Purificação e caracterização de asparaginase de Saccharomyces

Purificação e caracterização de asparaginase de Saccharomyces cerevisiae
clonada em Pichia pastoris: estudo de um possível fármaco antileucêmico
Luciana Facchinetti de Castro Girão, UFRJ/ IOC/ Farmanguinhos
Introdução
Aplicações da asparaginase
•
Utilizada há mais de 30 anos como agente terapêutico para tratamento de
leucemia linfoblástica aguda, melanosarcoma e linfomas não Hodgkin.
•
Produzida por bactérias (Escherichia coli e Erwinia chrisanthemi).
•Anafilaxia
•Provocam efeitos adversos
• Trombose;
• Hemorragia;
• Imunossupressão;
• Hepatotóxico;
• Nefrotóxico;
• Pancreatite.
Introdução
Mecanismo de Ação
•
Catalisa a reação:
CONH2CH2CHNH2COOH + H2O
Asparaginase
asparagina
COOHCH2CHNH2COOH + NH3
ác. aspártico
•
Células tumorais deficientes em asparagina sintetase.
•
Doses em torno de 1000 UI/Kg/Dia.
Introdução
Asparaginase no Brasil
•
O Brasil se encontra desabastecido em relação ao medicamento.
1 ‐ Alto custo;
‐ 10000 UI Elspar, R$ 80,00
‐ 2500 UI Oncaspar, US$ 3000,00
2 – Dependência tecnológica
Introdução
Asparaginase de Saccharomyces cerevisiae
•
pH ótimo próximo ao fisiológico (6,8)
•
Temperatura ótima próxima a fisiológica (37°C)
•
Utilização como medicamento
•
Alternativa para pacientes com rejeição a enzima bacteriana
•
No entanto, os níveis de produção são baixos
Introdução
Asparaginase de Saccharomyces cerevisiae
•
•
•
Gene ASP3 clonado em Pichia pastoris com sucesso.
Níveis de expressão em UI g‐1: Aumento de 7x em relação aos valores obtidos com S. cerevisiae
Desenvolvimento do bioprocesso em batelada alimentada em biorreator
de 2 e 5 litros.
(1) S. cerevisiae ‐ frascos agitados;
(2) P. pastoris – frascos agitados
(3) P. pastoris ‐ biorreator alta densidade celular
(4) P. pastoris ‐ biorreator alta densidade celular; condições de cultivo otimizadas
Ferrara et al, 2004.
Introdução
Pichia pastoris
•
O microrganismo é largamente utilizado em biologia molecular;
•
Microrganismo GRAS;
•
Cresce em meio simples e é metilotrófica;
•
Atinge altos níveis de densidade celular;
Células de P. pastoris
•
Padrão de glicosilação proteica semelhante a mamíferos.
Objetivo
Purificar e caracterizar a asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae clonada e
expressa em Pichia pastoris visando a produção de um fármaco antileucêmico.
Metodologia
Metodologia Analítica

Atividade da enzima asparaginase
• atividade de hidroxilaminólise (AHA)
asparagina + hidroxilamina
aspartohidroxamato + FeCl3
asparaginase
aspartohidroxamato +NH3
complexo Fe hidroxamato
Uma unidade internacional (UI) ‐ quantidade de enzima que forma 1 micromol de
produto (aspartohidroxamato) a partir de asparagina em 1 min
Resultados e discussão
Purificação da asparaginase
Exclusão Molecular (Superdex 200)
Troca iônica (Mono‐Q)
FS ‐ TI
(A)
% NaCl (….)
Resultados e discussão
Purificação da asparaginase
1
2
3
4
Resultados e discussão
Purificação da asparaginase
Etapa
Proteína Volume UI/mL
Total (mg) (mL)
UI
UI/mg
Purifica‐ Recuperação ção
Atividade
Extrato bruto
19,1
25
14,4 359 18,8
1,0
100%
Ultrafiltração
(50 kDa)
5,89
10
25,3 253 43,0
2,3
70,5%
Superdex
200
1,45
60
3,9
235 162,1
8,6
65,5%
Mono Q
0,9
53
3,5
184 204,4
10,9
51,3%
Resultados e discussão
Caracterização da asparaginase
7,2
9,0
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
46ºC
T ótima
0
2
4
6
pH
8
10
12
Absorvância500nm
Absorvância500nm
pH ótimo
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
Temperatura (◦C)
50
60
Resultados e discussão
Caracterização da asparaginase
Análise da glicosilação e desglicosilação por PNGase F
(B)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
(A)
kDa
97
66
45
30
20,1
14,4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Resultados e discussão
Caracterização da asparaginase
Estimativa do ponto isoelétrico por 2D‐PAGE
(C)
pI 4,55
3
10
Resultados e discussão
Caracterização da asparaginase
Estimativa da massa molecular dos monômeros )
1
2
48,6 kDa
46,0 kDa
Resultados e discussão
Caracterização da asparaginase
Identificação por espectrometria de massas (MALDI TOF/TOF))
Bandas
1
(48 kDa)
Proteína
Microorganismo
Asparaginase
Saccharomyces
cerevisiae
ID (gi)
NCBInr
Peptídeos
R.TADGTVPPDDAPEYAIGSGYLNPQK.S
gi|256269668
Score
Mascot
166
R.RTADGTVPPDDAPEYAIGSGYLNPQK.S
132
R.RTADGTVPPDDAPEYAIGSGYLNPQK.S
59
R.IASGFWTTK.M
70
K.IFGTGGTIASK.G
58
K.MNANSLDTFR.A
80
Cobertura de
sequência (%)
8,5%
19,6%
2
(46 kDa)
Asparaginase
Saccharomyces
cerevisiae
gi|256269668
Resultados e discussão
Caracterização da asparaginase
Estimativa da massa molecular por exclusão molecular (A) e por SDS‐PAGE em condições redutoras (B) A)
B)
Conclusão
Os resultados obtidos dão suporte à continuação da pesquisa visando o uso da
asparaginase de levedura recombinante como medicamento antileucêmico, já
tendo sido iniciados os estudos pré‐clínicos in vitro.
Agradecimentos
• Dr. Jonas Perales, Dra. Elba Bon e Dra. Maria Antonieta Ferrara
• Dra. Surza Rocha
•PDTIS – Fiocruz e FAPERJ
•Farmanguinhos e UFRJ