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Incertezas em Ensaios de Contagens Microbiológicas
*1
Fernando Mota de Oliveira MSc
Bruna Jaquelini Basso
Labwin Serviços Especializados Ltda
*1
Autor para correspondência:
Av Tancredo Neves, 274, bloco B, sala 734
Centro Empresarial Iguatemi,
Bairro Caminho das Árvores
CEP 41.820-020, Salvador-BA
E-mail: [email protected]
Tel. 71-9962-2865
Fax: 71-3371-4039
Resumo
Informações simples sobre cálculos de incertezas em ensaios de contagens microbiológicas são cada vez
mais requeridas. Uma metodologia simples e objetiva é aqui definida, inclusive com exemplos de cálculos,
1)
obtidos com base principalmente na referência .
Este artigo foi publicado inicialmente na edição nº 15 da Revista Analytica, fevereiro/março de 2005 com
1)
base na publicação inicial da referência
(Seppo I. Niemalä) de 2002. Nesta revisão consideramos a
revisão deste artigo feita em 2005 e atualizamos, complementamos, corrigimos ou facilitamos alguns
cálculos.
Palavras-chave: Incerteza; microbiologia; laboratório, intralaboratorial, interlaboratorial, proficiência
Summary
The Informations about uncertainty in quantitative determinations derived from cultivation of Microorganisms
are more frequently required in the last years. A simple and objective methodology is here defined, including
1)
calculations examples, based mainly in the reference .
This article was published initially in issue nº 15 Analytica Magazine, february/march 2005 based in the
1)
initial publication (2002) of reference (Sepplo I. Nemelã). This review was made based in the review of
2003 of the same publication and we are complementing, updating, correcting or making some more easy
some calculations.
Keywords: Uncertainty, microbiology, laboratory, intralaboratory, interlaboratory, proficiency
Introdução
Os ensaios de contagens microbiológicas geralmente seguem os procedimentos básicos a seguir:
a) Filtração em Membrana ou em Pour Plate (Pratos) em prato único (single-plate) ou prato múltiplo
(multiple-plate). Nestas técnicas faz-se contagem de colônias de microorganismos que se
desenvolvem em meios de culturas. Para um único prato o cálculo é feito por:
(1)
Onde: z = contagem de colônias, v = volume tomado.
O trabalho em prato múltiplo é como no exemplo em que se filtram 20mL e 80mL da mesma
amostra e têm-se contagens dentro das faixas “ideais” nas duas filtragens e o cálculo pode ser feito
1)
por :
(2)
Os resultados geralmente são expressos em UFC (Unidade Formadora de Colônia) por volume ou
por massa de amostra.
b) Tubos múltiplos nas modalidades “Uma diluição e 10 tubos de 10mL”, “Uma diluição e 5 tubos de
20mL”, “3 ou mais diluições com 10 tubos cada”, “3 ou mais diluições com 5 tubos cada” e “3 ou
mais diluições com 3 tubos cada”, etc. Para tubos múltiplos os resultados são estimados com base
em probabilidades estatísticas, calculadas com base nos números de tubos com resultados
positivos e em suas respectivas diluições, que são tabelados adequadamente. Os resultados
geralmente são expressos em NMP (Número Mais Provável) por volume ou por massa de amostra.
As tabelas também fornecem além dos resultados os valores de Limites Superiores e Inferiores para
os resultados, com nível de confiança de 95%.
Os cálculos serão obtidos por combinação de incertezas padronizadas relativas das diversas etapas dos
métodos. A letra “w” será utilizada para representar incerteza padronizada relativa na forma de índice. Para
incerteza relativa percentual utilizaremos “w%”, que seria “w” multiplicado por 100. Neste artigo procuramos
trabalhar sempre que possível com valores percentuais como forma de facilitar a visualização da
importância dos valores intermediários.
Metodologia
Expressão de Resultados
Tanto os resultados das amostras como os resultados das incertezas devem ser expressos com 2
3)
algarismos significativos . Devem ser expressos em números inteiros para valores menores que 10 ou em
notação científica para números maiores ou iguais a 10. As contagens devem ser usadas nos cálculos com
todos os números de significativos, e os demais números usados nos cálculos com mais significativos que
os resultados finais sempre que possível.
Para resultados altos, expressos em notação científica, deve-se utilizar o mesmo expoente. Exemplo: Para
o resultado de uma amostra de alimento, com uma incerteza expandida relativa de 25%, uma forma
6
6
adequada de expressão é 1,3X10 + 0,33X10 UFC/g.
Para resultados de tubos múltiplos (NMP) pudemos verificar que a melhor forma de expressão é com o
resultado obtido seguido da faixa de confiança das tabelas de NMP (do limite inferior ao limite superior)
utilizando também a notação científica quando necessário. Exemplo: 6,9 (2,5 a 1,5 x 10) NMP/100mL
Fontes de Incertezas
Em ensaios químicos, os estudos de repetitividade feitos na validação são úteis nos cálculos de incertezas,
sendo com freqüência a principal causa de incerteza.
Nos ensaios microbiológicos as principais causas de incertezas inviabilizam o uso de repetitividade e são:
a) Imprevisível número de colônias, que varia muito de caso a caso, e que em contagens baixas é a
principal fonte de incertezas (probabilidade de distribuição dos microorganismos na amostra);
b) Instabilidade das amostras. As amostras são suspensões (razoavelmente heterogêneas) de
partículas, que se multiplicam, morrem, etc.
A incerteza do ensaio depende muito de condições que na maioria das vezes não se repetem.
As regras de incertezas tipo A e tipo B, combinação através de raiz da soma dos quadrados (soma vetorial),
2)
etc. usadas em ensaios químicos também são válidas.
As principais fontes de Incertezas para os ensaio por filtração em membrana ou Pour Plate são:
a) Incerteza da medição da amostra (wV) - pesagem ou medição volumétrica.
b) Incerteza das diluições volumétricas da amostra (wF)
c) Incerteza da Leitura ou Contagem (wL) - incerteza do operador ao contar as colônias.
d) Incerteza da Dispersão de Poisson (wZ) - incerteza devido à heterogeneidade da amostra.
e) Incerteza da Confirmação (wP) - somente para confirmação parcial, é a incerteza devido às
restrições estatísticas do número de colônias usadas para a confirmação e o número de colônias
confirmadas.
As principais fontes de Incertezas para os ensaio por Tubos Múltiplos são:
a) Incerteza dos tubos múltiplos, inerente às probabilidades de distribuições dos microorganismos nos
diversos tubos tomados.
b) Incerteza da medição da amostra (wV) - pesagem ou medição volumétrica. Geralmente é
desprezível comparando com o item “a)” com valor bem mais alto.
c) Incerteza das diluições volumétricas da amostra (wF). Geralmente é desprezível comparando com o
item “a)” com valor bem mais alto.
Incertezas das medições volumétricas (wV) e diluições (wF): As incertezas das medições volumétricas e
diluições podem ter influência razoável na incerteza do resultado final no caso de filtração em membrana e
Pour Plate. Mais abaixo demonstramos que estas medições têm influência desprezível nos trabalhos típicos
com tubos múltiplos (TM).
Incertezas de Medições e diluições volumétricas em geral, que dependem de erros de leitura, variações de
temperatura e de incertezas de calibração das vidrarias, podem ter valores razoáveis quando se faz muitas
diluições da amostra. As tabelas que seguem mostram incertezas padronizadas típicas para vidrarias e
diluições.
Tabela –1: Incertezas típicas de medições volumétricas em um laboratório de Microbiologia
Instrumento
Pipeta Graduada
Pipeta Graduada
Pipeta Graduada
Pipeta Graduada
Pipeta Graduada
Pipeta Graduada
Proveta
Proveta
Microsseringa de 10µL
Micropipeta
Micropipeta
Micropipeta
“Dispenser” esterilizado
“Dispenser” esterilizado
“Dispenser” esterilizado
Volume (mL)
0,1
0,5
1,0
5,0
10
9
90
225
0,001 (1µL)
0,1
1,0
0,5
4,5
9,0
99
u (mL)(*)
0,0081
0,025
0,025
0,027
0,05
0,05
1
1,15
0,0001
0,0051
0,0087
0,005
0,024
0,089
0,249
wv
0,08
0,05
0,025
0,005
0,005
0,005
0,01
0,0063
0,10
0,05
0,009
0,01
0,005
0,01
0,025
wv%
8%
5%
2,5%
0,5%
0,5%
0,5%
1%
0,63%
10%
5%
0,9%
1%
0,5%
1%
2,5%
(*) Os valores de incerteza padronizadas das vidrarias podem ser obtidos de certificados de calibrações típicos, dividindo-se as
incertezas expandida pelos respectivos valores de k. Outra opção interessante é utilizar as tolerâncias das vidrarias, das respectivas
normas de calibração, considerando-as como incertezas expandidas e dividindo por um valor de Raiz(3), considerando-se assim como
uma incerteza Tipo-B com distribuição retangular. O uso das tolerâncias geralmente gera valores mais adequados ao trabalho rotineiro
do laboratório uma vez que as calibrações são feitas em condições otimizadas para volumetria (temperatura bem controlada, cuidados
específicos, etc) e uma vez que as vidrarias tenham sido calibradas farão medições dentro destes limites de incertezas. Outra
alternativa é obter o desvio padrão das medições volumétricas por pesagem em balança analítica de medições seguidas de água
destilada (umas 7 medições). O volume aproximado pode ser obtido dividindo a massa obtida pela massa específica da água
(aproximadamente 0,9982 a 20ºC) e o desvio padrão (DP) dos volumes obtido será utilizado para obter o W V calculado como
“DP”/”Volume médio”.
Tabela – 2: Incertezas típicas de diluições em um laboratório de microbiologia
Nº
1
2
3
4
Diluição
-1
1:10 (10 )
-1
1:10 (10 )
-1
1:10 (10 )
-1
1:10 (10 )
Execução
10mL-Pipeta + 90mL–proveta
1mL–Pipeta + 9mL–pipeta
0,5mL–Micropipeta + 4,5mL–Dispenser
25±0,2g (*) + 225mL– Proveta
Cálculo (combinação)
2
2
2
2
Raiz ((1 + 90 0,005 ) / (10 + 90) )
2
2
2
2
Raiz ((0,05 + 9 0,025 ) / (1 + 9) )
2
2
2
2
Raiz ((0,024 + 4,5 0,01 ) / (4,5+0,5) )
2
2
2
2
Raiz((1,15 +225 *0,0048 )/(25+225) )
(*) Variação típica tolerada na medição de massas de alimentos. Assim o u = 0,2/Raiz(3) = 0,12 e w = 0,0048 (0,48%).
As fórmulas para cálculos de incertezas de diluição, por adição de 2 volumes são dadas por:
wF (%)
1,1%
2,3%
1,0%
0,63%
(3)
(4)
Sendo: F = Fator de diluição, wf = Incerteza relativa de uma diluição, a = Volume de Amostra, b = Volume
de Branco, ub = Incerteza de b, wa = incerteza relativa de a.
Se várias diluições iguais são feitas, onde k é o número de diluições, a incerteza final é dada por:
(5)
-5
Fazendo-se uma diluição 10 , segundo o procedimento Nº 1 da Tabela-2, em diluições seguidas, a
2
incerteza da diluição (wF) será dada por Raiz ( 5 x 1,1% ) = 2,46%.
Se o procedimento de diluição mudar no mesmo ensaio, o que é pouco comum, será necessário obter a
incerteza do fator de diluição por:
(6)
Incerteza da leitura (wL): Depende de olho e mente humana. Uma pessoa com freqüência mostrará
resultados diferentes para contagens lidas repetidas vezes. Em situações “fáceis” as pessoas geralmente
erram na ordem de alguns porcentos (1%, 3% ....). Em amostras “difíceis” (populações misturadas, métodos
mais difíceis, junção de colônias, etc.) os erros podem ser bem maiores. A incerteza relativa da leitura varia
pouco com o número de colônias. Leituras em duplicata de pratos (Ver no anexo-I) podem oferecer um
indicativo da incerteza relativa da leitura. O valor médio relativo, obtido para cada ensaio, pode ser
combinado nos cálculos de incerteza. Para tubos múltiplos considera-se não haver erro de leitura, e uma
incerteza referente à probabilidade de erro dos tubos múltiplos, é que é considerada. A incerteza de leitura
em contagens por membrana ou Pour Plate pode ser feita de duas formas:
a) Um único Analista lê os mesmos pratos ou placas duas vezes em um intervalo de tempo curto que
não cause alterações nas contagens. O cálculo pode ser feito pela equação (7). Geralmente esta
forma de determinação é utilizada quando somente um Analista costuma fazer as leituras para um
determinado método.
b) 2 ou mais Analistas lêem os mesmos pratos ou placas em um intervalo de tempo curto que não
cause alterações nas contagens. Quando o teste é feito desta forma o valor de wL obtido serve para
representar o método para todo o laboratório. O cálculo é feito pela média dos CV (desvio padrão
relativo) de cada amostra.
c) Em ambos os casos o ideal é somente considerar nos cálculos valores dentro da faixa “ideal” de
contagem citada no método.
d) Uma vez determinado o wL de um certo método o mesmo será válido por tempo indeterminado ou
até que haja uma mudança considerável no método ou no pessoal que faz as contagens.
(7)
Dispersão de Poisson (wz): Considerando a heterogeneidade da suspensão em análise, com unidades
formadoras de colônias, a incerteza wz pode ser dada por:
(8)
Onde: z = contagem.
Incerteza da confirmação (wp): Algumas colônias podem ser testadas para confirmação, gerando um fator
de correção para o resultado, dado pela equação (9). Para uma distribuição binomial a incerteza relativa (w)
é dada pela equação (10):
(9)
(10)
Onde: p = fator de correção, n = número de colônias pegas para confirmação, k = colônias confirmadas.
Confirmando-se 5 colônias em 100 escolhidas o erro é de 43%. Confirmando-se 10 colônias em 100
escolhidas o erro é de 30%. Esta incerteza também pode ser calculada por “Poisson-binomial” e por
1)
“quadrado de RSD” , mas com resultados semelhantes.
Modelos matemáticos para resultados e suas incertezas
No cálculo de resultados em membrana e pour plate normalmente entram Contagem (leitura), Distribuição
de Poisson, Fator de Diluição e Volume de teste. O fator de correção de confirmação (p) também pode ser
inserido.
Tempo de leitura e temperatura de incubação são algumas vezes críticos (falhas em interlaboratoriais
mostram isto com freqüência), mas não há como estimar este tipo de erro, considerado “grosseiro”.
Recomenda-se apenas que durante a validação se definam limites adequados para os tempos de leitura e
temperatura, procurando seguir rigorosamente nas análises rotineiras para evitar a ocorrência deste tipo de
problema.
Para contagens (membrana e Pour Plate)
O resultado é dado por:
(11)
Onde y = Resultado, F = Fator de Diluição da amostra, z = contagem e v = Volume da porção de teste.
Quando há confirmação, o fator p deve ser inserido na fórmula:
(12)
A incerteza da leitura (L), embora não faça parte da fórmula deve também participar do cálculo de incerteza.
A incerteza padronizada relativa (w) é dada por:
(13)
Onde:
wF = Incerteza padronizada relativa das diluições (ver fórmulas de incertezas volumétricas)
wz = Incerteza padronizada relativa da contagem (heterogeneidade, etc.) = (raiz (1/z))
wv = Incerteza do volume de teste (ver fórmulas de incertezas volumétricas)
wp = Opcional – Incerteza padronizada relativa do fator de confirmação = raiz ((n-k)/kn)
wL = Incerteza relativa padronizada da leitura individual. Fazer diversos testes de leituras em replicatas (ver
no Anexo-I) e calcular um valor médio de erro relativo para cada método de ensaio.
Após obtido o valor de w, o mesmo deve ser convertido em valor absoluto, ao ser multiplicado pela
contagem da amostra e multiplicado por um fator de abrangência k (geralmente 2, para 95% de confiança)
para gerar a incerteza expandida do resultado.
Exemplo 1: Contagem em prato (Pour Plate) – Prato único
-3
Uma amostra foi diluída a 10 e um único prato continha z = 200 colônias após encubação. A diluição foi
obtida em 3 etapas de 1:10 conforme procedimento Nº 1 da Tabela 2, e o prato foi inoculado com 1mL
através de micropipeta. Um experimento feito com este ensaio previamente demonstrou que os analistas
estão sujeitos a uma incerteza de leitura (ver Anexo-I, Opção 2) de 9%.
20 colônias foram tomadas para confirmação e somente 12 foram confirmadas.
5
Resultado = 1000 x 200 x 12 / 20 = 1,2 x 10 UFC/mL
2
wF = Raiz(3 X 1,1% ) = 1,9%
wz = (raiz (1/200)) x 100 = 7,1%
wv = 0,9% (incerteza relativa de 1mL com micropipeta)
wp = Raiz ((20-12)/240) X 100 = 18,3%
wL = 9%.
2
2
2
2
2
w = Raiz (1,9 + 7,1 + 0,9 + 18,3 + 9 ) = 21,7%. Incerteza Expandida (com k=2): 43,4% (~43%).
5
5
Expressão final do resultado: 1,2 x 10 + 0,52 x 10 UFC/mL
Observação:
Em um dos exemplos da referência 1), assumiu-se, em um alimento, uma variação adicional de +17% causada pela heterogeneidade
da amostra. Em um outro exemplo, uma variação adicional de +20% foi assumida como causada por mortandade ou multiplicação
bacteriana (instabilidade da amostra). O leitor deve avaliar se considerações deste tipo são interessantes de acordo com a experiência
com os tipos de amostra analisados rotineiramente.
Exemplo 2: Contagem em prato (Pour Plate) – Prato Múltiplo
-1
-2
-3
-4
-3
Uma amostra foi analisada em 4 diluições (10 ; 10 ; 10 e 10 ). O prato com 10 continha 180 colônias e
-4
-1
-2
o prato com 10 continha 20 colônias após encubação. Os pratos de 10 e 10 apresentaram-se com
número muito grande colônias para contar, sendo desconsiderados. As diluições foram todas feitas de 1:10
conforme procedimento Nº 1 da Tabela 2, e os pratos foram inoculados com 1mL através de micropipeta.
Um experimento feito com este ensaio previamente demonstrou que os analistas estão sujeitos a uma
incerteza de leitura (ver Anexo-I, Opção 2) de 9%.
10 colônias foram tomadas para confirmação e todas foram confirmadas.
Resultado Segundo
1)
-3
-4
5
= (180 + 20)/(10 + 10 ) = 1,8 x 10 UFC/mL
2
wF = Raiz(3 X 1,1% ) = 1,9% (o mais concentrado é a diluição nominal)
wz = Raiz (1/(20+180)) x 100 = 7,1%
Neste caso o que interessa é a incerteza do volume total das 2 diluições, um total de 2mL. A incerteza
relativa do volume dos 2mL é menor que a incerteza relativa de cada 1mL medido.
Considerando-se a medição de 1mL com micropipeta com u = 0,0087mL (0,87%)
2
uV = Raiz (2 * 0,0087 ) = 0,012
wV = 0,012 / 2 = 0,0060 ou wV% = 0,60%
wp = 0
wL = 9%.
2
2
2
2
2
w = raiz (1,9 + 7,1 + 0,6 + 0 + 9 ) = 11,6%. Incerteza Expandida (com k=2): 23,2% (~23%).
5
5
Expressão final do resultado: 1,8 x 10 + 0,42 x 10 UFC/mL
Para incertezas de tubos múltiplos com uma única diluição ou 3 ou mais diluições
Para tubos múltiplos com uma única diluição o resultado é dado por:
(14)
Onde: y = resultado, F = Fator de diluição, v = volume do teste, Ln=Logarítimo natural (base e), n = total de
tubos e s = total de tubos com ausência (estéreis).
A equação 14 pode ser dispensada, pois os métodos apresentam tabelados os resultados e também os
limites com 95% de confiança, que somente podem ser obtidos por programa de computador.
Quando se utiliza 3 ou mais diluições, com 3, 5 ou 10 tubos em cada, os cálculos tanto de resultados como
de limites somente podem ser feitos interativamente através de programas de computador, de forma que o
uso das tabelas presentes nos métodos com resultados e limites com 95% de confiança é quase sempre a
melhor opção.
A incerteza dos tubos múltiplos é a principal fonte de incerteza e com freqüência torna as incertezas do fator
de diluição e do volume desprezíveis.
De posse dos limites superior e inferiores dos resultados podemos obter o valor de wTM por:
(15)
De posse das tabelas de NMP esta é a forma mais fácil de obter a incerteza padronizada. O wTM permite
obter um intervalo simétrico com relação ao resultado, diferente dos limites superior e inferior das tabelas,
permitindo assim o uso do sinal ±. Uma pequena divergência nos intervalos pode ser percebida. Mais duas
1)
outras formas de cálculos são citadas na referência e que levam a resultados semelhantes.
(16)
Onde:
wTM: Incerteza relativa padronizada da estimativa de tubos múltiplos (ver logo acima).
wF: Incerteza do fator de diluição (ver fórmulas de incertezas volumétricas).
wv: Incerteza do volume de teste (ver fórmulas de incertezas volumétricas)
Após obtido o valor de w, o mesmo deve ser convertido em valor absoluto, ao ser multiplicado pela
contagem da amostra e multiplicado por um fator de abrangência k (geralmente 2, para 95% de confiança)
para gerar a incerteza expandida do resultado.
Exemplo 3: Tubos múltiplos com uma diluição
Um ensaio de E. Colli em tubos múltiplos foi feito com 10 tubos, com um volume de 10mL cada, e a amostra
foi posta nestes tubos sem diluição. Após a encubação dos 10 tubos, 5 apresentaram resultado positivo. O
resultado é expresso em NMP/100mL.
Nas tabelas de NMP foram obtidos:
Resultado: 6,9 NMP/100mL
Limite Inferior (LI): 2,5 NMP/100mL
Limite Superior (LS): 15 NMP/100mL
Incerteza de tubos múltiplos:
wTM = (Ln(15)-Ln(2,5))/4 = 0,448 ou wTM% = 44,8%
Incerteza da diluição: Não se aplica
Incerteza da medição volumétrica
Neste caso o que interessa é a incerteza do volume total dos 10 tubos, um total de 100mL. A incerteza
relativa do volume dos 10 tubos juntos é menor que a incerteza relativa de cada medição individual
Considerando-se a medição de 10mL com pipeta graduada com u = 0,05mL
2
uV = Raiz (10 * 0,05 ) = 0,158
wV = 0,158 / 100 = 0,00158 ou wV% = 0,158%
2
2
wC = Raiz ( 44,8 + 0,158 ) = 44,8%
Desta forma fica demonstrado que a incerteza final não sofre influência perceptível da incerteza volumétrica
(sem considerar as incertezas volumétricas w% já era 44,8%)
O valor de U pode ser calculado considerando-se k=2 (95% de confiança) por:
U = 6,9 NMP/100mL * 44,8% * 2 /100 = 6,18 NMP/100mL
Expressão final do resultado: 6,9 + 6,2 NMP/100mL (*) ou melhor 6,9 (2,5 a 1,5 x 10) NMP/100mL
(*) O cálculo da incerteza padronizada de tubos múltiplos com base nos limites inferior e superior (equação
15) é necessário para realizar a combinação com outras fontes de incerteza do método. No entanto se
observa que invariavelmente leva a um intervalo de confiança a 95% incoerente, onde muitas vezes o
resultado zero faz parte. Uma vez que verifica-se facilmente que as demais fontes de incertezas
(volumétricas) são desprezíveis nesta técnica consideramos mais adequado expressar os resultados
simplesmente seguidos da faixa de limites das tabelas de NMP.
Exemplo 4: Tubos múltiplos com uma diluição contagem baixa
Este exemplo é do mesmo ensaio anterior (exemplo 2), mas com somente 2 tubos dando positivos.
Nas tabelas de NMP foram obtidos:
Resultado: 2,2 NMP/100mL
Limite Inferior (LI): 0,37 NMP/100mL
Limite Superior (LS): 8,2 NMP/100mL
Incerteza de tubos múltiplos:
wTM = (Ln(8,2)-Ln(0,37))/4 = 0,775 ou wTM% = 77,5%
Incerteza da diluição: Não se aplica
Incerteza da medição volumétrica
2
uV = Raiz (10 * 0,05 ) = 0,158
wV = 0,158 / 100 = 0,00158 ou wV% = 0,158%
2
2
wC = Raiz (77,5 + 0,158 ) = 77,5%
Desta forma fica também demonstrado que a incerteza final não sofre influência da incerteza volumétrica
(sem considerar as incertezas volumétricas w% já era 77,5%).
O valor de U pode ser calculado considerando-se k=2 (95% de confiança) por:
U = 2,2 NMP/100mL * 77,5 * 2 / 100 = 3,41 NMP/100mL
Expressão final do resultado: 2,2 + 3,4 NMP/100mL
ou melhor
2,2 (0,37 a 8,2) NMP/100mL.
Exemplo 5: Tubos múltiplos com 3 diluições
Na análise de Staphylococcus aureus em um alimento, tomou-se 25±0,2g de amostra e diluiu-se com 225
mL medidos em proveta de solução salina peptonada 0,1%, obtendo-se assim uma diluição considerada
como 0,1. Foram feitas 2 diluições subsequentes (1mL Pipeta Graduada + 9mL com Pipeta Graduada) para
obter as diluições 0,01 e 0,001. Com micropipeta esterilizada adicionou-se 1mL de cada diluição em 3 tubos
contendo caldo telurito manitol glicina (GC). Os tubos foram encubados a 36±1ºC por 48 horas e as leituras
presentes confirmadas nas 3 séries de 3 tubos foram de 2, 2 e 1 (2-2-1).
Nas tabelas de NMP para 3 diluições com 3 tubos cada foram obtidos:
Resultado: 28 NMP/g
Limite Inferior (LI): 8,7 NMP/g
Limite Superior (LS): 94 NMP/g
Incerteza de tubos múltiplos:
wTM = (Ln(94)-Ln(8,7))/4 = 0,595 ou wTM% = 59,5%
Incerteza da diluição:
1a. diluição: 0,63% (Tabela-2, Tipo 4)
2a e 3a diluições: 2,3% cada uma (Tabela-2, tipo 2).
Considera-se a incerteza do tubo mais concentrado com presença, ou seja, wF = 0,63% somente. Do
contrário seria necessário combinar com as diluições feitas posteriormente.
Incerteza da medição volumétrica:
O que interessa é a incerteza do volume total tomado para os 3 tubos, ou seja 3 X 1mL em Micropipeta (u =
0,0087 da Tabela-1).
2
uV = Raiz (3 * 0,0087 ) = 0,015
wV = 0,015 / 3 = 0,005 ou wV% = 0,5%
2
2
2
wC = Raiz ( 59,5 + 0,63 + 0,5 ) = 59,5%
A influência da incerteza volumétrica foi desprezível frente à incerteza das probabilidades dos tubos
múltiplos (sem considerar as incertezas volumétricas w% já era 59,5%).
O valor de U total pode ser calculado considerando-se k=2 (95% de confiança) por:
U = 28 NMP/g * 59,6% * 2 /100 = 33,4NMP/g ou ~ 33 NMP/g
Expressão final do resultado: 2,8 x 10 + 3,3 x 10 NMP/100mL ou melhor 2,8 x 10 (0,87 a 9,4 x 10)
NMP/100mL
Resultados e Discussões
Além das incertezas de medições volumétricas, os métodos de contagens microbiológicas estão sujeitos a
incertezas menos previsíveis que os métodos de ensaios físico-químicos e instrumentais, tendo também
valores bem maiores de incertezas em seus resultados.
Em métodos de contagens em membrana ou Pour Plate a principal fonte de incerteza costuma ser a
incerteza da leitura das placas, mas em contagens baixas a “Distribuição de Poisson” (probabilidade de
tomar colônias para análise) predomina fortemente. Quando são feitas confirmações parciais o fator de
correção de confirmações também pode ser a incerteza predominante.
Em métodos de Tubos Múltiplos a incerteza das probabilidades dos Tubos múltiplos costuma ser a principal
fonte de incerteza, como regra tornando as demais fontes de incertezas desprezíveis. Verificamos que a
melhor forma de expressão da incerteza dos resultados de tubos múltiplos é simplesmente mostrando a
faixa do limite inferior ao limite superior a 95% das tabelas de cálculos de NMPs.
Outras fontes de incertezas menos previsíveis, como heterogeneidade de amostras de alimentos,
instabilidade das amostras (multiplicação e morte de microorganismos), etc. freqüentemente não podem ser
devidamente estimadas para participar dos cálculos de incertezas.
Anexo-I – Incerteza de Leitura
O objetivo é obter uma incerteza média relativa para cada ensaio.
Este procedimento pode ser executado durante a validação do método ou posteriormente.
Opção 1 – Leitura por vários Analistas: Alguns analistas (2 ou mais) lêem o mesmo prato ou membrana
sem conhecer a leitura dos outros. Fazer com cerca de 10 pratos ou membranas, mas considerar somente
contagens dentro da faixa “ideal” definida no respectivo método.
O coeficiente de variância médio (desvio padrão relativo médio) representa a incerteza para o ensaio,
independente do analista.
Procedimento:
a) cerca de 10 pratos ou membranas são lidos pelos analistas disponíveis, sem que um saiba o valor
da contagem do outro.
b) Tabelar os resultados e calcular a média, o desvio padrão e o CV (Desvio padrão *100 / Média) de
cada placa ou membrana.
c) Somar os CVs e dividir pelo número de placas ou membranas, obtendo o CV médio (wL).
Teste
1
2
3
4
5
6
7
Analista A
80
110
345
33
12
212
180
wL% (CV médio)
Analista B
75
90
290
38
11
235
175
Analista C
73
90
290
38
11
235
175
Analista D
75
90
290
38
11
235
175
CV %
3,9
10,5
9,1
6,8
4,4
5,0
1,4
5,9%
Opção 2 – Leitura em duplicata: Um mesmo analista lê o mesmo prato ou membrana em horas diferentes
(em um intervalo de tempo que não permita mudança na contagem) sem ter os dados da contagem anterior,
mas considerar somente contagens dentro da faixa “ideal” definida no respectivo método.
A fórmula para incerteza de leituras para cálculos pode ser definida como:
(17)
Onde: wL = Incerteza padronizada relativa de Leituras, n=Número de Testes (duplicatas de leituras),
z=contagem.
Procedimento:
a) Ler em duplicata uma série de cerca de 10 (n) pratos ou membranas. O analista não deverá ter
disponível o registro da leitura anterior ao fazer a segunda leitura.
2
b) Calcular o desvio relativo de cada leitura elevado ao quadrado ((z1-z2)/(z1+z2))
c) Somar os desvios relativos.
d) Multiplicar a soma anterior por 2/n.
e) Obter a raiz do resultado anterior.
Contagem – A
80
Contagem – B
75
Diferença
5
((z1-z2)/(z1+z2))
0,00104
2
110
345
33
12
212
180
90
290
38
11
235
175
20
55
5
1
23
5
Total =>
0,01
0,00750
0,00496
0,00188
0,00264
0,000199
0,0282
wL Calculado = Raiz((2/7)*0,0282)=0,090 ou 9,0%
Referências
1) Seppo I. Niemalä: Uncertainty of Quantitative Determinations Derived from Cultivation of
Microorganisms. Mittatekniikan Keskus-Centre for Metrology and Accreditation, MIKES
Pubblication,
Helsinki,
Finland,
2003.
Disponível
em
http://www.mikes.fi/documents/upload/J4_2003.pdf. Acesso 20 de julho de 2009.
2) Eurachem CITAC Group: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Second Edition,
Eurachem, UK, 2000. Disponível em http://www.measurementuncertainty.org/mu/QUAM2000-1.pdf.
Acesso 20 de julho de 2009.
3) MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento: Instrução Normativa Nº 62 (IN-62),
Agosto de 2003. Disponível em www.Labwin.com.br/IN62.pdf. Acesso 20 de julho de 2009.
4) FDA-CFSAN: Bacteriological Analytical Manual Online (BAM) Appendix 2, Most Probable
Number
from
Serial
Dilutions.
Disponível
em
http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/
default.htm. Acesso 20 de julho de 2009.
Salvador-Ba, 09 de setembro de 2009