENSHINE, D. E. 1980. Artificial immunity to Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae) vaccination using tick antigens. J. Medical Entomol., 17 (5):391-397. ACKERMAN, S., BRIAN CLARE, F., MCGILL, T. W. & SONENSHINE, D. E. 1981. Passage of host serum components, incluiding antibody, across the digestive tract of Dermacentor variabilis (Say). J. Parasitol., 67 (5): 737-740. AGBEDE, R. I. S. & KEMP, D. H. 1985. Digestion in the catle-tick Boophilus microplus: light microscope study of the gut cells in nymphs and females. Intern. J. Parasitol., 15(2): 147-157. AGBEDE, R. I. S. & KEMP, D. H. 1986. 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