0 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA CAMPUS DE
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0 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA CAMPUS DE PARAGOMINAS JOSÉ RICARDO SANTOS BARBOSA MARIA ANTONIA MACHADO BARBOSA Parâmetros Fisiológicos e Bioquímicos em duas Cultivares de Feijão-caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp) Submetidas ao Déficit Hídrico e Inoculação com Bradyrhizobium spp. (BR 3256) PARAGOMINAS 2015 1 UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA CAMPUS DE PARAGOMINAS JOSÉ RICARDO SANTOS BARBOSA MARIA ANTONIA MACHADO BARBOSA Parâmetros Fisiológicos e Bioquímicos em duas Cultivares de Feijão-caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp) Submetidas ao Déficit Hídrico e Inoculação com Bradyrhizobium spp. (BR 3256) Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica, da Universidade Federal Rural da Amazônia, como requisito para obtenção do grau de Bacharel em Engenharia Agronômica. Áreas de Concentração: Fisiologia Vegetal e Bioquímica Aplicada. Orientador: D.Sc. Allan Klynger da Silva Lobato. PARAGOMINAS 2015 2 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal Rural da Amazônia --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Barbosa, José Ricardo Santos Parâmetros Fisiológicos e Bioquímicos em duas Cultivares de Feijão-caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp) Submetidas ao Déficit Hídrico e Inoculação com Bradyrhizobium spp. (BR 3256) / José Ricardo Santos Barbosa e Maria Antonia Machado Barbosa _ Paragominas, 2015. 48 f. Orientadora: Prof. Dr. Allan Klynger da Silva Lobato Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Engenharia Agronômica) – Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA, Paragominas - PA, 2015. 1. Trocas Gasosas. 2. Seca. 3. Metabolismo do Nitrogênio. I. Barbosa, José Ricardo Santos. II. Barbosa, Maria Antonia Machado Barbosa, Orient. III. Título. CDD 23.ed. 635.659 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 4 À Deus. Aos nossos pais José Barbosa, Raimunda dos Reis Santos Barbosa, Maria Lucia Barbosa e Antônio José Barbosa. Aos nossos irmãos Marilane, Aldiane, Erlan e Eliane. À Margarida da Silva Machado (in memorian) que com muito incentivo e apoio, não mediram esforços para que chegássemos ao fim dessa etapa de nossas vidas... Dedicamos. 5 AGRADECIMENTOS À Deus por ter nos dado saúde e sabedoria para superarmos os obstáculos. À esta universidade, seu corpo docente, direção e administração, que nos deram suporte para que pudéssemos crescer e evoluir, tanto em âmbito profissional como pessoal. Ao nosso orientador Allan Lobato, por toda dedicação e paciência, em nos direcionar por novos caminhos no mundo da Fisiologia Vegetal, Bioquímica e Melhoramento Genético. Ao CNPq pela concessão de bolsas de Iniciação Científica por três anos consecutivos. Aos nossos pais, pelo amor, carinho, companheirismo e apoio incondicional. Aos nossos familiares pelas palavras de incentivo e compreensão. Aos nossos companheiros de turma e do Núcleo de Pesquisa Vegetal Básica e Aplicada – NPVBA (em especial à Gélia Dinah e Kelly Nayara), por todas as experiências compartilhadas. 6 Pois será como a árvore plantada junto a ribeiros de águas, a qual dá o seu fruto no seu tempo e as suas folhas não cairão, e tudo quanto fizer prosperará. (Salmos 1:3) 7 RESUMO Vigna unguiculata é uma espécie amplamente distribuída pelo mundo, principalmente nas regiões tropicais. O déficit hídrico é um fator abiótico que vem prejudicando a sobrevivência e o crescimento de inúmeras espécies vegetais. Diferentes genótipos podem apresentar distintas respostas ao déficit hídrico, uma vez que os efeitos podem ser bastante complexos. Uma boa estratégia para o aumento da produtividade do feijão-caupi tem sido o uso de inoculantes com bactérias eficientes na FBN em condições de campo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o comportamento fisiológico e bioquímico de duas cultivares de feijão-caupi caracterizadas como tolerante e sensível ao déficit hídrico, sob efeito de inoculação. O estudo foi realizado na Universidade Federal Rural da Amazônia, campus de Paragominas, Pará, Brasil, conduzido em casa de vegetação sob condições de temperatura e umidade totalmente controladas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 2 cultivares, dois regimes hídricos, e duas formas de inoculação, resultando em 8 tratamentos, com seis repetições, totalizando 48 unidades experimentais. Os dados foram submetidos à análise de variância e quando ocorreu diferença significativa, foi aplicado o teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade de erro. Esta investigação revelou que o déficit hídrico promoveu impactos negativos em plantas de V. unguiculata, em todos os parâmetros fisiológicos avaliados, tanto na cultivar tolerante como na sensível. O déficit hídrico promoveu diminuição em dois parâmetros bioquímicos, tais como atividade da enzima redutase do nitrato e nos níveis de proteínas solúveis totais. A inoculação com Bradyrhizobium spp. promoveu aumentos nos níveis de compostos nitrogenados sob condições de déficit hídrico, tais como nitrato e prolina, em comparação com os mesmos tratamentos em plantas não-inoculadas. Palavras-chave: Trocas-gasosas. Seca. Metabolismo do Nitrogênio. 8 ABSTRACT Vigna unguiculata is a species widely distributed throughout the world, especially in tropical regions. The drought is an abiotic factor that is hindering the survival and growth of a great amount of plants. Different genotypes may have different responses to water deficit, since the effects can be quite complex. A good strategy to increase the cowpea productivity has been the use of bacterial inoculants efficient in FBN in field conditions. This study aimed to evaluate the physiological and biochemical behavior of two cowpea cultivars characterized as tolerant and sensitive to water deficit under inoculation effect. The study was conducted at the Universidade Federal Rural da Amazonia, campus de Paragominas, Pará, Brazil, conducted in a greenhouse under conditions of temperature and humidity completely controlled. The experimental design was completely randomized with two cultivars, two water regimes, and two forms of inoculation, resulting in eight treatments with six replications, totalling 48 experimental units. The data were submitted to variance analysis and when significant difference, the Scott-Knott test at 5% probability error was applied. This investigation revealed that the water deficit promoted negative impacts on V. unguiculata plants in all physiological parameters evaluated in both tolerant and sensitive cultivars. The drought caused a decrease in two biochemical parameters such as reductase enzyme activity of nitrate and levels of total soluble proteins. Inoculation with Bradyrhizobium spp. promoted increases in the levels of nitrogenous compounds under drought conditions, such as nitrate and proline in comparison to the same treatments in non-inoculated plants. Keywords: Gas Exchange. Drought. Nitrogen metabolism. 9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Representação esquemática da rota de assimilação do nitrogênio nas raízes e nas folhas de plantas........................................................................................................................21 Figura 2 – Vaso tipo Leonardo, adaptado pelo NPVBA.........................................................23 Figura 3 – Delineamento experimental com 48 unidades e uma planta de feijão-caupi por vaso...........................................................................................................................................24 Figura 4 – Aplicação do inoculante (A) e adubação com solução nutritiva (B)......................25 Figura 5 – Plantas de feijão-caupi sob tratamento controle (A) e após 5 dias de déficit hídrico (B).............................................................................................................................................25 Figura 6 – Determinação da transpiração e condutância estomática com o auxílio de um Analisador de Gás no Infra-vermelho (IRGA).........................................................................27 Figura 7 – Maceração de material vegetal em nitrogênio líquido para obtenção do extrato enzimático (A) e determinação dos parâmetros bioquímicos em espectrofotômetro (B).............................................................................................................................................28 Figura 8 – Conteúdo relativo de água na folha em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão.................................................................................29 Figura 9 – Condutância estomática em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão..................................................................................................30 Figura 10 – Transpiração em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão...........................................................................................................................31 Figura 11 – Atividade da enzima redutase do nitrato (RN) em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão........................................................................................................................................32 Figura 12 – Teores de nitrato (NO3-) em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão..................................................................................................34 10 Figura 13 – Aminoácidos solúveis totais em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão..................................................................................................35 Figura 14 – Proteínas solúveis totais em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão..................................................................................................36 Figura 15 – Teores de Prolina em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão..................................................................................................37 11 LISTA DE SIGLAS ATP – adenosina-5' trifosfato CO2 – Dióxido de Carbono CRA – Conteúdo Relativo de Água na Folha FBN – Fixação Biológica do Nitrogênio GOGAT – Glutamato Sintetase GS – Glutamina Sintetase H+ – Hidrogênio HCI – ácido clorídrico KH2PO4 – Fosfato de Potássio KNO3 – Nitrato de Potássio N2 – Nitrogênio Atmosférico NaOH – hidróxido de sódio NH4+ – Amônio NO2- – Nitrito NO3- - Nitrato NPVBA – Núcleo de Pesquisa Vegetal Básica e Aplicada P5C – Pirrolina – 5 – Carboxilato P5CR – pyrrolline – 5 – carboxilato de redutase P5CS – Pirrolina – 5 – Carboxilato Sintetase RN – Redutase do Nitrato RNi – Redutase do Nitrito UFC – Unidade Formadora de Colônia UR – Umidade Relativa do Ar 12 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................13 2. OBJETIVOS................................................................................................................15 2.1. Objetivo Geral............................................................................................................15 2.2. Objetivos Específicos...................................................................................................15 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................15 3.1. Características gerais do feijão-caupi......................................................................15 3.2. Déficit Hídrico.............................................................................................................16 3.2.1. Respostas Fisiológicas ao déficit hídrico......................................................................17 3.2.2. Respostas Bioquímicas ao déficit hídrico.....................................................................19 3.3. Inoculação....................................................................................................................20 4. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................24 4.1. Localização do experimento.......................................................................................24 4.2. Sementes e Substrato..................................................................................................24 4.3. Delineamento Experimental.......................................................................................25 4.4. Condução das plantas e Inoculação...........................................................................25 4.5. Mensuração dos Parâmetros Fisiológicos.................................................................27 4.5.1. Conteúdo Relativo de Água na Folha (CRA)................................................................27 4.5.2. Transpiração e Condutância Estomática.......................................................................27 4.6. Mensuração dos Parâmetros Bioquímicos...............................................................28 4.6.1. Atividade da enzima Redutase do Nitrato (RN)............................................................28 4.6.2. Nitrato, Aminoácidos Solúveis Totais e Prolina...........................................................29 4.6.3. Proteínas Solúveis Totais..............................................................................................29 4.7. Análises Estatísticas....................................................................................................30 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................30 5.1. Conteúdo Relativo de Água na folha (CRA)............................................................30 5.2. Condutância Estomática.............................................................................................31 5.3. Transpiração................................................................................................................32 5.4. Atividade da Redutase do Nitrato..............................................................................33 5.5. Nitrato..........................................................................................................................34 5.6. Aminoácidos Solúveis Totais......................................................................................35 5.7. Proteínas Solúveis Totais............................................................................................36 5.8. Prolina..........................................................................................................................37 13 6. CONCLUSÃO............................................................................................................39 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................40 14 1. INTRODUÇÃO O feijão-caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp.) é uma leguminosa de grande importância para as regiões Norte e Nordeste do Brasil, pois além de ser bastante cultivada pelos agricultores, representa uma grande fonte de proteínas e se destaca pela sua grande capacidade de fixação de nitrogênio atmosférico (N2), e consequentemente se adapta baixa fertilidade do solo (FROTA et al., 2008; ALVES et al., 2009). O feijão-caupi é uma cultura de importância fundamental no contexto socioeconômico das famílias que vivem na região norte e nordeste, por ser um alimento de alto valor nutritivo, importante fonte de proteínas, carboidratos e fibras, essenciais para facilitar a digestão dos alimentos. É importante também por gerar emprego e renda e ser um dos principais componentes da dieta alimentar nas zonas rural e urbana (SABOYA et al., 2008; MARTINS et al., 2013). Além do Brasil, o feijão-caupi é uma espécie amplamente distribuída pelo mundo, principalmente nas regiões tropicais, em virtude de terem condições edafoclimáticas semelhantes às do seu provável centro de origem, a África (BRITO et al., 2011). As plantas de uma forma em geral, estão sujeitas a uma grande variedade de estresses ambientais, incluindo temperaturas anormais, condições químicas e físicas do solo desfavoráveis e a várias doenças e pragas, contudo, pode-se dizer que o déficit hídrico é um dos principais fatores que reduzem o crescimento e a produtividade vegetal, pois ocorre em qualquer local, mesmo nas regiões consideradas úmidas, como é o caso da Amazônia (WANG et al., 2003). O déficit hídrico é um fator abiótico que vem prejudicando a sobrevivência e o crescimento de inúmeras espécies vegetais, acarretando em alterações nas características anatômicas e fisiológicas ou adaptações metabólicas. As alterações anatômicas decorrentes da baixa disponibilidade de água no meio geralmente estão envolvidas na proteção das plantas contra a perda de água para o ambiente e dessecação de células corticais assim como na manutenção da condução de água no xilema (VASELLATI et al. 2001; MELO et al., 2007). Estudos de ecofisiologia em plantas submetidas a seca, tem demonstrados eficientes resultados, uma vez que são concentrados nas alterações de abertura estomática, que em condições de déficit hídrico tendem a agir no sentido de minimizar as perdas de água por transpiração (FRANÇA et al., 2000; CHAVES et al., 2003). O feijão-caupi é uma espécie considerada tolerante à diferentes estresses abióticos, como a seca, sendo capaz de desenvolver importantes mecanismos de tolerância a falta de 15 água. Modificações bioquímicas no metabolismo do carbono, tal como aumento em sacarose (LOBATO et al., 2009a), bem como uma interferência significativa no metabolismo do nitrogênio, como redução de proteínas solúveis (COSTA et al., 2011) e aumento nos teores de aminoácidos totais contribuem para que ocorra um melhor ajustamento osmótico em plantas de V. unguiculata (LOBATO et al., 2008). Por outro lado, diferentes genótipos podem apresentar distintas respostas ao déficit hídrico, uma vez que os efeitos podem ser bastante complexos, afetando praticamente todos os aspectos de crescimento, incluindo modificações anatômicas, morfológicas, fisiológicas e bioquímicas (SOUSA et al., 2015). Uma boa estratégia para o aumento da produtividade do feijão-caupi tem sido o uso de inoculantes com bactérias eficientes na Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN) em condições de campo, porém, embora a cultura apresente ampla capacidade na FBN, nem sempre são observadas respostas positivas do uso de inoculantes em campo, em razão de o feijão-caupi ser cultivado, na maioria das vezes, em condições de subsistência com baixo aporte tecnológico (ZILLI et al., 2008). Outro fator limitante para o uso de inoculantes na cultura do feijão-caupi, deve-se ao caráter promíscuo da nodulação, onde espécies nativas presentes no solo podem colonizar as raízes, competindo com a cepa inoculante pelos sítios de infecção (ALMEIDA et al., 2010). Na literatura, poucos são os trabalhos que demonstram os efeitos da inoculação em plantas de feijão sob baixa disponibilidade de água, ou seja, há poucos relatos que evidenciam a ação das bactérias fixadoras de nitrogênio como amenizadoras dos danos causados pelo estresse hídrico, principalmente quando se trata de avaliações mais minuciosas, como parâmetros fisiológicos e bioquímicos. Diante da importância do feijão-caupi para o norte-nordeste do Brasil, torna-se imprescindível a realização de estudos utilizando ferramentas que avaliem a tolerância desta espécie em condições de baixa disponibilidade de água (NASCIMENTO et al., 2011), pois embora o feijão-caupi seja considerado espécie adaptada à seca, sua capacidade de adaptação varia de genótipo para genótipo (TAGLIAFERRE et al., 2013). Portanto, para o manejo adequado dessa cultura, visando à produtividade, é importante conhecer a sua capacidade de resposta ao déficit hídrico, bem como a relação entre disponibilidade de água e ação de bactérias fixadoras de nitrogênio através da técnica de inoculação. 16 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral Avaliar o impacto do déficit hídrico sobre o comportamento fisiológico e bioquímico de duas cultivares de feijão-caupi (V. unguiculata) caracterizadas como tolerante e sensível, sob efeito de inoculação. 2.2. Objetivos Específicos Determinar o conteúdo relativo de água nas folhas em duas cultivares de feijão-caupi em condições de déficit hídrico e inoculação; Observar o comportamento das trocas gasosas em plantas de feijão-caupi expostas a seca e inoculação; Avaliar parâmetros relacionados ao metabolismo do nitrogênio em cultivares de feijãocaupi tolerantes e sensíveis ao déficit hídrico e expostas à inoculação; 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Características gerais do feijão-caupi O feijão-caupi (V. unguiculata) é uma planta herbácea, autógama, anual, cuja região de origem mais provável situa-se na parte oeste e central da África. É uma das leguminosas melhor adaptada, versátil e nutritiva entre as espécies cultivadas (SILVA, 2011). A classificação botânica aceita para o feijão-caupi é que ele seja uma planta Dicotyledonea, da ordem Fabales, família Fabaceae, subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae, subtribo Phaseolineae, gênero Vigna, subgênero Vigna, secção Catyang, espécie Vigna unguiculata (L.) Walp. e subespécie unguiculata (VERDCOURT, 1970; SMARTT, 1990; PADULOSI, 1997). Esta espécie possui ainda denominações de feijão-de-corda, feijão-da-colônia, feijãomacassar e feijão-fradinho (grãos brancos), representando atualmente 15% da produção de feijão no Brasil (TEIXEIRA et al., 2010). Oliveira et al. (2002) descrevem que o feijão-caupi apresenta importantes características agronômicas, tais como rusticidade e precocidade, além de ser considerada uma planta adaptada às condições de limitada ou insuficiente disponibilidade hídrica. Embora a espécie apresente boas adaptabilidades a seca, deve ser considerado o fato que essa característica 17 possui uma variabilidade entre os cultivares e os estádios de desenvolvimento (MENDES et al., 2007). O estado do Pará é o maior produtor de feijão-caupi da Amazônia legal, em que a região do Nordeste Paraense possui larga contribuição na produção destes grãos (BARBOSA et al., 2013). Em relação à área plantada, no ano de 2011 foram plantados 52,7 mil hectares, e os municípios que apresentam as maiores áreas foram Monte Alegre, Tracuateua e Augusto Corrêa com 3,9; 3,8 e 3,0 mil hectares, respectivamente (SAGRI, 2013). As causas do baixo rendimento do feijão-caupi estão relacionadas a problemas edáficos; irregularidades das chuvas ou no suprimento inadequado de água no cultivo irrigado; fatores fitossanitários e ao uso de sistemas de produção de baixo nível tecnológico (MATOS FILHO et al., 2009). Até a década de 80, o feijão-caupi era quase que exclusivamente cultivado por pequenos e médios agricultores de base familiar. Atualmente, esta cultura passou a ocupar outros cenários agrícolas, em áreas com perímetro irrigado ou/e também na safrinha, frequentemente após a cultura da soja, sendo explorado por grandes produtores com adoção de novas tecnologias (SOARES et al., 2006; BORGES et al., 2012). A cultura do feijão-caupi exige pesquisas básicas e aplicadas vinculadas ao impacto provocado pelo déficit hídrico, devido as frequentes e intensas perdas de produção relacionadas a este estresse abiótico (DUBETZ;MAHLLE, 1969; WHITE et al., 1994; BEEBE et al., 2013) e a elevada importância econômica e nutricional para os países produtores e consumidores do grão, tal como o Brasil (BROUGHTON et al., 2003; LONDERO et al., 2008). Atualmente, o acervo de informações tecnológicas desta espécie já é bastante vasta. Por meio de programas de melhoramento genético, estão sendo desenvolvidas várias cultivares comerciais, ampliando o mercado e as formas de uso do produto. Melhorias nas técnicas de cultivo do feijão-caupi, sob condições de sequeiro e irrigado, estão sendo obtidas, elevando a produtividade dessa importante fonte de proteínas e de outros elementos essenciais ao ser humano (CORRÊA, 2003). 3.2. Déficit Hídrico As plantas de diversas espécies em condições de campo estão constantemente expostas a estresses abióticos ou bióticos, e sofrem interações que podem afetar significativamente os seus desempenhos (ATKINSON; URWIN, 2012), incluindo a cultura do feijão-caupi (BASTOS et al., 2011). 18 O déficit hídrico é um fenômeno frequente e característico do nosso país, principalmente nas regiões semiáridas e áridas, que apresentam intensidade e efeitos variáveis no espaço e no tempo. Uma vez que a seca é desencadeada por persistente ausência de pluviometria significativa, onde a variabilidade espacial da precipitação torna muito mais frequente às ocorrências de fenômenos regionais de seca, e devido à redução dessa disponibilidade de água nos solos, há uma grande influência na sobrevivência e adaptação das espécies vegetais sob essas condições (MENESES et al., 2006). A deficiência hídrica limita a absorção de água e nutrientes e, consequentemente, reduz a germinação das sementes, abertura dos estômatos, atividade fotossintética, transpiração, atividade enzimática e vários outros processos fisiológicos e metabólicos, reduzindo o rendimento e/ou a qualidade do produto. No entanto, as plantas têm desenvolvido, evolutivamente, mecanismos adaptativos complexos, muitos destes somente possíveis graças às interações com microrganismos benéficos (SANTOS et al., 2014). O feijão-caupi é classificada como moderadamente tolerante à deficiência hídrica, e o requerimento de água desta cultura é variável com o seu estádio de desenvolvimento (NASCIMENTO et al., 2011). Porém, já é constatado que em plantas de feijão o déficit hídrico diminui a condutância estomática e aumenta a resistência difusiva ao vapor de água, mediante fechamento dos estômatos, reduzindo a transpiração e, em consequência, o suprimento de CO2 (dióxido de carbono) para a fotossíntese (OLIVEIRA et al., 2005). Além disso, o déficit hídrico induz alterações moleculares, fisiológicas, bioquímicas e morfológicas em plantas de feijão-caupi (IUCHI et al., 1996; FIGUEIREDO et al., 1999; GOMES FILHO; TAHIN, 2002; LOBATO et al., 2009b), sendo considerado como estratégias de adaptação, visando à sobrevivência da espécie (MATSUI; SINGH, 2003). O déficit hídrico durante o crescimento das plantas tem sido uma das principais causas das frustações de safras nas últimas décadas e as ações que visam aumentar a tolerância das plantas despontam como de grande interesse para a pesquisa agrícola. Entretanto, práticas de inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio em sistemas agrícolas sustentáveis, tem proporcionado proteção cruzada contra diferentes tipos de estresses, incluindo o déficit hídrico (OLIVEIRA et al., 2014). 3.2.1. Respostas Fisiológicas ao déficit hídrico Inúmeros processos fisiológicos das plantas têm sido correlacionados a estresses hídricos, entre estes a transpiração, a condutância estomática, a resistência difusiva, a 19 temperatura foliar e o conteúdo de água na folha (CAVALCANTE et al., 2001). Em condições normais, a taxa de transpiração nas folhas é determinada especialmente pela radiação, déficit de saturação e pela condutância estomática (MARIANO et al., 2009). O fechamento dos estômatos é a estratégia mais comumente utilizada pela planta para manter a turgescência durante as horas mais quentes do dia e para diminuir a taxa de transpiração (CAVALCANTE, et al., 2001). Nos vegetais diversos aspectos estão associados a transpiração, sendo que o mecanismo de fechamento dos estômatos, quando a umidade do solo está abaixo do teor para o qual a demanda atmosférica é necessária, provoca redução da transferência de vapor para a atmosfera. Esse comportamento é mais comum durante as horas mais quentes do dia. (CARVALHO; SILVA, 2006). A disponibilidade de água é fator limitante no crescimento e produção de diversas culturas. Em condições hídricas normais, a planta consome grande quantidade de água durante o seu ciclo fenológico, mas perde em torno de 98% através da transpiração e assim, qualquer alteração no fluxo de água prejudica a produção da cultura (CAVALCANTE et al., 2001). O estado hídrico das plantas pode ser avaliado por diferentes métodos, os quais se baseiam desde sintomas visuais, como identificação do secamento ou enrolamento das folhas, ou por medidas quantitativas de conteúdo de água em órgãos vegetais (DUTRA et al., 2011). Muitos consideram que o conteúdo relativo de água (CRA) seja mais bem correlacionado com os fatores fisiológicos das plantas, por apresentar forte relação com volume celular, relevante no metabolismo de plantas sob o déficit hídrico (JHONES, 1992), entretanto, problemas metodológicos na determinação deste parâmetro, como determinação da massa túrgida e interferência da respiração e fotossíntese no ganho ou perda de massa do tecido tem dificultado a sensibilidade do índice e sua aplicação em folhas (DUTRA et al., 2011). A análise de parâmetros fisiológicos também permite a seleção e classificação de cultivares através de testes comparativos com genótipos já conhecidos quanto à tolerância ou sensibilidade ao déficit hídrico e, entre estes parâmetros, o CRA é considerado uma ferramenta de rápido e baixo custo para esta análise (GRAÇA, 2009). As plantas, ao absorverem CO2, inevitavelmente, perdem água pelas folhas. Essa perda de água ocorre principalmente através dos estômatos, que apresentam mecanismos para controlar o seu grau de abertura. Esse controle é atribuído à condutância estomática foliar, que é frequentemente utilizada como indicador da deficiência hídrica (OLIVEIRA et al., 2011). 20 Estudos tem evidenciado que a baixa quantidade de água presente no substrato, com uma consequente desidratação de partes das raízes pode causar parcial fechamento dos estômatos, evidenciando que o fechamento estomático está mais relacionado ao conteúdo hídrico do solo do que ao próprio conteúdo hídrico da planta (SAUTER et al., 2001; DAVIES et al., 2002; TAIZ; ZEIGER 2004). A transpiração é outro parâmetro que também podem ser usada para o estudo das relações hídricas dos vegetais, haja vista que a transpiração é um bom indicador da disponibilidade de água na planta. Em uma situação de boa disponibilidade de água, as plantas cultivadas geralmente apresentam altas taxas de transpiração. À medida que a água do solo se torna escassa, a planta começa a reduzir sua taxa transpiratória para a diminuição da perda de água e economia da água disponível no solo (CASTRO NETO, 2003). 3.2.2. Respostas Bioquímicas ao déficit hídrico As respostas dos vegetais à deficiência hídrica incluem muitas vezes alterações bioquímicas em nível celular (FLOSS, 2004; MENESES et al., 2006). Entender as alterações bioquímicas induzidas pelo déficit hídrico é peça chave para entender as respostas da planta aos estresses e como essas alterações influenciam o crescimento e o desenvolvimento da planta (COSTA, 2010). Diante de condições de estresse, as plantas desenvolvem mecanismos de defesa, como forma de mantença do seu estado hídrico. Alguns desses incluem o acumulo de solutos orgânicos de baixo peso molecular, também chamado de solutos compatíveis, em um processo conhecido como ajustamento osmótico (BAJJI et al, 2001). Alterações no metabolismo das plantas a nível molecular provocam, entre outras reações, redução no teor de proteínas, como consequência da redução na sua síntese ou na decomposição acentuada, resultando uma liberação reforçada de aminoácidos. Neste caso há um acréscimo da atividade da enzima glutamina sintetase, responsável pelo metabolismo dos aminoácidos, como a prolina (FERREIRA et al., 2002; SOUSA et al., 2015). Os aminoácidos são os constituintes básicos das proteínas, macromoléculas complexas que desempenham funções específicas nas plantas, principalmente a nível estrutural como componentes das paredes celulares (FRANCISCO JUNIOR; FRANCISCO, 2006). O acúmulo de aminoácidos pode ser considerado como um sinal de tolerância das plantas sob diferentes estresses ambientais (OLIVEIRA et al., 2013). Em condições de estresse hídrico, tipicamente ocorre um aumento da síntese de enzimas proteases, que 21 quebram as proteínas de reservas, no intuito de se ajustar osmoticamente ao meio estressante, aumentando assim, os níveis de aminoácidos. Concomitantemente, estes aminoácidos vão ser distribuídos para outras partes das plantas em deficiência (MAIA et al., 2007; TAIZ; ZEIGER, 2004). Uma das mais bem estudadas respostas das plantas ao déficit hídrico é a acumulação de prolina nas células. A acumulação desse aminoácido é resultado do aumento do fluxo de glutamato que é metabolizado pela Pirrolina – 5 – Carboxilato Sintetase (P5CS), a enzima que regula a taxa de biossíntese de prolina, bem como de um decréscimo no metabolismo desse aminoácido. Tal enzima, responsável pela transformação de Pirrolina – 5 - Carboxilato (P5C) em prolina, tem sua expressão regulada por mudanças no potencial osmótico do citoplasma (HARE;CRESS, 1997). Um decréscimo no potencial osmótico da célula leva a um aumento na síntese de P5C e, consequentemente, a um aumento na síntese de prolina. A acumulação de prolina em células vegetais submetidas ao déficit hídrico tem sido sugerida como um mecanismo de ajuste osmótico (MELO, 2014). As alterações do padrão de expressão atividade que codificam determinadas enzimas, como a redutase do nitrato (RN), são observadas como reações bioquímicas em resposta ao estresse hídrico (QUEIROZ, 2010). Considerando que a RN é a primeira enzima na via de assimilação do nitrato, e provavelmente representa o passo limitante na incorporação desse nutriente, é de grande importância a avaliação de sua atividade, visto que, ela tem sido constantemente utilizada como indicadora de estresses e de outras mudanças associadas aos fatores moduladores do crescimento das plantas (MARUR et al., 2000). 3.3. Inoculação O nitrogênio é o elemento mineral essencial exigido em maior quantidade referindo-se as exigências das culturas, o que se deve ao fato de estar envolvido nas principais reações bioquímicas em plantas e microrganismos, além de ser constituinte de vários compostos em plantas, destacando-se os aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos e clorofilas (NOVAIS et al., 2007). Dentre os elementos minerais essenciais, a disponibilidade do nitrogênio é um dos fatores mais importantes nos processos de crescimento e de desenvolvimento de plantas, se apresentando como o elemento mineral essencial de maior impacto para diversas características agronômicas de interesse (OLIVEIRA, 2010). 22 A principal forma nitrogenada absorvida pelas plantas, independentemente da natureza química do nitrogênio aplicado no solo, é o nitrato (NO3-). Mas, para que este possa ser utilizado, é necessário que seja reduzido a amônio (NH4+) (OLIVEIRA, 2010). Para que ocorra a redução do nitrato em nitrito e finalmente em amônio, é necessário a atuação das enzimas RN e RNi respectivamente, que em condições de déficit hídrico normalmente apresentam suas atividades comprometidas (DELÚ FILHO et al., 1997). De forma geral, o nitrato absorvido pelas raízes pode ser assimilado nesses órgãos ou nos órgãos aéreos, dependendo da sua disponibilidade e da espécie vegetal (OLIVEIRA et al., 2011). No processo de assimilação, o nitrato é reduzido a nitrito no citosol pela enzima RN, posteriormente, o nitrito é reduzido a amônio nos plastídeos da raiz ou nos cloroplastos das folhas pela enzima redutase do nitrito (TISCHNER, 2000). O amônio absorvido pela raiz ou produzido por assimilação do nitrato, ou ainda originário da fotorrespiração, é convertido nos aminoácidos glutamina e glutamato pela ação sequencial das enzimas glutamina sintetase e glutamato sintase, localizadas no citosol e nos plastídeos das raízes ou nos cloroplastídeos (BECKER et al., 1993), conforme ilustrado na Figura 1. Os aminoácidos gerados pela ação dessas enzimas por sua vez servem de substrato para reações de transaminação, para a produção de todos os outros aminoácidos necessários à síntese de proteínas (TAIZ; ZEIGER, 2004). Para melhorar o suprimento de N para as plantas, a utilização de insumos biológicos em substituição aos insumos químicos industrializados tem sido cada vez mais frequente na agricultura (HUNGRIA et al., 2007). O uso de inoculantes com bactérias fixadoras de nitrogênio do gênero Bradyrhizobium é, atualmente, uma tecnologia indispensável para diversas leguminosas no Brasil. A eficiência desses microrganismos tem possibilitado a obtenção de altos rendimentos de grãos nas culturas, sem a necessidade de aplicação de nitrogênio mineral (ZILLI et al., 2010). 23 Figura 1: Representação esquemática da rota de assimilação do nitrogênio nas raízes e nas folhas de plantas. Fonte: Adaptado de Bredemeier e Mundstock (2000). O gênero Bradyrhizobium é descrito como bactérias do solo que têm a capacidade de infectar o sistema radicular de plantas leguminosas, induzindo a formação de nódulos, para posterior fixação de nitrogênio (MERCANTE et al., 2002). Para a cultura do feijão-caupi, estima-se uma área plantada de 150 mil hectares na região amazônica, e pesquisas têm mostrado resultados positivos para o aumento da produtividade de grãos com a inoculação de bactérias do gênero Bradyrhizobium nas sementes (MARTINS et al., 2013; LACERDA et al., 2004;). Esses trabalhos evidenciam que, a inoculação de estirpes bacterianas são eficientes e capaz de substituir a adubação 24 nitrogenada de até 80 kg ha‑1, na forma de ureia, e aumentar o rendimento de grãos do feijãocaupi em mais de 30%. A interação entre plantas leguminosas e microrganismos é um exemplo de associação biológica, com efeitos benéficos sobre a sustentabilidade da agricultura, pois esta relação está associado ao processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) (SOUZA et al., 2008). A FBN é a capacidade que alguns organismos possuem para dividir a molécula de nitrogênio (N2) e realizar uma combinação com átomos de hidrogênio (H+), formando amônio (NH4+) (ALBINO; CAMPO, 2001), sendo realizada por um grupo distinto de microrganismos, isoladamente ou em simbiose (SOUZA et al., 2008). No caso das leguminosas, bactérias que pertencem ao gênero Bradyrhizobium se associam simbioticamente às plantas, formando estruturas especializadas nas raízes, chamadas nódulos, nos quais ocorre o processo de fixação biológica (HUNGRIA et al., 2007). A FBN é reconhecidamente eficiente em feijão-caupi, que quando bem nodulado, pode crescer independente de outras fontes de N e atingir altos níveis de produtividade (MARTINS et al., 2013). Essa eficiência relacionada a FBN, é devido a sua capacidade de nodular e estabelecer simbiose com variadas espécies de bactérias do grupo rizóbio, incluídos os gêneros Azorhizobium, Burkholderia, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium, entre outros. Contudo, uma baixa especificidade da cultura em relação ao microssimbionte mostra-se limitante à exploração tecnológica da FBN, pois, as bactérias nodulantes estabelecidas no solo, além de ser competitivas e estar em número elevado, apresentam eficiência variável na FBN (MELO; ZILLI, 2009). Além das peculiaridades inerentes ao microssimbionte, também há relatos de que determinados genótipos de feijão‑caupi apresentam maior capacidade de nodulação e eficiência na FBN, o que indica a possibilidade de otimização das respostas quanto à FBN com o uso de cultivares eficientes (SANGINGA et al., 2000). O estudo de modos de ação das rizobactérias responsivos no aumento do crescimento das plantas tem sido o foco de vários trabalhos disponíveis na literatura, entretanto, também é relatado que as rizobactérias podem atuar na tolerância das plantas aos estresses abióticos, como a seca por exemplo, e influenciar nas atividades bioquímicas das mesmas (SOUSA, 2013). Por isso, há a necessidade de constantes pesquisas a fim de avaliar os comportamentos fisiológicos e bioquímicos de diferentes cultivares de feijão-caupi em resposta a inoculação e expostos a seca, visto que algumas cultivares desempenham melhor FBN do que outras. 25 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Localização do experimento O estudo foi realizado na Universidade Federal Rural da Amazônia, campus de Paragominas, Pará, Brasil. O experimento foi realizado no período de 35 dias, compreendidos entre os meses de março a maio de 2013, sendo conduzido em casa de vegetação sob condições de temperatura e umidade controladas, com temperatura variando de 24º a 38º C e a umidade relativa do ar (UR) em torno de 72 a 89%. O fotoperíodo foi de 12 h de luz. 4.2. Sementes e Substrato Neste estudo foram utilizadas sementes de duas cultivares de V. unguiculata, denominadas Pitiúba e Pérola, classificadas como tolerante e sensível ao déficit hídrico, respectivamente (LOBATO et al., 2009b). O substrato utilizado para o crescimento das plantas foi composta por uma mistura de areia e sílica, na proporção de 3:1, respectivamente, sendo esterilizado em autoclave a 120°C atm-1 durante 40 min. Os recipientes utilizados para o crescimento das plantas foram vasos do tipo Leonard com capacidade de 2 L (Figura 2), adaptado pelo Laboratório do Núcleo de Pesquisa Vegetal Básica e Aplicada (NPVBA). Figura 2 – Vaso tipo Leonardo, adaptado pelo NPVBA. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. 26 4.3. Delineamento Experimental O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 2 cultivares (tolerante e sensível à seca), dois regimes hídricos (controle e déficit hídrico), e duas formas de inoculação (inoculado e não inoculado), resultando em 8 tratamentos, com seis repetições, totalizando 48 unidades experimentais, onde cada unidade experimental constou de uma planta por vaso (Figura 3). Figura 3 – Delineamento experimental com 48 unidades e uma planta de feijão-caupi por vaso. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015 4.4. Condução das plantas e Inoculação Foram semeadas três sementes em cada vaso, e 5 dias após a germinação foi realizado o desbaste, restando apenas uma planta por vaso. Para a inoculação das plântulas, foi utilizado 1 ml de suspensão de Bradyrhizobium spp. (BR 3256) com concentração de 1,0 × 109 UFC/ml, aplicado juntamente com a solução nutritiva, a cada cinco dias, em intervalos regulares no 5º, 10º e 15º dia após o inicio do experimento (Figura 4A). Os primeiros 5 dias de experimento, os vasos foram abastecidos apenas com água (sem solução nutritiva) apenas para a germinação das sementes. Nos tratamentos controle e déficit hídrico, as plantas receberam 400 ml de adubação com macro e micronutrientes na forma de solução nutritiva de Hoagland e Arnon (1950), a cada dois dias, durante 30 dias, sempre às 09:00 h (Figura 4B). O pH da solução nutritiva foi ajustado para 6,0 ± 0,1 com adição de HCI (ácido clorídrico) ou NaOH (hidróxido de sódio). 27 Figura 4 – Aplicação do inoculante (A) e adubação com solução nutritiva (B). A B Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. As plantas sob tratamento controle receberam regularmente o suprimento de água e solução nutritiva (Figura 5 A), porém, no 30º dia após o início do experimento, as plantas sob tratamento de déficit hídrico foram submetidos a período de 5 dias sem solução nutritiva, no qual o déficit hídrico foi simulado a partir do 30º dia até o 35º dia após o início do experimento (Figura 5 B). Figura 5 – Plantas de feijão-caupi sob tratamento controle (A) e após 5 dias de déficit hídrico (B). Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. 28 4.5. Mensuração dos Parâmetros Fisiológicos 4.5.1. Conteúdo Relativo de Água na Folha (CRA) Para determinação do Conteúdo Relativo de Água na Folha (CRA) foram, utilizados discos foliares (10 mm de diâmetro) de cada planta, determinando imediatamente a massa dos mesmos (MF1). Para cada planta, foram removidos 40 discos da parte central de folhas escolhidas aleatoriamente. Os discos foram pesados e transferidos para placas de Petri, contendo 35 mL de água destilada que permaneceram a 25o C por um período de 12 h. Após esse período, os discos foram dispostos em papel de filtro para retirar o excesso de água (1 minuto) e em seguida pesados para a determinacao da massa túrgida (MF2). Em seguida, os discos forão colocados em saco de papel e levados a estufa de ventilação forçada de ar a 75o C até massa constante e posteriormente determinada à massa seca dos discos (MS). O CRA foi calculada usando a fórmula descrita por Slavick (1979), conforme descrita abaixo: CRA (%) = MF1 – MS x 100 MF2 – MS Em que: MF1 = Massa fresca; MS = Massa seca; MF2 = Massa túrgida; 4.5.2. Transpiração e Condutância Estomática As taxa de transpiração e os valores de condutância estomática foram avaliados utilizando folhas do terceiro ramo principal, totalmente expandidas e sob luz, com o auxílio de um Analisador de Gás no Infra-Vermelho (IRGA, ADC BioScientific, modelo LC-pro SD), sendo as trocas gasosas avaliadas imediatamente durante o período, sempre nos intervalos entre 10:00 e 12:00 h em todas as plantas do experimento (Figura 6). A radiação fotossintética ativa oscilava entre 530 e 820 µmol m-2 s-1 (às 12:00 h) durante a avaliação de parâmetros fisiológicos. 29 Figura 6 – Determinação da transpiração e condutância estomática com o auxílio de um Analisador de Gás no Infra-Vermelho (IRGA). Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. 4.6. Mensuração dos Parâmetros Bioquímicos 4.6.1. Atividade da enzima Redutase do Nitrato (RN) A enzima redutase do nitrato (EC 1.6.6.1) foi extraída a partir de 500 mg de folha, macerada em nitrogenio líquido para obtenção da materia seca, e incubadas em 5 mL de solução tampão fosfato (KH2PO4 a 0,5 M, pH 7.6) (Figura 7A). Em seguida as amostras foram centrífugadas em centrífuga de bancada a velocidade de 10.000 rpm por 5 minutos. A quantificação da atividade da enzima foi obtida de acordo com o método de Hageman e Hucklesby (1971), utilizando o espectrofotômetro (Bel Photonics, modelo UV-M51) com a absorvância a 540 nm (Figura 7B). 30 Figura 7 – Maceração de material vegetal em nitrogênio líquido para obtenção do extrato enzimático (A) e determinação dos parâmetros bioquímicos em espectrofotômetro (B). Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. 4.6.2. Nitrato, Aminoácidos Solúveis Totais e Prolina Para a determinação do nitrato, aminoácidos solúveis totais e prolina, foram utilizadas 20 mg de matéria seca fina, obtida após a secagem do material vegetal (folhas) em estufa de circulação de ar forçada a temperatura de 65º C por 72 h. Em seguida as amostras foram homogeneizadas em 2 mL de água destilada e aquecidas em banho-maria por 30 minutos à 100º C. As amostras foram centrifugadas em centrífuga de bancada (NOVATECNICA, modelo NT 805) a 5.000 rpm por 5 minutos para a obtenção do extrato. A quantificação do nitrato foi realizada em espectrofotómetro (Bel Photonics, modelo UV-M51), a 410 nm, em conformidade com a metodologia de Cataldo et al. (1975), com KNO3 (Sigma Chemical) como solução padrão. A Quantificação dos aminoácidos solúveis totais foi realizada a 570 nm de acordo com o método de Peoples et al. (1989). A quantificação de prolina foi realizada após a medição da absorvância a 520 nm de acordo com Bates et al. (1973). 4.6.3. Proteínas Solúveis Totais A determinação das proteínas solúveis totais foi realizada, utilizando 500 mg de matéria fresca congelada e tritura em nitogênio líquido para obtenção do material em pó, que foram incubadas com 5 mL de solução de extração tampão fosfato (KH2PO4 a 0,5 M, pH 7.6) e centrifugadas em centrífuga de bancada (NOVATECNICA, modelo NT 805) a velocidade de 10.000 rpm por 4 minutos para a obtenção do extrato. A quantificação de proteínas solúveis totais foi realizada a 595 nm de acordo com Bradford (1976). 31 4.7. Análises Estatísticas Os dados foram submetidos à análise de variância e quando ocorreu diferença significativa, foi aplicado o teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade de erro. Os erros padrão foram calculados em todos os pontos estudados. As análises estatísticas foram realizadas com o software SAS® (SAS Institute, 1996). Os gráficos foram confeccionados com o auxílio do software SigmaPlot® (versão 10.0). 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Conteúdo Relativo de Água na folha (CRA) O déficit hídrico promoveu diminuição significativa no CRA em ambas cultivares tolerante e sensível. A cultivar tolerante à seca apresentou maiores valores de CRA sob déficit hídrico, quando comparada com a cultivar sensível. Para as plantas que receberam tratamento de inoculação, essa redução foi menor em comparação com as plantas que não foram inoculadas (Figura 8). Figura 8 – Conteúdo relativo de água na folha em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. A diminuição dessa variável em resposta ao déficit hídrico, pode ser explicada devido a ocorrência de uma menor disponibilidade de água no substrato (LAWLOR; CORNIC, 2002), pois a deficiência de água induz a perda do turgor e consequente fechamento dos estômatos 32 (NOGUEIRA et al., 1998). Fioreze et al. (2011) também observaram diminuição do CRA em plantas de soja (Glycine max) mantidas em condições de déficit hídrico, quando comparadas com as plantas em tratamento sob irrigação. A inoculação promoveu uma atenuação nos efeitos negativos induzida pela limitação de água sobre o conteúdo relativo de água na folha. Isso evidencia que a bactéria contribuiu positivamente para que a planta possa elevar o seu CRA com mais eficiência, gastando menos tempo e menos energia (GONÇALVES et al., 2012). 5.2. Condutância Estomática A condutância estomática apresentou uma significativa redução em plantas expostas à deficiência hídrica (Figura 9) em ambas cultivares, tolerante e sensível. As plantas inoculadas não apresentaram diferença significativa, quando comparados com os mesmos tratamentos nas plantas não-inoculadas. Os maiores valores de condutância estomática foram encontrados na cultivar tolerante. Figura 9 – Condutância estomática em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. Os resultados evidenciam que o déficit hídrico promoveu uma queda significativa na condutância estomática das duas cultivares, porém, as plantas tolerantes apresentaram valores mais elevados, provavelmente através de uma melhor manutenção de água da planta. Essa 33 redução da condutância estomática pode ser explicado, devido a baixa disponibilidade de água no substrato, que consequentemente produz uma diminuição do potencial hídrico da folha, resultando no fechamento dos estômatos (SANTOS; CARLESSO, 1998). Resultados semelhantes aos encontrados neste estudo foram relatados por Santos et al. (2009), em estudo com cinco genótipos de Phaseolus vulgaris submetidos à deficiência hídrica. 5.3. Transpiração A restrição hídrica produziu uma significativa diminuição da taxa de transpiração nas duas cultivares (Figura 10). As plantas sob tratamento de inoculação não apresentaram diferenças significativas, quando comparadas com plantas não inoculadas. Para a cultivar tolerante submetida ao déficit hídrico, os valores de transpiração foram maiores que os encontrados na cultivar sensível. Figura 10 – Transpiração em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de ScottKnott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. A diminuição da taxa de transpiração em plantas de V. unguiculata pode ser atribuída ao comportamento dos estômatos, que sob condição de déficit hídrico, são mantidos parcialmente fechados, contribuindo para a mudança de comportamento na transpiração das plantas (OLIVEIRA et al., 2005). Leite e Filho (2004) descrevem que a redução das taxas de transpiração, atuam como um importante mecanismo de tolerância a seca. Valores de transpiração demonstram relação direta com a condutância estomática e também com o conteúdo relativo de água na folha. Carvalho et al. (2013) descrevem que as relações entre as 34 células do mesófilo e os estômatos tendem a regular a transpiração da planta e controlar a perda de água para a atmosfera, processo importante em condições de baixa demanda de água a cultura. Semelhantes resultados de diminuição nas taxas de transpiração, foram apresentados por Nogueira et al. (1998) estudando duas cultivares de amendoim (Arachis hypogeae) expostos à deficiência hídrica. Morando et al. (2014) avaliando o efeito do deficit hídrico sobre a cultura da soja (G. max) também observaram diminuição nas taxas de transpiração, semelhantemente a este estudo. 5.4. Atividade da Redutase do Nitrato O déficit hídrico promoveu diminuição significativa na atividade da enzima redutase do nitrato (RN) em ambas cultivares (tolerante e sensível) quando comparada com o tratamento controle (Figura 11). Plantas inoculadas apresentaram redução na RN, em condições de seca, semelhantemente como nas plantas não-inoculadas. Figura 11 – Atividade da enzima redutase do nitrato (RN) em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. A redução da enzima RN durante o déficit hídrico é explicado por Machado et al. (1992), que citam que a escasses de água afeta negativamente o metabolismo do nitrogênio, assim como a enzima RN é extremamente sensível à indisponibilidade de água (COSTA, 1999). Serraj e Sinclair (1996) relataram que várias espécies de leguminosas tropical, tais 35 como V. unguiculata, são parcialmente afetadas pela a restrição de água. Ferreira et al. (2002) também obtiveram menor atividade dessa enzima com deficiência de água em dois genótipos de Zea mays. A menor atividade da RN em plantas inoculadas, pode ser devido o nitrogênio ser absorvidos sob a forma de N2 e transformado NH4+ no processo simbiótico proveniente da fixação de nitrogênio pelas bactérias (GERAHTY, 1992; TAIZ; ZEIGER, 2004), utilizando a enzima nitrogenase (BURRIS, 1999). Além disso, Silveira et al. (2001) descreveram que uma intensa atividade da RN na raiz e / ou nódulos podem compensar a diminuição deste enzima nas folhas. Mas novos estudos serão necessários para compreender os mecanismos de regulação desta via metabólica. 5.5. Nitrato A inoculação produziu um aumento significativo nos teores de nitrato em ambas as cultivares (Figura 12), em relação ao mesmo tratamento sem inoculação. Ambos cultivares não-inoculadas apresentaram menores concentrações de nitrato sob restrição de água em comparação com o tratamento controle. Neste estudo, a concentração de nitrato foi aumentada através da inoculação, e este efeito pode ser considerado indireto. O aumento na concentração de compostos orgânicos, como o nitrato, em plantas inoculadas sob déficit hídrico é uma resposta induzida por diminuição da atividade da enzima RN, pois o nitrato atua como substrato na reação catalisada por esta enzima, sendo ela, portanto, responsável pela redução de nitrato (NO3-) em nitrito (NO2-) (FERREIRA et al, 2002). Em outras palavras, a queda na atividade da RN promove o acúmulo de nitrato orgânico. Silveira et al., (2001) estudando o efeitos do déficit hídrico em plantas de feijão-caupi e inoculadas com estirpes de Bradyrhizobium sp, também atribuem o aumento dos níveis de nitrato à baixa atividade da enzima RN. 36 Figura 12 – Teores de nitrato (NO3-) em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. A redução de nitrato em plantas não-inoculadas e sob seca é associada com o menor assimilação de nitrogênio na forma de nitrato. Resultados semelhantes sobre o aumento de nitrato em folhas foram descritos por Delfini et al. (2010) investigando diferentes tecidos em plantas de A. hypogaea induzidas por inoculação de Bradyrhizobium sp. 5.6. Aminoácidos Solúveis Totais A concentração de aminoácidos solúveis totais em plantas submetidas a inoculação foi maior apenas em plantas tolerantes, em comparação com os mesmos tratamentos nas plantas não-inoculadas (Figura 13). O déficit hídrico promoveu um aumento significativo para esta variável em todos os tratamentos, com exceção para as plantas tolerantes sob inoculação. Plantas tolerantes inoculadas e sob deficiência hídrica, apresentaram aumento na concentração de aminoácidos, e este resultado pode ser atribuída à fixação biológica de nitrogênio. A enzima nitrogenase promove a absorção de nitrogênio na forma de gás nitrogenio (N2) e a conversão em amônio (NH4+). Adicionalmente, o aumento da formação de aminoácidos está provavelmente associado a um incremeto na atividade da enzima glutamina sintetase (GS), que depende de ATP (adenosina-5' trifosfato), e glutamato sintase (GOGAT). Ramos et al. (2005) avaliando a respostas de soja sob déficit hídrico e inoculação com Bradyrhizobium japonicum também observaram um aumento de concentração dos aminoácidos solúveis totais. 37 Figura 13 – Aminoácidos solúveis totais em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. A concentração de aminoácidos solúveis totais em plantas sob déficit hídrico aumentou em todos os tratamentos. Este incremento provavelmente ocorreu devido ao aumento da atividade de enzimas proteases, que são responsáveis pela quebra de proteínas e ajuste osmótico da planta (COSTA et al., 2006). Para plantas tolerantes, este parâmetro foi maior em tratamento inoculado do que não inoculado, no entanto uma tendência oposta foi verificado em plantas sensíveis expostas ao tratamento de não-inoculação e seca, e este fato pode ser explicado pela sensibilidade dessa cultivar sob condição de restrição hídrica. Dados semelhantes sobre aumento de aminoácidos foram obtidos por Costa et al. (1996) investigando plantas de V. unguiculata. Delfini et al. (2010) avaliando a respostas de duas cultivares de A. hypogaea inoculadas com Bradyrhizobium sp. também evidenciaram aumento significativo na concentração de aminoácidos solúveis totais. 5.7. Proteínas Solúveis Totais A deficiência hídrica causou uma diminuição significativa nas concentrações de proteínas solúveis totais em ambas cultivares, em comparação com o tratamento controle, tanto para as plantas inoculadas como não inoculadas. A diminuição foi mais expressiva em plantas sensíveis (Figura 14). 38 Figura 14 - Proteínas solúveis totais em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. O ligeiro aumento nas concentrações de proteínas solúveis totais observados nas plantas sensíveis inoculadas, sugere que a ação de bactérias resultou em aumento no suprimento de nitrogênio por meio de uma via secundária, que é regulada pela nitrogenase, pois já que não houve aumento da atividade da enzima RN após correspondente inoculação neste estudo. Hristozkova et al. (2006) avaliando respostas de plantas de P. sativum sob inoculação e aplicação de molibdênio também obtiveram um aumento nos níveis de proteína. A diminuição nos níveis de proteína promovido pela deficiência de água está associada com uma diminuição da síntese de proteínas combinado com um aumento de enzimas proteolíticas, responsável pela quebra de proteínas solúveis em plantas (LECHINOSCHI et al., 2007). Costa (1999) obteve semelhantes resultados ao estudar plantas de V. unguiculata submetidas ao déficit hídrico. 5.8. Prolina Para os teores de prolina, as plantas inoculadas apresentaram aumentos significativos, em comparação com os mesmos tratamentos em plantas não-inoculado (Figura 15). As duas cultivares apresentaram valores superiores sob limitação de água, em comparação com os respectivos controles. 39 Figura 15 – Teores de Prolina em duas cultivares contrastantes de V. unguiculata em condições de déficit hídrico e submetidas a inoculação. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam os desvios padrão. Fonte: Barbosa e Barbosa, 2015. O aumento dos níveis de prolina induzido pela inoculação está provavelmente ligado a uma melhor utilização dos aminoácidos, tais como ácido glutâmico e arginina, sendo o ácido glutâmico, o precursor da prolina, enquanto arginina podem sofrer de uma reação mediada pela enzima pyrrolline-5-carboxilato de redutase (P5CR) e consequentemente liberação de prolina (RAMOS et al., 2005). Kohl et al. (1991) também observaram maiores quantidades de prolina em plantas de G. max inoculadas com B. japonicum, corroborando com este estudo. O aumento dos teores de prolina em plantas sob déficit hídrico é uma resposta à perda de turgescência celular (OLIVEIRA et al., 2006). Nogueira et al. (1998) afirmaram que o acúmulo de prolina está relacionado à tolerância à seca em plantas superiores, atuando como agente osmoregulator para manter a água nos tecidos vegetais (MUCHOW;CARBERRY, 1993). Comportamento semelhante foi descrito por Gonzalez et al. (1998), trabalhando com plantas P. sativum sob restrição hídrica. 40 6. CONCLUSÃO Esta investigação revelou que o déficit hídrico promoveu impactos negativos em plantas de V. unguiculata, em todos os parâmetros fisiológicos avaliados, tanto na cultivar tolerante como na sensível, sendo a aplicação de inoculante ineficiente para amenizar o efeito da seca sobre essas variáveis (CRA, Condutância Estomática e Transpiração). O déficit hídrico promoveu diminuição em dois parâmetros bioquímicos, tais como atividade da enzima redutase do nitrato e nos níveis de proteínas solúveis totais, sendo este comportamento observado em ambas cultivares. A inoculação com Bradyrhizobium spp. promoveu aumentos nos níveis de compostos nitrogenados sob condições de déficit hídrico, tais como nitrato e prolina, em comparação com os mesmos tratamentos em plantas não-inoculadas. Esta investigação confirmou a hipótese de que a inoculação promove uma melhor assimilação do nitrogênio e ajustamento osmótico em plantas de V. unguiculata. 41 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBINO, U. B.; CAMPO, R. J. Efeito de fontes e doses de molibdênio na sobrevivência do Bradyrhizobium e na fixação biológica de nitrogênio em soja. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 36, p. 527-534, 2001. ALMEIDA, A. L. G. et al. Produtividade do feijão-caupi cv BR 17 Gurguéia inoculado com bactérias diazotróficas simbióticas no Piauí. Revista Brasileira de Ciências Agrárias, v. 5, p. 354-359, 2010. ALVES, J. M. A. et al. Avaliação agroeconômica da produção de cultivares de feijão-caupi em consórcio com cultivares de mandioca em Roraima. Revista Agroambiente, v. 3, p. 1530, 2009. ATKINSON, N. J.; URWIN, P. E. The interaction of plant biotic and abiotic stresses: from genes to the field. Journal of Experimental Botany, v. 63, p. 3523-3543, 2012. BAJJI, M.; LUTTS, S.; KINET, J. M. 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