universidade federal de sergipe

i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
Renata Lisboa Barbosa
EFEITO VASORELAXANTE DO P-CIMENO EM
ARTÉRIA MESENTÉRICA ISOLADA DE RATO.
SÃO CRISTOVÃO / SE
2013
ii
Renata Lisboa Barbosa
EFEITO VASORELAXANTE DO P-CIMENO EM ARTÉRIA
MESENTÉRICA ISOLADA DE RATO.
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Fisiológicas da Universidade
Federal de Sergipe como requisito para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Fisiológicas
Orientador: Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos
_______________________________________________________
1º Examinador: Prof. Dr. Márcio Roberto Viana Santos (UFS)
_______________________________________________________
2º Examinador: Prof.ª Dr.ª Sandra Lauton Santos (UFS)
________________________________________________________
3º Examinador: Prof. Dr. Flávia Viana Moreira (UFS)
iii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
B238e
Barbosa, Renata Lisboa
Efeito vasorelaxante do p-cimento em artéria mesentérica
isolada de rato / Renata Lisboa Barbosa ; orientador Márcio
Roberto Viana Santos. – São Cristovão, 2015.
61 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências
Universidade Federal de Sergipe, 2015.
Fisiológicas)
–
1. Sistema cardiovascular. 2. Artéria mesentérica. 3.
Vasodilatadores. I. Santos, Marcio Roberto Viana, orient. II. Título.
CDU 612.1:615.225
iv
RESUMO
Barbosa, R. L. Efeito vasorelaxante do p-cimeno em artéria mesentérica isolada de rato,
Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Sergipe, 61p, São Cristovão, 2013.
O p-cimeno é um monoterpeno aromático biossintético que apresenta inúmeras propriedades
biológicas, incluindo ações sobre o sistema cardiovascular. Em estudo in vivo, o p-cimeno
demonstrou atividade hipotensora, através de um efeito central. Diante disso, buscou-se
investigar o efeito do p-cimeno sobre a resistência vascular periférica em artéria mesentérica
superior de ratos. Para tanto, ratos Wistar foram eutanasiados por dessangramento sob
anestesia e a artéria mesentérica superior foi removida, seccionada e mantidas em cubas
contendo solução nutritiva de Tyrode. Para o registro das contrações isométricas, cada anel foi
suspenso por linha de algodão fixada a um transdutor de força conectado a um sistema de
aquisição de dados. Em anéis de artéria mesentérica com endotélio funcional pré-contraídos
com fenilefrina (FEN) (controle), o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) induziu relaxamento (Emáx =
77,1 ± 3,53%; n = 5) de maneira dependente de concentração.Este efeito não foi atenuado
após a remoção do endotélio (Emáx =72 ± 4,03%, n = 7) ou pré-contraído com KCl 80 mM
(Emáx = 79,37 ± 5,25%; n = 6), sugerindo um possível efeito independente do endotélio e
envolvendo canais para Ca2+. Em preparações sem endotélio funcional pré-contraídos com
FEN e incubadas com tetraetilamônio (TEA), um bloqueador não seletivo dos canais para K+,
o p-cimeno induziu relaxamento (Emáx= 50,56 ± 4,09%; n= 8), que não foi
significativamente diferente daquele obtido em anéis sem endotélio funcional pré-contraídos
com FEN sem o bloqueador. Portanto, possivelmente, não há participação dos canais para K+
neste efeito. Além disso, a incubação com o p-cimeno (3x10-3, 10-2 e 3x10-2M) foi capaz de
antagonizar as contrações induzidas por CaCl2 (10-7 - 3x10-2M) e Ortovanadato de Sódio
(Na3VO4) (10-5 - 3x10-2M), um inibidor não-seletivo de proteínas tirosina-fosfatase. Diante
desses resultados, pode-se concluir que o p-cimeno produz efeito vasorelaxante independente
do endotélio. As evidências farmacológicas sugerem que o mecanismo de ação vasorelaxante
do p-cimeno envolve canais para Ca2+ sensíveis à voltagem e dessensibilização de elementos
contráteis ao Ca2+.
Descritores: p-Cimeno, vasorelaxamento, artéria mesentérica superior.
v
ABSTRACT
Barbosa, R. L. Vasorelaxant activity of p-cymene in superior mesenteric artery of rats,
Master’s dissertation, Federal University of Sergipe , 61p, São Cristovão, 2013.
The p- cymene is a monoterpene aromatic biosynthetic which has many biological properties ,
including cardiovascular. Em system actions on the in vivo study, p- cymene showed
hypotensive activity through a central effect. Therefore, we sought to investigate the effect of
p-cymene on the peripheral vascular resistance in the superior mesenteric artery of rats Rats
were sacrificed by exsanguination under anesthesia and the superior mesenteric artery was
removed, sectioned and kept in vats containing nutrient solution Tyrode. For recording of
isometric contractions, each ring was suspended by cotton thread attached to a force
transducer connected to a data acquisition system. In mesenteric artery rings with functional
endothelium precontracted with phenylephrine (FE) (control), p- cymene (10-8 - 3x10 -2M)
induced relaxation (Emáx = 77.1 ± 3.53% , n = 5) in a concentration-dependent manner not
was attenuated after removal of endothelium (Emáx = 72 ± 4.03 %, n = 7) or pre-contracted
with 80 mM KCl (Emáx = 79.37 ± 5.25 % n = 6) , suggesting a possible effect independent of
the endothelium and surrounding channels for Ca2 +. In preparations without functional
endothelium and pre-contracted with FEN and incubated with tetraethylammonium (TEA),
tetraethylammonium (TEA), a blocker of non-selective for K+ channels, p- cymene induced
relaxation (Emáx = 50.56 ± 4.09 %, n = 8) which was not significantly different from that
obtained without functional endothelium in rings pre-contracted with FEN without blocking .
Thus, possibly there is no involvement of K + channels for this purpose. Furthermore,
incubation with p- cymene (3x10-3, 10-2 and 3x10-2M) was able to antagonize the contractions
induced by CaCl2 (3x10-7 - 3x10-2M), and sodium orthovanadate (Na3VO4) (10-5 - 3x10-2M) a
non-selective inhibitor of protein tyrosine fosfatase.These results it can be concluded that pcymene produces vasorelaxant effect independent of the endothelium. The pharmacological
evidence suggest that the mechanism of action of p- cymene vasorelaxant involves channels
for Ca2+ and voltage sensitive desensitization of the Ca2+ contractile elements.
Keywords: p-Cymene, vasorelaxation, superior mesenteric artery
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composição da solução de Tyrode para anéis de artéria mesentérica superior.......22
Tabela 2: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 80 mM
(KCl 80)....................................................................................................................................22
Tabela 3: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a 60 mM
(KCl 60)....................................................................................................................................22
Tabela 4: Composição da solução de Tyrode nominalmente sem Ca2+...................................23
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática do relaxamento via NO-GMPc...................................9
Figura 2: Hipótese sobre a natureza do H2O2/EDHF.............................................................10
Figura 3: Representação esquemática da contração do músculo liso......................................12
Figura 4: Estrutura química do p-cimeno................................................................................18
Figura 5: Artéria mesentérica superior de rato........................................................................24
Figura 6: Anel arterial disposto entre duas hastes suspenso por linha de algodão e mantido
em cuba para órgão isolado contendo solução nutritiva de Tyrode..........................................24
Figura 7: Sistema de aquisição de dados de reatividade vascular...........................................25
Figura 8: Curva concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional (n= 5), pré-contraídos com 10
µM deFEN ...............................................................................................................................29
Figura 9: Curva concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato com (Controle) e sem endotélio funcional, pré-contraídos
com 10 µM de FEN...................................................................................................................31
Figura 10: Curvas concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 – 3x10-2M) em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato, sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN
(sem endotélio) ou com KCl 80 mM........................................................................................32
Figura 11: Curva concentração-resposta para CaCl2 (10-7 - 3x10-2M) em anéis de artéria
mesentérica superior de ratos, sem endotélio, antes (controle) e após pré-incubação com pcimeno (3x10-3, 10-2 e 3x10-2M)...............................................................................................33
Figura 12: Curvas concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato, sem endotélio funcional (n= 8), pré-contraídos
com FEN (10 µM) antes e após a incubação com 1mM de TEA............................................35
Figura 13: Curva concentração-resposta para Na3VO4 (10-5 - 3x10-2M) em anéis de artéria
mesentérica superior de ratos, sem endotélio, antes (controle) e após pré-incubação com pcimeno (3x10-3, 10-2 e 3x10-2M)...............................................................................................37
viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
[Ca 2+]i – Concentração intracelular de cálcio
[Ca2+] – Concentração de cálcio
Ach – Cloridrato de acetilcolina
C6H12O6 – Glicose
Ca2+/CaM – Complexo Ca2+/Calmodulina
Ca2+-ATPase – Bomba de cálcio
CaCl2.2H2O – Cloreto de cálcio dihidratado
CaM – Complexo de cálcio e calmodulina
CaV(s) – Canais para cálcio sensíveis a voltagem
CICR – Liberação de cálcio induzida por cálcio
DAG – Diacilglicerol
DC– Débito cardíaco
DCV – Doenças cardiovasculares
E.P.M – Erro padrão da Média
ECA – Enzima conversora da angiotensina
EDHF – Fator hiperporlarizante derivado do endotélio
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial
FEN – Cloridrato de L (-) fenilefrina
GCs – Guanilato ciclase solúvel
GDP – Guanosina 5'-difosfato trifosfato
GMPc – Monofosfato de guanosina cíclico
GTP – Guanosina 5'-Trifosfato trifosfato
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
HA – Hipertensão arterial
HAR – Hipertensão arterial resistente
IP3 – Trifosfato de inositol
KCa – Canais para cálcio sensíveis a cálcio
KCl - Cloreto de potássio
KCl 60 - Solução despolarizante de Tyrode com Cloreto de potássio a 60 mM
KCl 80 – Solução despolarizante de Tyrode com Cloreto de potássio a 80 mM
L-arg – L-arginina
MCLP – Fosfatase de cadeia leve de miosina
ix
MgCl2.6H2O – Cloreto de magnésio hexa- hidratado
MLCK – Quinase de cadeia leve de miosina
MLV – Músculo liso vascular
Na+/ Ca2+ – Trocador de sódio e cálcio
Na3VO4 – Ortovanadato de sódio
NaCl – Cloreto de sódio
NaH2PO4 – Fosfato de sódio mono-hidratado
NaHCO3 – Bicarbonato de sódio
NO – Óxido Nítrico
p44/p42MAPK – Proteína quinase ativada por mitógeno
PA – Pressão arterial
PAM – Pressão arterial média
PGI2 – Prostaciclina
pH – Concentração hidrogeniônica
PIP2 - Fosfatodilinositol 4,5-bifosfato
PKC – Proteína quinase C
PLC – Fosfolipase C
ROC – Canais de cálcio operados por receptor
RPV– Resistência vascular periférica
RS – Retículo Sarcoplasmático
RyR – Receptor de rianodina
SNC – Sistema nervoso central
TEA – Tetraetilamônio
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .. ....................................................................................................................1
2. REVISÃO DE LITERATURA . .............................................................................................4
2.1 Hipertensão arterial e Hipertensão arterial resistente.......................................................4
2.2 Regulação da Pressão arterial...........................................................................................6
2.3 Músculo liso vascular.....................................................................................................11
2.4 Plantas medicinais..........................................................................................................15
2.5 Óleos essenciais..............................................................................................................16
2.6 P- cimeno........................................................................................................................18
3. OBJETIVOS .........................................................................................................................20
3.1 Objetivo Geral:...............................................................................................................20
3.2 Objetivos Específicos:....................................................................................................20
4.METODOLOGIA . .................................................................................................................21
4.1 Animais..........................................................................................................................21
4.2 Drogas............................................................................................................................21
4.3 Soluções Nutritivas........................................................................................................21
4.4 Estudo farmacológico....................................................................................................23
4.4.1 Avaliação dos efeitos do p-cimeno sobre a reatividade vascular in Vitro..................23
4.4.1.1 Preparação da artéria mesentérica superior isolada de rato................................23
4.4.1.2 Caracterização do efeito do p-cimeno sobre a reatividade vascular em artéria
mesentérica superior isolada de rato ............................................................................... 25
4.4.1.3 Avaliação do papel do endotélio vascular nas respostas induzidas pelo p-cimeno
........................................................................................................................................ 25
4.4.1.4 Avaliação da participação dos canais de Ca2+ nas respostas induzidas pelo pcimeno ............................................................................................................................ 25
4.4.1.5 Avaliação do efeito do p-cimeno sobre sensibilização dos elementos contráteis
ao Ca2+ ............................................................................................................................ 26
4.4.1.6 Avaliação da participação dos canais para K+ nas respostas induzidas pelo pcimeno ............................................................................................................................ 26
xi
4.5 Sacrifício e descarte dos animais....................................................................................27
4.6 Análise estatística...........................................................................................................27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 28
6. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 38
7.REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 39
1
1. INTRODUÇÃO
A hipertensão arterial (HA) é uma condição clínica multifatorial caracterizada
por níveis elevados e sustentados de pressão arterial (PA), onde podem ocorrer
alterações funcionais e/ou estruturais dos órgãos-alvo (coração, encéfalo, rins e vasos
sanguíneos) e alterações metabólicas, com consequente aumento do risco de eventos
cardiovasculares. Associa-se a vários fatores de risco como obesidade, consumo elevado
de álcool, inatividade física, idade, gênero, etnia, fatores socioeconômicos e ingestão de
sal (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2010).
A HA tem alta prevalência no Brasil e apresenta custos médicos e
socioeconômicos muito elevados, devido às complicações dela decorrentes, como
infarto do miocárdio, derrame, insuficiência cardíaca, falência dos rins, edema agudo
dos pulmões, crescimento do coração (miocardiopatia dilatada hipertensiva), angina e
aneurismas. A redução da PA diminui os riscos do aparecimento dessas complicações,
porém o seu controle só é conseguido em uma minoria dos pacientes hipertensos
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2007; 2010).
No Brasil, estima-se que apenas 10% da população hipertensa estejam com PA
controlada e muitas vezes isto ocorre devido à falta de sucesso do tratamento
medicamentoso, que pode está relacionado a diversos fatores, dentre eles, a não adesão
à terapêutica apresenta-se como um dos maiores desafios, tanto para o diagnóstico da
HA quanto para o seu controle. Este abandono do tratamento pelos pacientes ocorre, na
maioria das vezes, devido aos inúmeros efeitos colaterais que as drogas antihipertensivas causam nos pacientes (LESSA, 2006).
Estudos mostram que hipertensos que interromperam o tratamento tiveram risco
de infarto três vezes maior do que os que tiveram uma adesão (THRIFT et al., 1998).
No Brasil, o impacto da não-adesão ao tratamento anti-hipertensivo pode ser avaliado
pela importância dos acidentes vasculares encefálicos como causa de morte. Portanto, o
adequado controle da hipertensão poderia reduzir esta mortalidade (SOCIEDADE
BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA 2010).
Diversos medicamentos são amplamente utilizados no tratamento da
hipertensão, os quais incluem vários grupos de drogas tais como: diuréticos,
betabloqueadores,
inibidores
da
enzima
conversora
da
angiotensina
(ECA),
bloqueadores dos canais para Ca2+, além dos antagonistas dos receptores da
angiotensina II. Entre as novas classes de medicamentos, podemos citar os inibidores
2
diretos da renina, antagonistas do receptor da endotelina e bloqueadores β-1 seletivos
(BORTOLOTTO e MALACHIAS, 2009).
Entretanto, algumas destas substâncias têm significativos efeitos colaterais,
incluindo tontura, hipotensão postural, boca seca, impotência sexual, broncoespasmo,
bradicardia excessiva, astenia, insônia e depressão (ANDRADE et al., 2002). Como
exemplo podemos citar o propranolol (bloqueador não seletivo dos receptores β adrenérgicos), que provoca depressão do sistema nervoso central e alucinações, a
clonidina (agonista alfa-adrenérgico) que diminui a atividade motora do comportamento
condicionado de fuga, possui propriedades antipsicóticas, além de sedação acentuada, a
nifedipina e diltiazem (antagonistas dos canais para Ca2+) provocam tontura e sedação
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2010).
Estes efeitos colaterais associados com os altos custos dos medicamentos são as
principais causas da elevada taxa de abandono do tratamento. A literatura mostra que
16% a 50% dos novos hipertensos descontinuam a medicação anti-hipertensiva durante
o primeiro ano de uso. Portanto, a não adesão da pessoa hipertensa ao tratamento é alta,
e tem sido indicada como uma das principais causas responsáveis pela falta de controle
da pressão arterial (PA) (ANDRADE et al., 2002; LIMA et al., 2010).
Além disso, existem pacientes que a PA não é controlada mesmo aderindo ao
tratamento medicamentoso corretamente. Esses pacientes possuem resistência ao
tratamento anti-hipertensivo e são diagnosticados com hipertensão arterial resistente
(HAR) (BLOCH et al., 2008; CASTRO e FUNCHS, 2008).
A HAR ocorre quando a PA continua em níveis elevados em pacientes em uso
correto de três ou mais anti-hipertensivos em doses otimizadas, incluindo um diurético.
A permanência prolongada desses altos níveis de PA aumenta lesões à órgãos alvo e o
risco de mortalidade por doenças cardiovasculares (ACELAJADO e CALHOUN, 2009;
CALHOUN et al., 2008;
Estudos mostram que pacientes que apresentam HAR possuem uma maior
disfunção endotelial, maior atividade simpática e maior rigidez arterial (CALHOUN et
al., 2008). Sendo assim, ainda é de grande importância descobrir medicamentos que
atuem mais precisamente nesses distúrbios e que consequentemente tenham melhor
efeito anti-hipertensivo nesses pacientes (BORTOLOTTO e MALACHIAS, 2009).
Assim, a busca por novas alternativas de drogas é bastante relevante e a
avaliação farmacológica das plantas e seus constituintes químicos pode contribuir para o
enriquecimento do arsenal de medicamentos utilizados no tratamento da HA e da HAR
3
e no desenvolvimento de uma base científica para a sua aplicação terapêutica e como
consequência, redução dos efeitos colaterais (MENEZES, 2010).
O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando
com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000.
Em contrapartida, apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foram estudadas
em busca de compostos bioativos e 1.100 espécies vegetais foram avaliadas em suas
propriedades medicinais (FIRMO et al., 2011).
Dentre as espécies vegetais encontradas na ampla flora brasileira estão às
espécies aromáticas, as quais são extraídos os óleos essenciais que são compostos com
inúmeras propriedades biológicas (DE SOUSA et al, 2006). Um exemplo de substâncias
presentes nesses óleos essenciais de plantas aromáticas são os monoterpenos e vários
estudos têm relatado efeitos dessas substâncias sobre o sistema cardiovascular de ratos
(BASTOS et al, 2010; CUNHA et al, 2004; DE SIQUEIRA et al, 2006; MENEZES et
al., 2010; MOREIRA et al., 2013; SANTOS et al., 2007; SANTOS et al., 2010).
Dentre os compostos monoterpênicos que tem apresentado ação sobre o sistema
cardiovascular, podemos citar o p-cimeno, que apresentou atividade hipotensora, através
de um efeito central (El TAHIR et al., 2003; MENEZES et al., 2010). Este monoterpeno
é um hidrocarboneto aromático encontrado em diversas espécies aromáticas, muito
promissor quanto as suas propriedades farmacológicas (BAGAMBOULA et al., 2004;
BONJARDIM et al., 2012; KODALI et al., 2008; SANTANA, et al; 2011; XIE et al.,
2012).
Portanto, diante da existência de estudos anteriores comprovando a atividade
hipotensora do p-cimeno através de um efeito central, buscou-se investigar o efeito do
p-cimeno sobre a resistência vascular periférica. Será apresentado no presente trabalho,
através de uma abordagem in vitro, utilizando modelo de artéria mesentérica isolada de
rato, os resultados demonstrando o potencial efeito anti-hipertensivo do p-cimeno
através do estudo do seu efeito vascular, bem como serão apresentadas as evidências
farmacológicas do mecanismo de ação associado ao efeito observado, como o
envolvimento dos canais para Ca2+ e da dessensibilização dos elementos contráteis ao
Ca2+ neste efeito.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Hipertensão arterial e Hipertensão arterial resistente
A HA é uma doença caracterizada pela alta pressão que o sangue exerce nas artérias.
Está associada com anomalias estruturais e/ou funcionais do sistema cardiovascular.
Estas anomalias incluem aumento na relação parede versus luz das artérias e
consequentemente aumento na resistência periférica, aumentando o risco do
desenvolvimento de DVC (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 2010).
A HA é a doença crônica mais comum afetando 25% da população adulta. Estudos
mostram que há uma relação linear entre nível de PA e de riscos de eventos
cardiovasculares. A pressão arterial não controlada é consequentemente, a causa mais
comum de mortes no mundo, sendo responsável ainda por 62% das doenças
cerebrovasculares e 49% das doenças isquêmicas do coração, contando com uma
estimativa de 7,1 milhões mortes por ano (SARAFIDIS e BAKRIS, 2008).
A HA tem alta prevalência e baixa taxa de controle, é considerada um dos principais
fatores de risco modificáveis e um dos mais importantes problemas de saúde pública. A
mortalidade por doença cardiovascular (DCV) aumenta progressivamente com a
elevação da PA, sendo a maioria em países de baixo e médio desenvolvimento
econômico e afeta com maior frequência indivíduos entre 45 e 69 anos (SOCIEDADE
BRASILEIRAS DE CARDIOLOGIA, 2010).
As DCV são ainda responsáveis por alta frequência de internações, ocasionando
custos médicos e socioeconômicos elevados. No Brasil, em 2010, o número de óbitos
por doenças do aparelho circulatório totalizou em torno de 326.370 e foram registradas
mais de 131.809 internações no SUS por doenças hipertensivas desencadeando elevados
custos com a saúde pública (DATASUS, 2010; SOCIEDADE BRASILEIRA DE
CARDIOLOGIA, 2010).
Estudos demonstram que há um aumento nos riscos de desenvolvimento de DCV
devido à impossibilidade de atingir os níveis ideais de PA em alguns pacientes, apesar
dos inúmeros tratamentos para o seu controle. Estes estudos indicam que 20% a 35%
dos participantes não tem PA controlada, apesar de fazerem tratamento com três
medicamentos anti-hipertensivos, indicando a presença de HAR (SARAFIDIS e
BAKRIS, 2008).
HAR é diagnosticada quando a PA permanece com níveis elevados, apesar da
utilização simultânea de três medicamentos anti-hipertensivos de diferentes classes.
5
Preferencialmente, um desses três medicamentos deve ser um diurético e todos os
medicamentos devem ser prescritos em quantidades ideais de dose. Conforme definido,
a HAR inclui os pacientes cuja PA só é controlada com o uso de mais de três
medicamentos, ou seja, quando o paciente utiliza quatro ou mais medicamentos é
considerado resistente ao tratamento (CALHOUN et al., 2008; SARAFIDIS e BAKRIS,
2008).
A prevalência de HAR na população em geral é desconhecida devido a um pequeno
número de estudos publicados, bem como, a inviabilidade de fazer um grande estudo
prospectivo que responderia a questão (KAPLAN et al., 2005). Com base em dados do
National Health and Nutrition Examination Survey, 2003 a 2004, 58% das pessoas que
recebem tratamento para a hipertensão não atingem níveis satisfatórios de PA
(CHOBANIAN et al., 2003). Na Europa, o número de pacientes com hipertensão
controlada está entre 19% e 40% em cinco países. Tais dados sugerem que a HAR é
mais comum do que demonstrado, no entanto, estimativas precisas não são possíveis,
pois o controle do tratamento é afetado por muitos fatores, como não adesão do paciente
ao tratamento (CALHOUN et al., 2008; SARAFIDIS e BAKRIS, 2008). Sabe-se que a
prevalência de HAR vem aumentando pela epidemia de obesidade, pela maior
longevidade e pela maior ocorrência de doenças renais na população nos últimos anos
(SARAFIDIS e BAKRIS, 2008).
Várias hipóteses têm sido propostas na literatura para a existência do verdadeiroresistente. Os primeiros estudos demonstravam maior retenção de sódio nesses
pacientes. Foi demonstrado, ainda, exacerbado tônus das células musculares lisas da
vasculatura, explicado pelo maior tônus vasomotor do sistema nervoso simpático, maior
quantidade de vasopressores
circulantes,
maior sensibilidade
às
substâncias
vasopressoras e diferenças no tônus miogênico delas (CALHOUN et al., 2008).
Portanto, o sucesso do tratamento requer a identificação e reversão desses fatores que
contribuem para a resistência ao tratamento, além de diagnóstico e tratamento
apropriado de causas secundárias de hipertensão, e, ainda avaliação e modificação de
estilo de vida (BORTOLOTTO e MALACHIAS, 2009).
É importante destacar que não existem na literatura estudos prospectivos sobre
avaliação de pacientes com pobre resposta à terapêutica anti-hipertensiva. Desse modo,
reforça a necessidade de estudos nessa área, bem como, estudos para descoberta de
novos medicamentos, tendo em vista a prevalência crescente da HAR na prática clínica
diária (KAPLAN et al., 2005)
6
2.2 Regulação da Pressão arterial
A regulação da pressão arterial (PA) é uma das funções fisiológicas mais complexas
do organismo, pois depende de ações integradas do sistema cardiovascular, renal, neural
e endócrino. A manutenção dos níveis pressóricos dentro de uma faixa de normalidade
depende de variações do débito cardíaco ou da resistência periférica ou de ambos.
Diferentes mecanismos de controle estão envolvidos não só na manutenção como na
variação momento a momento da pressão arterial, regulando o calibre e a reatividade
vascular, a distribuição de fluido dentro e fora dos vasos e o débito cardíaco (PAIVA e
FARIAS, 2005; ZAGO e ZANESCO et al., 2006).
O estudo dos mecanismos de controle da pressão arterial tem indicado grande
número de substâncias e sistemas fisiológicos que interagem de maneira complexa e
com redundância para garantir a PA em níveis adequados nas mais diversas situações.
Admite-se, portanto, que alterações da PA, como as encontradas na hipertensão ou em
outras patologias, resultariam da disfunção dos sistemas de controle de pressão arterial
(IRIGOYEN et al., 2001, 2005).
O equilíbrio da pressão arterial média (PAM) é mantido pela regulação permanente
entre o débito cardíaco e a resistência vascular periférica, uma vez que a PA pode ser
calculada pelo produto dessas duas variáveis hemodinâmicas (PA = DC x RVP). Desta
forma, elevações do DC e/ou da RVP resultam no aumento dos níveis de PA (PAIVA e
FARIAS 2005). Esta regulação deve ocorrer em faixas temporais diferentes, ou seja,
respostas orgânicas acontecem em diferentes tempos (curto, médio e longo prazos) que
se unem para ajustar os níveis pressóricos (GUYTON e HALL, 2011).
A regulação da PA em curto prazo envolvem mecanismos neurais que abrangem a
ativação de receptores periféricos (barorreceptores, quimiorreceptores e receptores
cardiopulmonares), cuja aferências se projetam para o sistema nervoso central via
nervos vagos e glossofaríngeos (FERNANDES et al., 2005).
Os barorreceptores são mecanoreceptores de estiramento, que estão localizados no
seio carotídeo e no arco aórtico. A elevação da pressão estira os barorreceptores, através
do estiramento da parede arterial e faz com que sinais sejam transmitidos para o sistema
nervoso central (SNC), mais precisamente para o núcleo do trato solitário, no bulbo,
onde sinais secundários inibem o centro vasoconstritor e excitam o centro vagal,
provocando vasodilatação das veias e arteríolas e diminuição da frequência e da força
7
de contração do coração, provocando redução da PAM por causa da baixa resistência
periférica e do menor débito cardíaco (DUSCHEK et al., 2008).
Os quimiorreceptores estão intimamente associados aos barorreceptores, mas em
vez dos receptores do estiramento que iniciam a resposta, as células respondem a
alterações de pressão parcial de oxigênio (pO2), pressão parcial de dióxido de carbono
(pCO2) e concentração hidrogeniônica (pH) (IRIGOYEN et al., 2005). Esses receptores
encontram-se distribuídos em corpúsculos carotídeos e aórticos,
localizados
bilateralmente na bifurcação da carótida (quimiorreceptores carotídeos) ou em pequenos
corpúsculos espalhados entre o arco aórtico e a artéria pulmonar (quimiorreceptores
aórticos) (IRIGOYEN et al., 2001, 2005).
Os
receptores
cardiopulmonares
são
mecanoreceptores,
cujas
fibras
são
amielinizadas e se projetam para o nervo vago. Estão localizados nos átrios, ventrículos,
coronárias, pericárdio, parênquima pulmonar e vasos pulmonares. A ativação desses
receptores aumenta a atividade parassimpática no coração e causa uma inibição
simpática no coração e nos vasos de forma a reduzir os valores de pressão
(COGOLLUDO et al., 2005).
A regulação em médio prazo envolvem as ações de mediadores químicos, tais como
as catecolaminas, endotelinas, prostaglandinas, óxido nítrico e angiotensinas. Porém,
tem-se como principal evento a liberação de renina pelas células justaglomerulares dos
rins. Esta enzima chega à circulação e catalisa a quebra do angiotensinogênio, que é
produzido no fígado, em angiotensina I, que, por sua vez, através da lise de sua
molécula pela enzima conversora de angiotensina, forma um potente vasoconstritor
denominado de angiotensina II. Este sistema renina-angiotensina é normalmente
acionado quando há redução dos níveis pressóricos e reforça as ações do barorreflexo
(GUYTON e HALL, 2011).
A regulação em longo prazo difere daqueles de ação rápida porque é um
mecanismo não adaptativo, e provê um efeito regulatório sustentado. O rim é o centro
desse sistema de regulação, controlando a volemia pela absorção de sódio e água, e é
influenciado pelo sistema renina-angiotensina-aldosterona ( FERREIRA NETO, 2013).
Os vasos sanguíneos também ajudam a controlar os níveis pressóricos através do
mecanismo conhecido como auto regulação que é dividido em: metabólico, endotelial e
miogênico (CARVALHO et al., 2001; STANKEVICIUS, 2003).
8
O controle metabólico é governado conforme a demanda e /ou necessidade de um
órgão, ou seja, respostas vasodilatadoras ou vasoconstritoras são efetuadas conforme o
catabolismo ou anabolismo dos tecidos corporais (GUYTON e HALL, 2011).
O endotélio atua na regulação da PA, controlando o tônus da musculatura lisa
vascular pela produção de mediadores que podem produzir vasodilatação ou
vasoconstrição. Os principais fatores relaxantes derivados do endotélio são o óxido
nítrico (NO), o fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) e a prostaciclina
(PGI2). Entre os fatores contráteis, os principais são a endotelina e o tromboxano
(FELETOU e VANHOUTTE, 2006).
Em condições fisiológicas existe um equilíbrio preciso entre a liberação desses
fatores, sendo a produção dos fatores relaxantes mais importantes. No entanto, em
diversas condições patológicas, esse equilíbrio é alterado com uma consequente
atenuação dos efeitos vasodilatadores do endotélio, podendo ocorrer uma disfunção
endotelial, que é uma condição bastante comum na HA (FELETOU e VANHOUTTE,
2006).
Em especial, o NO produzido pelas células endoteliais desempenha um papel de
grande importância no controle hemodinâmico, tanto no controle da resistência
periférica vascular como na agregação plaquetária. O NO é um potente vasodilatador e
assim seu papel no controle da PA é extremamente relevante. (CARVALHO et al.,
2001; STANKEVICIUS, 2003).
A síntese de NO pelas células endoteliais ocorre a partir de estímulos que podem ser
químicos ou físicos. Os estímulos químicos são originados de interação de agonistas
endógeno/exógenos com receptores específicos presentes nas células endoteliais. O
estímulo físico é feito pela força que o sangue exerce sobre a parede das artérias,
denominada força de cisalhamento, ou shear stress (MATLUNG et al., 2009). A
ocupação dos receptores por agonistas resulta no aumento da concentração de cálcio
intracelular ([Ca2+]i), via ativação da via fosfolipase C-inositol 1,4,5-trifosfato (PLCIP3), que se liga a calmodulina (CaM) formando o complexo Ca2+- calmodulina
(Ca2+/CaM). Este, por sua vez, ativa a óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) que é
capaz de sintetizar NO a partir do aminoácido L-arginina (L-Arg). Uma vez liberado, o
NO difunde-se rapidamente da célula geradora para a célula-alvo ou, mais
particularmente, das células endoteliais para a musculatura lisa do vaso sanguíneo. Na
célula muscular lisa, o NO irá ativar uma enzima catalítica, a guanilato ciclase solúvel
(GCs), que por sua vez irá formar o monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), a partir
9
da quebra do trifosfato de guanosina (GTP). A formação do GMPc promove a ativação
da bomba de cálcio (Ca2+-ATPase) do retículo sarcoplasmático (RS), diminuindo as
concentrações de cálcio intracelular que promoverá a redução do tônus vascular (Figura
1) (CARVALHO et al., 2001). Outros mecanismos pelos quais a via NO/GMPc induz
vasodilatação incluem inibição da geração de IP3 (na musculatura lisa), desfosforilação
da cadeia leve de miosina, ativação de proteínas quinases, estimulação da Ca2+-ATPase
de membrana e abertura de canais de K+ (CARVALHO et al., 2001; STANKEVICIUS
et al., 2003).
Figura 1: Representação esquemática do relaxamento via NO-GMPc. M3, receptor
muscarínico subtipo M3; ↑[Ca2+]i, aumento da concentração de cálcio intracelular; PLC,
fosfolipase C; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato; Ca2+/CaM, complexo cálcio calmodulina;
eNOS, óxido nítrico sintase endotelial; L-Arg, L-arginina; NO, óxido nítrico; GCs,
guanilato ciclase solúvel; GTP, guanosina trifosfato; GMPc, guanosina monofosfato
cíclica. Fonte: CUNHA, 2013.
Já está amplamente aceito que o FHDE também desempenha um papel importante
na modulação vasomotora. Porém, apesar de existirem alguns estudos sobre a existência
de FHDE, sua natureza ainda continua a ser identificada. Tem sido sugerido que o K+
10
liberado do endotélio pode ser um FHDE (EDWARDS et al.,1998). No entanto, este
pode não ser o caso de todos os vasos sanguíneos. Em algumas artérias, foi sugerido
recentemente que a junções mioendoteliais podem também desempenhar um papel para
provocar vasodilatação e hiperpolarização do músculo liso vascular (GRIFFITH et al.,
2004). Assim, mais do que um FHDE parece existir e a contribuição de cada uma ao
relaxamento dependente do endotélio pode variar dependendo do tipo de vaso
(EDWARDS et al.,1998; HATTORI et al., 2004; FELETOU e VANHOUTTE, 2004).
Alguns estudos sugerem que o FHDE compartilha algumas semelhanças biológicas
com o NO, visto que ambos são sintetizados por células endoteliais de uma forma
dependente do complexo Ca2 +/calmodulina. Em situações onde o relaxamento mediado
pelo NO é reduzido (por exemplo, hipertensão e hiperlipidemia), o FHDE compensa o
NO para causar relaxamento dependente do endotélio, enquanto em aterosclerose
avançada , o relaxamento mediado por FHDE também é prejudicado. Com base nessas
observações, há a hipótese de que um fator derivado da eNOS, possivelmente uma
espécie reativa de oxigênio, seja uma FHDE (FELETOU e VANHOUTTE, 2004;
MATOBA et al., 2002; SHIMOKAWA et al., 2004, 2005, 2010; VANHOUTTE, 2009;
YADA et al., 2003; 2006, 2007).
Figura 2: Hipótese sobre a natureza do H2O2/EDHF. EDHF hiperpolariza músculo liso
vascular através da abertura de canais de K+ e então provoca vasodilatação. Os
principais candidatos para a natureza da EDHF incluem: (1) íons K+ liberado do
endotélio através de canais KCa (2) comunicação elétrica através de junções
mioendoteliais; (3) H2O2 derivado do endotélio. FONTE: SHIMOKAWA, 2010.
11
Tem sido demonstrado que a eNOS ativado pode gerar superóxido sob a depleção
de L -arg na presença de análogos de L-arg. A produção de superóxido leva à formação
de peróxido de hidrogênio (H2O2) no endotélio vascular através de superóxido
dismutase . Além disso, foi visto que o H2O2 pode provocar tanto a hiperpolarização e
relaxamento das artérias, como pode ativar os canais para K+ sensíveis a cálcio (KCa) no
músculo liso vascular (Figura 2) (BUSSE et al., 2002; MORIKAWA et al, 2003,2004;
SHIMOKAWA et al., 2005; VANHOUTTE, 2009).
O controle miogênico é outro mecanismo essencial para o controle do fluxo
sanguíneo. Este mecanismo explica como o músculo liso vascular (MLV) é capaz de
contrair ou relaxar conforme as alterações na pressão. Por esta razão o MLV torna-se
indispensável no controle da resistência periférica total, do tônus arterial e venoso, bem
como na distribuição do fluxo sanguíneo corporal. Apresenta células altamente
especializadas contendo canais iônicos e proteínas contráteis e reguladoras responsáveis
pelos processos de contração e relaxamento, resultando em um equilíbrio das
necessidades orgânicas (WEBB, 2003).
2.3 Músculo liso vascular
O MLV apresenta forma fusiforme de pequeno tamanho (5-10 μm de diâmetro),
com invaginações (cavéolos), que são vesículas que contém Ca2+ que se comunicam
com o RS, fazendo papel análogo ao túbulo transverso, além de aumentar a superfície
celular. As células que compõem o músculo liso vascular se comunicam eletricamente
através de junções comunicantes (Gap junctions), estas oferecem baixa resistência ao
fluxo iônico, assim, quando há uma despolarização, esta se propagará por todas as
células ao redor (GUYTON e HALL, 2011).
O MLV participa do controle da resistência periférica total e é de extrema
importância para que os vasos sanguíneos apresentem um tônus (estado contraído do
MLV) que é influenciado pela mínima concentração de Ca2+ no interior da célula
muscular lisa. O tônus vascular é mantido por mecanismos intrínsecos do MLV, mas
pode sofrer alterações mediadas por fatores neurogênicos, biogênicos, endócrinos,
parácrinos, além de outros sinais como fármacos ou liberação circulante de Ca2+
(KNOT et al., 1996).
12
O [Ca2+]i é o principal mecanismo regulador da contração e do relaxamento do
MLV. O aumento do [Ca2+]i vai ocasionar a ligação de quatro íons Ca2+ com a CaM,
formando o complexo Ca2+/Calmodulina, induzindo uma mudança conformacional na
CaM. Com sua conformação alterada, o complexo Ca2+/Calmodulina se liga e ativa a
miosina quinase de cadeia leve (MLCK), ocorrendo a fosforilação da cadeia leve
regulatória da miosina, resultando no deslizamento entre os filamentos finos e grossos
de actina e miosina e desenvolvendo assim, os ciclos das pontes cruzadas, geração de
força e encurtamento no MLV, havendo a contração muscular (Figura 3). Por outro
lado, quando [Ca2+]i diminui, o complexo Ca2+/Calmodulina se dissocia da MLCK,
inativando-a. Além disso, há a ação de outra enzima, a fosfatase de cadeia leve de
miosina (MCLP), cuja atividade é independente de Ca2+. A MCLP desfosforila a cadeia
leve regulatória de miosina pela retirada do fosfato de alta energia que mantém o MLV
no seu estágio contraído e, assim, o ciclo é interrompido, assim como a contração.
Afirma-se que o balanço entre a MLCK e a MCLP são elementos fundamentais para a
contração e o cessar dessa contração (REMBOLD, 1996).
Figura 3: Representação esquemática da contração do músculo liso. PLC, fosfolipase
C; PIP2, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato; IP3; R, receptor
para inositol 1,4,5-trifosfato; CICR, liberação de cálcio induzida por cálcio; RyR,
receptor de rianodina; RS, retículo sarcoplasmático; DAG, diacilglicerol; PKC, proteína
quinase C; Cav, canal para cálcio sensível à voltagem; ↑[Ca2+]i, aumento da
concentração de cálcio intracelular; CaM, calmodulina; MLCK, quinase da cadeia leve
de miosina. Fonte: CUNHA, 2013.
13
Em resposta a estímulos vasoconstritores, o Ca2
+
é mobilizado a partir de
reservas intracelulares, como o RS ou do meio extracelular. O aumento da [Ca2+]i pode
ser causado por despolarização da membrana (acoplamento eletromecânico) ou pela
ligação de agonistas contráteis a receptores de superfície celular (acoplamento
farmacomecânico) (SOMLYO e SOMLYO, 1990).
Os mecanismos que levam a uma resposta contrátil através do acoplamento
eletromecânico são devido a uma despolarização de membrana, seja diretamente pelo
aumento da concentração externa de K+ ou indiretamente pela ligação dos agonistas aos
seus receptores, levando a abertura de canais de cálcio operados por voltagem (Cav)
causando influxo de Ca2+ no citoplasma e consequentemente a contração (REMBOLD,
1996).
O acoplamento farmacomecânico envolve a interação entre um agonista e um
receptor específico, acoplado a proteína G, que ativa a fosfolipase C (PLC), um
fosfomonoesterase dependente de Ca2+ localizada na membrana celular. A maioria dos
agonistas contráteis provoca a contração através da ligação a receptores acoplados a
PLC. A ligação do agonista com o receptor resulta em uma interação que provoca uma
mudança conformacional na proteína G, que é composta por três subunidades (α, β e γ),
sendo que há uma molécula de guanosina 5'-difosfato trifosfato (GDP) ligada ao
complexo. Quando ocorre a ocupação do receptor, a atividade fosforilativa da proteína é
ativada, fosforilando a molécula de GDP a guanosina-5'-trifosfato (GTP). O complexo α
- GTP se desprende então das outras subunidades, ativa PLC que, por sua vez, quebra o
fosfatodilinositol 4,5-bifosfato (PIP2), formando os segundos mensageiros, IP3 e DAG
(JACKSON, 2000).
O IP3 difunde-se a partir da membrana celular para o citoplasma, enquanto o
DAG permanece na membrana celular. No citosol, o IP3 liga-se ao receptor presente na
membrana do RS, permitindo a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, ocorrendo
a formação do complexo Ca2+/CaM e consequentemente a contração. O aumento da
[Ca2+]i provoca a liberação de mais Ca2+ do RS, através dos receptores de rianodina
(RyR), presentes nesta organela. O DAG, por sua vez, ativa a proteína quinase C (PKC)
que além de fosforilar MLCK, fosforila também os Cav(s), provocando sua abertura e
consequentemente o influxo de Ca2+, também ativa outras protéinas envolvidas na
contração (AKATA, 2006).
Os estoques intracelulares de Ca2+ são finitos e para que ocorra a manutenção da
contração é necessária à utilização deste íon proveniente do meio extracelular. A
14
membrana celular das células musculares lisas é composta por diversos canais, além dos
Cav(s), que auxiliam nestes mecanismos, e, dentre eles podemos citar os canais para
Ca2+ operados por receptor (ROC), que atuam através da ligação do agonista com o
receptor e formação de segundos mensageiros como IP3 e DAG e o canais para Ca2+
operados por estoque, que são ativados quando há uma depleção de Ca2+ dos estoques
intracelulares do RS, portanto a abertura desses canais é direcionada a reposição de Ca2+
dos estoques desta organela. Diante disso, quando os níveis de Ca2+ estão elevados há
inibição do influxo de Ca2+ por esses canais (MCFADZEAN e GIBSON, 2002).
Em contrapartida, estudos têm demonstrado que a célula muscular lisa pode ser
capaz de contrair pelo aumento da fosforilação da cadeia leve regulatória de miosina em
níveis muito baixos de Ca2+ por um mecanismo conhecido como sensibilização ao Ca2+.
Este fenômeno tem como principal fator a inibição da MLCP, que é a enzima
responsável por desfosforilar a cadeia regulatória de miosina (SOMLYO e SOMLYO,
2000).
A contração é mantida e potencializada pela sensibilização da maquinaria contrátil
ao Ca2+ através de várias proteínas de transdução de sinal e por várias vias de
sinalização. Evidências das últimas décadas têm demonstrado que a ativação da MLCK
provoca muitas vias de sinalização intracelular, incluindo a via da PLC, IP3, DAG e a
via p44/p42MAPK, resultando em uma série de eventos celulares que causam a
contração do MLV. Por exemplo, a proteína quinase C (PKC) quando ativada pelo
DAG, além de causar a abertura dos Cav(s), aumenta a contração inibindo a MCLP,
reduzindo, assim, a desfosforilação da cadeia regulatória de miosina. A proteína quinase
ativada por mitógeno (p44/p42MAPK) potencializa a contração através da fosforilação
do caldesmon (proteína de ligação da calmodulina), aumentando a ligação da actina
com a miosina (YU et al., 2004).
O relaxamento do MLV é mediado por eventos contrários aos que foram descritos
para contração, ocorrem mecanismos que impedem ou limitam a entrada de Ca2+ pela
membrana plasmática em combinação com mecanismos que reduzem o Ca2+
intracelular. A hiperpolarização reduz o influxo de Ca2+ através dos Cav(s) tipo L,
diminuindo, portanto a [Ca2+]i e a fosforilação da miosina e consequentemente a
contração (REMBOLD, 1996). Além disso, há o aumento da atividade da Ca2+-ATPase
tanto da membrana do RS como da membrana plasmática, levando a um aumento do
recaptação e da extrusão de Ca2+, respectivamente, diminuindo assim a [Ca2+]i
(AKATA, 2006).
15
2.4 Plantas medicinais
A utilização de plantas medicinais para o tratamento de doenças humanas tem
aumentado consideravelmente em todo o mundo. Informações sobre os conhecimentos
tradicionais ou grupos étnicos de plantas medicinais e seus usos representam um papel
vital na descoberta de novos produtos a partir de plantas como agentes farmacológicos
(BARBOSA-FILHO et al., 2006, 2008).
Esta terapia alternativa é bastante utilizada, especialmente nos países em
desenvolvimento, onde a disponibilidade de serviços de saúde é limitada. Mesmo em
países desenvolvidos, uma grande parte da população faz uso destas plantas como
medicamento, devido a crenças históricas e culturais (AGRA et al., 2007).
Os produtos naturais, nomeadamente os de origem vegetal, tem sido sempre uma
fonte importante de agentes terapêuticos, cerca de 25% de todas as drogas disponíveis
como terapêutica são derivados de produtos naturais (Quadro 1) (YUNES E CALIXTO,
2001). Além disso, os países latino-americanos possuem grande parte da biodiversidade
do mundo. Neste contexto, o Brasil possui cerca de 22% de todas as plantas e
microrganismos existentes. No entanto, menos de 10% têm sido investigadas em relação
às suas propriedades químicas, farmacológicas ou aspectos biológicos (BARBOSAFILHO et al., 2006; CALIXTO, 2005).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, ainda existem muitos princípios
ativos responsáveis pelas ações farmacológicas de plantas medicinais desconhecidos,
apesar de inúmeroes estudos neste setor. Estima-se que cerca de 75% dos compostos
puros naturais empregados na indústria farmacêutica foram isolados seguindo
recomendações da medicina popular (TABASSUM e AHMAD, 2011)
A opção de conduzir pesquisas a partir da indicação de plantas utilizadas por
comunidades encurta o percurso do desenvolvimento de uma nova droga, já que os
pesquisadores dispõem, antes de iniciarem os estudos científicos, de uma indicação de
qual atividade biológica esta droga pode apresentar (FUNARI e FERRO, 2005).
16
Quadro 1: Exemplo de fármacos extraídos de espécies vegetais
Fármaco
Classe terapêutica
Espécie vegetal
Ácido salicílico
Analgésico
Salix alba
Artemisinina
Antimalárico
Artemisia annua
Atropina
Anticolinérgico
Atropa belladona
Capsaicina
Anestésico tópico
Capsicum spp.
Cocaína
Anestésico local
Erythroxylum coca
Colchina
Anti-reumático
Colchicum autumnale
Digitoxina
Cardiotônicos
Digitalis purpurea
Dicumarol
Anticoagulante
Melilotus officinalis
Efedrina
Broncodilatador adrenérgico
Ephedra sinica
Ergotamina
Bloquedor adrenérgico
Claviceps purpurea
Fisostigmina
Antiglaucomatoso
Physostigma venenosum
Morfina; Codeína
Analgésico,antitussígeno
Papaver somniferum
Pilocarpina
Antiglaucomatoso
Pilocarpus jaborandi
Quinina
Antimalárico
Cinchona spp.
Reserpina
Anti-hipertensivo
Rauwolfia spp.
Fonte: YUNES e CALIXTO, 2001.
Assim, uma vez que as plantas medicinais produzem uma variedade de
substâncias com propriedades farmacológicas, é importante haver estudos que possam
apontar novos compostos, candidatos ao desenvolvimento de novos medicamentos.
Entretanto, as investigações científicas visando determinar o potencial terapêutico das
plantas são limitadas, existindo a carência de estudos científicos experimentais que
confirmem as possíveis propriedades farmacológicas de um grande número destas
plantas (AGRA et al., 2007).
2.5 Óleos essenciais
Os óleos essenciais são substâncias voláteis extraídas de plantas aromáticas,
constituindo matérias-primas de grande importância para as indústrias cosmética,
farmacêutica e alimentícia. Estes óleos são amplamente distribuídos na natureza, pois
são misturas complexas de compostos naturais voláteis como os monoterpenos,
sesquiterpenos e arilproponóides contidos em muitas espécies vegetais e que
17
apresentam uma variedade de propriedades biológicas (CARDOSO et al., 2000;
GUIMARÃES et al., 2013; LEAL CARDOSO e FONTELES, 1999; MOREIRA et al.,
2001; SANTOS et al., 2010).
Nas plantas, os óleos essenciais apresentam-se como misturas de compostos em
diferentes proporções, tendo, normalmente um composto majoritário. A grande maioria,
destes óleos, no entanto, é constituída de derivados fenilpropanóides ou de terpenóides,
preponderando os últimos. Os terpenóides constituem uma grande variedade de
substâncias vegetais, sendo esse termo empregado para designar todas as substâncias
cuja origem biossintética deriva de unidades do isopreno. Os terpenóides, também
conhecidos como isoprenóides, são derivados do ácido mevalónico e pode ser chamado
de isoprenes ativos (SIMÕES et al., 2004). A nomenclatura dos terpenóides depende do
número de estruturas de isopreno e podem ser classificados como monoterpeno,
sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpene e politerpeno. Os compostos
terpênicos mais frequentes nos óleos essenciais são os monoterpenos (BAKKALI et al.,
2008; GUIMARÃES et al., 2013).
Os monoterpenos podem ser divididos em três subgrupos: acíclico, monocíclico e
bicíclico e em cada um desses subgrupos, há outras classificações: hidrocarbonetos
insaturados, álcoois, aldeídos e cetonas, lactonas e tropolonas. Sua estrutura consiste em
duas unidades de isopreno ligadas, que são formados por 5 carbonos (C5) cada um
(SIMÕES et al., 2004; GUIMARÃES et al., 2013).
Os monoterpenos são as moléculas mais representativas dos óleos essenciais,
constituem mais de 90% de sua composição e apresentam uma variedade de
propriedades biológicas, tais como miorrelaxante, antimicrobiano, antiespamódico,
antidepressivos, anti-inflamatório, cardioestimulante, antihipertensivo, depressor do
trânsito intestinal, analgésico, anticonvulsivante e ansiolítico (DE SOUSA, 2011;
GUIMARÃES et al., 2013).
Além das atividades descritas acima, monoterpenos também produzem efeitos
significativos sobre o sistema cardiovascular, promovendo, entre outras ações,
vasorelaxamento, diminuição da frequência cardíaca e hipotensão Assim, estes
monoterpenos podem ser úteis como agentes para a prevenção e / ou tratamento de
DCV (AYDIN et al., 2007; BASTOS et al., 2010; MAGALHÃES et al, 2008;
PEIXOTO-NEVES et al, 2010; SANTOS et al;, 2010).
18
2.6 P- cimeno
O p-cimeno, também chamado de p-isopropiltolueno; 1-metil-4 isopropilbenzeno;
metilpropilbenzeno é um hidrocarboneto natural, monoterpeno, monocíclico, com
fórmula molecular C10H14 (Figura 4). É um precursor biológico do monoterpeno
carvacrol e um dos principais constituintes do óleo essencial de diversas espécies
vegetais, a exemplo do Protium sp, com mais de 80% das espécies encontradas na
região Amazonas e Nigella sativa L. (aliprive, cominhos negros) (SANTANA, et al;
2011).
Figura 4: Estrutura química do p-cimeno
Alguns estudos têm relatado efeito antimicrobiano do p-cimeno que parece
resultar, pelo menos parcialmente, a partir de uma perturbação bruta da fração lipídica
da membrana plasmática deliberando por romper a membrana citoplasmática das
bactérias (CRISTANI, 2007). O p-cimeno tem menor efeito antimicrobiano do que seu
precursor, o carvacrol, pois o p- cimeno carece de um grupo hidroxila, para
desempenhar um papel importante na atividade antimicrobiana (ULTEE et al., 2002).
Porém, tem sido relatado que o sinergismo entre carvacrol e p-cimeno é eficaz contra B.
cereus in vitro e in vivo (ULTEE et al., 2000). Estudos in vitro demonstraram que o
monoterpenos podem ser usados como um antimicrobiano contra as bactérias Grampositivas
(Staphylococcus
aureus)
e
as
Gram-negativas
(Escherichia
coli)
(BAGAMBOULA et al., 2004; CRISTANI et al., 2007). Além disso, diferentes estudos
têm mostrado que o p-cimeno possui atividade antibacteriana, antifúngica e herbicida
(KODALI et al., 2008).
A atividade antinociceptiva do p-cimeno também foi confirmada, podendo
modular tanto a dor neurogênica como inflamatória. Além disso, parece, pelo menos em
19
parte, que a ação antinociceptiva de p-cimeno envolve o sistema opióide (BONJARDIM
et al., 2012; SANTANA, et al; 2011; XIE et al., 2012).
A espécie conhecida como vindicar (Alpinia speciosa) é usada como
espasmolítica e hipotensora, tendo também ação cardiovascular e depressora no sistema
nervoso central. Os monoterpenos limoneno, terpinen-4-ol, α-terpineno e p-cimeno
foram os componentes principais encontrados neste óleo essencial (MAIA et al., 2001)
O óleo essencial de Thimus Capitatus e Laurus Nobilis, que possuem em sua
composição química o p-cimeno, apresentou porcentagem de relaxamento em aorta
isolada de rato de 96,9 % e de 82%, respectivamente, demonstrando um potencial efeito
anti-hipertensivo. Além disso, nesse mesmo estudo, o p-cimeno apresentou correlação
positiva entre atividade anti-hipertensiva e atividade antioxidante, visto que a atividade
antioxidante pode contribuir para a prevenção do aumento da pressão arterial (YVON et
al., 2012).Assim, o p-cimeno pode ser útil na prevenção e / ou tratamento de DCV.
Outros estudos mostraram a influência do p-cimeno contido no óleo volátil de
Nigella sativa (a semente preta) sobre o sistema cardiovascular de ratos e cobaias (El
TAHIR et al., 1993; 1994; 2003). Nestes estudos, o p-cimeno diminuiu tanto a PA como
a FC, através de um efeito central.
Dentro desse contexto, o interesse deste trabalho em avaliar a atividade
vasorelaxante do p-cimeno é bastante justificável, na busca de novas drogas com
potencial efeito anti-hipertensivo, para uma possível utilização em tratamentos
cardiovasculares.
20
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral:
Avaliar o efeito do p-cimeno sobre reatividade vascular em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de ratos normotensos.
3.2 Objetivos Específicos:
Caracterizar os efeitos do p-cimeno sobre a reatividade vascular in vitro,
investigando:
- A influência dos fatores relaxantes derivados do endotélio;
- A participação dos íons Ca2+ na resposta relaxante e a sensibilização da
maquinaria contrátil sensível ao Ca2+ da musculatura lisa vascular;
- A participação dos canais para K+ na resposta vascular.
21
4.METODOLOGIA
4.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos normotensos, pesando entre 250-300g,
provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe (UFS), e mantidos
no biotério setorial do laboratório de farmacologia cardiovascular (LAFAC), sob
condições ambientais de temperatura, obedecendo o ciclo claro-escuro tendo livre
acesso à alimentação e água. Todos os procedimentos descritos foram previamente
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS (CEPA/UFS), sob o
número de protocolo 03/2012.
4.2 Drogas
O p-cimeno, o cloridrato de L (-) fenilefrina (FEN), cloridrato de acetilcolina
(Ach), tetraeltilmônio (TEA) e Ortovanadato de sódio (Na3VO4) foram obtidos
comercialmente da SIGMA BRASIL. Para a preparação das soluções estoques, o pcimeno foi emulsificado em uma mistura de água destilada/cremofor (0,1% v/v). O
cremofor não altera os resultados dos experimentos.
4.3 Soluções Nutritivas
As soluções nutritivas de Tyrode foram preparadas utilizando-se as seguintes
substâncias: cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de Ca2+ dihidratado
(CaCl2.2H2O),
cloreto
de
magnésio
hexa-hidratado
(MgCl2.6H2O),
bicarbonato de sódio (NaHCO3), fosfato de sódio mono-hidratado (NaH2PO4) e glicose
(C6H12O6).
Na solução despolarizante de Tyrode acrescida com cloreto de potássio a 80 ou
60 mM, a concentração de Na+ foi equimolarmente substituída. Nas soluções
nominalmente sem Ca2+, o CaCl2 foi omitido. As tabelas a seguir mostram as
composições das mesmas:
22
Tabela 1: Composição da solução de Tyrode para anéis de artéria mesentérica superior.
Substância
Concentração (mM)
NaCl
158,3
KCl
4,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Tabela 2: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a
80 mM (KCl 80).
Substância
Concentração (mM)
NaCl
82,3
KCl
80,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Tabela 3: Composição da solução despolarizante de Tyrode com cloreto de potássio a
60 mM (KCl 60).
Substância
Concentração (mM)
NaCl
102,6
KCl
60,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
23
Tabela 4: Composição da solução de Tyrode nominalmente sem Ca2+.
Substância
Concentração (mM)
NaCl
158,3
KCl
4,0
CaCl2
0,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
4.4 Estudo farmacológico
4.4.1 Avaliação dos efeitos do p-cimeno sobre a reatividade vascular in Vitro
4.4.1.1 Preparação da artéria mesentérica superior isolada de rato
Os ratos foram previamente anestesiados com dose excessiva de tiopental sódico
e então eutanisados por deslocamento cervical e dessangramento. Em seguida, através
de uma incisão no abdome do animal, foi retirada a artéria mesentérica (Figura 5).
Foram obtidos quatro anéis livres de tecido conjuntivo e adiposo, do primeiro segmento
da artéria (1-2 mm).Esses anéis foram mantidos em cubas contendo 10 mL de solução
nutritiva de Tyrode, a 37º C e gaseificados com uma mistura carbogênica (95% de O2 e
5% de CO2) (Figura 6). Os anéis foram suspensos por linhas de algodão fixadas a um
transdutor de força (Letica, TR210, Barcelona, Espanha) acoplado a um sistema de
aquisição (AVS, São Paulo, Brasil) para o registro das contrações isométricas. Cada
anel foi submetido a uma tensão constante de 0,75 g por um período de no mínimo 60
minutos para estabilização. Durante este tempo, a solução nutritiva foi trocada a cada 15
minutos para prevenir a interferência de metabólitos (ALTURA e ALTURA, 1970).
Os anéis sem endotélio foram obtidos por remoção mecânica através do atrito
entre as paredes internas do vaso com o auxílio de uma haste de algodão. A presença ou
ausência do endotélio funcional foi verificada pela habilidade, medida em percentagem
(%), da Ach (10 uM) em relaxar os anéis pré-contraídos com 10 µM de FEN. Foram
considerados com endotélio funcional, os anéis que apresentaram relaxamentos
superiores a 75 % sobre a pré-contração com FEN. Já os anéis com relaxamentos
24
inferiores a 10 %, foram considerados sem endotélio funcional (FURCHGOTT e
ZAWADZKI, 1980). Anéis com relaxamentos entre 10 e 75 % foram descartados.
Figura 5: Artéria mesentérica superior de rato. Fonte: MAYNARD, 2011.
Figura 6: Anel arterial disposto entre duas hastes suspenso por linha de algodão e
mantido em cuba para órgão isolado contendo solução nutritiva de Tyrode. Fonte:
MAYNARD, 2011.
25
Figura 7: Sistema de aquisição de dados de reatividade vascular. Fonte: arquivo
pessoal.
4.4.1.2 Caracterização do efeito do p-cimeno sobre a reatividade vascular em
artéria mesentérica superior isolada de rato
Após o período de estabilização e a verificação da presença do endotélio
funcional, os anéis de artéria mesentérica foram pré-contraídos com FEN (10 µM) e
sobre a fase tônica desta contração foram adicionadas cumulativamente à cuba,
concentrações crescentes do p-cimeno (10-8 - 3x10-2M), para obtenção de uma curva
concentração-resposta controle.
4.4.1.3 Avaliação do papel do endotélio vascular nas respostas induzidas pelo pcimeno
Após o período de estabilização e a verificação da ausência do endotélio
funcional, os anéis foram pré-contraídos com FEN (10 μM) e sobre a fase tônica desta
contração foram adicionadas cumulativamente a cuba concentrações crescentes do pcimeno (10-8 - 3x10-2M). A curva concentração-resposta para esta condição
experimental foi construída e comparada com a condição controle (4.4.1.2).
4.4.1.4 Avaliação da participação dos canais de Ca2+ nas respostas induzidas
pelo p-cimeno
O possível efeito do p-cimeno sobre os canais para Ca2+ foi investigado
construindo-se curvas concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis
sem endotélio e na presença de altas concentrações de K+. Neste protocolo experimental
a solução de Tyrode da cuba foi trocada pela solução despolarizante de Tyrode com KCl
26
a 80 mM (KCl 80) e as preparações permaneceram nesta solução até o final do
experimento.
Também foram construídas curvas concentração - resposta para CaCl2. Estas
preparações foram lavadas com solução de Tyrode nominalmente sem Ca2+ e
permaneciam nesta solução por 15 min. Após este período, as preparações eram lavadas
com uma solução de KCl 60 mM isentas de cálcio por mais 15 min, e em seguida, era
adicionado cumulativamente a cuba o CaCl2 (10-7 - 3x10-2M). Porém na presença de
concentrações isoladas de p-cimeno
(3x10-3, 10-2 e 3x10-2M) por um período de
incubação de 15 min. Decorrido este tempo, os resultados foram avaliados comparandose os percentuais de resposta contrátil na presença e na ausência do p-cimeno.
4.4.1.5 Avaliação do efeito do p-cimeno sobre sensibilização dos elementos
contráteis ao Ca2+
O efeito do p-cimeno sobre sensibilização dos elementos contráteis ao Ca2+ foi
investigado através do protocolo descrito por YU et al. (2004), utilizando o
ortovanadato de sódio (Na3VO4) .O Na3VO4 é um potente inibidor da MLCP e induz
contração do músculo liso, reduzindo a desfosforilação e aumentando o nível de
fosforilação da MLCK , responsável pela ativação de vias de sinalização que causam
contração do músculo liso (YU et al., 2004). Para obtenção de um curva concentraçãoresposta controle para o Na3VO4 , anéis sem endotélio funcional foram contraídos
através da adição cumulativa de Na3VO4 (10-5 - 3x10-2M). Em seguida, os mesmos
anéis foram lavados com solução Tyrode e pré-incubados com concentrações isoladas
de p-cimeno (3x10-3, 10-2 ou 3x10-2M) por 15 min. As curvas concentração-resposta
para os anéis pré-incubados com o p-cimeno foram comparadas com a curva
concentração-resposta controle (Na3VO4 na ausência do p-cimeno).
4.4.1.6 Avaliação da participação dos canais para K+ nas respostas induzidas
pelo p-cimeno
O possível efeito do p-cimeno sobre os canais para K+ foi investigado construindo
curvas concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis sem endotélio
incubados com 1 mM de TEA, que nesta concentração, é um bloqueador não seletivo de
canais de K+ (COOK, 1989). A curva concentração-resposta para esta condição
experimental foi comparada com a obtida em anéis sem endotélio funcional.
27
4.5 Eutanásia e descarte dos animais
Os animais foram eutanisados através de uma dose excessiva de anestésico seguido
de dessangramento. As carcaças foram embaladas em jornal, acondicionados em sacos
plásticos brancos para lixo infectante e depositados no freezer do biotério setorial do
DFS/UFS para devido descarte pela Torre, empresa responsável pela coleta do lixo
hospitalar da UFS.
4.6 Análise estatística
Os valores das medidas obtidas foram expressos como a média ± erro padrão da
média (E.P.M.). Quando necessário, foram utilizados análise de variância “two-way”
(ANOVA) seguida do pós-teste de Bonferroni para avaliar a significância das diferenças
entre as médias. Em todos estes procedimentos foram feitas análises pelo programa
estatístico GraphPad Prism 3.02.
28
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A HA é uma doença crônica multifatorial que tem sido considerada o fator de
risco mais comum das DCV. Assim sendo, o tratamento da HA é muito importante para
a saúde da população mundial, por prevenir o surgimento de complicações advindas da
elevação da pressão arterial (PA) que possam comprometer a vida do indivíduo
hipertenso (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2010).
Diante disso, informações sobre os conhecimentos tradicionais e grupos de
plantas medicinais, óleos essenciais e seus usos representam um papel fundamental na
descoberta de novos compostos a partir dessas substâncias como agentes
farmacológicos. Estudos nesse setor são de extrema importância, principalmente a
investigação de espécies que não tenham sido objeto de estudos farmacológicos e
químicos (AGRA et al., 2007; CALIXTO et al., 2000).
O p-cimeno foi escolhido para esse estudo devido às inúmeras propriedades
relatadas na literatura para os componentes dos óleos essenciais, principalmente sobre o
sistema cardiovascular (BASTOS et al., 2010; CUNHA et al, 2004; DE SIQUEIRA et
al, 2006; MENEZES, 2010; SANTOS et al., 2007). Lima et al. (2012) demonstrou em
seu estudo a importância química natural dos óleos essenciais como bons candidatos
para medicamentos anti-hipertensivos, relacionando a sua estrutura química com seu
efeito farmacológico.
Além disso, estudos anteriores mostram que o p-cimeno tem um potencial efeito
anti-hipertensivo. Óleos essenciais de plantas, como a Thimus capitatus, Laurus Nobilis,
Nigella sativa (semente preta) e Alpinia speciosa, que possuem em sua composição
química o p-cimeno, apresentaram efeito hipotensor e vasorelaxante (ANDRADE et al.,
2001; El TAHIR et al., 1993; 1994; 2003; YVON et al., 2012;).
El Tahir et al. (2003) realizou experimentos in vivo avaliando a atividade
hipotensora do p-cimeno. Neste estudo, foi observado que o p-cimeno foi capaz de
antagonizar o efeito do hexametônio, um bloqueador ganglionar. Desse modo, foi
observado uma inibição do centro vasomotor com consequente diminuição do fluxo
simpático nos vasos sanguíneos e no coração, resultando em diminuição da PA e da FC.
Desta forma, diante da existência de estudos anteriores comprovando a atividade
hipotensora do p-cimeno através de um efeito central, buscou-se investigar no presente
estudo a ação do p-cimeno sobre a resistência vascular periférica Portanto, foi avaliado
o efeito vasorelaxante do p-cimeno através de experimentos in vitro, em artéria
29
mesentérica superior de rato, que, por ser um vaso de pequeno calibre, pode apresentar
resistência ao fluxo sanguíneo, implicando na regulação do débito sanguíneo e na
pressão capilar e, consequentemente, pode refletir variações na resistência periférica
total e promover alterações na PA (FOLKOW, 1979; MULVANY e AALKJAER,
1990).
De acordo com a Figura 8, o p-cimeno foi capaz de induzir relaxamento
dependente da concentração em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
com endotélio funcional pré-contraídos com 10 µM de FEN (Emáx = 77,09 ± 5,53%; n
= 5).
% Relaxamento
0
25
50
75
Com endotélio
100
8
7
6
5
4
3
2
- Log [p-cimeno]
Figura 8: Curva concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional (n= 5), précontraídos com 10 µM de FEN. Os valores estão expressos como média ± E. P. M. Os
dados foram analisados por ANOVA de duas vias, seguido pelo pós-teste de
Bonferroni.
Como relatado na literatura, o endotélio é um importante regulador do tônus
vascular por liberar fatores relaxantes derivados do endotélio. Estudos mostram que as
células endoteliais são capazes de sintetizar várias substâncias vasoativas como o NO, a
PGI2 e o EDHF. Em especial, o NO produzido pelas células endoteliais desempenha um
papel de grande importância no controle da resistência vascular periférica, pois é um
potente vasodilatador e assim seu papel no controle da PA é extremamente relevante
(FURCHGOTT e ZAWADZKI, 1980; VANHOUTTE et al., 2005). Alguns estudos têm
demonstrado que o endotélio vascular possui importante função moduladora sobre o
30
vasorelaxamento induzido por óleos essenciais (LAHLOU et al, 2002; MAGALHÃES
et al, 2008; PINTO et al, 2009).
Em preparações de aorta isolada de rato com endotélio intacto, 1,8-cineol,
monoterpeno presente em ínúmeros óleos essenciais, induziu relaxamento significativo
da contração induzida por FEN. Este efeito foi abolido após remoção do endotélio
vascular. O efeito vasorelaxante deste monoterpeno foi significativamente reduzido por
N (G)-nitro-L-arginina éster metílico (L-NAME), inibidor direto da eNOS, sugerindo
que o efeito vasorelaxante está associado diretamente ao endotélio vascular e a
produção de NO (LAHLOU et al, 2002; PINTO et al, 2009).
Magalhães et al.(2008) avaliaram o papel da via do óxido nítrico no endotélio
do óleo essencial de Croton nepetaefolius e dois dos seus constituintes, metileugenol e
α-terpineol em aorta isolada de rato. O tratamento com L-NAME, azul de metileno e a
remoção mecânica do endotélio aumentou significativamente os valores de IC50,
indicando que a ação vasorelaxante está relacionada à integridade do endotélio vascular.
Estudo de Guedes et al.(2004) mostrou que o óleo essencial de Mentha x villosa em
ratos induz o relaxamento de vasos por uma via envolvendo mediadores endoteliais.
Diante disso, com o objetivo de avaliar a participação dos fatores relaxantes
derivados do endotélio nos efeitos induzidos pelo p-cimeno, foram feitos experimentos
em anéis sem o endotélio funcional. Porém, a remoção mecânica do endotélio não
alterou o efeito vasorelaxante induzido pelo p-cimeno, sugerindo que o endotélio não
parece ser importante para a expressão desta resposta e que outra via independente do
endotélio está envolvida no efeito do p-cimeno (Emáx = 72 ± 4,03%; n = 8) (Figura 9).
El Tahir et al. (2003) avaliou em experimentos in vivo, a participação do NO no
mecanismo hipotensor do p-cimeno, através da administração de azul de metileno, que é
um inibidor da ativação da GCs. Neste estudo, foi observado que o p-cimeno não
antagonizou os efeitos do azul de metileno, indicando que não há participação do NO na
hipotensão causada pelo p-cimeno.
Estes resultados corroboram a outros estudos com monoterpenos, demostrando
que o efeito vasorelaxante não está associado à capacidade de liberar fatores relaxantes
derivados do endotélio como o NO ou EDHF, visto que, nestes estudos, também não
houve diferença estatística entre o relaxamento de preparações com o endotélio intacto e
aquelas com endotélio removido (EL TAHIR et al., 2003; PEIXOTO-NEVES et al.,
2010).
31
Em experimentos realizados por Peixoto-Neves et al. (2010), foi demonstrado que
os monoterpenos timol e carvacrol induziram um relaxamento independente do
endotélio em aorta isolada de ratos. Os autores sugeriram o envolvimento da via de
transdução de sinal entre o Ca2+ e a liberação do retículo sarcoplasmático e / ou
regulação da sensibilidade da maquinaria contrátil ao Ca2+. Além disso, o timol e
carvacrol, em baixas concentrações, bloquearam o influxo de Ca2+ através dos Cav(s)
% de relaxamento
0
25
50
75
Com endotélio
Sem endotélio
100
8
7
6
5
4
3
2
- Log [p-cimeno] M
Figura 9: Curva concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional (n=5) e sem
endotélio funcional (n=8), pré-contraídos com 10 µM de FEN. Os valores estão
expressos como média ± E. P. M. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias,
seguido pelo pós-teste de Bonferroni.
Como o p-cimeno induziu vasorelaxamento por uma via independente do
endotélio, buscou-se investigar um mecanismo de relaxamento, envolvendo outras vias
de sinalização. Portanto, foram realizados experimentos para avaliar a participação dos
canais para Ca2+ nas respostas induzidas pelo p-cimeno. Nestes experimentos, foi
avaliada a ação do p-cimeno em contrações sustentadas e induzidas por alta
concentração de potássio extracelular (KCl 80 mM). É bem estabelecido na literatura
que o aumento da concentração externa de K+ (KCl 80 mM) induz contração do
músculo liso através da ativação de canais de cálcio operados por voltagem (Ca v(s))
com consequente, liberação de cálcio do RS, iniciando todo o processo de contração
(KARAKI e WEISS, 1988). Os canais para cálcio sensíveis a voltagem são canais
32
ativados pela despolarização por meio de estímulos químicos ou elétricos e são
classificados, de acordo com suas propriedades farmacológicas e eletrofisiológicas:
canais sensíveis a diidropiridina (DHP) ativados por alta voltagem (tipo-L ou
Cav1.1,Cav1.2, Cav1.3), canais insensíveis à diidropiridina ativados por alta voltagem
(tipo - P/Q/N ou Cav2.1, Cav2.2, Cav2.3) e canais ativados por baixa voltagem (tipo-T
ou Cav3.1, Cav3.2, Cav3.3) (ERTEL et al., 2000). É predominante no músculo liso
vascular a presença de Cav(s) tipo L e tipo T, entretanto recente estudo demonstrou a
expressão de Cav(s) tipo P e Q em células musculares lisas vasculares renais e aórticas
de ratos e camundongos (ANDREASEN et al., 2006).
Então, para avaliar a participação dos Cav(s) no efeito vasorelaxante induzido pelo
p-cimeno, curvas para o óleo estudado foram obtidas em anéis, sem endotélio funcional,
pré-contraídos por solução despolarizante de Tyrode (KCl 80 mM). Nestas preparações,
o p-cimeno foi capaz de induzir relaxamento (Emáx = 79,31 ± 5,24 %; n = 6), que não
foram significativamente diferentes daqueles obtidos em anéis sem endotélio précontraídos com FEN (Emáx = 72 ± 4,03 %; n = 8) (Figura 10), sugerindo um possível
envolvimento dos Cav(s) nesta resposta.
% de relaxamento
0
25
50
Sem endotélio (Fen)
75
Sem endotélio (KCl 80 mM)
100
8
7
6
5
4
3
2
- Log [p-cimeno] M
Figura 10: Curvas concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 – 3x10-2M) em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato, sem endotélio funcional (n=8), précontraídos com FEN (sem endotélio) ou com KCl 80 mM (n=6). Os valores estão
expressos como média ± E. P. M. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias,
seguido pelo pós-teste de Bonferroni.
33
Para confirmar a hipótese acima, foram obtidas curvas concentração-resposta para
CaCl2 (10-7–3x 10-2M), em solução isenta de Ca2+, antes e após individual préincubação com p-cimeno (3x10-3, 10-2 e 3x10-2M). Nestas condições, o p-cimeno nas
concentrações de 10-2 e 3x10-2M foi capaz de inibir significativamente as contrações
induzidas por CaCl2 em 40,53% ± 2,56% e 74,51 ± 4,05%, respectivamente (Figura
11).
100
CaCl2
CaCl2 - p-cimeno 3x10-3
CaCl2 - p-cimeno 10-2
% Contração
75
CaCl2 - p-cimeno 3x10-2
***
***
50
***
**
***
25
***
***
***
***
***
*** ***
**
0
6
5
4
3
2
- Log [CaCl2] M
Figura 11: Curva concentração-resposta para CaCl2 (10-7 - 3x10-2M) em anéis de artéria
mesentérica superior de ratos, sem endotélio, antes (controle) e após pré-incubação com
p-cimeno (3x10-3, 10-2 e 3x10-2M). Os valores foram expressos como média ± E.P.M.
Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias, seguido pelo pós-teste de
Bonferroni. ** p <0.01 e *** p < 0,001 vs CaCl2.
34
Portanto, o p-cimeno produz efeito relaxante tanto sobre contrações induzidas por
acoplamento eletromecânico como farmacomecânico. No acoplamento eletromecânico,
a contração é causada pela despolarização da membrana. Essa despolarização ativa os
Cav(s) causando uma entrada de cálcio no meio intracelular e desencadeando uma
contração (AKATA, 2006). No acoplamento farmacomecânico, a contração é feita
através da ligação do agonista ao seu receptor, o que desencadeia uma cascata de
segundo mensageiro (COTECCHIA, 2010). A cascata de segundo mensageiro leva a
uma liberação de cálcio dos estoques internos, aumento da sensibilidade do aparato
contrátil ao cálcio intracelular e um influxo de cálcio extracelular, o que desencadeia a
contração (JACKSON, 2000; WEBB, 2003). O p-cimeno foi eficaz sobre contrações
induzidas por acoplamento eletromecânico e farmacomecânico, visto que foi capaz de
induzir o relaxamento em anéis pré-contraídos com FEN (10µM) e com KCl a 80mM.
Com intuito de confirmar a hipótese de que o efeito do p-cimeno sobre o
acoplamento eletromecânico e farmacomecânico está associado ao bloqueio dos Cav(s)
e que não há participação dos canais de K+ nesta resposta, anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato, sem endotélio funcional, foram pré-contraídos com 10 µM de
FEN na presença de 1mM de TEA, um bloqueador não seletivo destes canais. Segundo
a literatura, os canais de K+ representam a via de condução iônica majoritária nas
células musculares vasculares e sua atividade contribui para regulação do potencial de
membrana e do tônus vascular (JACKSON, 2000). O gradiente eletroquímico para íons
K+, assim como a abertura de canais de K+, resultam em difusão destes cátions para o
meio extracelular e consequentemente hiperpolarização e relaxamento do músculo liso
vascular. Como pode ser observado na Figura 11, o p-cimeno foi capaz de induzir
relaxamentos (Emáx= 50,54% ± 4,08%; n=8) que não foram significativamente
diferentes daqueles obtidos em anéis sem endotélio pré-contraídos com FEN (Emáx =
72%% ± 4,03%; n = 8) na ausência de TEA (Figura 12). Estes resultados sugerem que o
efeito vasorelaxante induzido pelo p-cimeno parece não envolver a participação de
canais de K+.
35
% de relaxamento
0
25
50
75
Sem endotélio
Sem endotélio após TEA (1 mM)
100
8
7
6
5
4
3
2
- Log [p-cimeno] M
Figura 12: Curvas concentração-resposta para o p-cimeno (10-8 - 3x10-2M) em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato, sem endotélio funcional (n= 8), précontraídos com FEN (10 µM) antes e após a incubação com 1mM de TEA. Os valores
estão expressos como média ± E.P.M. Os dados foram analisados por ANOVA de duas
vias, seguido pelo pós-teste de Bonferroni.
Os dados aqui obtidos relacionadas com Cav (s) corroboram a outros resultados com
outros monoterpenos. Evidências indiretas obtidas no músculo liso vascular sugeriram
que muitos monoterpenos como o borneol, linalol, timol, carvacrol, eugenol e citronelol
atuam através do bloqueio dos Cav(s) (BASTOS et al., 2010; LAHLOU et al., 2002;
LIMA et al., 2010; PEIXOTO-NEVES et al., 2010).
Nestes estudos, o borneol, linalol, timol, carvacrol, eugenol e citronel promoveram
um vasorelaxamento de uma maneira dependente de concentração que não foi atenuado
com a remoção do endotélio vascular ou pré-contraído com KCl 80 mM. Além de
antagonizar as contrações induzidas por adição cumulativa de CaCl2 (ANJOS et al.,
2013; BASTOS et al., 2010; LAHLOU et al., 2002; LIMA et al., 2010; PEIXOTONEVES et al., 2010;; SILVA-FILHO et al.,2011)
Os resultados deste trabalho são análogos ao descrito por Lalhou et al (2005),
Menezes et al (2010), Maynard et al (2011) e Moreira et al. (2010) que demonstraram
que os óleos essenciais de Aniba canelilla Bark, Cymbopongon winterianus, Lippia alba
(Mill.)
N.E.
Brown.
e
Cymbopongon
citratus,
vasorelaxamento através de uma inibição dos Cav(s).
respectivamente,
produziram
36
Além disso, estudo recente avaliou o efeito antiespasmódico do óleo essencial da
Lippia sidoides Cham. e seus constituintes, timol, p-cimeno e beta-cariofileno, sobre o
músculo liso traqueal de ratos e foi visto que a ação do óleo e seus constituintes está
relacionado com o bloqueio de Cav(s). (TEÓFILO, 2012). Estes resultados mostrados
em outros estudos adicionam suporte a nossa hipótese da ação inibitória do p-cimeno
sobre os Cav(s).
Porém, há um mecanismo de contração que independe do grande aumento da
concentração de cálcio intracelular, conhecido por sensibilização ao cálcio, que também
foi investigado no estudo em questão.
Sabe-se que para haver relaxamento é necessária a ação da MLCP, que é uma
enzima regulatória responsável pela desfosforilação da cadeia leve regulatória de
miosina. A contração do MLV pode ser mantida e potencializada por proteínas
contráteis sensíveis ao Ca2+ através da inibição da MLCP e consequentemente redução
da desfosforilação da cadeia leve regulatória de miosina, provocando a contração (YU
et al., 2004). O Na3VO4 é um potente inibidor da fosforilação da proteína tirosina (YU
et al., 2004; ELBERG et al., 1994) e também induz contrações mediadas por esta via
(YU et al., 2004).
Baseado nisso, um possível efeito do p-cimeno nas contrações induzidas por
inibição da MLCP foi investigado. Foram obtidas curvas concentração-resposta para as
contrações induzidas pelo Na3VO4 (10-5 - 3x10-2M) Esses experimentos foram
realizados em anéis sem endotélio, mantidos em solução Tyrode, antes e após préincubação individual com p-cimeno (3x10-3, 10-2 e 3x10-2M). Nessas condições, o pcimeno nas concentrações 3x10-3, 10-2 e 3x10-2M foi capaz de inibir significativamente
as contrações induzidas pelo Na3VO4 em 17,63 ± 6,75%; 46,74 ± 4,60%; 73,82 ±
4,20%, respectivamente (Figura 13), sugerindo, assim, que o p-cimeno também parece
estar agindo através da diminuição da sensibilidade maquinaria contrátil ao Ca2+.
37
100
Na3VO4
Na3VO4 - p-cimeno 3x10-3
Na3VO4 - p-cimeno 10-2
% Contração
75
***
-2
Na3VO4 - p-cimeno 3x10
***
50
***
***
25
***
**
***
**
***
***
***
***
0
5
4
3
2
- Log [Na3VO4] M
Figura 13: Curva concentração-resposta para Na3VO4 (10-5 - 3x10-2M) em anéis de
artéria mesentérica superior de ratos, sem endotélio, antes (controle) e após préincubação com p-cimeno (3x10-3, 10-2 e 3x10-2M). Os valores foram expressos como
média ± E.P.M. Os dados foram analisados por ANOVA de duas vias, seguido pelo pósteste de Bonferroni. ** p <0.01 e *** p < 0,001 vs Na3VO4.
Estes resultados corroboram a outros estudos feitos em nosso laboratório com os
monoterpenos (-) linalol e citral. Estes compostos antagonizaram as contrações
induzidas por Na3VO4 nas concentrações de 10-2M e 10-3M, respectivamente, sugerindo,
portanto, que o efeito vasorelaxante dos monoterpenos podem estar, também,
relacionados à redução da sensibilidade da resposta contrátil ao Ca2+ (CUNHA, 2013;
MOREIRA, 2013).
38
6. CONCLUSÃO
Estes resultados demonstram que o p-cimeno produz efeito vasorelaxante, em artéria
mesentérica superior de rato, sendo este independente da participação do endotélio. Este
efeito parece ocorrer através do bloqueio do influxo de Ca2+ através dos canais para
Ca2+ operados por voltagem na membrana do músculo liso vascular, associado à
diminuição da sensibilidade da maquinaria contrátil ao Ca2+..
Estes achados denotam uma base racional do uso de plantas medicinais que
contenham o p-cimeno em sua composição para o tratamento da hipertensão, além do
uso do composto puro. Porém, são necessários outros estudos para melhor caracterizar
os efeitos cardiovasculares e colaterais do p-cimeno, para que essa substância possa ser
utilizada para fins terapêuticos.
39
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