análise bioclínica, clínica e molecular da região codificadora do

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
GEISON LUIZ COSTA DE CASTRO
ANÁLISE BIOCLÍNICA, CLÍNICA E MOLECULAR DA REGIÃO
CODIFICADORA DO DOMÍNIO FORKHEAD DO GENE FOXE1 EM
PACIENTES COM HIPOTIREOIDISMO CONGÊNITO
BELÉM
2011
GEISON LUIZ COSTA DE CASTRO
ANÁLISE MOLECULAR DA REGIÃO CODIFICADORA DO DOMÍNIO
FORKHEAD DO GENE FOXE1 EM PACIENTES COM
HIPOTIREOIDISMO CONGÊNITO
Trabalho de Conclusão de
Curso
apresentado
à
Faculdade de Biomedicina da
Universidade federal do Pará,
como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva
Co-orientador: Prof. MsC. Erik Artur Cortinhas Alves
BELÉM
2011
GEISON LUIZ COSTA DE CASTRO
ANÁLISE MOLECULAR DA REGIÃO CODIFICADORA DO DOMÍNIO
FORKHEAD DO GENE FOXE1 EM PACIENTES COM
HIPOTIREOIDISMO CONGÊNITO
Trabalho de Conclusão de
Curso
apresentado
à
Faculdade de Biomedicina da
Universidade federal do Pará,
como requisito parcial para a
obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina, aprovado com
o conceito _______________.
Belém, 15 de dezembro de 2011.
Banca Examinadora:
_______________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva
ICB - UFPA
(Orientador)
_______________________________________
Prof. Dra. Rita de Cássia Mousinho Ribeiro
ICB - UFPA
_______________________________________
Prof. Dr. Nazário de Souza Messias Junior
ICB - UFPA
_______________________________________
Prof. Msc. Isabel Cristina Souza Neves (Suplente)
ICS - UFPA
i
Aos meus pais pelo apoio, incentivo e confiança.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, que tornou tudo possível e me deu forças para continuar nas horas mais
difíceis.
À minha família, que sempre esteve ao meu lado em todos os momentos, sempre
acreditando em mim e me incentivando de todas as formas.
Ao Prof. Dr. Luiz Carlos Santana da Silva pela oportunidade de realizar este trabalho
e pela orientação no mesmo.
Ao Prof. MsC. Erik Artur Cortinhas Alves pelo apoio e interminável paciência que
tornaram a realização deste trabalho possível.
Aos meus professores da graduação, que iluminaram o meu caminho para esta
realização.
Aos amigos do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo pelos bons momentos.
Aos amigos de turma Ana Paula Gomes, Bárbara Brasil e Felipe Tuji pelo
interminável apoio durante os anos de graduação.
A todos que de alguma forma contribuiram para a realização deste trabalho.
iii
RESUMO
O hipotireoidismo congênito é uma doença endócrina de origem genética
caracterizada por defeitos na síntese ou ação dos hormônios tireoidianos T3 e T4.
Acomete 1:3000 a 1:4000 recém-nascidos em regiões iodo-suficientes e a principal
causa de retardo mental reversível na infância. Quando não tratado, a doença leva a
uma grave deficiência mental, acompanhada de vários outros sintomas, com
variação de paciente para paciente. A disgenesia tireoidiana é a causa mais comum
do hipotireoidismo congênito e, em geral, causada por mutações com padrão de
herança complexa em genes relacionados com o desenvolvimento embrionário da
tireóide, sendo os principais candidatos os genes PAX8, TTF1 e FOXE1. O gene
FOXE1 localiza-se no locus 9q22 e possui apenas um único éxon que codifica a
proteína TTF2, que se expressa em vários tecidos durante a embriogênese. O TTF2
é um fator de transcrição que contém uma região com vários resíduos de alanina e
um domínio forkhead, através do qual ela se liga aos seus genes-alvo, ativando sua
transcrição. Mutações inativadoras levam à síndrome de Bamforth-Lazarus,
caracterizada por diversas anormalidades congênitas em tecidos onde há expressão
do FOXE1. Este trabalho teve como objetivo a identificação de possíveis mutações
presentes em pacientes com hipotireoidismo congênito no gene FOXE1, avaliando
se existe relação entre o genótipo alterado e o fenótipo bioquímico. Foi coletado
sangue de 109 pacientes com hipotireoidismo congênito e 100 indivíduos controle,
seguido por extração de DNA pelo método do fenol-clorofórmio. Amplificação da
região codificadora do domínio forkhead do gene TTF2 foi feita através de PCR e a
busca por mutações através de seqüenciamento direto. Entretanto, não foi
encontrada alteração em nenhum dos 209 indivíduos estudados, o que está de
acordo com estudos semelhantes.
Palavras-chave: FOXE1, TTF2, hipotireoidismo, disgenesia, Bamforth-Lazarus.
iv
ABSTRACT
Congenital hypothyroidism is an endocrine disease with genetic origin characterized
by defects in the synthesis or action of the thyroid hormones T3 and T4. Affects
1:3000 to 1:4000 newborns in iodine sufficient areas and is the main cause of
reversible mental retardation in childhood. When untreated, the disease leads to a
severe mental deficiency, accompanied by various symptoms, with variation from
patient to patient. Thyroid dysgenesis is the most common cause of congenital
hypothyroidism and usually caused by mutations with complex inheritance pattern in
genes related to the embryonic development of thyroid, being the main candidates
the PAX8, TTF1 and TTF2 genes. The FOXE1 gene is located in the 9q22 locus and
has only one exon that encodes the TTF2 protein, which is expressed in various
tissues during embryogenesis. TTF2 is a transcription factor which has a region with
various alanine residues and a forkhead domain, through which it binds to its target
genes, activating their transcription. Inactivating mutations lead to the BamforthLazarus syndrome, characterized by several congenital anomalies in the tissues
which have FOXE1 expression. This study aimed to the identification of possible
mutations present in pacients with congenital hypothyroidism in the FOXE1 gene,
estimate if there is a relationship between the altered genotype and biochemical
fenotype. Blood samples were collected from 109 pacients with congenital
hypothyroidism and 109 control subjects, followed by DNA extraction by phenolchloroform method. The amplification of the encoding region of the forkhead domain
of TTF2 protein was made by PCR and the molecular screening by direct
sequencing. However, there were no alterations in any of the 209 studied subjects,
which is consistent with similar studies.
Key words: FOXE1, TTF2, hipothyroidism, dysgenesis, Bamforth-Lazarus.
v
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPc - Adenosina monofosfato cíclico
ATP - Adenosina tri-fosfato
DAG - Diacilglicerol
DIT - Diiodotirosina
DPHC - Deficiência pituitária hormonal combinada
DT - Disgenesia tireoidiana
DUOX - Dual oxidase
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético
FOXE1 - Forkhead Box E1
FSH - Hormônio folículo estimulante
FT - Folículo tireoidiano
GDP - Guanosina di-fosfato
GTP - Guanosina tri-fosfato
H2O2 - Peróxido de oxigênio
HC - Hipotireoidismo congênito
I - Iodo
I- - Íon iodeto
I0 - Iodo orgânico
IP3 - 1,4,5-tri-fosfato
LH - Hormônio luteinizante
MIT - Monoiodotirosina
NIS - Simportador sódio/iodeto
O2 - Oxigênio
PAX8 - Paired box 8
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PIP2 - 4,5-bi-fosfato
PKA - Proteína cinase A
PKC - Proteína cinase C
rT3 - Triiodotironina reversa
SNC - Sistema nervoso central
T2 - Diiodotironina
T3 - 3,5,3’-triiodoitironina
T4 - 3,5,3’,5’-tiroxina
TG - Tireoglobulina
TPO - Tireoperoxidase
TR - Receptor de HT
TRE - Elemento de resposta aos HT
TRH - Hormônio liberador da tireotrofina
TSH - Hormônio estimulante da tireóide
TSHR - Receptor de TSH
TTF1 - Fator de transcrição da tireóide 1
TTF2 - Fator de transcrição da tireóide 2
UREMIA - Unidade de Referência Especializada Materno-Infantil e do Adolescente
do Estado do Pará
vi
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 01
1.1 TIREÓIDE .................................................................................................... 01
1.1.1 Anatomia .................................................................................................. 01
1.1.2 Histologia ................................................................................................. 02
1.1.3 Fisiologia.................................................................................................. 04
1.1.3.1 Síntese e secreção de T3 e T4 ................................................................ 04
1.1.3.2 Regulação da função tireoidiana ............................................................ 06
1.1.3.3 Transporte plasmático, captação e ação celular .................................... 09
1.1.3.4 Efeitos no organismo .............................................................................. 11
1.1.4 Desenvolvimento embrionário ............................................................... 11
1.2 HIPOTIREOIDISMO CONGÊNITO .............................................................. 13
1.2.1 Triagem neonatal . ................................................................................... 14
1.2.2 Prevalência .......... ................................................................................... 15
1.2.3 Sintomas .............. ................................................................................... 15
1.2.4 Diagnóstico .......... ................................................................................... 16
1.2.4.1 Clínico ................ ................................................................................... 16
1.2.4.2 Laboratorial ........ ................................................................................... 16
1.2.4.3 Etiológico ............ ................................................................................... 17
1.2.5 Tratamento ........... ................................................................................... 17
1.2.6 Classificação ....... ................................................................................... 18
1.2.6.1 O gene FOXE1 ... ................................................................................... 19
2 JUSTIFICATIVA.......... ................................................................................... 22
3 OBJETIVOS ................ ................................................................................... 23
3.1 GERAIS .................... ................................................................................... 23
3.2 ESPECÍFICOS ......... ................................................................................... 23
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 24
4.1 AMOSTRA................ ................................................................................... 24
4.2 EXTRAÇÃO DE DNA ................................................................................... 25
4.3 AMPLIFICAÇÃO DO GENE FOXE1 ............................................................ 25
4.4 SEQUENCIAMENTO DIRETO ..................................................................... 27
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 27
5 RESULTADOS ............ ................................................................................... 28
5.1 ANÁLISE BIOQUÍMICA DOS PACIENTES COM HC .................................. 28
5.1 ANÁLISE CLÍNICA DOS PACIENTES COM HC.......................................... 28
5.3 ANÁLISE MOLECULAR DA REGIÃO CODIFICADORA DO DOMÍNIO
FORKHEAD DO GENE FOXE1 ......................................................................... 29
6 DISCUSSÃO ............... ................................................................................... 30
7 CONCLUSÃO ............. ................................................................................... 34
REFERÊNCIAS .............. ................................................................................... 35
ANEXO I......................... ................................................................................... 41
ANEXO II........................ ................................................................................... 44
ANEXO III....................... ................................................................................... 45
ANEXO IV ...................... ................................................................................... 46
vii
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 01 - Glândula Tireóide ........................................................................ p. 02
Figura 02 - Folículos Tireoidianos ................................................................. p. 03
Figura 03 - Síntese e secreção de HT ........................................................... p. 06
Figura 04 - Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide ................................................ p. 07
Figura 05 - Sinalização do TSHR .................................................................. p. 08
Figura 06 - Desiodações do T4 ...................................................................... p. 09
Figura 07 - Captação e ação dos hormônios tireoidianos ............................. p. 10
Figura 08 - Organogênese da Tireóide .......................................................... p. 13
Figura 09 - Desenho esquemático da determinação dos primers. A região em
destaque é a que codifica o domínio forkhead ............................................... p. 25
Gráfico 01 - Freqüências dos sintomas encontrdos ...................................... p. 29
Quadro 01 - Primers ...... ............................................................................... p. 26
Quadro 02 - Concentrações dos reagentes para cada protocolo de PCR ..... p. 26
Tabela 01 - Valores médios da dosagem de TSH e T4L ................................ p. 28
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 TIREÓIDE
A glândula tireóide é responsável pela síntese, armazenamento e
secreção dos hormônios tireoidianos (HT) 3,5,3’-triiodotironina (T3) e 3,5,3’,5’-tiroxina
(T4), que apresentam função importante no desenvolvimento, crescimento e
metabolismo do organismo através da regulação da taxa metabólica corporal,
principalmente na utilização do oxigênio (O2) (Aires, 2008).
1.1.1 Anatomia
A tireóide é constituída por dois lobos laterais unidos por um istmo estreito
e ocorre, freqüentemente, a presença do lobo piramidal, que se projeta para cima a
partir do istmo, normalmente à esquerda da linha mediana (Snell, 2000). A glândula
pesa entre 15 e 25 g, e cada lobo mede em torno de 2 a 2,5 cm de largura e 3 a 5
cm de comprimento com o lobo direito sendo ligeiramente maior que o esquerdo
(Aires, 2008).
Os lobos apresentam ápice voltado para cima, até a linha oblíqua da
cartilagem tireóidea e a base situada abaixo do 4º ou 5º anel traqueal e o istmo se
estende pela linha mediana na frente dos 2º, 3º e 4º anéis traqueais. A glândula
apresenta se localiza entre as vértebras C5 e T1. A margem posterior de cada lobo
se relaciona com as glândulas paratireóides (Snell, 2000).
Uma faixa fibrosa ou muscular freqüentemente une o lobo piramidal ao
osso hióide. Se a faixa é muscular recebe a denominação de músculo levantador da
tireóide (Snell, 2000). É ligada por tecido conjuntivo à cartilagem cricóide e aos anéis
traqueais superiores (Moore & Agur, 2002).
A glândula é circundada por uma bainha derivada da lâmina pré-traqueal
da fáscia cervical profunda, que prende a glândula à laringe e à traquéia (Snell,
2000).
2
A tireóide é um órgão altamente vascularizado, irrigado pelas artérias
tireóideas superiores e inferiores, ramos das artérias carótida e do tronco
tireocervical, e a artéria tireóidea ima, que nem sempre está presente e quando está
se origina da artéria braquiocefálica ou do arco da carótida. A drenagem venosa é
feita através das veias tireóideas superior, média e inferior, que drenam o sangue
para a veia jugular. A drenagem linfática é feita principalmente para os linfonodos
cervicais profundos, porém, há vasos que descem para os linfonodos paratraqueais
(Snell, 2000) (Figura 01).
Figura 01 - Glândula Tireóide (Fonte: http://www.jorgebastosgarcia.com.br)
A inervação recebida é oriunda do sistema nervoso autônomo por nervos
simpáticos e parassimpáticos. As fibras simpáticas derivam-se do gânglio cervical,
ao passo que as fibras parassimpáticas, derivadas do nervo vago, são ramificações
do nervo faríngeo (Aires, 2008).
1.1.2 Histologia
A tireóide é composta por aproximadamente três milhões de unidades
funcionais chamadas de folículos tireoidianos (FT). Os FT medem aproximadamente
0,5 mm de diâmetro é formado por células epiteliais cubóides, também chamadas de
tireócitos, que delimitam o lúmen do FT em espaços esféricos compostos por uma
3
substância chamada colóide. As células epiteliais do folículo podem ser do tipo
cúbico ou pavimentoso, com a altura das células indicando a atividade funcional da
tireóide (Ross et al., 1993).
Os tireócitos estão sobre uma fina lâmina basal. A porção basal da célula
é rica em reticulo endoplasmático granular, com uma quantidade moderada de
mitocôndrias. A porção apical possui uma quantidade discreta de complexos de
Golgi bem desenvolvidos e apresenta grânulos com característica do colóide
folicular, além de lisossomos e vacúolos de aspecto claro. O núcleo possui uma
localização central e há normalmente um ou mais de um nucléolo proeminente
(Ross et al., 1993) (Figura 02).
Figura 02 - Folículos Tireoidianos (Fonte:http://projetonucleocatireoide.blogspot.com)
A glândula é envolta por uma cápsula de tecido conjuntivo derivado da
fáscia cervical profunda que envia septos para o parênquima glandular, que vão se
ficando mais delgados e gradualmente atingem todos os FT, separando-os em
agrupamentos de 30 a 40 FT chamados lóbulos, abrindo caminho para os vasos
sanguíneos, linfáticos e fibras nervosas (Junqueira & Carneiro, 2008). Este tecido
conjuntivo é constituído por fibras reticulares e uma significativa rede de capilares
linfáticos e capilares sanguíneos fenestrados, que facilitam a passagem dos
hormônios para os vasos. O espaço extrafolicular também é constituído por células
claras, as chamadas células parafoliculares ou células C, que secretam o hormônio
calcitonina, cujo efeito sistêmico é a redução da calcemia (Junqueira & Carneiro,
2008).
4
1.1.3 Fisiologia
1.1.3.1 Síntese e secreção de T3 e T4
O iodo (I) possui um papel de extrema importância na síntese dos
hormônios tireoidianos. É adquirido através da alimentação, sendo convertido no íon
iodeto (I-) pela microbiota intestinal, que é amplamente absorvido pelo intestino
delgado, com pouca quantidade sendo eliminada pelas fezes. O I- na circulação é
absorvido pelos tireócitos através do simportador sódio/iodeto (NIS, de natrium
iodine symporter), que realiza o transporte ativo de I- contra um gradiente
eletroquímico, pois o I- é cerca de 30 vezes mais concentrado no meio intracelular
(Guyton, 2006). A proteína localiza-se na porção basal do tireócito e o processo de
simporte se dá na proporção de dois íons Na+ a favor do gradiente de concentração
para um íon I- contra o seu gradiente (Koeppen & Stanton, 2009).
No meio intracelular, o iodeto se difunde em direção à porção apical da
célula e alcança o lúmen do FT através de uma proteína localizada na porção apical
da membrana plasmática que atua como transportador de ânions chamado pendrina
(Koeppen & Stanton, 2009).
No lúmen do FT, o iodeto é oxidado pela enzima tireoperoxidase (TPO),
também localizada na porção apical do tireócito (Koeppen & Stanton, 2009). O
processo é catalisado pelo peróxido de hidrogênio (H2O2), que atua como doador de
O2 (Aires, 2008) e é produzido pelas enzimas dual oxidases (DUOX), também
localizadas na porção apical do tireócito e possuem atividade NADPH oxidase.
Paralelamente, a TG, precursora dos HT é traduzida como na sua forma
pré-proteína como um monômero e passa por várias modificações pós-traducionais
até ser dimerizada e então liberada no lúmen (Targovnik et al., 2011).
Depois de oxidado, o iodo orgânico (I0), através de um processo de
iodação catalizado pela TPO, é incorporado aos resíduos de tirosina da TG (Guyton
& Hall, 2006). Quando uma molécula de I0 é incorporada ao resíduo de tirosina é
formada uma monoiodotirosina (MIT) e quando ocorre a incorporação de duas
moléculas de I0 é formada uma diiodotirosina (DIT) (Koeppen & Stanton, 2009).
5
Ainda quando ligadas à TG, iodotirosinas se acoplam. Ocorrendo o
acoplamento de MIT com DIT, ocorre a formação de T3 ou triiodotironina reversa
(rT3), que diferem entre si quanto à posição de iodação, ao passo que o
acoplamento de duas MIT leva à formação de T4. Outra situação que pode ocorrer é
o acoplamento de duas MIT, o que leva à formação de diiodotironina (T2), que assim
como rT3 não apresenta efeito conhecido no organismo (Aires, 2008).
O próximo passo é a captação do colóide pelo tireócito pelo processo de
pinocitose. Por ação do hormônio estimulante da tireóide (TSH), ocorre a formação
de pseudópodes na membrana apical do tireócito, levando à captação do colóide
(Guyton & Hall, 2006). Este processo é mediado pela megalina, proteína similar ao
receptor de colesterol de baixa densidade localizada na face lumiar da membrana
apical do tireócito (Koeppen & Stanton, 2009). No interior da célula, ocorre a fusão
das vesículas de colóide com lisossomos, formando os endossomos, levando à
hidrólise da TG e eventual liberação de MIT, DIT, T2, T3, rT3 e T4 (Aires, 2008), com
apenas pequenas quantidades de TG intactas sendo liberadas na circulação,
mesmo sob circunstâncias normais (Koeppen & Stanton, 2009).
Sendo MIT e DIT moléculas biologicamente inativas, ocorre a retirada do
iodo delas pela ação das desalogenases, que atuam especificamente nestas
moléculas. Ainda no tireócito, parte de T4 é convertida em T3 por ação enzimática da
5’-desiosidase. O I- removido de MIT, DIT e T4 é reutilizado em uma nova síntese
hormonal. Os hormônios são secretados pelo tireócito através de difusão pela
porção basal da célula e atingem a rede de capilares, sendo distribuídos pelo
organismo (Aires, 2008) (Figura 03).
6
Figura 03 - Síntese e secreção de HT (Fonte: Guyton & Hall, 2006)
A tireóide é a única glândula endócrina que apresenta a capacidade de
armazenar seu produto de excreção. Os HT são armazenados nos FT ligados à
molécula de TG em uma quantidade suficiente para suprir o organismo por dois ou
três meses depois de cessada a síntese hormonal. Desta forma, somente depois
deste tempo que os efeitos da interrupção da síndrome hormonal são sentidos
(Guyton & Hall, 2006).
1.1.3.2 Regulação da função tireoidiana
A função da tireóide é regulada através de mecanismos intrínsecos e
extrínsecos. O mecanismo de regulação de controle intrínseco é realizado através
da disponibilidade de I- no tireócito, sendo a síntese hormonal diminuída em
escassez ou excesso de ingestão de I-. Os efeitos da escassez se dão pela ausência
de I- para a iodação da TG, ao passo que em níveis muito altos do íon, a atividade
das NADPH oxidases e a transcrição dos genes do NIS e da TPO são reprimidas,
resultando em uma baixa na síntese hormonal. Entretanto com a normalização dos
7
níveis de I- a síntese hormonal também é normalizada. Este processo é chamado de
efeito Wolff-Chaikoff (Koeppen & Stanton, 2009).
O principal meio regulador da função tireoidiana é o eixo hipotálamohipófise-tireóide. O hormônio liberador da tireotrofina (TRH) liberado pelo hipotálamo
chega à hipófise via sistema porta hipotálamo-hipófise e estimula a secreção de TSH
através da sua ação sobre os receptores dos tireotrofos da adeno-hipófise. A
secreção de TSH também é regulada pelos níveis plasmáticos dos HT livres, de
forma que níveis elevados de T3 e T4 diminuem a síntese de TSH, assim como
níveis baixos dos HT aumentam a secreção de TSH para compensar o déficit
hormonal. A hipófise é capaz de desiodar T4 em T3, que por sua vez agirá como
molécula efetora no bloqueio da secreção do TSH (Koeppen & Stanton, 2009).
(Figura 04).
Figura 04 - Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide (Fonte: http://shalwediscuss.com)
O TSH age o tireócito através de sua ação no receptor de TSH (TSHR),
localizado na membrana celular, ativando vias de sinalização por intermédio da
ativação das proteínas Gs e Gq, acopladas ao receptor. A ativação do receptor
promove a substituição da molécula de guanosina di-fosfato (GDP) ligada à
8
subunidade α de ambas as proteínas G por guanosina tri-fosfato (GTP), levando à
dissociação desta subunidade.
A subunidade α da proteína Gs promoverá a ativação da enzima
adenililciclase, que estimula a conversão de adenosina tri-fosfato (ATP) a adenosina
monofosfato cíclico (AMPc), que por sua vez ativará a proteína cinase A (PKA). A
subunidade α da proteína Gq, por sua vez, levará à ativação da fosfolipase C, que
estimulará a conversão de fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP2) para 1,4,5-trifosfato
(IP3) e diacilglicerol (DAG), levando à liberação de cálcio intracelular e a ativação da
proteína cinase C (PKC), respectivamente (Aires, 2008) (Figura 05).
Figura 05 - Sinalização do TSHR. (Fonte: HTTP://www.hotthyroidology.com)
O TSH estimula a expressão de proteínas envolvidas na síntese
hormonal, proteólise da TG, captação de I-, a endocitose do colóide e a liberação
dos HT pela glândula. O TSH também promove hipertrofia e hiperplasia das células
foliculares, aumentando também o número de capilares e o fluxo sanguíneo
(Koeppen & Stanton, 2009).
9
1.1.3.3 Transporte plasmático, captação e ação celular
Pouca quantidade dos HT se encontra na forma livre do plasma, estando
em sua maioria ligado a proteínas transportadoras. Entretanto, apenas em sua forma
livre os HT promovem sua ação fisiológica nos tecidos periféricos, sendo a porção
ligada às proteínas forma de armazenamento dos HT secretados (Aires, 2008).
Os HT entram nas células através da ação de vários tipos de
transportadores, como os transportadores de ânions orgânicos e transportadores de
aminoácidos (Aires, 2008).
Apesar de que aparentemente apenas o T3 possui atividade biológica nos
tecidos periféricos, a maior parte dos HT secretados pela tireóide está na forma de
T4 com pouca quantidade de T3 sendo secretada. Entretanto, nos tecidos periféricos,
grande parte do T4 é desiodado em T3, produzindo 80% da quantidade total deste.
Dependendo da posição do I- retirado do T4, o processo de desiodação pode originar
tanto T3, se o I- retirado for do anel externo do T4, como rT3 , se a retirada for no anel
interno. Quase toda a quantidade de rT3 é produzida desta forma (Aires, 2008)
(Figura 06).
Figura 06 - Desiodações do T4 (Fonte: Meyer et al., 2007)
Apesar de não haver ainda mecanismos descritos, existem evidências
que apontam para uma atividade biológica do T4 (Koeppen & Stanton, 2009).
10
O T3 liga-se
se aos receptores de HT (TR),
(T ), que se encontram ligados a
regiões específicas de DNA chamadas elementos de resposta aos HT (TRE), com
função de fatores de transcrição (Aires, 2008).
O TR se liga ao TRE independente da presença de T3. O TRE contém
dois hemissítios com a seqüência nucleotídica AGGTCA, que podem estar na forma
de repetições diretas um do outro, palíndromos reversos ou sítios únicos,
dependendo do tipo celular. Na ausência do T3, dois TR formam um homodímero
que se liga aos hemissítios
hemissíti do TRE, levando à repressão da transcrição, através da
ação de proteínas co-regulatórias
regulatórias que promoverão a desacetilação das histonas,
compactando
do a cromatina.
cromatina
Na presença do T3, é formado um heterodímero TR-T
TR 3, que levará à
desativação do processo de repressão, ocorrendo a ação de proteínas coco
ativadoras, promovendo a acetilação das histonas e, conseqüentemente,
conseq
o
afrouxamento da cromatina e o acesso de fatores transcricionais (Zhang & Lazar,
2000),, estimulando a transcrição de genes-alvo,
genes
como os que codificam enzimas
relacionadas ao metabolismo de carboidratos, lipídeos e proteínas, assim como o
próprio TSH e o TR (Koeppen & Stanton, 2009) (Figura 07).
Figura 07 - Captação e ação dos hormônios tireoidianos (Fonte: Guyton & Hall, 2006)
11
1.1.3.4 Efeitos no organismo
O efeito geral dos HT sobre o organismo é o aumento da atividade
funcional do corpo, levando a um maior consumo de O2 e aumento da temperatura
corporal (Aires, 2008).
Ao nível celular os HT aumentam a atividade metabólica celular,
estimulando o metabolismo protéico, lipídico e de carboidratos (Guyton & Hall,
2006). Ocorre também o aumento no número e tamanho de mitocôndrias (Koeppen
& Stanton, 2009).
No organismo, os HT apresentam efeitos estimulatórios nos sistemas
respiratório, cardiovascular, renal, muscular, ósseo, endrócrino e no sistema nervoso
central (SNC) (Koeppen & Stanton, 2009).
No SNC, os HT induzem a expressão de genes importantes para a função
neuronal, como os das proteínas básicas da mielina, do fator neurotrópico e
proteínas envolvidas a adesão e migração de células neurais. No geral, os HT
promovem uma estimulação geral do SNC (Koeppen & Stanton, 2009).
1.1.4 Desenvolvimento Embrionário
O intestino primitivo, logo após sua formação, tem um formato amorfo e
apresenta uma cavidade cilíndrica, cuja superfície interior é revestida por uma
camada de células com características epiteliais. Subseqüentemente, ocorre a
invaginação de vários brotos ao longo do seu comprimento, cada um levando à
formação de um dos órgãos derivados do intestino primitivo (Parlato et al., 2004). A
diferenciação morfológica é conseqüência da expressão de fatores de transcrição
específicos para cada órgão que através da ativação de genes-alvo, levará a
formação dos órgãos específicos (Parlato et al., 2004).
A tireóide é a primeira glândula endócrina a surgir no embrião humano
(Aires, 2008). Por volta da 3ª semana de desenvolvimento, ocorre um espessamento
endodérmico mediano no assoalho da faringe primitiva entre a primeira e a segunda
bolsas branquiais (Aires, 2008). Este espessamento logo forma uma projeção para
baixo chamada divertículo tireoidiano (Moore & Persaud, 2008), que abriga as
12
células do primórdio tireoidiano (Fagman & Nilsson, 2010), que migram
caudalmente. O divertículo tireoidiano se mantém ligado à base da língua através do
duto tireoglosso (Moore & Persaud, 2008).
As células do primórdio tireoidiano se distinguem das demais células
endodérmicas pela expressão combinada dos fatores de transcrição: Fator de
transcrição da tireóide 1 (TTF1), Fator de transcrição da tireóide 2 (TTF2) e Paired
Box 8 (PAX8) (Fagman & Nilsson, 2010). Estes fatores são conectados por uma
rede regulatória integrada (Parlato et al., 2004).
Na 7ª semana, a tireóide primitiva passa por uma expansão bilateral, que
originará os lobos esquerdo e direito, com a porção mediana remanescendo como o
istmo (Fagman & Nilsson, 2010). O divertículo tireoidiano atinge sua posição
definitiva: a região anterioinferior do pescoço abaixo da cartilagem cricóide,
anteriormente ao segundo e o terceiro anéis traqueais, com a degeneração do duto
tireoglosso, cuja abertura proximal dará origem ao forame cego. Em alguns casos, a
extremidade do duto tireoglosso não se degenera, originando, o lobo piramidal, que
se liga ao osso hióide (Moore & Persaud, 2008). Neste mesmo período, o primórdio
tireoidiano recebe células da bolsa ultimobranquial, derivadas da crista neural, que
se diferenciarão nas células C (Sadler, 2005).
No início, o primórdio tireoidiano consiste em uma massa sólida de
células endodérmicas. Este agregado celular é posteriormente dividido em uma rede
de cordões epiteliais, pela invasão de tecido conjuntivo (Moore & Persaud). Na 10ª
semana, os cordões se dividem em pequenos grupos celulares. Em seguida a
massa celular se diferencia e adquire aspecto folicular (Garcia & García, 2001). Na
11ª semana já pode ser detectada a formação de colóide e a detecção de T4 pode
ser feita na 12ª semana (Moore & Persaud, 2008) (Figura 08).
13
Dias Embrionários
20-24
50
60
70
Diferenciação
84
Endoderme
Início da
Proliferação e união
Glândula
da faringe
Migração
com as células da crista
Tireóide
neural
funcional
TTF1
TTF2
PAX8
TSHR
Tg, TPO e NIS
Figura 08 - Organogênese da Tireóide (Fonte: Davies et al. 2005)
1.2 HIPOTIREOIDISMO CONGÊNITO
O hipotireoidismo congênito (HC) é uma doença metabólica causada por
deficiência na síntese e ação dos HT, resultando em redução generalizada de
processos metabólicos (Margotto, 2006). É a causa mais comum de retardo mental
tratável e reversível na infância (Silva et al., 2005). Exceto nos casos de HC central,
a doença é caracterizada por níveis séricos elevados de TSH, em resposta a
redução dos níveis de HT (Montanelli & Tonacchera, 2010).
A deficiência hormonal acarreta em alterações no crescimento e
desenvolvimento dos os recém-nascidos afetados (Margotto, 2006). Dessa forma, o
diagnóstico precoce e o tratamento iniciado nas primeiras semanas de vida são
fundamentais para se evitar o comprometimento neurológico das crianças afetadas
e, na maioria dos casos, propiciar um desenvolvimento intelectual normal (Pezzuti et
al., 2009). Ausência ou atraso no tratamento agrava mais a sintomatologia, podendo
levar a um quadro de cretinismo (Oliveira et al., 2006).
Estudos mostram que os hormônios da tireóide são necessários para o
desenvolvimento cerebral desde o final do primeiro trimestre de gestação. Até a
14
tireóide fetal se tornar totalmente funcional, a fonte mais importante de HT para para
o feto são os hormônios maternos. Após o desenvolvimento da tireóide fetal, os
hormônios maternos são gradualmente substituídos pelos hormônios fetais
(Santisteban & Bernal, 2005).
As manifestações clínicas da doença são escassas e inespecíficas ao
nascimento, surgindo gradativamente ao longo do tempo, especialmente nos três
primeiros meses de vida (Oliveira et al., 2006). Em razão da elevada frequência e da
severidade da doença, foram implantados programas de triagem neonatal, que
visam o diagnóstico tanto do HC quanto de outras doenças genéticas (Margotto,
2006).
1.2.1 Triagem Neonatal
O ano de 1972 marca o início dos programas de triagem neonatal para
HC na América do Norte (Djelmi et al., 2006). Triagem neonatal para o HC foi
estabelecida a nível mundial, começando no Canadá em 1974 e no Reino Unido em
1982 (Park & Chatterjee, 2010). Estudos posteriores apontaram para um aumento
da prevalência de HC após a implementação do programa. (Pezzuti et al., 2009).
No Brasil, em 1990, com a iniciativa de regulamentação estabelecida pelo
Estatuto da Criança e do Adolescente (lei n. 8069/1990) a realização de exames
visando o diagnóstico e tratamento precoce de doenças congênitas tornou-se
obrigatória. Entretanto, nesse período a triagem neonatal era restrita ao diagnóstico
de HC e fenilcetonúria (Oliveira et al., 2006). A implementação do Programa
Nacional de Triagem Neonatal, mediante a Portaria do Ministério da Saúde nº822,
de junho de 2001 (França & Domingos, 2008), tornou possível a inclusão de exames
para a detecção de fibrose cística, doenças falciformes e hemoglobinopatias
(Oliveira et al., 2006).
15
1.2.2 Prevalência
Em regiões iodo-suficientes afeta de 1:3000 a 1:4000 nascidos vivos
(Perone et al., 2004), sendo a mais comum desordem endócrina (Park & Chatterjee,
2010). Estes números se referem somente aos casos de HC permanente. Quando
são considerados os casos de HC periférico e os causados por defeitos no eixo
hipotalâmico-hipofisário, a incidência sobe para 1:1200 nascidos vivos (Moreno,
2003). O sexo feminino é duas a três vezes mais afetado do que o masculino e essa
prevalência é maior ainda em pacientes com síndrome de Down (Perone et al.,
2004).
Dados de 2007 mostram uma prevalência mais alta em indianos (1:1200)
em relação a outras etnias asiáticas, como chineses e vietnamitas (1:2380). Em
ocidentais, a prevalência maior é vista em latinos (1:1600). Na população
caucasiana a prevalência esta na média dos países iodo-suficientes (1:3533). Na
população negra a prevalência é muito baixa, em torno de 1:11000 (LaFranchi,
2011). No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde, a prevalência é de 1:3500
(Oliveira et al., 2006).
1.2.3 Sintomas
O sintoma clássico e mais freqüente é a icterícia prolongada (Oliveira et
al., 2006). Além da icterícia, outros sintomas podem ocorrer, como: fontanela
anterior alargada, macroglossia, distensão abdominal, hérnia umbilical, hipotonia,
choro rouco, perfusão periférica inadequada, bradicardia, diminuição de pressão
arterial, derrame pericárdico, facies mixedematosa, bócio, retardo na maturação
óssea, retardo do crescimento, deficiência mental, sendo este último o sintoma mais
importante (Margotto, 2006).
16
1.2.4 Diagnóstico
1.2.4.1 Clínico
As manifestações clínicas do HC são geralmente escassas ou ausentes,
estando presente em apenas 5% dos recém-nascidos nos primeiros dias de vida. Os
sintomas surgem gradativamente ao longo dos primeiros meses de vida, quando não
tratados precocemente. Assim, o quadro clínico pode se instalar ao final do 1º mês
de vida em 10% dos casos, ao final do 3º mês em 35% dos casos e ao final de 12
meses em 75% dos casos (Margotto, 2006). Esta ausência ou reduzida
apresentação dos sintomas no início da vida podem ser explicadas pela passagem
transplacentária de HT maternos. Ainda sim, o diagnóstico inicial deve ser
inicialmente clínico (Pezzuti et al., 2009).
1.2.4.2 Laboratorial
De acordo com a Portaria GM/MS n° 822, de 06 de jun ho de 2001, o
diagnóstico laboratorial se dá através da dosagem de TSH em amostras de sangue
colhidas em papel filtro, o chamado Teste do Pezinho.
Quando o valor do TSH sérico é superior a 20 uL/L em radioimunoensaio
ou 15 uL/L em ensaios imunométricos é feita a dosagem de T4 para a confirmação
do resultado, que deve ser maior do que 6 ug/dL. Em caso de positividade, deve ser
feita a dosagem em sangue venoso de TSH e porções total e livre de T4. Persistindo
os resultados alterados é confirmado o diagnóstico.
Os níveis de TSH de crianças não-afetadas podem ser mais elevados
durante as primeiras 24 horas de vida devido ao estresse do parto, podendo gerar
diagnósticos falso-positivos. Entretanto, estes níveis geralmente normalizam entre
dois ou três dias. Os programas que testam apenas a T4 apresentam 10% de casos
falsos-negativos, enquanto a dosagem de TSH nas primeiras 48 horas pode levar a
um aumento de casos falsos-positivos. Por isso, deve-se fazer repetição em plasma
(Souza et al., 2002).
17
Agindo desta forma, a média de detecção dos casos suspeitos é de
aproximadamente 90%. Os 10% dos casos restantes são afetados de forma menos
grave e não se tornam detectáveis por dosagem de TSH sérico até a idade de duas
a seis semanas de vida. Qualquer que seja a estratégia escolhida, a triagem pode
perder casos raros de HC, tais como: HC central, doença compensada (com T4
normal e TSH elevado) e aumento tardio de TSH (Margotto, 2006).
1.2.4.3 ETIOLÓGICO
A cintilografia da tireóide é útil para a distinção morfofuncional da etiologia
nos casos de DT (Clerc et al., 2008). Por ser pouco prática, a cintilografia não é
amplamente aplicada na rotina. A ultra-sonografia da tireóide permite a localização e
um exame da morfologia da glândula, sendo bem mais prática do que a cintilografia
(Bettendorf, 2002).
Os anticorpos anti-Tg, antiTPO e anti-TSHR podem ser produzidos pela
mãe em algumas patologias e a sua dosagem também permite um esclarecimento
quanto à etiologia, visto que a presença destes anticorpos foi detectada em casos de
HC transitório (Silva et al., 2005). O teste de estímulo em TRH tem como objetivo
avaliar a integridade do eixo hipotálamo-hipófise-tireóide e auxilia no diagnóstico do
hipotireoidismo central.
1.2.5 Tratamento
Após a repetição do exame em plasma, deve-se iniciar o tratamento o
mais cedo possível com administração oral de levotiroxina. O paciente deve seguir
acompanhamento clinico com um endocrinologista, além de monitoramento
laboratorial com objetivo de manter os níveis de TSH inferiores a 4 mU/mL (Souza et
al., 2002). Se não imediatamente, o tratamento deve ser iniciado preferencialmente
antes do 14º dia de vida do recém-nascido. A dosagem normalmente é de 10 a 15
µg/kg corporal. Durante o primeiro mês de vida os níveis plasmáticos de TSH devem
diminuir, ao passo que os níveis de T4, T3 e rT3 devem entrar na normalidade
18
(Bettendorf, 2002). É importante haver um devido controle da dosagem, pois
reações adversas podem ser observadas em casos de superdosagem e
subdosagem, caracterizados por quadros clínicos de hiper e hipotireoidismo,
respectivamente (Margotto, 2006).
1.2.6 Classificação
Dependendo da sua etiologia, o HC apresenta diversas classificações. O
hipotireoidismo
primário
é
aquele
que
decorre
de
deficiência
glandular.
Aproximadamente 85% do hipotireoidismo primário são decorrentes de defeitos na
formação glandular durante a embriogênese e é denominado disgenesia tireoidiana
(DT), que por sua vez pode ocorrer por hemiagenesia e agenesia glandular (2042%), ectopia (35-42%) ou hipoplasia tireoidiana (24-36%) (Perone et al., 2004). Em
até 98% dos casos a DT pode ser esporádica, 2% dos casos são familiais (AbuKhudir et al., 2010). A DT apresenta uma grande variabilidade de sintomas, o indica
que a patogênese envolve múltiplos defeitos de desenvolvimento, afetando
diferentes processos da embriogênese da glândula (Fagman & Nilsson, 2011).
Entretanto, a patogênese é muito pouco conhecida (Castanet et al., 2002). Ademais,
há uma associação entre DT e outros defeitos congênitos, principalmente cardíacos
(Grüters et al., 2004). Dos vários genes candidatos a estar associados à DT, os
principais são os genes TTF1, FOXE1, PAX8 e o TSHR (Park & Chatterjee, 2010).
Cerca de 10% dos casos de HC primário são erros inatos que levam a
defeitos na síntese hormonal, chamados de disormonogênese (Perone et al., 2004).
Clinicamente, pacientes com esta patologia normalmente apresentam bócio (Perone
et al., 2004), porém há exceções. As mutações que levam à disormonogênese
predominantemente parecem ser herdadas de uma forma autossômica recessiva
(Park & Chatterjee, 2010). A transferência transplacentária de anticorpos maternos é
a causa dos 5% restantes (Kopp, 2002).
O HC transitório é uma anormalidade na função tireoidiana do recémnascido, que progressivamente volta ao normal, necessitando ou não de terapia de
reposição hormonal. Acomete de forma mais freqüente as crianças prematuras e
pode ocorrer como conseqüência de: carência ou excesso de I- na mãe ou no
19
recém-nascido, doenças tireoidianas maternas, uso de drogas pela mãe que
interferem na função tireoidiana fetal, a passagem transplacentária de anticorpos
maternos (Bhavani, 2011) e mutações gene DUOX2 (Pfarr et al., 2006).
O HC central ocorre por uma estimulação deficiente de TSH em uma
tireóide normal em decorrência de disfunções hipotalâmicas ou hipofisárias
congênitas. Estas deficiências também podem ocorrer por diversos tipos de câncer
ou lesões neurológicas. Bioquimicamente se caracteriza por baixos níveis séricos de
TSH e de HT (Gupta & Lee, 2011). Defeitos genéticos no desenvolvimento da
hipófise podem resultar em várias formas de deficiência pituitária hormonal
combinada (DPHC), que acarretam em deficiência de produção e secreção de um
ou mais hormônios hipofisários, incluindo TSH, e são associadas a mutações em
fatores transcricionais hipofisários (Perone et al., 2004). A inativação do receptor de
TRH também pode levar ao HC central, ao passo que nenhuma mutação no gene
codificador do TRH foi descrita (Kopp, 2002). Mutações na subunidade β do TSH
são desordens genéticas raras, com herança autossômica recessiva e fenótipo
clínico variável, mas que também estão relacionadas ao HC central (Perone et al.,
2004).
Outra forma de HC é resistência periférica aos HT, um distúrbio
hereditário caracterizado por diminuição na resposta dos tecidos-alvo ao T3, que
ocorre freqüentemente devidos mutações no gene TRHB, que codifica a o TRβ, um
dos tipos de TR (Perone et al., 2004) e leva à falta de ação dos HT nos tecidos onde
predomina o TRβ, como o fígado, rim, músculo esquelético, miocárdio, cérebro,
hipotálamo e hipófise (Aires, 2008).
1.2.6.1 O gene FOXE1
O gene Forkhead box E1 (FOXE1), também chamado de TTF2 ou
FKHL15 faz parte da família de genes codificadores de proteínas que se ligam ao
DNA através do domínio forkhead, em sua maioria importantes reguladores da
embriogênese (Castanet et al., 2002). O gene localiza-se no cromossomo 9q22 e
contém um único éxon, que se estende por 4,5 kb (Kang et al., 2010).
20
O gene codifica o TTF2, uma fosfoproteína (Park & Chatterjee, 2010) com
376 resíduos de aminoácidos. Possui um comprimento com vários resíduos de
alanina, denominado trato polialanina, cujo comprimento varia de 11 a 19 resíduos
de alanina (Szczepanek et al., 2011), além de um domínio forkhead, que contém 110
resíduos de aminoácidos altamente conservados na família de proteínas FOX (Kang
et al., 2010).
A proteína TTF2 atua como fator de transcrição de genes alvo, como a
TG e a TPO através da ligação do seu domínio forkhead à seqüências específicas
de DNA nos promotores e ativando a transcrição destes (Castanet et al., 2002).
Entretanto, há uma controvérsia quanto ao papel do TTF2 na tireóide adulta porque
também foi detectada uma atividade repressora sobre a expressão de PAX8 e TTF1
(Perrone et al., 2000). O TTF2 também regula a expressão dos genes MSX1 e
TGFβ-3, essenciais para a formação adequada do palato. (Venza et al., 2011).
A proteína TTF2 está presente na camada endodérmica ao longo do
intestino primitivo, que se caracterizada pela presença dos arcos e bolsas faringeos,
estruturas embrionárias transitórias que darão origem a vários órgãos na cabeça e
no pescoço. No desenvolvimento, o TTF2 é expresso no revestimento epitelial nos
arcos faringeos, mas está ausente nas segunda, terceira e quarta bolsa faringeas.
Caudalmente à quarta bolsa faringea, o TTF2 é detectado no assoalho ventral da
faringe primitiva, mas está ausente no sulco laringo-traqueal (Dathan et al., 2002).
O TTF2 é ausente nos órgãos derivados das bolsas traqueais, como o
timo e paratireóides. É expressa em tecidos derivados dos arcos e da parede
traqueais, como a tireóide, língua, epiglote, palato e esôfago, além da superfície oral
do palato. É importante enfatizar que no esôfago, a expressão do TTF2 é restrita à
camada epitelial, cessando no limite com o estômago. A detecção é significativa
durante a vida embrionária, mas no esôfago adulto, os níveis de expressão são
insignificantes (Dathan et al., 2002).
Em tecidos derivados da ectoderme, a expressão do TTF2 é detectável
nas coanas e na bolsa de Rathke, estrutura que participa da formação da adenohipófise, e no epitélio da cavidade oral. Entretanto a expressão do TTF2 não é
detectada nos tecidos derivados da neuroectoderme. A proteína é expressa na
adeno-hipófise apenas nos estágios iniciais da embriogênese, não sendo mais
detectada em estágios posteriores (Dathan et al., 2002).
21
No camundongo, TTF2 apresenta expressão transitória durante a
migração do primórdio tireoidiano. Nesta fase, a proteína reprime a transcrição dos
fatores TTF1 e PAX8 e, conseqüentemente, dos genes da TG e TPO,
respectivamente. Subseqüentemente, a expressão do TTF2 é desligada, e é
restaurada no tecido adulto, onde a proteína apresenta função de ativador
transcricional da TG e TPO (Hishinuma et al., 2001).
Em estudos com modelos animais com camundongos, os heterozigotos
Foxe
+/-
não apresentaram fenótipo clínico evidente. Entretanto, camundongos
homozigotos Foxe-/- morrem dentro de 48 horas após o nascimento, apresentando
agenesia ou ectopia tireoidiana. Ocorre também ausência de HT, com elevação
compensatória
de
TSH,
evidenciando
resposta
hipofisária
normal.
Estes
camundongos também apresentaram grave fenda palatina, que é apontada como a
possível causa da morte (De Felice et al.,1998). Estes estudos evidenciam um
importante papel na migração correta do primórdio tireoidiano, assim como a
sobrevivência e proliferação dos tireócitos (Szczepanek et al., 2011).
Mutações inativadoras em homozigose no gene FOXE1 levam à
Síndrome de Bamforth-Lazarus, quadro clínico caracterizado por HC por agenesia
tireoidiana, fenda palatina, atresia das coanas, epiglote bífida e cabelo espetado
(Tonacchera et al., 2004). Estudos apontam para uma alteração nos níveis de
expressão do gene FOXE1 em diversas patologias da tireóide, chegando a ser
totalmente reprimida em alguns casos de câncer na glândula (Sequeira et al., 2001).
22
2 JUSTIFICATIVA
Um dos principais aspectos que mostram a importância deste trabalho é a
falta de grupos de pesquisa sobre HC e distúrbios relacionados ao metabolismo da
tireóide no Brasil, de tal forma que a consolidação de um grupo de pesquisa é de
relevante importância no avanço do conhecimento dos mecanismos causadores
desta doença, que é a causa prevenível mais comum de deficiência mental na
infância.
Entre as doenças triadas pelo Programa de Triagem Neonatal, o HC é a
doença mais freqüente, porém não apresenta dados claros em relação aos seus
aspectos moleculares, principalmente no que se diz respeito à etiologia do HC
primário quanto à DT, que é a causa mais comum de HC primário. Dessa forma,
estudos nos genes associados à patologia se mostram de relevante importância
visto que podem trazer esclarecimentos acerca do entendimento da etiologia da
doença
Uma possível solução do problema quanto à da doença seria a união de
técnicas bioquímicas às técnicas moleculares, que podem contribuir para a definição
do diagnóstico etiológico do HC e até para a relação genótipo e fenótipo dos
pacientes, que pode ser usada como instrumento no monitoramento do tratamento
com reposição do hormônio sintético levotiroxina de forma a adequar a posologia do
hormônio ao genótipo de cada paciente.
Ademais, nunca foi feito nenhum estudo com o gene FOXE1 na região
Norte do Brasil, onde existem numerosos casos da doença.
23
3 OBJETIVOS
3.1 GERAL
Identificar e caracterizar mutações presentes no gene FOXE1 em
pacientes com HC e estabelecer a incidência das mesmas na amostra em estudo.
3.2 ESPECÍFICOS
a) Investigar se há uma relação entre o genótipo encontrado com o fenótipo
bioquímico e clínico do HC;
b) Determinar a frequência das mutações encontradas no gene FOXE1 em
pacientes com HC primário;
c) Descrever os achados clínicos nos pacientes associados com as possíveis
mutações encontradas no gene FOXE1.
24
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 AMOSTRA
Para a realização do projeto, foram estudados 109 pacientes com HC
com faixa etária de 1 a 12 anos tratados na Unidade de Referência Especializada
Materno-Infantil e do Adolescente do Estado do Pará (UREMIA). As famílias dos
pacientes foram convidadas a participar do estudo sendo informadas por folheto
(Anexo I). Foi utilizado um grupo controle de 100 indivíduos saudáveis e sem casos
de HC na família.
O trabalho foi a provado pelo comitê de Ética da Fundação Hospital Santa
Casa de Misericórdia do Pará (Anexo III) e está de acordo com os princípios éticos
básicos das diretrizes e normas que regulamentam a pesquisa em seres humanos:
autonomia, beneficência, não-maleficência e justiça. Levando em consideração que
o estudo é de caráter analítico, não houve exposição a risco maior.
No momento do contato com o responsável pelo paciente com HC, foram
informados os objetivos deste estudo e os riscos e benefícios do mesmo ao
paciente, aos familiares e a população afetada pela doença em questão. Os
objetivos do estudo e eventuais dúvidas foram esclarecidos por contato pessoal com
a família dos pacientes. Nos casos de convites aceitos foi fornecido o termo de
consentimento livre e esclarecido (Anexo II) aos pais ou responsável dos pacientes,
já que sua maioria é menor de idade, antes da coleta do material.
O critério fundamental para a inclusão dos pacientes neste trabalho foi o
diagnóstico confirmado de HC primário, através de avaliação clínica e achados
bioquímicos, neste caso, a dosagem plasmática dos hormônios TSH e T4.
O material utilizado neste trabalho foi sangue periférico. Foram coletados
5 mL de sangue total através de punção venosa em um tubo contendo o
anticoagulante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). As amostras foram
devidamente identificadas com o nome do paciente e data de chegada e
armazenadas a -20°C até o momento do processamento.
25
4.2 EXTRAÇÃO DE DNA
Inicialmente foi realizada a extração de DNA através de uma adaptação
do método do Fenol-Clorofórmio estabelecido por Sambrock (1989). A técnica se
baseia na extração do DNA de leucócitos. Para a execução da técnica
primeiramente é feita uma lise de hemácias por três ou quatro vezes; em seguida é
feita a lise de leucócitos; posteriormente é feita a precipitação de proteínas através
do fenol-clorofórmio e isopropanol; por fim o DNA genômico é precipitado, suspenso
e dissolvido em água (Anexo IV).
4.3 AMPLIFICAÇÃO DO GENE FOXE1
Foi realizada a amplificação do gene FOXE1 por reação em cadeia da
polimerase (PCR) do DNA previamente extraído. Nesta etapa foi utilizada a
metodologia proposta por Castanet et al. (2002), que divide o éxon em 7 regiões
diferentes, com um par primers para cada uma (Figura 09).
Figura 09 - Desenho esquemático da determinação dos primers. A região em destaque é a que
codifica o domínio forkhead (Fonte: Castanet et al., 2002)
Para este trabalho foram utilizadas as regiões 2 e 3, que equivalem à
região codificadora do domínio forkhead (Quadro 01).
26
Temperatura de
Região
Sequências Nucleotídicas
Comprimento
2
F2: 5’-ggctaccgtgaaggaagagc-3’
R2: 5’-ggaagcagtcgttgagtgtga-3’
272pb
61 °C
3
F3: 5’-ggcggcatctacaagttcat-3’
R3: 5’-gtaagccgggtaggtggaga-3’
254pb
58 °C
anelamento
Quadro 01 - Primers
Para a reação de amplificação foram utilizadas concentrações diferentes
de reagentes para cada região, conforme observado no Quadro 02.
Reagentes
R2
R3
Água
12,6
13,35
Tampão
2,0
2,5
MgCl2 (50mM)
0,6
2,0
dNTPs
0,4
2,5
Primer F
0,6
0,25
Primer R
0,6
0,25
DMSO
2,0
2,0
Taq
0,2
0,15
DNA (amostra)
1,0
2,0
Volume
20,0
25,0
Quadro 02 - Concentrações dos reagentes para cada protocolo de PCR
As condições de amplificação foram 95 °C por 5 minu tos; 35 ciclos de 95
°C por 40 segundos, 61 °C ou 58 °C por 40 segundos, referentes à temperatura de
anelamento de cada primer, e 72 °C por 1 minuto, terminando com 72 °C por 7
minutos.
27
4.4 SEQUENCIAMENTO DIRETO
Os produtos de PCR foram submetidos à análise através de
seqüenciamento direto baseado na eletroforese capilar, utilizando o kit ABI PRISM
BigDye, Terminator Cycle Sequencing, os mesmos primers das reações de PCR e o
Seqüenciador Automático ABI-PRISM 377, da Applied Biosystems.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística dos resultados encontrados no estudo foi feita
através do programa Biostat versão 5.0. A partir dos resultados da análise molecular
seriam calculadas as freqüências alélicas e genotípicas de cada mutação. A
frequência alélica seria obtida dividindo o número de alelos portadores pelo número
total de alelos e as freqüências genotípicas seriam calculadas dividindo o número de
genótipos alterados pelo número total de amostras. Nos testes bioquímicos foi
realizado o teste T de Student para verificar se há variação significativa nas médias
estudadas.
28
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE BIOQUÍMICA DOS PACIENTES COM HC
Através da análise dos valores de TSH e T4L dos pacientes foi possível
realizar a divisão destes em dois grupos. O grupo 1 apresentou valores de TSH
elevado e T4L abaixo do normal, correspondendo a 80% dos pacientes. Ao passo
que o grupo 2, apresentou a dosagem de TSH elevada e T4L normal,
correspondendo a 20% dos pacientes. Esses valores são referentes às
concentrações destes hormônios quantificados no momento do diagnóstico, que
tiveram como referência os valores < 15,00 mUL/mL para o TSH e T4L: 0,8-1,33.
(Tabela 01).
Tabela 01 - Valores médios das dosagens de TSH e T4L
Grupo 1
Grupo 2
p
TSH (em mUL/mL)
93,55 ± 66,08
91,79 ± 52,30
0,1003
T4L (em ng/dL)
0,57 ± 0,44
14,25 ± 10,42
< 0, 0001
5.2 ANÁLISE CLÍNICA DOS PACIENTES COM HC
A análise clínica de 100 pacientes foi realizada pela equipe médica
especializada da UREMIA e revelou que 47% dos pacientes estudados
apresentaram hérnia umbilical, 38% icterícia precoce, 33% hipotonia, 27% obstrução
intestinal, 25% macroglossia, 20% fontanelas amplas, 18% choro fraco e rouco, 18%
pele seca e áspera e 14% abdômen globoso. Em 97,5% dos casos o diagnóstico foi
precoce e em 2,5% da amostra havia outro caso de HC na família (Gráfico 01).
29
Sintomas (%)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Gráfico 01 - Freqüências dos sintomas encontrados
5.3
ANÁLISE
MOLECULAR
DA
REGIÃO
CODIFICADORA
DO
DOMÍNIO
FORKHEAD DO GENE FOXE1
Não foram encontradas alterações na região codificadora do domínio
forkhead em nenhum dos pacientes e controles através da técnica de
seqüenciamento direto.
30
6 DISCUSSÃO
A distinção bioquímica entre os dois grupos de pacientes se deu através
da passagem transplacentária de HT materno, que manteve os níveis hormonais na
normalidade. Entretanto, quando foi feita a repetição em um momento posterior
estes já apresentavam o fenótipo bioquímico do HC.
Em 2006, Benevides et al. realizaram um estudo epidemiológico em
pacientes de HC com matriculadas no Programa de Triagem Neonatal da UREMIA
1995 a 2004. Os achados clínicos encontrados foram semelhantes ao deste
trabalho, visto que hérnia umbilical foi encontrada em mais da metade dos casos,
assim como a macroglossia. Outros sintomas também foram encontrados com uma
significativa
frequência,
como
atraso
no
desenvolvimento
neuropsicomotor,
constipação intestinal e hipoatividade. Também se observou malformações
congênitas associada ao HC, com metade destes últimos apresentando Síndrome
de Down.
Segundo Oliveira et al, (2006), a icterícia persistente é o sintoma mais
freqüente, assim como a macroglossia, hérnia umbilical e fontanela avantajada, o
que está de acordo com os dados encontrados.
A discrepância entre o número de pacientes estudados clinica e
genotipicamente se dá pelo fato de que os dados clínicos de nove pacientes não
foram conseguidos.
Os resultados da análise molecular foram semelhantes aos encontrados
por Tonacchera et al. (2004) e Narumi et al. (2010). Ambos realizaram análises com
um número elevado de indivíduos. A diferença entre estes trabalhos se deu no fato
de que Tonacchera et al. realizou o trabalho com 70 pacientes com HC com e sem
fenda palatina e Narumi et al. com uma população de 102 recém-nascidos.
A primeira vez que uma patologia foi associada a mutações no gene
FOXE1 foi em 1998, quando Clifton-Bligh et al., fizeram uma análise no gene em
dois irmãos que apresentavam com HC por DT e outras anomalias congênitas,
incluindo a fenda palatina, atresia das coanas, epiglote bífida e cabelo espetado,
descritos por Bamforth et al. em 1989. Foi descoberto que eles apresentavam a
mutação A65V em homozigose, localizada na região codificadora do domínio
forkhead. Estudos funcionais mostraram que esta mutação é altamente deletéria,
31
pois a proteína mutante apresenta completa falta de capacidade de ligação ao DNA
e ativação transcricional.
Em 2002, Castanet et al. descreveram o caso de dois irmãos do sexo
masculino, filhos de pais heterozigotos aparentados, que apresentavam a mutação
S57N em homozigose na região que codifica o domínio forkhead do gene FOXE1,
entretanto, apresentaram fenótipo incompleto da Síndrome de Bamforth. Apenas DT,
fenda palatina e cabelo espetado foram detectados. Estudos funcionais indicaram
que a proteína mutante possui atividade residual de ligação ao DNA e ativação de
transcrição, que poderia ser a causa do fenótipo incompleto da síndrome.
Baris et al. (2006) relataram o caso de uma recém-nascida do sexo
feminino que herdou, de pais consangüíneos, a mutação R102C que também
apresentava os sintomas da Síndrome de Bamforth-Lazarus.
Em um estudo realizado em pacientes com HC na Malásia por Kang et
al., (2010) foi encontrada uma paciente do sexo feminino, com pais sem parentesco
com a mutação N132D. A paciente apresentava quadro de HC por DT, entretanto,
não foram relatadas outras anomalias congênitas. Apesar de não acarretar em uma
total inativação, esta mutação leva à uma considerável diminuição na atividade da
proteína.
Foi descrito por Castanet et al. (2010) um caso de DT por mutação em
homozigose do gene FOXE1 transmitida por isodissomia. Uma criança do sexo
feminino com os sintomas da Síndrome de Bamforth-Lazarus, herdou ambos os
alelos do cromossomo 9 da mãe, que tinha a mutação F137S. Estudos de expressão
mostraram que a proteína mutante tem uma atividade comprometida. Além dos
sintomas esperados, outras características fenotípicas foram detectadas, como
alterações faciais, defeitos cardíacos e baixa estatura. Entretanto, não se pôde
determinar se estas alterações adicionais são por conseqüência do atraso no
tratamento do HC ou pela isodissomia em si.
Estes dados mostram que poucos pacientes com DT apresentam
mutações no gene FOXE1. Além disso, é difícil fazer uma associação satisfatória
entre as mutações e o fenótipo clínico (Castanet et al., 2005).
A escassez de mutações detectadas no gene FOXE1 em estudos
populacionais pode ser explicada pelo fato de que as análises são limitadas à região
32
codificadora do gene e, dessa forma, não torna possível a detecção de mutações
existentes na região promotora ou intrônica (Ramos et al., 2008).
Perry et al. (2005) encontraram vários casos de gêmeos não
concordantes em DT nos testes de triagem, muitas vezes sendo detectados apenas
em repetições dos testes. Também sugere que, em casos de gêmeos monozigóticos
recém-nascidos, se faça uma segunda dosagem hormonal, visto que a mistura de
sangue entre gêmeos, que pode ocorrer em até 70% dos casos, permite que haja
transferência de T4 do gêmeo eutireódeo, mantendo o nível de TSH do gêmeo com
HC normal. Somando esse fato a baixa incidência de casos familiais com
penetrância incompleta e expressividade variável, permitem aferir que a DT é ocorre
por um padrão herança não-mendeliana (Abu-Khudir et al., 2010). Os eventos
moleculares mais prováveis seriam eventos pós-zigóticos não-herdáveis, que
poderiam incluir modificações epigenéticas, mutações somáticas no início da
formação do embrião, ou eventos estocásticos no desenvolvimento (Perry et al.,
2005). A isodissomia também pode ser uma causa genética para casos
aparentemente esporádicos de DT sem consangüinidade parental (Castanet et al.,
2010).
É possível que mutações dominantes causadoras de DT grave não sejam
transmitidas devido à probabilidade reduzida dos portadores desta patologia de
gerar descendentes. Entretanto, com os avanços nos métodos de triagem e
tratamento, ocorre o aumento da probabilidade de os férteis transmitirem a doença.
Com isso, é provável que no futuro a incidência da DT aumente em virtude dos
avanços em triagem neonatal e tratamento precoce (Knobel et al., 2001).
Estudos mostram que defeitos congênitos associados ao HC permanente
estão em uma freqüência elevada em comparação com a população normal.
Entretanto, estes defeitos são limitados aos casos de DT, principalmente defeitos
cardíacos. Além disso, nenhum paciente com defeito molecular conhecido de um
fator de transcrição do coração apresenta HC grave (Grüters et al., 2004). Ademais,
defeitos nos fatores de transcrição relacionados à organogênese da tireóide estão
relacionados com anomalias congênitas. Por exemplo, defeitos no gene FOXE1
ocasionam a já descrita síndrome de Bamforth-Lazarus, com certa variação
fenotípica (Castanet et al., 2005); alterações no TTF1 foram descritas em pacientes
nascidos com HC, problemas respiratórios neonatais e ataxias (Kopp, 2002) e;
33
mutações de caráter dominante no PAX8, levam a HC e hemiagenesia renal. Esses
dados permitem a formulação de sistemas de formas sindrômicas de HC (Park &
Chatterjee, 2010).
No caso descrito por Baris et al. em 2006, foi detectado, por
ultrassonografia, um tecido pouco ecogênico na região paratraqueal do paciente,
indicando grave hipoplasia ao invés de ausência de tecido tireoidiano. Entretanto,
através de dosagens hormonais e cintilografia se detectou que esse tecido não era
funcional e não foi detectada TG sérica, indicando que poderia se tratar de agenesia
da tireóide. Esta observação mostra que é difícil diferenciar exatamente hipoplasia
de agenesia tireoidiana. Apesar de ser amplamente utilizada, uma classificação
unicamente morfológica para os casos de DT não é satisfatória, visto que fenótipos
semelhantes podem ser oriundos de eventos moleculares distintos (Ramos et al.,
2008).
A organogênese da tireóide é um processo complexo (Knobel et al., 2001)
e vários outros genes podem estar envolvidos com base em sua função e sua
expressão espaço-temporal. Os genes NKX2.5, HOXA3, HEX, o HNF3, GATA6 e
EYA1 são alguns dos genes candidatos a serem causa da patologia, uma vez que
estão expressos no início durante a embriogênese da glândula tireóide. Entretanto,
nenhum destes genes é específico da tiróide e camundongos nocaute para estes
apresentam anomalias congênitas não apenas na tireóide, que não têm sido
freqüentemente encontrados em pacientes com DT (Castanet et al., 2005), ao passo
que o fenótipo clínico de mutações nos fatores de transcrição já conhecidos da
tireóide já foram associadas com várias anormalidades (Park & Chatterjee, 2010).
34
7 CONCLUSÃO
Apesar dos resultados negativos, a investigação molecular de genes
candidatos ao HC é um estudo importante, pois poderá fornecer evidências cruciais
para o aconselhamento genético, visto que, em algumas formas de HC, o
componente genético já é conhecido. Estes estudos também poderão levar
adequação do tratamento para cada caso de HC, haja vista que, por exemplo, em
casos de HC por defeitos no NIS, o tratamento apresenta eficácia maior com
suplementação de I- do que com levotiroxina.
Por se tratar de uma patologia com padrão de herança evidentemente
complexo, a busca pela elucidação dos mecanismos da DT deve ir além da busca
por mutações. Estudos de expressão gênica se mostram uma importante ferramenta
visto que apenas a presença de mutações não é suficiente para explicar a maioria
dos casos estudados na literatura. As mutações descritas no gene FOXE1 por si só
foram capazes de explicar alguns casos da Síndrome de Bamforth-Lazarus, porém,
dada a variabilidade de sintomas encontrados, os mecanismos de herança e
patogênese precisam ser melhor elucidados.
Apesar da ausência de mutações encontradas no gene FOXE1 nos
pacientes, estudos com outros genes devem ser feitos nestes visando encontrar o
mecanismo genético que levaram a estes casos de HC primário. Ademais, além do
aconselhamento genético, com a genotipagem pré-natal do HC seria possível iniciar
a terapia logo após o nascimento, minimizando ao máximo os danos neurológicos
pela ausência de HT e levando a melhorias significativas na vida do paciente.
35
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41
ANEXO I
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
LABORATÓRIO DE ERROS INATOS DO METABOLISMO
INFORMAÇÕES PARA OS PAIS OU RESPONSÁVEIS LEGAIS
TÍTULO DO ESTUDO:
“ANÁLISE MOLECULAR DE PACIENTES COM HIPOTIREODISMO CONGÊNITO NO
ESTADO DO PARÁ”
O QUE É O HIPOTIREOIDISMO CONGÊNITO
A tireóide é uma glândula endócrina importantíssima para o bom funcionamento do
nosso corpo. Os hormônios produzidos por ela, T4 (tiroxina) e T3 (triiodotironina) estimulam o
metabolismo, isto é, o conjunto de reações necessárias para assegurar todos os processos
bioquímicos do organismo.
Os principais distúrbios da tireóide são o hipotireoidismo (baixa ou nenhuma
produção de hormônios) e o hipertireoidismo (produção excessiva de hormônios), doenças
que incidem mais nas mulheres do
d que nos homens.
QUAIS AS CONSEQUÊNCIAS DESSA DOENÇA?
nascido,, ocorre: choro rouco, apatia, diminuição de reflexos, pele seca,
No recém-nascido
dificuldade de desenvolvimento e problemas neurológicos.
Se o paciente não receber tratamento adequado até a quarta semana de vida, pode
ocorrer retardo mental severo, surdez, e retardo no desenvolvimento de peso e altura.
A doença predomina no sexo feminino, no qual ocorre também irregularidade
menstrual, incluindo a cessação da menstruação (amenorréia), infertilidade e galactorréia
(aparecimento de leite nas mamas fora do período de gestação e puerpério).
COMO O MÉDICO FAZ O DIAGNÓSTICO?
No recém-nascido
nascido,, deve ser realizada a triagem neonatal através da dosagem de T4
ou TSH em papel filtro. Se essas dosagens forem alteradas,
alteradas, o exame deve ser confirmado
com os mesmos procedimentos no sangue e, se alterados, iniciar de imediato o tratamento.
COMO SE TRATA?
O tratamento de todas as formas de hipotireoidismo é realizado através da reposição
dos hormônios que a tireóide
tireóid não está produzindo (Tiroxina ou T4). O controle do tratamento
é realizado pela dosagem de TSH, que deve se manter sempre em um padrão normal.
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POR QUE ESTE ESTUDO ESTÁ SENDO REALIZADO?
O objetivo desse estudo é identificar a causa genética (mutações – alterações no
DNA) responsável pelo aparecimento do Hipotireoidismo Congênito no seu filho, sendo este
exame o diagnóstico molecular (diagnóstico definitivo) que mostra as mutações genéticas
que levaram à não produção dos hormônios da tireóide, nas pessoas com hipotireoidismo
que foram detectados pelo teste do pezinho.
COMO E ONDE ESTE ESTUDO SERÁ REALIZADO?
Deverão participar deste estudo pacientes do Estado do Pará. Os pacientes
selecionados serão solicitados a fornecer informações sobre sua história médica. Se você
permitir, estas informações poderão ser obtidas através do seu médico ou de registros
médicos hospitalares. Os pacientes que estiverem comparecendo à consulta de retorno
serão convidados a participar deste estudo quando será realizado o seguinte procedimento:
Coleta de sangue (5 a 10mL). O material coletado será processado e analisado nos
Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo e Laboratório de Genética Humana e
Médica, ambos da Universidade Federal do Pará, para identificar as mutações
causadoras da doença.
QUAIS OS RISCOS DESTE ESTUDO?
A coleta de sangue poderá causar um desconforto temporário por causa da picada
de agulha, hematoma e raramente, infecção. Às vezes, uma pessoa pode ficar tonta ou
desmaiar quando o sangue for coletado.
QUAIS SÃO OS BENEFÍCIOS DESTE ESTUDO?
Como esse diagnóstico, poderá ser possível estabelecer correlação com a gravidade
da doença e, com isso, oferecer melhor tratamento, isto é, ajustar a reposição hormonal de
acordo com a gravidade das mutações detectadas pelo estudo molecular, ou seja, de
acordo com as mutações detectadas, se mais ou menos graves, permitir uma reposição
hormonal mais ou menos rigorosa. Além disso, para as famílias interessadas, este estudo
pode ser oferecido para encontrar pessoas portadoras da mutação, ou seja, identificar
pessoas da mesma família que têm o risco de ter um filho com Hipotireoidismo Congênito.
POSSO RECUSAR A PARTICIPAÇÃO?
Seu filho não é obrigado a participar deste estudo. A sua participação neste estudo é
voluntária. A recusa em participar não terá conseqüências para os seus cuidados presentes
e futuros. Seu filho poderá se retirar do estudo a qualquer momento. Os médicos do estudo
podem decidir para o estudo ou não permitir a participação de seu filho se isto for do seu
melhor interesse.
TENHO QUE PAGAR PARA PARTICIPAR?
Não há nenhum custo para participar dessa pesquisa. Seu filho não será pago para
participar deste estudo.
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E SE EU / MEU FILHO FOR PREJUDICADO?
O Dr. Luiz Carlos Santana da Silva deverá ser notificado se você suspeitar que seu
filho foi prejudicado por estar no estudo.
AS INFORMAÇÕES SOBRE MEU FILHO SE TORNARÃO PÚBLICAS?
A identidade de seu filho e outras informações pessoais obtidas neste estudo serão
confidenciais. Informações científicas e médicas obtidas neste estudo, das quais a
identidade de seu filho não poderá ser revelada, deverão ser apresentadas em encontros e
publicadas a fim de tornar as informações obtidas neste estudo de benefício para os outros.
COM QUEM POSSO TIRAR DÚVIDAS?
Você está livre para fazer perguntas sobre estudo clínico a qualquer momento.
Quando você tiver dúvidas relacionadas a este estudo, poderá falar com:
- Dr. Luiz Carlos Santana da Silva
- Dra. Milena Coelho Fernandes Caldato
- Mestrando Erik Artur Cortinhas Alves
Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo
Centro de Ciências Biológicas
Universidade Federal do Pará
Av. Augusto Correa, S/N, Bairro Guamá, CEP. 666075-900 Belém-Pa
Telefone: 3183-2030 – e-mail: [email protected]
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ANEXO II
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu
manifesto
meu
consentimento com envolvimento do meu filho no projeto de pesquisa intitulado:
1. A natureza e objetivo do projeto de pesquisa, descritos na folha de informação
em anexo, foram explicadas a mim. Eu compreendo e concordo em participar.
2. Eu compreendo que meu filho poderá não ter benefício direto por participar do
estudo
3. Eu entendo que os possíveis riscos e/ou efeitos adversos, desconforto e
inconveniências, como foi destacado na folha de informações, foram explicadas a
mim.
4. Eu compreendo que, apesar das informações obtidas no estudo poderem ser
publicadas, elas serão confidenciais e meu filho não será identificado a partir
delas.
5. Eu compreendo que posso retirar meu filho do estudo em qualquer etapa e que
isto não irá afetar os cuidados médicos ou quaisquer outros aspectos da relação
recebidos ao meu filho.
6. Eu compreendo que não haverá pagamento para meu filho por participar deste
estudo.
7. Eu tive a oportunidade de discutir a participação de meu filho neste projeto de
pesquisa com um membro da família ou amigo e/ou tive a oportunidade de ter
um membro da família ou amigo presente enquanto o projeto de pesquisa estava
sendo explicado pelo pesquisador.
8. Eu estou ciente de que devo guardar uma cópia do Termo de Consentimento,
quando completo, e da folha de Informações.
9. Eu concordo que o material (sangue) coletado de meu seja utilizado no projeto
acima.
Assinatura do Responsável:
Relação de parentesco com o paciente:
Nome completo do paciente:
Data: __ / __ / __
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ANEXO III
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ANEXO IV
Extração de DNA
1. Adicionar sangue total (no máximo 5 mL) em tubo de centrífuga de 15 mL;
2. Completar com solução salina (0,15M de NaCl) até um volume final de 14 mL;
3. Centrifugar (1800 FCR/10’)
4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 14 mL de tampão de lise de
hemácias (5mM/L de MgCl2, 20 mM/L de Tris-HCl, pH 7,8);
5. Centrifugar (1800 FCR/10’);
6. Desprezar o sobrenadante e adicionar ao precipitado 5 mL de tampão de lise de leucócitos
(0,2 mM/L de NaCl, 1 mM/L de EDTA e 10 mM/L de Tris-HCl, pH 7,8);
7. Adicionar 500 µL de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 10%, e 10 µL de proteinase K
(20mg/L);
8. Agitar o material por duas horas à temperatura ambiente em agitador pendular;
9. Adicionar um volume de fenol, agitar por 10’, centrifugar (1800 FCR/10’) e transferir o
sobrenadante para outro tubo de 15 mL;
10. Adicionar um volume de clorofórmio-isopropanol (24:1);
11. Agitar por 10’, centrifugar (1800 FCR/10’);
12. Transferir o sobrenadante para outro tubo de 15 mL;
13. Adicionar 2,5 vezes o volume de isopropanol e misturar por inversão ate a precipitação do
pellet de DNA;
14. Centrifugar (1800 FCR/5’); desprezar o sobrenadante e deixar o DNA secando à
temperatura ambiente por algumas horas. Em seguida, adicionar água destilada para
hidratar.
Deixar o DNA ressuspender por algumas horas, e então armazenar sob refrigeração.