UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Dissertação
Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da
imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do
Rio Grande do Sul
Fábio da Silva e Silva
Pelotas, 2012
1
FÁBIO DA SILVA E SILVA
Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina em
gatos domésticos da região do sul do Rio Grande do Sul
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação
em
Veterinária
da
Universidade Federal de Pelotas, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre
em
Ciências
(área
de
conhecimento: Veterinária Preventiva).
Orientador: Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner
Pelotas, 2012
Dados de catalogação na fonte:
(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
S587e Silva e Silva, Fábio da
Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da
imunodeficiência felina em gatos domésticos da
região sul do Rio Grande do Sul / Fábio da Silva e
Silva ; orientador Silvia de Oliveira Hübner.
Pelotas,2012.30f. : il..- Dissertação(Mestrado ) –
Programa de Pós-Graduação em Veterinária.Área de
conhecimento Veterinária Preventiva. Faculdade de
Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas,
2012.
1Gato 2.Epidemiologia 3.Subtipo 4.Vírus da
imunodeficiência felina 5.PCR I.Hübner, Silvia de
Oliveira(orientador) II. Título.
CDD 636.8089
Banca examinadora:
Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner – Universidade Federal de Pelotas (orientadora)
Prof. PhD. Geferson Fischer – Universidade Federal de Pelotas
Prof. Dr. Marcelo de Lima – Universidade Federal de Pelotas
a
Prof . Dra. Márcia de Oliveira Nobre – Universidade Federal de Pelotas
Agradecimentos
Aos meus pais queridos, Edmundo e Nidelcina que partiram durante meu
período de mestrado, mas deixaram vivo o legado da busca pelo conhecimento, pois
sempre priorizaram a minha formação acadêmica e me incentivaram a evoluir como
indivíduo a partir do caminho da educação.
À
minha
amada
esposa
Débora,
pelo
carinho,
companheirismo
e
compreensão, além do suporte técnico prestado na língua portuguesa e inglesa.
À minha orientadora Silvia de Oliveira Hübner, pela amizade, paciência e pelo
apoio acadêmico na realização deste trabalho.
Ao Prof. João Pessoa da UNESP-Botucatu, por ter participado ativamente da
execução do meu projeto de pesquisa.
À equipe (professores, funcionários e colegas) do Laboratório de Virologia e
Imunologia Animal da UFPel que me acolheu e passou a fazer parte da minha
família.
Às minhas colegas e amigas Paula e Clarissa, que foram fundamentais na
execução das atividades de laboratório relativas ao mestrado.
À Universidade Federal de Pelotas que me proporcionou a realização do curso de
Pós-Graduação em Veterinária.
Muito obrigado!
“Gatos amam mais as pessoas do que elas permitiriam. Mas eles têm sabedoria
para manter isso em segredo”.
Mary Wilkins
RESUMO
SILVA, Fábio da Silva e. Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da
imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do Rio Grande do
Sul. 2012. 30f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Orientadora: Silvia de Oliveira
Hübner.
O vírus da imunodeficiência felina pertence à família Retroviridae, gênero Lentivirus
e apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao vírus da imunodeficiência
humana (HIV), entretanto não é transmissível ao homem, sendo suscetíveis
somente os felinos domésticos e selvagens. O FIV é classificado em cinco subtipos
filogeneticamente diferentes de A a E, distribuídos mundialmente, além de cepas
com recombinações entre os subtipos. Recentemente dois novos subtipos foram
descritos, o subtipo F identificado nos Estados Unidos e Portugal, e o subtipo UNZenv na Nova Zelândia. Considerando-se que os retrovírus têm a capacidade de
integrar-se ao genoma celular, sob a forma de DNA de dupla fita, é possível a
detecção do provírus em leucócitos infectados, através da técnica de reação em
cadeia da polimerase (PCR). O presente trabalho investigou a ocorrência de
infecção pelo vírus da imunodeficiência felina, entre os anos de 2010 e 2011, em
gatos domésticos levados para atendimento médico no Hospital de Clínicas
Veterinária da Universidade Federal de Pelotas e clínicas privadas da cidade de
Pelotas, RS. Amostras de sangue de 70 animais, entre hígidos e doentes, foram
colhidas e submetidas à técnica de nested-PCR. Os gatos testados foram
classificados em dois grupos quanto à condição clínica: o grupo 1 foi representado
por 28 felinos suspeitos de FIV, diagnosticados com linfoadenomegalia, sinais
neurológicos ou com infecções crônicas e recidivantes; o grupo 2 representado por
42 animais livres de sintomatologia relacionada a FIV. Os resultados apontaram uma
frequência de infecção pelo FIV de 15,7% (11/70). Das amostras positivas, 8 foram
submetidas à caracterização molecular, sendo todas alocadas dentro do subtipo B.
As manifestações clínicas mais diagnosticadas nos felinos que desenvolveram
doença relacionada a FIV, foram as infecções secundárias broncopulmonares (4/10)
e cutâneas (3/10). Outras alterações clínicas identificadas em animais positivos
foram gengivite, uveíte, anemia e icterícia. Os animais infectados por FIV
apresentaram letalidade de 30% durante o período de estudo. Em relação à faixa
etária a maior proporção de felinos infectados apresentava idade superior a 10 anos.
Diante dos dados apresentados conclui-se que o subtipo B do vírus da
imunodeficiência felina apresenta circulação na população de gatos domésticos da
região sul do Rio Grande do Sul, e que animais idosos acometidos por infecções
crônicas ou recidivantes devem ser testados para esse agente.
Palavras-chave: Gato. Epidemiologia. Subtipo. Vírus da imunodeficiência felina.
PCR.
ABSTRACT
SILVA, Fábio da Silva e. Epidemiological study of the feline immunodeficiency
virus infection in domestic cats of the south region of Rio Grande do Sul State.
2012. 30f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária.
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Orientadora: Silvia de Oliveira Hübner.
The feline immunodeficiency virus belongs to the Retroviridae family, Lentivirus
gennus and presents molecular structure and pathogenicity similar to the human
immunodeficiency virus (HIV), therefore it is not transmissible to humans, being
susceptible only the domestic and feral cats. FIV is classified in five phylogenetically
different subtypes from A to E spread worldwide, apart from recombinant strains
among the subtypes. Recently, two new subtypes were described, the subtype F
identified in the United States and Portugal, and the subtype U-NZenv in New
Zealand. Considering that the retroviruses have the ability to integrate the cell
genome, under double stranded DNA form, it is possible to detect the provirus in
infected leucocytes through the polymerase chain reaction (PCR) technique. The
present report investigated the occurrence of the feline immunodeficiency virus
infection between 2010 and 2011 in domestic cats submitted to medical treatment at
the Hospital of Veterinary Clinics of the Federal University of Pelotas and private
clinics from Pelotas, RS. Blood samples of seventy animals, healthy or sick, were
collected and subjected to the nested-PCR technique. The tested cats were
classified in two groups taking into account their clinical condition: the group 1
represented 28 FIV suspect cats with lymphadenomegaly, neurological disorders or
chronic and recurring infections. The results pointed out a FIV infection frequency of
15,7% (11/70). Eight of the positive samples were subjected to molecular
characterization, being all of them into the subtype B. The most diagnosed clinical
manifestations in the cats that developed disease related to FIV were
bronchopulmonar (4/10) and cutaneous (3/10) secondary infections. Another clinical
disorders observed in the positive animals were gingivitis, uveitis, anemia and
icterus. The FIV infected cats presented 30% of lethality during the period of study.
Most of the infected cats were up to 10 years of age. Faced with the data shown in
this report we could conclude that the subtype B of the feline immunodeficiency virus
presents circulation in the domestic cat population of the south region of Rio Grande
do Sul and elderly animals affected by chronic or recurring infections must be FIV
tested.
Keywords: Cat. Epidemiology. Subtype. Feline immunodeficiency virus. PCR
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 6
ABSTRACT ................................................................................................................. 7
1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................... 8
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 9
3. ARTIGO................................................................................................................ 13
Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em gatos
domésticos da região sul do Rio Grande do Sul .................................................... 14
3.1 RESUMO ......................................................................................................... 14
3.2 ABSTRACT ...................................................................................................... 14
3.3 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15
3.4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 16
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 17
3.6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 19
3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 19
4. CONCLUSÃO GERAL........................................................................................... 23
5. REFERÊNCIAS GERAIS ...................................................................................... 24
6. ANEXO .................................................................................................................. 28
8
1. INTRODUÇÃO GERAL
Com população estimada de mais de 100 milhões de felinos domésticos em
todo o mundo, as infecções virais nessa espécie determinam uma casuística
relevante no exercício da medicina felina (BARR et al., 1997). Dentre as infecções
virais de importância destaca-se a infecção pelo vírus da imunodeficiência felina
(FIV). O FIV foi isolado em 1987 nos Estados Unidos por Niels Pedersen, e desde
então é reconhecido por determinar significativa imunossupressão em gatos
(MACLACHLAN & DUBOVI, 2011).
No Brasil em 2010 a população de gatos estimada foi de 18,5 millhões, um
crescimento de 9% em relação ao ano de 2009, em contrapartida a população de
cães cresceu apenas 3,9% no mesmo período (ANFALPET).1 Esses dados refletem
a crescente e significativa população de felinos no Brasil e a importância do
diagnóstico do FIV, pois esse agente atua como fator predisponente ao
desenvolvimento de infecções concomitantes.
O FIV é considerado um agente cosmopolita, e apresenta uma prevalência
mundial de 4 a 12%, embora os valores possam apresentar variabilidade de acordo
com a área geográfica. Nos Estados Unidos e Canadá a prevalência encontrada
variou entre 1 a 7% e, no Japão, onde a população de gatos errantes é alta, a
prevalência chegou a 44% (HAYWARD et al., 2009). No Brasil, anticorpos contra o
FIV foram detectados em 3,7% dos felinos assintomáticos e em 20,2% dos animais
doentes, em um levantamento realizado durante os anos de 1998 e 1999, na cidade
do Rio de Janeiro (SOUZA et al., 2002). Outro estudo realizado entre outubro de
2000 a outubro de 2002, incluindo 454 felinos oriundos de 13 cidades do estado de
São Paulo, demonstrou que 14,7% (67/454) dos gatos estavam infectados (LARA et
al., 2008). Já no Rio Grande do Sul, uma investigação epidemiológica referente à
infecção pelo FIV foi realizada na cidade de Porto Alegre no ano de 2007 aonde
constatou-se taxa de infecção de 21,5% (14/65) a partir de diagnóstico sorológico e
molecular (SILVA et al., 2007). Em Pelotas e região não há registros de estudos
epidemiológicos referentes à infecção pelo FIV.
1
Associação Nacional dos Fabricantes de Produtos para Animais de Estimação- Disponível em: < http:
//anfalpet.org.br/portal/ >. Acesso: 25/02/2012.
9
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O vírus da imunodeficiência felina pertence à família Retroviridae, gênero
Lentivirus e apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao vírus da
imunodeficiência humana (HIV), entretanto, não é transmissível ao homem, sendo
suscetíveis somente os felinos domésticos e selvagens (HOSIE et al., 2009).
O genoma do FIV é composto de três grandes regiões denominadas de Gag,
Pol e Env. A região Gag codifica as proteínas estruturais internas, representadas
pela matriz (MA), capsídeo (CA) e nucleocapsídeo (NC). A porção Pol é responsável
pela síntese das enzimas transcriptase reversa (RT), integrase (IN) e protease (PR).
E a região Env codifica as proteínas do envelope viral, sendo elas a glicoproteína de
superfície (SU), gp120 e a glicoproteína de transmembrana (TM), gp41. Além das
três grandes regiões genômicas, o FIV também apresenta os genes acessórios Vif,
OrfA e Rev, responsáveis pela neutralização de citocinas da célula hospedeira,
ativação da transcrição e exportação do núcleo viral durante a replicação (KENYON
& LEVER, 2011).
A imunossupressão observada nos animais infectados pelo FIV é o resultado
da depleção dos linfócitos T auxiliares (CD4+), que leva a uma inversão da relação
CD4/CD8. Paralelo à diminuição da contagem de linfócitos T CD4 + o FIV determina
um quadro de hipergamaglobulinemia, decorrente da elevação de linfócitos B CD21 (TAKANO et al., 2012). Atualmente há indícios de que a imunossupressão pelo FIV
pode ser exacerbada por disfunção na síntese de hormônios esteróides, a partir do
aumento na concentração de estradiol e testosterona. Estudos sugerem que essas
alterações hormonais possam agravar o quadro de imunossupressão de pacientes
positivos para FIV, diminuindo a expressão do MHC II, a apresentação de antígenos,
e a expressão de citocinas pelas células linfóides (TEJERIZO et al., 2012).
A disseminação do vírus no organismo ocorre principalmente pelos linfócitos
CD4+ infectados e, em escala menor, pelos monócitos e macrófagos. Estes últimos
relacionados com o vírus no estágio terminal da doença (RAVAZZOLLO & COSTA,
2007). O vírus também pode promover infecção de astrócitos e células da micróglia,
determinando sintomatologia neurológica (FERNÁNDEZ et al., 2007). Os gatos
infectados apresentam saliva com alta carga viral e o modo mais eficiente de
10
transmissão é a partir de mordedura, mas a transmissão também pode ocorrer
verticalmente, por infecção uterina, via colostro ou amamentação (ARJONA et al.,
2000).
A partir da análise da sequência de nucleotídeos do gene Env das regiões
variáveis 3-5, o FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes, de
A a E, além de cepas recombinantes. Os subtipos A, B e C estão mundialmente
distribuídos, sendo o subtipo D encontrado somente no Japão e Vietnã e o subtipo E
identificado na Argentina (PECORARO et al., 1996; BACHMANN et al., 1997;
TEIXEIRA et al., 2010). Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o
subtipo F identificado nos Estados Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv
encontrado na Nova Zelândia (HAYWARD et al., 2009; GRACE et al., 2011). No
Brasil pouco se conhece sobre a diversidade genética do FIV. Até o momento a
caracterização filogenética foi realizada nos estados de Minas Gerais, São Paulo e
Rio de Janeiro, identificando-se somente o subtipo B (CAXITO et al., 2006; LARA et
al., 2007 MARTINS et al., 2008).
O conhecimento da variabilidade genética do FIV é fundamental no
desenvolvimento de vacinas que promovam imunidade a cepas específicas de uma
determinada região. O sequenciamento do gene Env também possibilita a relação
dos subtipos do FIV com padrões clínicos específicos (TEIXEIRA et al., 2010). A
infecção pelo subtipo A está associada com o desenvolvimento de doença
neurológica, já o subtipo B determina a ocorrência de um quadro de baixa
morbidade, e o subtipo C pode causar enfermidade aguda, desencadeando severa
imunodeficiência com 60% de mortalidade 18 semanas pós infecção (ROZìERES et
al.,2008; HAYWARD et al., 2009).
As infecções crônicas, secundárias ou associadas, causadas por agentes
infecciosos comensais ou patogênicos são frequentes em felinos com FIV, levando a
complicações representadas por quadros de enterite, dermatite, gengivite e doença
respiratória crônica (ZANUTTO et al., 2011). Gatos FIV positivos também
apresentam cinco vezes mais chance de desenvolver linfoma ou leucemia do que
gatos não infectados e os pacientes em viremia podem apresentar uveíte e
glomerulonefrite por deposição de imunocomplexos (HARTMANN et al., 2011).
Aproximadamente 5% dos felinos infectados por FIV apresentam encefalite,
podendo desenvolver distúrbios de comportamento, demência, convulsão e déficit
motor (MURPHY et al., 1999).
11
Os sinais clínicos de gatos com FIV não são suficientes para confirmar a
infecção. Portanto, o diagnóstico deve ser realizado pela detecção de anticorpos
pelo teste de imunoabsorção enzimática (ELISA) e confirmado pela técnica de
reação em cadeia da polimerase (PCR) ou Western blotting (TIZARD, 2009), pois
reações positivas falsas são comuns no teste de ELISA (NELSON & COUTO, 2006;
VEIR et al., 2010).Considerando-se que os retrovírus têm a capacidade de integrarse ao genoma celular sob a forma de DNA de dupla fita, é possível a detecção do
provírus em leucócitos infectados pela técnica de PCR (CALDAS et al., 2000). Essa
técnica apresenta como vantagem alta sensibilidade e especificidade, custo
acessível e fácil reprodução (VEIR et al, 2010). Entretanto, a variabilidade genética
do vírus e a baixa carga proviral em linfócitos de pacientes assintomáticos crônicos,
podem determinar um resultado falso negativo (CRAWFORD et al., 2007;
AMMERSBACH et al., 2011).
O tratamento, na maioria das vezes, é de suporte e dirigido contra as
condições mórbidas relacionadas, sendo os antivirais também utilizados, porém
apresentam potencial tóxico para os felinos (TEIXEIRA et al., 2010). A zidovudina
(AZT) é uma droga antiviral amplamente utilizada no tratamento de gatos
acometidos por FIV, é um fármaco análogo da timidina que bloqueia a DNA
polimerase viral (transcriptase reversa) inibindo a replicação dos retrovírus (BOTHE
et al., 2001). À semelhança do que ocorre no tratamento do HIV, o uso do AZT em
felinos resulta no aparecimento de cepas mutantes ao fármaco. Um estudo realizado
na cidade de Botucatu/SP no ano de 2007 demonstrou que o uso do AZT (10mg/ Kg/
dia) por 96 dias, em gatos positivos para FIV, não diminuiu a carga viral. Além disso,
o sequenciamento genético da região codificadora da transcriptase reversa,
constatou a presença de lisina na posição 41 que é relacionada ao fenótipo de
resistência ao AZT (FIGUEIREDO et al., 2007). Outro medicamento também
utilizado no tratamento da FIV é o interferon recombinante, pois apresenta atividade
antiviral e imunomoduladora. O uso do inteferon-alfa humano em felinos é altamente
questionável,
pois
essa
droga
é
espécie-específica
e
pode
induzir
o
desenvolvimento de anticorpos neutralizantes ao fármaco. Recentemente foi
desenvolvido o interferon-ômega recombinante felino, essa molécula tem mostradose bastante promissora, pois tem determinado, em pacientes infectados por FIV,
melhora
da
condição
clínica
(DOMÉNECH et al., 2011).
e
normalização
dos
valores
hematológicos
12
Um grande número de vacinas experimentais contra FIV tem sido testado,
incluindo imunógenos de vírus inativado, células infectadas, vacinas de DNA e
recombinantes, mas a alta capacidade do lentívirus de evadir a resposta imune do
hospedeiro torna-se um fator limitante na indução de imunidade frente ao FIV
(DUNHAM et al., 2008). Uma vacina com preparados de vírus inativado, contendo o
subtipo APetaluma e o subtipo DShizuoka ( Fel-O-Vax; Fort Dodge®; USA), foi licenciada
para comercialização nos Estados Unidos em 2002. Essa vacina apresenta eficácia
comprovada contra subtipos homólogos e o subtipo heterólogo B, com um índice de
proteção superior a 70% em animais desafiados (HUANG et al., 2009).
Devido à ausência de estudos epidemiológicos referentes à ocorrência do FIV
na região sul do Rio Grande do Sul, o presente trabalho teve como objetivo
diagnosticar o agente etiológico da imunodeficiência viral felina no município de
Pelotas e região, a partir da reação em cadeia da polimerase, bem como realizar a
caracterização molecular dos isolados obtidos para identificação do(s) subtipo(s) de
FIV prevalente(s) na região.
13
1
2
3. ARTIGO
3
4
5
6
7
8
9
10
Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em
11
gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul
12
13
(Artigo científico a ser submetido ao periódico Arquivo Brasileiro de Medicina
14
Veterinária e Zootecnia)
15
14
16
17
18
Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em gatos
domésticos da região sul do Rio Grande do Sul, Brasil
19
[Infection and molecular characterization of the feline immunodeficiency virus in domestic
20
cats from the south of Rio Grande do Sul state, Brazil]
21
22
F.S. Silva1*, J.P. Araújo Jr2, G. Fischer1, G.D. Vargas1, P.F. Finger1, S.O. Hübner1
23
24
¹ Laboratório de Virologia e Imunologia Animal, Faculdade de Veterinária, Universidade
25
Federal de Pelotas, Capão do Leão, RS 96010-900, Brasil;
26
² Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade
27
Estadual Paulista, Botucatu, SP 18618-000, Brasil.
28
29
3.1 RESUMO
30
31
O presente trabalho investigou a frequência de infecção pelo vírus da
32
imunodeficiência felina (FIV), entre os anos de 2010 e 2011, em gatos domésticos submetidos
33
a atendimento clínico na cidade de Pelotas. Amostras de sangue de 70 animais, entre hígidos
34
(42) e doentes (28), foram colhidas e submetidas à técnica de reação em cadeia pela
35
polimerase (PCR), para diagnóstico da FIV. Os resultados apontaram uma frequência de
36
infecção pelo FIV de 15,7% (11/70) e a análise dos fatores associados a infecção pelo FIV
37
(sexo, idade e condição clínica) evidenciou que gatos com idade superior a 10 anos e
38
acometidos por infecções crônicas e recidivantes foram os mais suscetíveis. Oito das amostras
39
positivas foram submetidas à caracterização molecular, sendo todas alocadas dentro do
40
subtipo B.
41
42
Palavras-chave: gato, epidemiologia, subtipo, vírus da imunodeficiência felina, PCR
43
44
3.2 ABSTRACT
45
46
The present study investigated the frequency of the feline immunodeficiency virus
47
(FIV) infection between 2010 and 2011, in domestic cats submitted to medical attendance in
15
48
the city of Pelotas. Blood samples of seventy healthy (42) or sick (28) animals were obtained
49
and analyzed by the polymerase chain reaction (PCR) technique to diagnose FIV. The results
50
pointed out a FIV infection frequency of 15,7% (11/70) and the analysis of the factors (sex,
51
age and clinical condition) evidenced that cats up to 10 years of age attacked by chronic and
52
recurring infections were the most susceptible. Eight of the positive samples were submitted
53
to molecular characterization and all of them were placed into the subtype B.
54
55
Keywords: cat, epidemiology, subtype, feline immunodeficiency virus, PCR
56
57
58
3.3 INTRODUÇÃO
59
O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um retrovírus do gênero Lentivirus, que
60
apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao HIV (Hosie et al., 2009). Os gatos
61
infectados pelo FIV podem desenvolver disfunção imunológica caracterizada por
62
hipergamaglobulinemia, elevação de linfócitos B CD21- e depleção de linfócitos T CD4+
63
(Takano et al., 2012). Os sinais clínicos observados são variáveis e inespecíficos. Em geral os
64
pacientes podem manifestar gengivite, emaciação, linfoadenomegalia, insuficiência renal
65
crônica, complicações neurológicas, diarréia crônica e infecções bacterianas (Zanutto et al.,
66
2011), além de alterações hematológicas como anemia, leucopenia e linfopenia (Arjona et al.,
67
2000). Entretanto, em relação ao HIV, o vírus da imunodeficiência felina apresenta menor
68
potencial de virulência, sendo que a maioria dos gatos infectados apresenta-se assintomático
69
por um longo período da vida, mesmo na ausência de tratamento antiretroviral (Hartmann,
70
2011; White e Norris, 2011).
71
O FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes. Os subtipos A, B
72
e C estão mundialmente distribuídos, sendo o subtipo D encontrado somente no Japão e
73
Vietnã, e o subtipo E identificado na Argentina (Pecoraro et al., 1996; Teixeira et al., 2010).
74
Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o subtipo F identificado nos Estados
75
Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv encontrado na Nova Zelândia (Hayward et al., 2009;
76
Teixeira 2010). Além disso, recombinações entre os subtipos têm sido descritas (Bachmann et
77
al., 1997). No Brasil, pouco se conhece sobre a diversidade genética do FIV. Até o momento a
78
caracterização molecular foi realizada somente nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio
79
de Janeiro, identificando-se somente o subtipo B (Caxito et al., 2006; Lara et al., 2007;
80
Martins et al., 2008).
16
81
O FIV é considerado um agente cosmopolita e apresenta uma prevalência variável de
82
acordo com a área geográfica. Nos Estados Unidos e Canadá valores de prevalência de 1 a 7%
83
foram encontrados, enquanto que no Japão a taxa de prevalência reportada foi de 44%
84
(Hayward et al., 2009). Um estudo realizado no estado de São Paulo, incluindo 454 felinos
85
oriundos de 13 cidades, demonstrou que 14,7% (67/454) dos gatos estavam infectados (Lara
86
et al., 2008). No Rio Grande do Sul uma investigação epidemiológica referente à infecção
87
pelo FIV realizada na cidade de Porto Alegre constatou uma taxa de infecção de 21,5%
88
(14/65) a partir de diagnóstico sorológico e molecular (Silva, 2007).
89
O presente trabalho teve como objetivo determinar a frequência de infecção do FIV na
90
região sul do Rio Grande do Sul, mediante a detecção de DNA proviral por nested-PCR,
91
caracterização molecular dos isolados obtidos e análise dos fatores associados à infecção pelo
92
FIV.
93
94
3.4 MATERIAL E MÉTODOS
95
96
Durante o período de agosto de 2010 a agosto de 2011 foram colhidas 70 amostras de
97
sangue de gatos submetidos a atendimento médico no Hospital de Clínicas Veterinária da
98
UFPel e Clínicas Veterinárias privadas, localizadas na cidade de Pelotas, RS. Os animais
99
testados foram classificados em dois grupos quanto à condição clínica: o grupo 1 foi
100
representado por 28 gatos suspeitos de imunodeficiência viral felina, diagnosticados com
101
linfoadenomegalia, sinais neurológicos ou com infecções crônicas e recidivantes; o grupo 2
102
representado por 42 animais livres de sintomatologia relacionada a FIV. Sendo que todos os
103
pacientes positivos receberam acompanhamento médico de no mínimo 6 meses após o
104
diagnóstico, com objetivo de avaliar a evolução clínica dos pacientes e estabelecer a taxa de
105
letalidade.
106
As amostras sanguíneas foram obtidas por punção venosa, acondicionadas em frascos
107
contendo anticoagulante EDTA e armazenadas a 4°C. A extração do DNA proviral foi obtida
108
utilizando-se o Kit QIAamp (QIAGEN®), conforme especificações do fabricante em até 30
109
dias após a colheita das amostras.
110
Posteriormente, as amostras foram submetidas à reação de nested-PCR utilizando – se
111
primers correspondentes à região p17 e p24 do gene gag. As sequências dos primers externos
112
utilizados foram 5’ AAT ATG ACT GTA TCT ACT GC 3’ (sense) e 5’ TTT TCT TCT AGA
113
GTA CTT TCT GG 3’ (anti-sense) e a dos primers internos 5’ TAT TCA AAC AGT AAA
114
TGG AG 3’ (sense) e 5’ CTG CTT GTT GTT CTT GAG TT 3’ (anti-sense). A primeira
17
115
reação amplifica uma sequência de nucleotídeos de 658 pares de base (pb) de DNA e a
116
segunda reação uma sequência de 329 pb (Hodatsu et al., 1998).
117
Cada reação foi executada em um volume total de 25µl contendo: 1.25U de Taq DNA
118
Polimerase, 2.5μl de tampão de PCR 10X, 1.75mM de MgCl2, 0.25mM de cada dNTP, 1µl de
119
cada primer a 10pmol/µl, 7.5μl de Betaine 5M (Sigma-Aldrich®) e 5μl do DNA extraído. Os
120
ciclos padronizados para a amplificação do DNA foram: uma incubação inicial a 96°C por 7
121
minutos, seguida de 45 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94°C por 60 segundos,
122
anelamento a 45°C por 60 segundos, extensão pela polimerase a 72°C por 90 segundos e
123
extensão final a 72°C por 5 minutos. Ao final da reação, os produtos foram submetidos à
124
eletroforese e logo analisados em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio (0,5
125
mg/ml) e comparados com marcadores de peso molecular de 100 pb. Em todas as reações
126
foram incluídas amostras contendo água ultra-pura como controle negativo e uma amostra
127
com células infectadas por FIV (gentilmente cedida pelo Laboratório de Virologia e
128
Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de
129
Biociências da UNESP/Botucatu-SP) como controle positivo.
130
Para sequenciamento, as amostras positivas no nested PCR foram submetidas a uma
131
segunda reação para amplificação de um segmento da região Env. Em seguida os produtos
132
tiveram suas bandas extraídas do gel e purificacadas com o Kit SV Gel and PCR Clean-up
133
System Promega (Wizard®). Os fragmentos purificados foram submetidos a sequenciamento
134
direto utilizando-se o Big Dye® Terminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
135
Biosystems) e o aparelho de sequenciamento automático ABI 3500 (Applied Biosystems).
136
Todo o procedimento de caracterização molecular foi realizado no Laboratório de Virologia e
137
Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de
138
Biociências da UNESP, Campus de Botucatu, SP.
139
Variáveis como condição clínica, faixa etária e sexo foram analisadas como possíveis
140
fatores de associação a infecção pelo FIV, mediante o tratamento estatístico do Qui-quadrado
141
(x2), fixando-se o valor de 1% para o nível de rejeição da hipótese de nulidade.
142
143
3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
144
145
Das 70 amostras submetidas ao nested-PCR 11 apresentaram-se positivas,
146
determinando uma taxa de frequência de infecção pelo FIV, na população estudada, de
147
15,7%. O valor encontrado está próximo às prevalências relatadas no Rio de Janeiro de
148
16,7% e São Paulo com 14,7% (Souza et al., 2002; Lara et al., 2008). Na América do Norte, a
18
149
prevalência relatada foi de 1% em gatos hígidos e de 7% em animais doentes, dados esses
150
inferiores ao do presente estudo. Contrastando com os valores dos Estados Unidos e Canadá,
151
a prevalência encontrada no Japão, onde a população de gatos errantes é alta, foi de 44%,
152
(Hayward et al., 2009), valor esse bem superior ao dos levantamentos epidemiológicos
153
realizados no Brasil até o presente momento.
154
Em relação ao estado de higidez dos pacientes (Tab. 1), foi observado que a proporção
155
de felinos positivos com sinais clínicos associados a FIV (10/28) foi estatisticamente maior
156
(p<0,01) do que a proporção de felinos assintomáticos (1/42), estando de acordo com os
157
levantamentos epidemiológicos encontrados na literatura (Caldas et al., 2000; Souza et al.,
158
2002; Lara et al., 2008; Murray et al., 2008). Dos felinos positivos para FIV 90,9% (10/11)
159
desenvolveram doença relacionada, apresentando principalmente infecções broncopulmonares
160
(4/10) e cutâneas (3/10) secundárias. Outras alterações clínicas associadas à infecção por FIV,
161
como gengivite, uveíte, anemia e icterícia, também foram detectadas em animais positivos.
162
O presente estudo foi realizado no estado do Rio Grande do Sul, em região
163
relativamente próxima à Argentina, onde foi identificado o subtipo E (Pecoraro et al., 1996).
164
Contudo, todas as amostras submetidas à caracterização molecular foram alocadas dentro do
165
subtipo B, sugerindo ser este o subtipo predominante nessa região. O conhecimento da
166
variabilidade genética do FIV é fundamental no desenvolvimento de vacinas que promovam
167
imunidade a cepas específicas de uma determinada área. Além disso, também possibilita a
168
associação de subtipos do FIV com padrões clínicos específicos (Teixeira et al., 2010). No
169
Brasil, até o momento, foi descrita a ocorrência única do subtipo B (Caxito et al., 2006; Lara
170
et al., 2007; Martins et al., 2008).
171
Somente 30% (3/10) dos felinos com sinais clínicos de FIV vieram a óbito durante o
172
período de 6 meses de observação após o diagnóstico. Possivelmente a baixa letalidade
173
verificada no estudo está relacionada ao subtipo B, que apresenta como característica a baixa
174
virulência (Bachmann et al., 1997), ao contrário do subtipo C, que está associado à
175
enfermidade aguda e de acentuada imunodeficiência, com 60% de mortalidade 18 semanas
176
pós infecção (de Rozìeres et al.,2008).
177
Como esperado, a categoria sênior (Tab. 1) apresentou de maneira significativa (p<0,01)
178
a maior proporção de felinos infectados (6/9). Esse resultado pode ser explicado pelo fato do
179
FIV apresentar um grande período de latência, determinando o aparecimento tardio dos sinais
180
clínicos, mesmo que a transmissão do vírus tenha ocorrido em idade jovem (Hartmann, 2011;
181
White e Norris, 2011). Contudo, diferentemente de outros estudos que apontam os machos
182
inteiros como os mais suscetíveis à infecção pelo FIV (Lara et al., 2008; Murray et al., 2008;
19
183
Samman et al., 2011), não foi observada diferença estatística entre sexos. Provavelmente isso
184
se deve ao fato de que 32,4% (12/37) dos gatos machos analisados eram castrados. Sabe-se
185
que a forma de transmissão mais comum é por meio de mordeduras, com ocorrência mais
186
frequente em gatos machos inteiros devido aos conflitos por acasalamento e territoriais
187
(Souza et al., 2002).
188
189
Tabela 1. Análise dos fatores associados à infecção pelo FIV nos 70 gatos oriundos da região
190
sul do Rio Grande do Sul, segundo sua positividade ao nested-PCR
Fatores de risco
Total de amostras
Amostras Positivas p/ FIV (%)
Assintomático
42
1 (2,4%)
Suspeito de FIV
28
10 (35,7%)*
Macho
25
3 (12%)
Macho castrado
12
1 (8,3%)
Fêmea
21
4 (19,1%)
Fêmea castrada
12
3 (25%)
< 1ano (jovem)
21
0 (0%)
1-4 anos (adulto jovem)
18
3 (16,6%)
5-10 anos (adulto)
15
2 (13,3%)
>10 anos (sênior)
9
6 (66,6%)*
Idade desconhecida
7
0 (0%)
Condição clínica
Condição sexual
Faixa etária
191
* Estatisticamente significativo no nível de 1%
192
193
3.6 CONCLUSÃO
194
195
Os resultados apontam uma frequência de infecção de 15,7% e permitem afirmar que o
196
subtipo B do FIV circula na população de felinos domésticos da região sul do Rio Grande do
197
Sul. Os dados ainda sugerem que gatos com idade superior a 10 anos acometidos por
198
infecções crônicas ou recidivantes apresentaram a maior proporção de animais positivos para
199
FIV.
200
201
202
3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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23
4. CONCLUSÃO GERAL
- A frequência de infecção para FIV em gatos domésticos da região sul do Rio
Grande do Sul foi de 15,7%.
- As amostras positivas submetidas à caracterização molecular foram alocadas
dentro do subtipo B, sendo esse o único subtipo identificado no país até o presente
momento.
- Os felinos domésticos com idade superior a 10 anos e acometidos por infecções
crônicas e recidivantes apresentaram a maior proporção de animais positivos para
FIV.
24
5. REFERÊNCIAS GERAIS
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2011.
28
6. ANEXO
FIGURA 1.
Figura 1. Eletroforese em gel de agarose mostrando produtos da amplificação
da nested-PCR para FIV. Canaleta 1: marcador de peso molecular de 100 pb; Canaletas 6-710: amostras positivas. Canaleta 11: controle positivo. Canaleta 12: controle negativo. Seta
indica 329 pb.
29
FIGURA 2.
Figura 2. Felino, macho, 10 anos e sem raça definida, positivo para FIV e
com dermatite profunda por Sporothrix schenkii.
30