Produção de citocinas por células mononucleares - IPTSP

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
CLAYSON MOURA GOMES
Produção de citocinas por células mononucleares humanas
estimuladas por formas amastigotas de Leishmania
(Viannia) braziliensis
Goiânia
2012
i
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e
Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal
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com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para
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científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico:
[ X ] Dissertação
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Autor(a): Clayson Moura Gomes
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gatício do autor
Agência de fomento:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Sigla:
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Brasil
UF:
Goiás
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Título:
Produção de citocinas por células mononucleares humanas estimuladas por
formas amastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis
Palavras-chave: Leishmania braziliesis, amastigotas, IL-1, IL-6, IL-10, TGF-β, leishmaniose
humana
Título em outra língua:
Cytokine production by human mononuclear cells estimulated by
amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis
Palavras-chave em outra língua: Leishmania braziliesis, amastigotes IL-1, IL-6, IL-10, TGFβ, human, leishmaniasis
Área de concentração:
Imunologia
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
03/02/2012
Programa de Pós-Graduação:
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
Orientador(a): Milton Adriano Pelli de Oliveira
CPF:
80151000620
E-mail:
[email protected]
Co-orientador(a):
CPF:
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3. Informações de acesso ao documento:
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imprescindível o envio do(s)
Data: ____ / ____ / _____
Assinatura do(a) autor(a)
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
CLAYSON MOURA GOMES
Produção de citocinas por células mononucleares humanas
estimuladas por formas amastigotas de Leishmania
(Viannia) braziliensis
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás para
obtenção do Título de Mestre em
Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientador: Milton Adriano Pelli de
Oliveira
Goiânia
2012
i
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP)
Gomes, Clayson Moura.
Leishmania (Viannia) braziliensis amastigotes stimulate
production of cytokines related to Th17 and regulatory T
cells by peripheral blood mononuclear cells from healthy
donors [manuscrito] / Clayson Moura Gomes. - 2013.
115 f. : il., figs.
Orientador: Prof. Dr. Milton Adriano Pelli de Oliveira
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2012.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e tabelas.
Apêndices.
ii
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública
da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Clayson Moura Gomes
Orientador (a): Prof. Dr Milton Adriano Pelli de Oliveira
Membros:
1. Prof. Dr Wilson de Melo Cruvinel
2. Prof. Drª Irmtraut Araci Hoffmann Pfrimer
3. Prof. Dr Milton Adriano Pelli de Oliveira
Data: 03/02/2012
iii
DEDICATÓRIA...
Este trabalho é dedicado à minha mãe: Nárima
Maria Mênezes de Moura, pelo apoio integral,
confiança, incentivo, carinho, amor, compreensão e todos
os outros bons sentimentos existentes.
iv
“You must be the change you wish to see
in the word” - Gandhi
v
AGRADECIMENTOS
Aos meus familiares, em especial à minha irmã e meu padrasto por acreditarem
em mim e aos meus avós maternos por terem me ensinado grandes lições.
A meu orientador Drº Milton Adriano Pelli de Oliveira pela sua orientação,
dedicação, apoio, paciência, ensinamentos e principalmente pela oportunidade
concedida.
Aos professores e amigos Drº Wilson de Melo, Drª Irmtraut Araci, Drª Flávia
Ikeda, Drº Hermínio Sobrinho, Drª Eliane, Drª Fátima Dias e Drª Leda Vieira que
contribuíram imensamente para minha formação profissional, acadêmica e como
pessoa.
Ao amigo Gustavo Nascimento que foi o principal responsável pelo meu
ingresso ao laboratório, à Lucilla Ávila pela amizade e companheirismo em estudos,
festas, brigas, conversas e situações diversas e à Bruninha Daniella que me ajudou nos
momentos mais difíceis do mestrado.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Citocinas: Marcondes, Lucas, Walki,
Danilo, Mayara Miranda, Maína, Vânia, Bruno, Fernanda, Aryanne, Lohane e Roberta
pela amizade e contribuição neste trabalho.
Aos amigos e colegas da pós graduação e iniciação científica: Hildelberto, Aline,
Rejane, Mayara Magiolli, Adeliane, Monalisa, Michele, Ildefonso Jr, Arissa, Camila
Imai, Karol, Rodrigo, Andréia e Hélio.
Aos amigos e colegas do LAGI em Belo Horizonte: Daniel, Paulinha, Dionê,
Caio, Luciana, Matheus, Erick, Leonardo, Lili, Magda, Louisa, Hassan, Ana Clara,
Yuri, Evérton e Ricardo que me ensinaram, ajudaram e me divertiram durante os seis
meses que passei na UFMG.
A todos os professores, técnicos e funcionários do IPTSP, em especial à Gilda,
Zezinho, Karine, Tiago, Marco Vítor e Natália.
Aos portadores de leishmaniose tegumentar americana e doadores sadios que
participaram e contribuíram para este estudo.
Ao Cnpq, à Capes e minha família pelo apoio financeiro.
Enfim, a todos que contribuíram de alguma forma para a conclusão deste
trabalho.
vi
SUMÁRIO
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS..............................................................................ix
SÍMBOLOS, SIGLAS, ABREVIATURAS..................................................................xi
RESUMO......................................................................................................................xiii
ABSTRACT...................................................................................................................xv
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................01
1.1 Leishmaniose – características gerais........................................................................01
1.2 Leishmânia – ciclo biológico.....................................................................................05
1.3 Geração de uma resposta imune adaptativa: Importância das citocinas....................08
1.4 Resposta imune a leshmaniose tegumentar ..............................................................11
2 JUSTIFICATIVA ...................................................................................................14
3 OBJETIVO..................................................................................................................16
3.1 Objetivo geral............................................................................................................16
3.2 Objetivos específicos.................................................................................................16
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................17
vii
4.1 Camundongos............................................................................................................17
4.2 Parasitos e infecção dos camundongos......................................................................17
4.3 Doadores....................................................................................................................18
4.4 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) .......................18
4.5 Detecção de citocinas pelo ensaio imunoenzimático ...............................................18
4.6 Detecção de citocinas pelo método da reação em cadeia da polimerase (PCR) em
tempo real........................................................................................................................19
4.7 Análise estatística dos resultados..............................................................................21
5 RESULTADOS...........................................................................................................22
5.1 Caracterização dos isolados do estudo......................................................................22
5.2 Avaliação da habilidade de diferentes isolados induzirem a produção de IL-1β, IL-6,
IL-10, IFN-γ , IL-17A e TNFα....................................................................................24
5.3 Indução da produção de IL-1β por PBMCs de um mesmo doador estimuladas com
formas amastigotas de diferentes isolados de L. (V.) braziliensis oriundos de lesões
cutâneas ou mucosas........................................................................................................29
5.4 Indução da produção de IL-6 por PBMCs de um mesmo doador estimuladas com
formas amastigotas de diferentes isolados de L.(V.) braziliensis oriundos de lesões
cutâneas ou mucosas........................................................................................................31
viii
5.5 Indução da produção de IL-10 por PBMCs de um mesmo doador estimuladas com
formas amastigotas de diferentes isolados de L.(V.) braziliensis oriundos de lesões
cutâneas ou mucosas........................................................................................................33
5.6 Expressão de mRNA para de IL1, IL10 e TGFβ em PBMCs estimuladas com
formas amastigotas de diferentes isolados de L.(V.) braziliensis oriundos de lesões
cutâneas ou mucosas pela PCR em tempo real................................................................35
6 DISCUSSÃO...............................................................................................................37
7 CONCLUSÃO.............................................................................................................43
8 REFERÊNCIAS..........................................................................................................44
ix
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
TABELAS
Tabela 1 Sequência dos iniciadores................................................................................20
Tabela 2 Caracterização dos isolados no estudo.............................................................23
FIGURAS
Figura 1 Ciclo de vida da leishmânia.............................................................................05
Figura 2 Produção de IL-1, IL-6 e IL10 por células mononucleares do sangue periférico
humano (PBMCs) de doadores sadios estimuladas ou não com formas amastigotas
oriundas
de
lesão
cutânea
ou
mucosa
após
diferentes
períodos
de
incubação.........................................................................................................................25
Figura 3 Produção de IFNγ, IL-17 e TNF por PBMCs de doadores sadios estimuladas
ou não com formas amastigotas oriundas de lesão cutânea ou mucosa após diferentes
períodos de incubação.....................................................................................................26
Figura 4 Produçãode IL-1, IL-6 e IL-10 por PBMCs de doadores sadios não
estimuladas ou estimuladas com formas amastigotas de leishmânia oriundas de lesões
cutâneas, mucosa ou mucocutânea..................................................................................28
Figura 5 Comparação entre a quantidade de IL-1 β produzida por PBMCs de doadores
sadios estimuladas com formas amastigotas oriundas de lesões cutâneas, mucosa ou
mucocutânea por 24 horas...............................................................................................30
Figura 6 Comparação entre a quantidade de IL-6 produzida por PBMCs de doadores
sadios estimuladas com formas amastigotas oriundas de lesões cutâneas, mucosas ou
mucocutânea por 24 horas...............................................................................................32
x
Figura 7 Comparação entre a quantidade de IL-10 produzida por PBMCs de doadores
sadios estimuladas com formas amastigotas oriundas de lesões cutâneas, mucosas ou
mucocutânea por 24 horas...............................................................................................34
Figura 8 Expressão de mRNA para IL1β, IL10 e TGFβ em PBMCs de doadores sadios
estimuladas por formas amastigotas de leishmânias oriundas de pacientes com lesão
cutânea ou mucosa comparado ao não infectado após 48 horas .....................................36
ANEXOS
Anexo 1 Parecer do Comitê de Ética .............................................................................65
Anexo 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Banco de Sangue .................66
Anexo 3 Manuscrito........................................................................................................69
xi
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ADP - Adenosina difosfato
AMP – Adenosina monofosfato
ATP - Adenosina trifosfato
CD – Grupo de diferenciação
CT – Controle
CUT – Cutânea
DCs – Células dendríticas
DNase – Desoxyribonuclease
DTH – Hipersensibilidade do tipo tardio
ELISA – Ensaio imunoenzimático
Phox - Fagócito NADPH oxidase
GAPDH – Gliceraldeído-3-Fosfato DeHidrogenase
HC – Hospital das Clínicas
IFNγ – Interferon gama
IFNγKO – Camundongos deficientes do gene IFNγ
IL-1,10,12 etc – Interleucina -1, 10, 12 etc
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
LCL – Leishmaniose cutânea localizada
LCDf – Leishmaniose difusa
LCD – Leishmaniose disseminada
LM – Leishmaniose mucosa
LMC – Leishmaniose mucocutânea
LPS – Lipopolissacarídeo
xii
LV – Leishmaniose visceral
mRNA – RNA mensageiro
n – Número de amostras
NI – Não infectado
NK – Célula Natural Killer
NKT – Célula Natural Killer T
NLRP3 – Proteínas que contém o domínio NHCHT-LRR e pirina 3
NO – Óxido nítrico
NR – Não retornou
PBMC – Célula mononuclear do sangue periférico
PBS – Solução salina fosfato
PCR – Reação da polimerase em cadeia
RNA – Ácido ribonucléico
ROS – Espécies reativas de oxigênio
SBF – Soro bovino fetal
ST – Sem tratamento
TGF-β – Fator transformador de crescimento β
Th1 – Linfócito T auxiliar do tipo 1
Th17 - Linfócito T auxiliar do tipo 17
Th2 – Linfócito T auxiliar do tipo 2
TNF – Fator de necrose tumoral
TO – Tocantins
TSA – Proteína antioxidante específica do thiol
Tregs – Linfócitos T reguladores
xiii
RESUMO
Produção de citocinas por células mononucleares humanas estimuladas
por formas amastigotas de Leishmania. (Viannia) braziliensis
Introdução: A leishmaniose é uma zoonose tropical endêmica com diferentes formas
clínicas, incluindo as formas cutânea, difusa, disseminada, mucosa e visceral. L. (V.)
braziliensis é o parasito mais comumente encontrado na leishmaniose tegumentar no
Brasil sendo, o principal agente da leishmaniose mucosa. A manifestação da doença e as
formas clínicas existentes são dependentes de diversos fatores relacionados ao parasito e
ao hospedeiro.
Objetivo: Comparar a habilidade de formas amastigotas isoladas de pacientes com
leishmaniose cutânea ou mucosa em estimular a produção de citocinas em células
mononucleares do sangue periférico (PBMCs) obtidas de doadores sadios.
Métodos: Isolados obtidos de pacientes com lesões cutâneas ou mucosas foram
inoculados em camundongos deficientes de IFNγ para obtenção de formas amastigotas,
que foram separadas por gradiente de densidade usando o Percoll. As PBMCs de
indivíduos sadios foram separadas por gradiente de densidade usando o Ficoll e
cultivadas por diferentes tempos com as formas amastigotas. O sobrenadante foi
coletado para quantificar as citocinas por ELISA e as células restantes foram lisadas
para análise do mRNA para citocinas usando o PCR em tempo real.
Resultados: As PBMCs produziram IL-1β, IL-6, IL-10 e TGFβ em culturas após a
estimulação com amastigotas. Os isolados de lesões cutâneas produziram quantidades
semelhantes de IL-6, IL-10 e TGFβ quando comparados com isolados de lesões
mucosas. Formas amastigotas obtidas de pacientes com leishmaniose cutânea induziram
uma maior produção de IL-1β do que parasitos obtidos de lesões mucosas. A produção
de IFNγ, IL-17, e TNF não foi detectada em todos os tempos avaliados, após a
estimulação com amastigotas de L. (V.) braziliensis.
Conclusão: Os resultados sugerem que formas amastigotas de pacientes com
leishmaniose tegumentar interagem com células da imunidade inata, induzindo a
produção de citocinas pró e anti inflamatórias, sendo que isolados oriundos de lesão
mucosa induzem menos IL-1 do que parasitos obtidos de lesões cutâneas. A maior
quantidade de IL-1 favorece uma resposta inflamatória com a migração de células para
xiv
o local da infecção. Uma baixa produção dessa citocina faria com que a doença fosse
mais lenta prejudicando a formação de uma resposta adquirida eficiente. Portanto, o
parasito poderia ser capaz de sobreviver por um tempo maior no hospedeiro de uma
maneira silenciosa, causando a forma mucosa.
xv
ABSTRACT
Cytokine production by human mononuclear cells estimulated by
amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis
Introduction: Leishmaniasis is a tropical zoonoses that is endemic, causing different
clinical forms including cutaneous, diffuse, disseminated, mucosal and visceral
manifestations. The L. (V.) braziliensis is the most common parasite found in cutaneous
leishmaniasis in Brazil and is the major agent for the mucosal leishmaniasis. The
manifestation of the disease and the clinical forms are dependent on several factors
related between the parasite and host.
Objective: The aim of this study was to compare the ability of amastigote parasite
isolated from patients with cutaneous or mucosal leishmaniasis to stimulate the
production of cytokines in peripheral blood mononuclear cells cultures (PBMC)
obtained from health donors.
Methods: Isolates of patients with cutaneous or mucosal lesion were inoculated in IFNγ
knockout mice to obtain amastigotes, which were purifyed by density using Percoll. The
PBMCs from healthy individuals were separated by density using Ficoll. The cells were
incubated in cultures at different times with amastigotes and then the supernatant were
collect to quantify cytokines by ELISA or cells that are used to quantify cytokines using
the real time PCR.
Results: PBMCs produced higher amounts of IL-1β, IL-6, IL-10 and TGFβ in cultures
after stimulation with amastigotes than uninfected controls. When comparing isolates
from cutaneous or mucosal disease it was not found differerence regarding to the
production of IL-6, IL-10 and TGFβ, but amastigotes from patients with cutaneous
leishmaniasis induced more IL-1β than in parasites obtained from mucosal lesion.
Production of IFNγ IL17, and TNF was was not detected at different times after
stimulation with L. (V.) braziliensis amastigotes.
Conclusion: The results suggest that amastigotes of patients with cutaneous
leishmaniasis interact with innate immunity cells by inducing the production of
proinflammatory or anti-inflammatory and isolated from mucosal lesions induce less
IL-1 than parasites obtained from skin lesions. The greatest amount of IL-1 promotes an
inflammatory response with migration of cells to the site of infection, so a low
xvi
production would cause a slower disease and would prejudice an effective acquired
response. Thus, the parasite would be able to survive longer in host in a silent way.
xvii
1 INTRODUÇÃO
1.1 Leishmaniose – Características gerais
As leishmanioses são zoonoses presentes nos quatro continentes com
prevalência em regiões tropicais e subtropicais, sendo consideradas endêmicas em 88
países (Mougneau et al. 2011). Os agentes etiológicos são protozoários pertencentes ao
gênero Leishmania, ordem Kinetoplastidae e família Trypanosomatidae, que são
transmitidos por flebotomíneos (Doyle et al. 2009). A Organização Mundial da Saúde
estima a existência de doze milhões de casos de leishmaniose em todo mundo, sendo
que o número de novos casos informados varia de 1,5 a 2 milhões por ano.
Aproximadamente 1 a 1,5 milhão dos casos correspondentes às formas tegumentares
como a cutânea localizada (LCL), a difusa (LCDf), disseminada (LCD) e a mucosa
(LM) (Doyle et al. 2009; Clem 2010; Mitropoulos et al. 2011). Os casos de
leishmaniose visceral (LV) são em torno de 500.000 por ano. Vale ressaltar que
aproximadamente 350 milhões de pessoas estão sob o risco de infecção (Clem 2010).
O impacto da leishmaniose na saúde pública foi subestimado por muitos anos,
porém, ficou claro que esta doença merece mais atenção devido a sua alta incidência e
extensa distribuição geográfica. No Brasil, a incidência de leishmaniose aumentou nos
últimos anos e vários surtos têm ocorrido em diversas regiões do país (Brasil 2007).
Durante o período de 1985 a 2005, a média anual de casos novos informados no país
inteiro foi de 28.568 (Brasil 2007).
A manifestação da doença e as formas clínicas existentes são dependentes de
diversos fatores relacionados ao parasito como a espécie, a quantidade de parasitos
inoculados pelo flebotomíneo, diversidade genética e a morfologia (Weigle & Saravia
1996; Banuls et al. 2007).
A LCL é a forma mais comum da doença, sendo caracterizada por lesões na
derme formadas por uma ou mais pápulas e nódulos, que se expandem formando uma
área central ulcerada e necrosada, onde histologicamente observa-se a presença de
macrófagos infectados por formas amastigotas, que são as formas arrendondadas,
aflageladas e imóveis da leishmânia, e um grande infiltrado de células mononucleares
(Gutierrez et al. 1991; Sanchez et al. 1992; Weigle & Saravia 1996; Mitropoulos et al.
2011). A úlcera geralmente é redonda ou oval, rasa com bordas bem definidas,
ligeiramente elevadas e endurecidas. A lesão normalmente se desenvolve no local do
1
inóculo, principalmente nos antebraços, face ou partes mais baixas das pernas. Estas
lesões são geralmente indolores e se desenvolvem dentro de algumas semanas após a
picada do flebotomíneo, mas em alguns casos, elas podem ser dolorosas e se
desenvolverem após vários meses. A úlcera pode se curar espontaneamente ao longo do
tempo, mas os parasitos provavelmente não são erradicados. Principalmente em
pacientes sem tratamento, mas também em alguns pacientes tratados, a úlcera pode
reaparecer no mesmo ou em outro local (Brasil 2007; Mitropoulos et al. 2011). Existem
várias espécies que causam a leishmaniose cutânea, e estas irão se diferir dependendo da
distribuição geográfica. As principais espécies em países do velho mundo são a L. (L.)
major e a L.(L.) tropica, nos países do novo mundo as principais espécies envolvidas
são a L. (V.) braziliensis, a L. (L.) amazonensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) panamensis,
sendo a L. (V.) braziliensis o agente mais frequente no Brasil (Goto & Lindoso 2010).
A LM é uma doença destrutiva que não se cura espontaneamente e geralmente é
caracterizada por ulcerações no nariz e/ou na boca, podendo se apresentar como
exofíticas, nodulares e endurecidas (Sethuraman 2008; Daneshbod et al. 2011). No
Brasil, elas são causadas principalmente por L. (V.) braziliensis e mais raramente por L.
(V.) guyanensis (Guerra et al. 2011). Esta doença também é conhecida pela
denominação “espundia”, termo que designava as formas metastáticas da leishmaniose
que se espalhavam para os tecidos das mucosas e que representa uma diferença
marcante na gravidade da doença e no impacto na saúde pública (Marsden 1994).
A LM é uma doença endêmica que apresenta uma significativa morbidade e
mortalidade aos pacientes. A LM tem uma história natural de destruição progressiva nos
septos nasais e no palato, o que causa uma desfiguração facial que leva a distúrbios
respiratórios e dificuldades de alimentação (Amato et al. 2007). A LM também acarreta
problemas psicossociais na vida dos pacientes, que em sua maioria relatam que
sofreram algum tipo de modificação em suas vidas no decorrer da doença tendo vários
tipos de problemas sociais. Os pacientes se sentem marginalizados e afastados do
convívio da sociedade e possuem dificuldade de retornar ao trabalho, já que a doença
possui características de deformações no corpo e pessoas sadias sem o esclarecimento
da doença ficam com receio de contraí-la devido ao caráter destrutivo das lesões (Costa
et al. 1987).
São pouco conhecidos os parâmetros imunológicos que permitam prever se
lesões nas mucosas aparecerão em um paciente infectado com L. (V.) braziliensis,
porém, é conhecido que estas lesões são mais prevalentes em homens em torno da
2
quarta década de vida. O risco de aparecimento de lesões mucosas é aparentemente mais
alto em pacientes que têm lesões primárias múltiplas, pacientes que apresentaram
manifestações clínicas por períodos mais longos do que um ano, ou pacientes que não
foram tratados, ou foram com intermitência de tratamento (Jones et al. 1987; Marsden
1994; Grevelink & Lerner 1996). Vale salientar que uma das possíveis causas das
reações exacerbadas é a resistência de alguns parasitos à eliminação pelo sistema imune
e a persistência de antígenos que favorecem um aumento da resposta imune, causando
uma intensa hipersensibilidade do tipo tardio. (Avila et al. 1984).
A LCDf é uma forma grave da doença que ocorre em pacientes considerados
anérgicos, ou seja com deficiência na resposta imune celular específica a antígenos de
leishmânia. Observam-se lesões nodulares por toda a pele, rosto e orelhas, sendo que
em estágios avançados, os parasitos invadem as mucosas da orofaringe e nasofaringe. L.
(L.) mexicana, L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis e L. (L.) aethiopica são algumas
das diversas espécies que provocam a LCDf. No Brasil esta enfermidade é causada
principalmente por L. (L.) amazonensis (Brasil 2006; Pereira et al. 2009b; Silveira et al.
2009; Hernandez-Ruiz et al. 2010). O tratamento utilizando uma combinação de drogas
quimioterápicas inicialmente é satisfatório, porém as recidivas costumam ser frequentes
e o tratamento não é totalmente eficaz apresentando resultados variáveis (Convit 1993;
Pereira et al. 2009b; Silveira et al. 2009).
A LCD é uma forma mais rara, relatada com maior frequência em pacientes
imunodeficientes, sendo causada principalmente por L. (V.) braziliensis, porém em
alguns casos pode ser causada por L. (L.) amazonensis. Esta enfermidade é
caracterizada por apresentar 10 ou mais lesões na cabeça, tronco e membros, sendo
pequenas e papulares, e secundariamente várias destas lesões podem ulcerar (Carvalho
et al. 1994; Alborzi et al. 2008). Os pacientes em geral respondem bem ao tratamento e
apresentam a cura das lesões (Silveira et al. 2009), porém em alguns casos o diagnóstico
e tratamento não apresentam uma boa eficácia, já que o tratamento é realizado por um
conjunto de drogas quimioterápicas que podem apresentar efeitos adversos ao paciente
(Singh et al. 2011).
A LV é a forma mais grave de leishmaniose e potencialmente fatal. É
caracterizada por febre prolongada, aumento do baço e do fígado, perda de peso e
anemia progressiva, causada por parasitos membros do complexo donovani (Shakya et
al. 2011).
3
Como já foi descrito fatores do parasito, como as diferentes espécies existentes
estão relacionados com a geração e a forma clínica da leishmaniose, porém fatores
relacionados com o hospedeiro também estarão envolvidos (Weigle & Saravia 1996;
David & Craft 2009). O local da infecção, as células residentes, citocinas, quimiocinas,
a imunidade e a genética são fatores relacionados com o hospedeiro que interferirão na
definição da forma clínica e evolução da doença (Weigle & Saravia 1996; Derouin
2007; Mougneau et al. 2011). Dentre os fatores inerentes ao hospedeiro, destacam-se os
polimorfismos nos genes TNFA e IL6 que estariam envolvidos na regulação das
próprias citocinas e associado com doenças inflamatórias como a leishmaniose, onde
estariam influenciando na susceptibilidade para leishmaniose mucosa, mas não para
leishmaniose cutânea localizada (Cabrera et al. 1995; Castellucci et al. 2006).
4
1.2 Leishmânia – Ciclo biológico
A Leishmânia tem um ciclo de vida caracterizado por duas etapas principais,
sendo uma no flebotomíneo onde as leishmânias estão sob as formas promastigotas
flageladas e móveis que vivem no seu intestino médio e a etapa no hospedeiro
vertebrado onde as leishmânias estão sob formas amastigotas que são aflageladas e
imóveis que ficam dentro de vesículas fagolissomais (Van Assche et al. 2011) (Figura
1).
Figura 1 – Ciclo de vida da leishmânia. Adaptado de (Van Assche et al.
2011)
A infecção natural por leishmânia começa quando a fêmea do flebotomíneo
inocula aproximadamente 100 a 100.000 formas promastigotas infectantes na pele do
hospedeiro (Kimblin et al. 2008). Células residentes, como os macrófagos e as células
dendríticas imaturas, são ativadas pelos parasitos ou moléculas destes parasitos e
recrutam inicialmente polimorfonucleares do sangue periférico, principalmente
5
neutrófilos, seguidos de células mononucleares, incluindo monócitos (precursores de
macrófagos e células dendríticas, (DCs)), células natural killers (NK), e linfócitos (Beil
et al. 1992; de Baey et al. 2001; Bajenoff et al. 2006).
O sistema complemento protege contra patógenos invasores principalmente por
dois mecanismos: a opsonofagocitose e a cascata lítica, durante a transmissão da
leishmaniose e imediatamente após o contato com o sangue as formas promastigotas
podem se ligar a anticorpos naturais e ativar a via clássica do sistema complemento e
consequentemente ativarem a cascata lítica, porém o mecanismo de opsonofagocitose
não está associado na proteção do hospedeiro, neste caso ele facilita a invasão da
leishmânia no macrófago de uma forma mais rápida, e também, paradoxalmente o
sistema complemento estaria exercendo uma forte pressão seletiva selecionando apenas
as formas metacíclicas, podendo ser uma chave de evasão da própria leishmânia
(Dominguez et al. 2003).
As formas promastigotas metacíclicas são fagocitadas pelos macrófagos, as
células hospedeiras do parasito (Van Assche et al. 2011) ou pelos neutrófilos recém
chegados que sofrerão apoptose e serão fagocitados pelos macrófagos (Filardy et al.
2011). Recentemente observou que os neutrófilos, juntamente com os macrófagos
também são capazes de matar eficientemente as leishmânias, o mecanismo utilizado
parece envolver a enzima elastase do neutrófilo, porém ela não parece matar os
parasitos diretamente pela toxicidade e sim auxiliando na ativação dos macrófagos,
porém os mecanismos que envolvem a morte diretamente por neutrófilos ainda
permanecem incertos (Guimaraes-Costa et al. 2009; de Souza Carmo et al. 2010).
Dentro do vacúolo fagocítico dos macrófagos, os protozoários transformam-se em
formas amastigotas e multiplicam-se por divisão binária simples. Depois de vários
ciclos de divisão, elas são liberadas como amastigotas devido à ruptura da célula
hospedeira. As formas amastigotas emergentes serão novamente fagocitadas por
macrófagos perpetuando a infecção no hospedeiro e causando as várias formas clínicas
associadas à infecção por Leishmania (Liew & O'Donnell 1993; Herwaldt 1999) (Figura
1).
Outro flebotomíneo é infectado ao ingerir em sua refeição células infectadas
com as formas amastigotas. As formas amastigotas são liberadas no intestino dos
flebotomíneos onde elas se desenvolvem em formas promastigotas flageladas. As
formas promastigotas passam por mudanças na morfologia à medida que progridem da
fase inicial chamada de procíclica, passando por um estágio intermediário do
6
desenvolvimento denominado de nectomonas e depois de leptomonas (Lei et al. 2010),
por fim elas encerram o processo chamado de metaciclogênese, em que formas
promastigostas adquirem uma maior capacidade de virulência transformando em formas
promastigotas metacíclicas. Estas formas promastigotas metacíclicas irão migrar para a
faringe e cavidade bucal do flebotomíneo e serão transmitidas durante uma próxima
refeição, reiniciando o ciclo (Van Assche et al. 2011) (Figura 1).
7
1.3 A importância de citocinas da imunidade inata na geração de uma resposta
imune adaptativa
A entrada de patógenos, incluindo a leishmânia, desencadeia a resposta imune
inata do hospedeiro, esta é extremamente importante para definir o padrão da resposta
imune adquirida que será gerada e para prover células hospedeiras ou microbicidas para
os parasitos (Voronov et al. 2010). As citocinas produzidas por células da resposta
imune inata são importantes na modulação da inflamação, como por exemplo,
desencadeando e regulando o influxo de neutrófilos e monócitos para a lesão (Liddiard
et al. 2011; Strutt et al. 2011). Estas citocinas também participam na resposta frente a
um determinado patógeno (Espinosa & Rivera 2011; Strutt et al. 2011). Além disso,
dependendo das citocinas produzidas durante a resposta imune inata, os linfócitos T
auxiliares podem se diferenciar em diferentes perfis (Hofmann et al. 2002; Watford et
al. 2003).
Dentre as citocinas produzidas durante a resposta imune inata destaca-se a
interleucina-12 (IL12), que é uma citocina heterodimérica pró-inflamatória que induz a
produção de interferon-gama (IFN-γ), o qual induzirá a produção de fator de necrose
tumoral (TNF), favorecendo a diferenciação dos linfócitos para o perfil T auxiliar do
tipo 1 (Th1), formando um elo entre a imunidade inata e a imunidade adquirida. As
principais fontes de produção de IL-12 são as células dendríticas e os macrófagos em
resposta a patógenos durante a infecção (Trinchieri 2003; Watford et al. 2003). O IFN-γ
é outra citocina fundamental para a geração do perfil Th1. Esta citocina pode ser
produzida em uma fase inicial pelas células NK da imunidade inata (Liew & O'Donnell
1993; Scharton-Kersten et al. 1998). De uma maneira geral, a indução de uma resposta
imune que favoreça o perfil Th1 irá controlar os patógenos intra-celulares através da
ativação de macrófagos e a não geração desta resposta imune promove a replicação do
patógeno (McMahon-Pratt & Alexander 2004; Rocha et al. 2007).
Os macrófagos são fagócitos que destroem micro-organismos ingeridos por meio
da produção de espécies reativas do oxigênio (ROS), óxido nítrico (NO) e enzimas nos
fagolissomos, além de produzirem citocinas que estimulam a inflamação (Cassatella
1995; Underhill & Ozinsky 2002; Pluddemann et al. 2011). Macrófagos ativados por
IFNγ também conhecidos como macrófagos classicamente ativados, expressam uma
grande quantidade da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e da fagócito
NADPH oxidase (Phox) (Bogdan et al. 2000; Gordon 2003; Mukbel et al. 2007; Colotti
8
& Ilari 2010). A iNOS utiliza o aminoácido L-aginina para a produção de óxido nítrico,
que é uma das principais moléculas leishmanicidas conhecidas. A Phox converte o
oxigênio molecular em ânion superóxido, o qual também tem um importante papel
microbicida para algumas espécies de leishmânia (Gordon 2003; Liese et al. 2008;
Colotti & Ilari 2010).
Outro fenótipo do linfócito T auxiliar pró-inflamatório é o Th17, que é
dependente do fator de crescimento transformador- β (TGFβ), interleucina-1 (IL-1),
Interleucina-6 (IL-6) e interleucina-23 (IL-23). Apesar de várias outras citocinas
participarem no desenvolvimento de células Th17, a combinação de IL-6 e TGF β são
as citocinas mais importantes para a geração destas células a partir de células T naives
(Kimura & Kishimoto 2011). A IL-6 possui um papel chave na inflamação, sendo uma
indutora da síntese de proteínas de fase aguda e pode ser produzida por uma grande
variedade de tipos celulares como macrófagos e monócitos ativados (Assier et al. 2010).
A IL-23 junto com a IL-1 são necessárias para a diferenciação adicional e manutenção
da produção de interleucina-17 (IL-17) (Veldhoen et al. 2006; Kryczek et al. 2007; Das
et al. 2009; Santarlasci et al. 2009).
A IL-1 é uma citocina pró-inflamatória produzida principalmente por células
mielóides. Existem duas isoformas de IL-1 (α e β) que se ligam ao mesmo receptor e
possuem as mesmas atividades biológicas (Dinarello 2011; Lachmann et al. 2011).
Algumas dessas funções dependem da ativação do inflamassoma que levará à liberação
de IL-1β, que irá estimular a resposta inflamatória generalizada de várias maneiras
como, por exemplo, agindo centralmente no hipotálamo para induzir a febre,
aumentando a frequência cardíaca, ativando fibroblastos e ajudando na quimiotaxia e
adesão de leucócitos (Cruvinel et al. 2010; Lachmann et al. 2011; Lane & Lachmann
2011).
O perfil Th2 está relacionado principalmente na proteção contra infecções
helmínticas, porém em infecções por patógenos intracelulares este perfil relaciona-se
com a progressão da doença. A diferenciação para o perfil Th2 é dependente das
citocinas IL-4, IL-25 e IL-33 e de nuócitos (Barlow & McKenzie 2011). Estas citocinas
são capazes de inibir a produção de IFN-γ e de NO, mas promovem a ativação
alternativa de macrófagos (Gordon 2003; Buxbaum & Scott 2005; Peters & Sacks
2006). Macrófagos alternativamente ativados desviam o metabolismo da L-arginina
para produção de poliaminas e uréia, o que pode favorecer a proliferação dos parasitos
(Gordon 2003; Kropf et al. 2005; Maizels et al. 2009; Modolell et al. 2009).
9
Linfócitos T reguladores (Tregs) possuem grande importância ao impedirem as
respostas imunes exacerbadas e as principais citocinas responsáveis para a sua
diferenciação são o TGF-β e a interleucina 10 (IL-10) (Hawrylowicz 2005; Mucida &
Cheroutre 2007). O TGF-β é capaz de exercer efeitos anti-inflamatórios ou próinflamatórios, dependendo da concentração nos diferentes órgãos e da presença ou
ausência de outros fatores de crescimento que podem influenciar na sua atividade
celular e imunológica, sendo uma citocina fundamental para determinar o tipo de
resposta imune específica (Tandon et al. 2010). A IL-10 é a mais importante citocina
com propriedades anti-inflamatórias, sendo produzida por células do sistema
imunológico ativado, em especial monócitos/ macrófagos e subpopulações de células T
(Sabat et al. 2010).
Em resumo observamos que as citocinas da imunidade inata são importantes na
geração de uma resposta imune adquirida. O perfil Th1 depende das citocinas IL-12 e
IFNγ e a ausência da geração deste está relacionada à geração de outros perfis, como o
Th2 que depende das citocinas IL-4, IL-25 e IL33 e o Th17 que está associado com as
citocinas IL-6, TGFβ, IL-1 e IL-23, ambos associados com a exacerbação da
leishmaniose (Tapia et al. 1994; McMahon-Pratt & Alexander 2004; Scott 2004;
Bacellar et al. 2009; Pitta et al. 2009). Além disso, temos o perfil de células Tregs que
possuem grande importância ao impedirem as respostas imunes exacerbadas e são
dependentes principalmente de IL-10 e TGFβ (Hawrylowicz 2005; Mucida & Cheroutre
2007).
10
1.4 Resposta imune a leishmaniose tegumentar
No modelo murino de infecção por L. (L.) major há uma associação clara entre a
produção de IFN-γ e IL-12, ativação de macrófagos, geração de um fenótipo Th1 e o
controle de doença. Neste modelo o IFN-γ induz a produção de NO que é um dos
principais mecanismos de morte das leishmânias (Buxbaum et al. 2002), o qual é
indispensável para que os macrófagos sejam capazes de eliminar eficientemente os
parasitos (Mukbel et al. 2007). Contrariamente, a produção de IL-4 e a geração de um
fenótipo Th2 são associados à suscetibilidade a este patógeno (Sacks & Anderson
2004). A IL-4 e as outras citocinas deste perfil são capazes de inibir a produção de IFNγ, a ativação dos macrófagos classicamente ativados e consequentemente a produção de
NO, porém as citocinas deste perfil promovem a ativação alternativa de macrófagos que
favorece o crescimento da leishmânia (Gordon 2003). Ainda neste modelo, células
Tregs produtoras de IL-10/TGFβ teriam um papel regulador que previne a exacerbação
da inflamação e da resposta Th1, porém, também inibem a eliminação do parasito
(Belkaid et al. 2002; Mendez et al. 2004; Anderson et al. 2009). Este modelo clássico
em camundongos foi importante para estabelecer um perfil de resposta para L. (L.)
major, porém quando associado com outras espécies de Leishmania, mesmo no modelo
murino a importância destes perfis de linfócitos T ainda não está tão clara (McMahonPratt & Alexander 2004).
Em seres humanos, observou-se em vários estudos com o material de pacientes
infectados com diferentes espécies de Leishmania do Novo Mundo, uma resistência aos
parasitos de uma maneira dependente de células T CD4+ que secretam IFNγ. Sabendo
que na maioria das lesões da LCL há um grande número destas células (CaceresDittmar et al. 1993; Carvalho et al. 1995; Silveira et al. 2004), observou-se uma
correlação positiva entre a produção de IFNγ e a cura da lesão desencadeada por L. (V.)
braziliensis. Esta correlação foi observada com a ativação de células mononucleares do
sangue periférico (PBMCs) de pacientes curados ou não curados com antígenos de
leishmânia (Carvalho et al. 1995). Foi demonstrado em pacientes que, em lesões
causadas por L. (V.) braziliensis, a freqüência de macrófagos infectados e de células T
CD4+ secretando IFNγ são mais altas do que nas lesões induzidas por L. (L.)
amazonensis. Estas últimas, entretanto, têm uma maior porcentagem de células
secretando IL-4 (Silveira et al. 2004, 2005). A grande quantidade de IFNγ no infiltrado
de lesões de pacientes infectados com L. (V.) braziliensis correlaciona com as reações
11
de hipersensibilidade tardia mais fortes do que as encontradas em pacientes infectados
com L. (L.) amazonensis (Pirmez et al. 1990). Embora o IFNγ encontrado seja
produzido principalmente por células T CD4+, células T CD8+ e células T CD4-CD8também participam na produção desta citocina.
O TNF também é uma potente citocina pró-inflamatória com um importante
papel na lesão inflamatória tecidual (Tansey & Szymkowski 2009). Sugere-se que o
tamanho da úlcera na LCL provocada por L. (V.) braziliensis correlaciona-se
positivamente com o tempo de cura clínica e que inibidores de TNF, combinados com a
terapia padrão, melhoram a cicatrização de pacientes com lesões graves (Oliveira et al.
2011).
Uma resposta Th1 exacerbada também pode ser observada pela ativação de
células mononucleares do sangue periférico de pacientes com leishmaniose mucosa
(Bacellar et al. 2002). Em biópsias de lesões mucosas de pacientes infectados por
leishmânias do Novo Mundo observou-se que células T CD4+ de memória infiltram nas
lesões (Barral et al. 1987; Pirmez et al. 1990; Martinez-Arends et al. 1991; Esterre et al.
1992) e produzem uma grande quantidade das citocinas IFNγ e TNF, que por sua vez
parecem participar da lesão tecidual, porém elas não estão relacionadas com a cura da
lesão (Faria et al. 2005). A forma mucosa da leishmaniose está associada a uma forte
resposta imune mediada por células T, parasitos escassos, hipersensibilidade do tipo
tardio (DTH) exagerada e um intenso infiltrado inflamatório com necrose (de
Magalhaes et al. 1986; Pirmez et al. 1990; Silveira et al. 2004). Na Venezuela e no
sudeste de Brasil foram mostrados perfis de citocinas mistos Th1 e Th2 em lesões de
pacientes com a forma mucosa da doença (Caceres-Dittmar et al. 1993; Pirmez et al.
1993).
Como vimos com o modelo de L. (L.) major as citocinas da imunidade inata são
cruciais para determinar o tipo de resposta adquirida gerada que vai estar diretamente
relacionado com a cura ou exacerbação da leishmaniose (McMahon-Pratt & Alexander
2004), porém os mecanismos responsáveis para o controle da infecção intracelular por
L. (V.) braziliensis em macrófagos humanos ativados por citocinas não são ainda claros.
O papel do NO como um mecanismo microbicida de macrófagos humanos é
questionado principalmente porque a quantidade de NO produzida por células humanas
estimuladas é muito reduzida em comparação àquela produzida por células murinas
(Roshick et al. 2006). Porém, a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) pode ser observada em lesões de pacientes com leishmaniose cutânea ou
12
mucosa (Faria et al. 2005; Diaz et al. 2006). Como existe uma grande produção de IFN
e TNF nas lesões de pacientes com leishmaniose mucosa, seria esperado também uma
maior produção de NO neste tecido. Porém, a porcentagem de células expressando
iNOS é maior em lesões de pacientes com a forma cutânea do que nas lesões de
pacientes com a forma mucosa (Faria et al. 2005).
As células Tregs capazes de produzir IL-10 e/ou TGFβ foram investigadas na
leishmaniose humana e foram identificadas nas lesões de pacientes com LCL causada
por L. (V.) braziliensis com a função de ajudar no controle da doença (Campanelli et al.
2006).
Em resumo, nós temos que a cura da LCL é dependente das células e citocinas
do perfil Th1 e a exacerbação das lesões é dependente das células e citocinas do perfil
Th2, porém não se observa o mesmo com a leishmaniose mucosa, onde a cura não
depende apenas das células e citocinas do perfil Th1 e parece estar relacionada com uma
combinação com outros perfis.
13
2 JUSTIFICATIVA
A leishmaniose é uma zoonose, sendo que o homem pode ser um hospedeiro
ocasional. Várias espécies de leishmânia são responsáveis por provocar as diferentes
formas da doença no homem e nos animais, porém, muitos dos nossos conhecimentos
acerca da leishmaniose vieram de estudos utilizando-se o modelo experimental de
infecções murinas por L. major, sendo que existe uma tendência em expandir estes
conhecimentos para as outras espécies de leishmânia (McMahon-Pratt & Alexander
2004). Espécies encontradas na Europa e na Ásia (como L. major e L. donovani)
divergiram das espécies da América Latina a aproximadamente 40–80 milhões de anos
atrás, não sendo surpreendente que estes parasitos desenvolveram estratégias diferentes
para sobreviver dentro de uma gama diferente de hospedeiros e podem se localizar em
diferentes tecidos nos mamíferos e nos insetos (McMahon-Pratt & Alexander 2004).
Embora o grande número de estudos em camundongos infectados com L. major
tenha contribuído para a compreensão da infecção por leishmânias, a imunobiologia das
espécies da América Latina diverge consideravelmente da imunobiologia de L. major.
Leishmânias pertencentes ao subgênero Viannia são a causa mais freqüente de
leishmaniose cutânea ou mucosa na América Latina, tendo a L. (V.) braziliensis como a
causa mais freqüente de leishmaniose mucosa, porém até pouco tempo atrás era
desprezada a capacidade de estes patógenos infectarem camundongos, (McMahon-Pratt
& Alexander 2004; Guerra et al. 2011), atualmente alguns grupos de pesquisa
começaram a explorar os modelos murinos infectados por L. (V.) braziliensis (DeKrey
et al. 1998; de Souza-Neto et al. 2004; Maioli et al. 2004; de Moura et al. 2005; Giudice
et al. 2007; Rocha et al. 2007; Pereira et al. 2009a; Oliveira et al. 2010; Costa et al.
2011).
A compreensão dos mecanismos que estão envolvidos no desencadeamento das
lesões mucosas e cutâneas em seres humanos causadas por esta espécie é ainda muito
limitada e mais estudos são necessários, já que a LM é uma doença endêmica e
destrutiva que não se cura espontaneamente, sendo caracterizada por várias ulcerações
nas mucosas apresentando uma alta morbidade e mortalidade para os pacientes
(Daneshbod et al. 2011).
Este estudo também possuiu a particularidade de utilizar formas amastigotas
para a infecção de células mononucleares humanas.
A utilização de amastigotas
oriundas de lesões de pacientes com a forma cutânea ou mucosa assemelha o ambiente
14
onde ocorre o controle de uma lesão cutânea sem a eliminação completa dos parasitos.
As formas amastigotas remanescentes podem desenvolver diferentes mecanismos de
escape, já que elas se mantêm por vários anos no ser humano, sofrendo uma pressão de
seleção pelo sistema imunológico deste hospedeiro. Estas formas amastigotas migram
para a mucosa, onde irão provocar a doença, sendo assim, é possível que os parasitos
tenham se diferenciado daqueles que só provocam a lesão cutânea e tenham adquirido
características que possibilitam a geração da doença na mucosa (Cupolillo et al. 2003;
Alcolea et al. 2010; Maretti-Mira et al. 2011).
Para verificar se há diferença entre as formas amastigotas obtidas de lesão
cutânea ou mucosa, investigamos se estes parasitos são capazes de induzir diferentes
tipos de respostas imunes, o que poderia estar associado às diferentes formas clínicas da
leishmaniose. Sabendo que as citocinas da imunidade inata são importantes na
modulação da inflamação, na erradicação de parasitos e na geração de uma resposta
imune adquirida, e que a eliminação ou proliferação dos parasitos está relacionada com
o tipo de resposta gerado, a comparação da produção destas citocinas por células
humanas induzidas com formas amastigotas de isolados de leishmânia poderia
esclarecer se haveria diferenças desses parasitos em induzir diferentes tipos de respostas
imunes, o que poderia estar associado às diferentes formas clínicas da leishmaniose
como a forma cutânea ou a forma mucosa.
15
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
3.1.1 Avaliar a produção de citocinas por PBMCs de doadores sadios
estimuladas com formas amastigotas de diferentes isolados de L. (V.) braziliensis
oriundas de pacientes com lesões mucosas e cutâneas.
3.2 Objetivos específicos
3.2.1 Determinar o melhor curso temporal da produção de citocinas em cultura
de PBMCs com amastigotas para detecção de IL-1, IL-6, IL-10, IFNγ, IL-17 e TNF.
3.2.2 Avaliar a capacidade de isolados obtidos de lesões cutâneas e de lesões
mucosas em induzirem a produção de IL-1, IL-6, IL-10, IFNγ, IL-17 e TNF.
3.2.3 Avaliar a capacidade de PBMCs de doadores sadios em expressar mRNA
para IL-1β, IL-10 e TGFβ estimuladas com isolados obtidos de lesões cutâneas e de
lesões mucosas.
3.2.4 Avaliar diferenças na capacidade de isolados obtidos de lesões cutâneas e
de lesões mucosas em induzir a produção de IL-1, IL-6, IL-10, TGFβ, IFNγ, IL-17 e
TNF por PBMCs.
16
4 MÉTODOS
4.1 Camundongos
Foram utilizados camundongos C57BL/6 (B6.129S7-ifngtm1Ts) desprovidos do
gene para INFγ (IFNγKO) cujas matrizes foram cedidas pela Drª Leda Q. Vieira
(Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia, UFMG). Os animais foram infectados
quando atingiram 6 - 12 semanas de idade. Foram utilizados machos ou fêmeas
indistintamente neste projeto, porém animais de gêneros diferentes foram mantidos em
gaiolas separadas. As matrizes foram mantidas no Biotério do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás. Nos experimentos os
camundongos foram mantidos em estantes ventiladas (UNO BV, Holanda) com
alimentação e água a vontade e utilizados nas infecções, como descrito posteriormente.
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em pesquisa humana e animal do
Hospital das Clínicas/UFG Nº 094/08 (Anexo 1).
4.2 Parasitos e infecção dos camundongos
Formas amastigotas de leishmânias foram selecionadas aleatoriamente do
estoque de parasitos do Leishbank (Banco de leishmânias da região Centro
Oeste/UFG/Goiás) e mantidas em camundongos IFNγKO como descrito anteriormente
(Oliveira et al. 2010). Somente participaram deste trabalho parasitos que tenham sido
previamente confirmados como pertencentes ao subgênero Viannia pela técnica da
reação da cadeia de polimerase (PCR) com iniciadores específicos (Passos et al. 1996;
Volpini et al. 2004). Foram utilizados três isolados oriundos de lesão mucosa de
pacientes com leishmaniose e quatro isolados oriundos de lesão cutânea, sendo que um
paciente também apresentava lesão mucosa. Para obtenção dos parasitos utilizados na
infecção de PBMCs humanas, formas amastigotas recém descongeladas foram lavadas
duas vezes com solução salina fosfato (PBS) e 1 x 106 formas amastigotas foram
inoculadas no coxim plantar dos animais. Após a lesão atingir 3 milímetros, os animais
foram sacrificados por decapitação e as formas amastigotas foram purificadas das patas
por gradiente de densidade, utilizando o PercollTM (GE Healthcare – Sweden) a 40% e
90% (Ahmed et al. 2003; Lang et al. 2005).
17
4.3 Doadores
Foram incluídos no projeto apenas doadores sadios do Banco de Sangue do
Hospital das Clínicas da UFG do gênero masculino ou feminino de idade entre 18 e 40
anos que não estavam utilizando nenhum tipo de medicação. Os doadores foram
convidados a participar como voluntários do estudo e assinaram o termo de
consentimento livre e esclarecido (Anexo 2 ). Foram coletados 10 mL de sangue com
EDTA de cada doador e levado para o laboratório do IPTSP. Para este estudo coletamos
o sangue de 98 doadores que foram utilizados para padronização das técnicas utilizadas
e para a realização dos experimentos.
4.4 Obtenção das células mononucleares do sangue periférico humano
(PBMCs)
As PBMCs foram separadas a partir de sangue total de doadores sadios em
gradiente de Ficoll-Paque® PLUS (GE Healthcare - Sweden). As PBMCs foram
cultivadas em meio RPMI 1640 (SIGMA Chemical Co. St Louis, MO, EUA),
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF, Cripion, São Paulo, Brasil), 2 mM
de
L-glutamina
(SIGMA), 100 U/mL de penicilina (SIGMA), 100 g/mL de
estreptomicina (SIGMA) e 50 M de 2-mercaptoetanol (SIGMA). Foram cultivadas 1,5
x 106 PBMCs por poço em placas de cultura de 24 poços (TPP, Suíça) em 500 µL de
meio RPMI completo, em estufa contendo 5% de CO2, por 12, 24, 48 ou 72 horas, na
presença ou ausência de 3 x 105 formas amastigotas de L. (V) braziliensis. Foram
utilizados, em alguns experimentos, 5 μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) 011:B4
(SIGMA), 107 bactérias/mL de Escherichia coli B41(K99+F41) ou 107 bactérias/mL de
Listeria monocitogenes
mortas pelo calor. Decorrido o tempo de cultura, o
sobrenadante e as células remanescentes foram colhidos para avaliação das citocinas
IL1β, IL-6, IL-10, TNFα, IL17A, IFNγ, e TGFβ por ensaio imunoenzimático (ELISA)
e/ou reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
4.5 Detecção de citocinas pelo ensaio imunoenzimático
A produção de citocinas foi analisada nos sobrenadantes de cultura pelo ensaio
imunoenzimático (ELISA) de captura, onde a placa foi sensibilizada com 80 μL da
18
concentração correspondente do anticorpo específico (anticorpo de captura), sendo em
seguida, incubadas por volta de 24 horas na geladeira a 4ºC. Ao fim deste tempo, as
placas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween e bloqueadas com solução de bloqueio
(3% de SFB em PBS), à temperatura ambiente (T.a.) por 1 h depois as placas foram
novamente lavadas 3 vezes com PBS-Tween e depois se adicionou as amostras da
pesquisa e da curva padrão e as placas foram incubadas por volta de 24 horas na
geladeira a 4ºC. Em seguida as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-Tween e
procedeu se a aplicação dos anticorpos conjugados com biotina, nos nossos ensaios foi
usado 80 μL da concentração correspondente do anticorpo de detecção, em seguida as
placas foram lavadas 5 vezes com PBS-Tween. As placas foram incubadas por 1 hora,
T.a. Após este tempo, foram lavadas 5 vezes com PBS-Tween e incubadas durante 30
minutos (T.a.) com solução de estreptoavidina-peroxidase. Por fim, a placa foi lavada 5
vezes com PBS-Tween e foi adicionada a solução reveladora (Tampão citrato-fosfato
pH 7,2, ortofenilenodiamina e H2O2), por cerca de 20 min (T.a.). A reação foi finalizada
com a aplicação de acido sulfúrico (H2SO 2 N). A leitura das placas foi realizada em
leitora de ELISA (MULTISKAN), utilizando filtro a 492 nm com filtro de referência
620 nm.
Utilizou-se os kits comerciais Ready-Set-Go da eBioscience (San Diego,USA)
para hIL-1β e hIL-17A e o kit da PeproTech 900-K16 para hIL-6. Para as demais
citocinas foram utilizados os anticorpos de captura, anti-h10 clone 9D7 (0,1 mg/mL),
anti- hTNF clone B154.9 (2,5 μg/mL) e anti-hIFNγ clone B133.1 (5 μg/mL) A detecção
destas citocinas foi feita pelos anticorpos biotinilados anti-h10 clone 12G8 (2,6 μg/mL),
anti- hTNF clone
B154.7 (1 μg/mL ) e anti-hIFNγ clone (1 ug/mL) B133.5 (os
anticorpos foram produzidos a partir de hibridomas doados pelo Dr. Giorgio Trinchieri Philadelphia, PA USA). Todos os ELISAs foram executados com curvas padrões das
respectivas citocinas recombinates (eBioscience). Anticorpos obtidos de hibridomas
foram purificados em coluna de proteína G (Pharmimgem). Quando estes anticorpos
foram
utilizados
na
detecção,
eles
foram
previamente
biotinilados
com
Biotinamidocaproate N-hydroxysuccinimidyl (SIGMA). Todas as amostras foram
testadas em duplicatas.
4.6 Detecção de citocinas pelo método da reação em cadeia da polimerase
(PCR) em tempo real
19
Foram utilizadas as PBMCs cultivadas por 48 horas, na presença ou ausência de
formas amastigotas de L. (V.) braziliensis. As PBMCs foram mantidas 200mL de trizol
(ABGene) a -80ºC até o momento da extração. O RNA total foi extraído utilizando
40μL de clorofórmio (Merck), sendo em seguida o RNA foi precipitado com 100 μL de
isopropanol (Merck), lavado com 200 μL de etanol 75% (Merck) e dissolvido em água.
Em seguida, o RNA extraído foi quantificado utilizando o nanodrop (Thermo-Fisher
Scientific). O RNA foi tratado com DNAse antes de ser transcrito em DNA usando
Oligo(dt), iniciadores e transcriptase reversa MMLV, sendo em seguida, submetido ao
termociclador Mastercycler Personal (J. R. Ehlke). O Gliceraldeído -3- fosfato
desidrogenase foi usado como gene de referência. As sequências de iniciadores para a
detecção da IL-1β, IL10, TGFβ e da GAPDH estão mostradas na Tabela 1, as
sequências foram projetadas usando o software PRIMER EXPRESS (Applied
Biosystems, Foster City, CA) com base nas sequências de nucleotídeos disponíveis no
banco de dados GenBank. O sybr green (Applied Biosystems) foi usado para detectar a
amplificação dos iniciadores. As condições da PCR foram às seguintes: 2 minutos a 50
°C, 10 minutos a 95 °C, seguido por 40 ciclos de reação da PCR em 94°C por 45
segundos, 70 °C por 2 minutos, e 59 °C for 1 minuto. Para as análises utilizou-se o
método de comparação (ΔΔCT) usando o programa Step one Software v2.1 (Applied
Biosystems). Todas as amostras foram testadas em duplicatas.
Tabela 1 – Sequência dos iniciadores
Iniciadores
Sequência dos iniciadores
IL-1 β humana
FW (5’-3’) AAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC
CAG G
RV (5’-3’) TGG AGA ACA CCA CTT GCT CCA
IL-10 Humana
FW (5’-3’) GGT TGC CAA GCC TTG TCT GA
RV (5’-3’) TCC CCC AGG GAG TTC ACA T
TGFβ Humano
FW (5’-3’) TAC CTG AAC CCG TGT TGC TCT
RV (5’-3’) ATC GCC AGG AAT TGT TGC TG
GAPDH
FW (5’-3’) GCA CCA CCA ACT GCT TAG CA
RV (5’-3’) TGG CAG TGA TGG CAT GGA
20
4.7 Análise estatística
Os resultados foram comparados quanto à significância dos mesmos pelo
método de análise utilizando o teste t de student pareado paramétrico ou ANOVA
seguido pelo teste de Bonferroni (Análise de variância), usando o programa Graph-Pad
Prism Sophtware 5.0 (Inc. San Diego, CA, USA). Os dados foram apresentados em
gráficos ou tabelas contendo média  desvio padrão. Valores de p < 0,05 foram
considerados significantes.
21
5 RESULTADOS
5.1 Caracterização dos isolados do estudo
Os isolados deste estudo foram sorteados aleatoriamente entre parasitos obtidos
de lesões cutâneas e parasitos obtidos de lesões mucosas, previamente caracterizados
como pertencentes à espécie de L. (V.) braziliensis. Os pacientes foram caracterizados
quanto à possível localização da lesão, a forma clínica, o número de lesões, o tipo de
lesão, o tratamento e o resultado clínico. Essas informações estão descritas na tabela 2.
Os pacientes foram provenientes dos estados de Goiás (n = 2), do Pará (n = 2),
da Bahia (n = 1), do Tocantins (n = 1) e do Mato Grosso (n = 1).
Apenas um paciente com a forma cutânea apresentou duas lesões com úlceras
crostosas (RPL5c), os outros dois com a forma cutânea apresentaram apenas uma lesão
ulcerada (JCJ8c e CSA7c). Um paciente apresentou a forma mucocutânea com uma
lesão cutânea ulcerada e com uma lesão mucosa ulcerada eritemato-edematosa
(SMB7mc), porém o isolado do estudo foi obtido da lesão cutânea. Dois pacientes com
a forma mucosa apresentaram úlcera nasal (PPS6m e JBC8m), sendo que um apresentou
lesão no palato (JBC8m) e o outro paciente com a forma mucosa apresentou lesão
ulcerada eritemato-edematosa, infiltração e perfuração nasal (ASL9m).
Em relação ao tratamento, dois pacientes não retornaram após o diagnóstico e
não receberam tratamento (PPS6m e CSA7c), os outros cinco pacientes (JBC8m, JCJ8c,
ASL9m, RPL5c e SMB7mc) foram tratados com glucantime®, sendo que quatro
pacientes evoluíram para a cura clínica e apenas um deles retornou com lesões e
continua com o tratamento (JBC8m).
22
Tabela 2 - Caracterização dos isolados no estudo
Isolado
RPL5c
Espécie
L(V)b
Estado
PA
Forma
Número
Tipo
Tratamento
clínica
de lesões
de lesão
LC
2
Úlcero-
Antimonial
crostosa
Pentavalente
ST
Resultado
clínico
Cura clínica
PPS6m
L.(V)b
BA
LM
-
Úlcera nasal
NR
JBC8m
L(V)b
GO
LM
-
Úlcera nasal Antimonial
Retornos
e lesão no Pentavalente
das lesões e
palato
em
tratamento
ASL9m
L. (V)b
GO
LM
-
Ulcerada,
Glucantime
eritemato-
incompleto
edematosa,
(antimonial
infiltração
pentavalente)
Cura clínica
perfuração
nasal
JCJ8c
L(V)b
PA
LC
1
Ulcerada
Antimonial
Cura clínica
Pentavalente
SMB7mc
L(V)b
TO
LMC
1 (Cutânea) Ulcerada
Antimonial
e lesão na (cut)
Pentavalente
mucosa
Mucosa
nasal
ulcerada
Cura clínica
eritematoedematosa
CSA7c
L(V)b
MT
LC
1
Ulcerada
ST
NR
L(V)b= Leishmania (Viannia) braziliensis; LC= Leishmaniose Cutânea; LM=
Leishmaniose Mucosa; LMC= Leishmaniose Muco-cutânea; ST= Sem Tratamento;
NR= Não Retornou
23
5.2 Avaliação da habilidade de diferentes isolados induzirem a produção de
IL1β, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-17A e TNFα.
Para definir o melhor tempo de cultura para detecção de diferentes citocinas
produzidas, PBMCs de doadores sadios foram estimuladas in vitro com formas
amastigotas de L.(V.) braziliensis e cultivadas em diferentes intervalos de tempo
(Figuras 2 e 3). Nestes experimentos foram utilizados um isolado oriundo de paciente
que desenvolveu a forma cutânea da doença (JCJ8c) e um isolado de paciente com a
forma mucosa (PPS6m). Após a incubação, foi possível observar que apenas IL-1β, IL6 e IL-10 puderam ser detectadas nos sobrenadantes de cultura em valores superiores
aos produzidos pelas células controles não estimuladas (Figura 2 A, B e C). É
interessante notar que o isolado de lesão cutânea induziu uma maior produção de IL-1β,
IL-6, e IL-10 do que o isolado de lesão mucosa, embora apenas a diferença na produção
de IL-1β tenha sido estatisticamente significante (Figura 2 A).
As citocinas IFNγ e IL-17A no sobrenadante não foram detectadas nos ensaios
(Figura 3A e 3 B), enquanto a citocina TNF estava acima do limite de detecção (Figura
3 C). Formas amastigotas de leishmânia, entretanto, foram incapazes de alterar a
produção basal desta citocina. Para demonstrar que a quantidade de TNF detectada não
era devido ao estímulo com leishmânia, as células foram estimuladas com Escherichia
coli morta pelo calor, Listeria monocitogenes ou LPS e comparadas com células não
estimuladas ou estimuladas com formas amastigotas de leishmânia (JCJ8c) (Figura 3D).
Todos os estímulos, exceto as formas amastigotas induziram significantemente a
produção de TNF (Figura 3 D).
24
B
20
IL-6 -ng/mL
Controle
JCJ8c
PPS6m
*#
*#
n = 19
*
*
15
*
10
Controle
JCJ8c
PPS6m
n = 10
5
hr
s
24
Tempo em Cultura
48
hr
s
48
h
0
24
h
IL-1 ng/mL
A
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Tempo em Cultura
C
2.00
Controle
JCJ8c
PPS6m
IL-10 ng/mL
1.75
1.50
1.25
1.00
*
*
*
*
*
*
0.75
n = 07
0.50
0.25
48
h
24
h
0.00
Tempo em Cultura
Figura 2. Produção de IL-1 (A), IL-6 (B) e IL-10 (C) por PBMCs (1,5 x 106
células/500 μL) de doadores sadios estimuladas ou não com formas amastigotas (3 x 105
leishmânias/500 μL) oriundas de lesão cutânea (JCJ8c) ou mucosa (PPS6m) após
diferentes períodos de incubação. As barras representam as médias ± DP da produção de
citocinas de pelo menos 3 experimentos independentes. * indica a diferença entre o
grupo não estimulado e o grupo estimulado com formas amastigotas de leishmânia (p <
0,05). # indica diferença entre células estimuladas por JCJ8c e PPS6m (p < 0,05) e n
representa o número de doadores. Para a análise estatística foi utilizado o teste ANOVA
seguido pelo teste de Bonferroni.
25
h
48
h
24
h
25
Controle
Listeria
E.coli
LPS
Listeria+E.coli+LPS
JCJ8c
TNF ng/mL
20
15
10
5
12
72
48
h
24
h
h
n = 06
D
Controle
JCJ8c
PPS6m
n = 08
Tempo em Cultura
Controle
JCJ8c
PPS6m
Tempo em Cultura
C
h
TNF ng/mL
Tempo em Cultura
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
B
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
72
h
48
24
IL-17 ng/mL
Controle
JCJ8c
PPS6m
n = 06
h
IFNy ng/mL
A
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
n = 06
0
12 horas
Tempo em Cultura
Figura 3. Produção de IFN γ (A), IL-17 (B) e TNF (C) (D) por PBMCs (1,5 x
106 células/500 μL) de doadores sadios estimuladas ou não com formas amastigotas (3 x
105 leishmânias/500 μL) oriundas de lesão cutânea (JCJ8c) ou mucosa (PPS6m) após
diferentes períodos de incubação. As barras representam as médias ± DP da produção de
citocinas de pelo menos 3 experimentos independentes e n representa o número de
doadores. Para as análises estatísticas foi utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de
Bonferroni. A linha pontilhada indica o limite de detecção do ensaio . Valores abaixo do
limite de detecção são extrapolações da curva padrão e não são confiáveis.
26
A produção de IL-1β, IL-6 e IL-10 por PBMCs estimuladas por leishmânias
foram detectadas em altos níveis em 24 e 48 horas após o início da cultura, indicando
que o tempo de incubação de 24 horas é suficiente para avaliar a capacidade dos
diferentes isolados induzirem a produção destas citocinas (Figura 2 A, 2 B e 2 C).
Para observar se a produção de IL-1β, IL-6 e IL-10 seria também induzida por
outros isolados e não apenas aos dois analisados (JCJ8c e PPS6m), PBMCs de doadores
sadios foram estimuladas separadamente com mais dois isolados oriundos de lesão
cutânea (RPL5c e CSA7c), com outros dois isolados de lesão mucosa (JBC8m e
ASL9m) ou ainda um isolado de lesão muco-cutânea (SMB7mc). A quantidade de
citocina produzida por células de um doador estimuladas por um isolado foi comparada
com a quantidade de citocina produzida por células do mesmo doador sem nenhum
estímulo (Controle (CT)) (Figura 4A, B e C). Observamos que as PBMCs estimuladas
com todos os isolados analisados produziram significativamente mais IL-1β do que
células não estimuladas (Figura 4 A). A produção de IL - 6 também repetiu o mesmo
perfil, exceto quando as células foram estimuladas pelos isolados RPL5c e SMB7mc
(Figura 4B). O mesmo fenômeno foi observado para a produção de IL-10, quando as
PBMCs estimuladas com todos os isolados analisados produziram significativamente
mais IL-10 do que células não estimuladas (Figura 4 C).
Nestes experimentos (Figura 4A, 4B e 4C), foi observada uma grande variação
na produção de citocinas por PBMCs de diferentes doadores sadios. Podemos destacar,
por exemplo, PBMCs estimuladas com o isolado JCJ8c, onde foi observado, desde
ausência da produção de IL-1 até produção equivalente a 30 ng/mL de IL-1β (Figura 4
A). As células de alguns doadores, não estimuladas, produziram uma quantidade
indetectável de citocinas, enquanto células de outros doadores produziram uma
quantidade próxima de 10 ng/mL de IL-1β (Figura 4 A). Devido a esta grande
variabilidade entre os doadores, novas análises foram feitas comparando-se a produção
de citocinas utilizando sempre células de um mesmo doador estimuladas com diferentes
isolados e por isto não foi comparado pareadamente os isolados oriundos de lesão
cutânea com isolados oriundos de lesão mucosa neste tipo de análise.
27
A
*
50
p=0,03
IL-1 ng/mL
40
*
*
*
p<0,0001
p<0,0001
p=0,002
*
*
p=0,01
p=0,007
*
30
p=0,006
20
10
A
7c
C
T
C
S
L9
m
C
T
A
S
R
P
L5
c
C
T
B
7m
c
C
T
S
M
JB
C
8m
C
T
S
6m
C
T
P
P
JC
C
T
J8
c
0
B
40
*
IL-6 - ng/mL
*
30
p<0,0001
*
*
*
p<0,0001
p=0,1
p=0,0002
p=0,01
p=0,01
p=0,21
20
10
7c
T
C
S
A
C
m
T
S
L9
A
R
C
P
L5
c
T
C
7m
c
T
B
C
S
M
8m
T
C
JB
C
S
6m
T
C
P
P
T
C
JC
J8
c
0
C
6
*
*
IL-10 ng/mL
p<0,0001
4
p=0,0018
*
p=0,0008
*
*
p=0,0015
*
p=0,003
p<0,0001
*
p=0,001
2
A
7c
C
S
C
T
L9
m
A
S
C
T
c
C
T
L5
R
P
M
B
7m
c
C
T
S
C
T
JB
C
8m
S
6m
P
C
T
P
J8
c
JC
C
T
0
Figura 4. Produção de IL-1 (A), IL-6 (B) e IL-10 (C). Foram cultivadas PBMCs
(1,5 x 106 células/500 μL) por 24 horas na ausência (CT) ou na presença de formas
amastigotas de leishmânia (3 x 105 leishmânias/500 μL) oriundas de lesões cutâneas
(JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosa (PPS6m, JBC8m e ASL9m) ou mucocutânea
(SMB7mc). Cada símbolo representa a quantidade de citocinas no sobrenadante de
cultura de 1 doador. A linha reta indica a média e * indica a diferença entre o CT e o
respectivo isolado (p < 0,05). Para estas análises foi utilizado o teste t de student
pareado.
28
5.3 Indução da produção de IL1β por PBMCs de um mesmo grupo de
doadores estimuladas com formas amastigotas de L. (V.) braziliensis isoladas de
lesões cutâneas ou mucosas
Os resultados apresentados anteriormente foram re-analizados, para comparar a
diferença na capacidade dos isolados oriundos de lesões cutâneas ou mucosas induzirem
a produção de IL1β em células de um mesmo doador.
PBMCs estimuladas com o isolado de lesão cutânea JCJ8c produziram
significante mais IL1β que aquelas estimuladas com isolados de lesão mucosa PPS6m,
JBC8m e ASL9m (Figura 5A , 5B e 5C). O isolado RPL5c também induziu uma maior
produção de IL1β do que os isolados de lesão mucosa: JBC8m em 5 dos 7 ensaios
(Figura 5E) e ASL9m em 5 dos 6 ensaios (Figura 5F), porém a diferença dos grupos não
foi estatisticamente significante e não foi observada diferença na indução de IL1β pelo
isolado RPL5c em relação ao isolado de lesão mucosa PPS6m (Figura 5 D). O isolado
CSA7c induziu significante uma maior produção de IL1β comparado ao isolado de
lesão mucosa PPS6m (Figura 5G). O isolado CSA7c induziu uma maior produção de
IL1β comparado ao isolado JBC8m (em 5 dos 6 ensaios com PBMCs dos doadores
sadios), porém não foi estatisticamente significativo (Figura 5H) e não observou
diferença na capacidade dos isolados CSA7c e ASL9m em induzirem a produção de
IL1β pelas células (Figura 5I). Não foram demonstradas diferenças significantes entre o
isolado de lesão muco-cutânea (SMB7mc) em induzir a produção de citocinas
comparado com os isolados de lesão mucosa (Figura 5J, 5K e 5L).
29
Figura 5. Comparação entre a quantidade de IL1β produzida (ng/mL) por
PBMCs (1,5 x 106 células/500 μL) de doadores sadios estimuladas com formas
amastigotas de leishmânia (3 x 105 leishmânias/500 μL) oriundas de lesões cutâneas
(JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosa (PPS6m, JBC8m e ASL9m) ou mucocutânea
(SMB7mc) por 24 horas. Os círculos fechados representam a produção de IL1β no
sobrenadante de cultura de PBMCs de cada doador. * indica a diferença estatística,
seguido pelo valor respectivo de p e do número de doadores (n). Para estas análises foi
utilizado o teste t de student pareado.
30
5.4 Indução da produção de IL6 por PBMCs de um mesmo doador
estimuladas com formas amastigotas de diferentes isolados de L. (V.) braziliensis
isoladas de lesões cutâneas ou mucosas
Na etapa subsequente do trabalho, foi comparada a diferença na capacidade dos
isolados oriundos de lesões cutâneas ou mucosas induzirem a produção de IL-6. Para
isto, PBMCs de um mesmo doador foram estimuladas com um isolado de lesão cutânea
ou um isolado de lesão mucosa por 24 horas. Foi observada uma grande variação na
quantidade de IL-6 produzida pelas células (Figura 6), entretanto, foi possível observar
que o isolado JCJ8c induziu uma maior produção de IL-6 do que o isolado PPS6m
(Figura 6 A), que por sua vez induziu uma maior produção desta citocina do que o
isolado RPL5c ( Figura 6D). O isolado SMB7mc induziu uma menor produção de IL6
que os isolados PPS6m, JBC8m e ASL9m (Figuras 6J, 6K e 6L), nas demais
comparações, não observamos nenhuma diferença significante (Figuras 6B, 6C, 6E,
6F,6G, 6H, 6I e 6J).
31
Figura 6. Comparação entre a quantidade de IL-6 (ng/mL) produzida por
PBMCs (1,5 x 106 células/500 μL) de doadores sadios estimuladas com formas
amastigotas (3 x 105 leishmânias/500 μL) oriundas de lesão cutânea (JCJ8c, RPL5c e
CSA7c), mucosa ( PPS6m, JBC8m e ASL9m) ou mucocutânea (SMB7mc) por 24
horas. Os símbolos representam a produção de IL-6 no sobrenadante de cultura de
PBMCs de cada doador. n indica o número de doadores e * indica a diferença
estatística, seguido pelo valor respectivo de p. Para estas análises foi utilizado o teste t
de student pareado.
32
5.5 Indução da produção de IL10 por PBMCs de um mesmo doador
estimuladas com formas amastigotas de L.(V.) braziliensis isoladas de lesões
cutâneas ou mucosas
Foi comparada a diferença na capacidade dos isolados oriundos de lesões
cutâneas ou mucosas induzirem a produção de IL10. PBMCs de um mesmo doador
sadio foram estimuladas com um isolado de lesão cutânea e um isolado de lesão mucosa
por 24 horas.
A produção de IL-10 induzida por isolados de formas cutâneas ou mucosas
mostrou-se extremamente variável, sendo que em alguns doadores foi possível observar
uma maior indução destas citocinas pelos isolados de lesão cutânea e em outros por
isolados de lesão mucosa (Figura 7). Porém, apenas o isolado de lesão cutânea CSA7c
induziu significante uma maior produção de IL-10 em 24 horas quando comparado aos
isolados de forma mucosa PPS6m e JBC8m (Figura 7 G e 7 H).
33
Figura 7. Comparação entre a quantidade de IL-10 produzida (ng/mL) por PBMCs (1,5
x 106 células/500 μL) de doadores sadios estimuladas com formas amastigotas (3 x 105
leishmânias/500 μL) oriundas de lesão cutânea (JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosa
(PPS6m, JBC8m e ASL9m) ou mucocutâneo (SMB7mc) por 24 horas. Os símbolos
representam a produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de PBMCs de cada doador.
n indica o número de doadores e * indica a diferença estatística, seguido pelo valor
respectivo de p. Para estas análises foi utilizado o teste t de student pareado.
34
5.6 Expressão de mRNA para IL-1, IL-10 e TGFβ por PBMCs estimuladas
com formas amastigotas de L. (V.) braziliensis isoladas de lesões cutâneas ou
mucosas pela PCR em tempo real
Nesta fase foi investigado se as diferenças encontradas nas concentrações das
citocinas secretadas eram também observadas na expressão do mRNA.
Uma tendência das PBMCs em produzir menos IL-1 quando estimuladas por
isolados oriundos de lesão mucosa (PPS6m, JBC8m ou ASL9m) em comparação com
isolados de lesão cutânea (JCJ8c, RPL5c ou CSA7c) foi confirmada pelo método da
PCR em tempo real (Figura 8 A). Analisando a expressão de IL-1 entre o isolado
oriundo de lesão cutânea (JCJ8c) e o de lesão mucosa (PPS6m), que possuíram uma
diferença significativa na indução de IL-1 pelo método de ELISA (Figura 5 A), também
foi observado uma expressão maior de IL-1 quando as células foram estimuladas com o
isolado oriundo de lesão cutânea (JCJ8c) (Figura 8 B).
O mRNA para IL-10 aumentou após o estímulo com leishmânia, porém não
observamos nenhuma diferença significante entre os isolados de lesão cutânea e os
isolados de lesão mucosa em induzir a produção de IL10 pelas PBMCs (Figura 8 C), o
mesmo foi observado analisando a expressão de IL-10 entre o isolado oriundo de lesão
cutânea (JCJ8c) e o de lesão mucosa (PPS6m) (Figura 8D).
A expressão de mRNA para TGFβ também foi demonstrada, sendo observado
um aumento na expressão de 10 vezes dos ensaios com estímulos de amastigotas em
relação ao não estimulado, porém não observamos diferença entre os isolados de lesões
cutâneas e mucosas (Figura 8 E). O mesmo foi observado analisando a expressão de IL10 entre o isolado oriundo de lesão cutânea (JCJ8c) e o de lesão mucosa (PPS6m)
(Figura 8F).
35
A
IL1
B
IL1
8
10
n=26
p=0,14
5
0
Cutânea
Mucosa
mRNA IL1 relativo
(Aumento em vezes/ NI)
mRNA IL1 relativo
(Aumento em vezes/ NI)
15
6
n=5
p = 0,01
4
2
*
0
JCJ8c
C
IL-10
5
D
4
IL-10
15
3
n=28
p=0,77
2
1
0
Cutânea
Mucosa
mRNA IL-10 relativo
(Aumento em vezes/ NI)
mRNA IL-10 relativo
(Aumento em vezes/ NI)
PPS6m
n=5
p = 0,1
10
5
0
JCJ8c
E
PPS6m
TGF
15
15
10
n=16
p=0,49
5
0
Cutânea
Mucosa
mRNA TGF relativo
(Aumento em vezes/ NI)
mRNA TGF relativo
(Aumento em vezes/ NI)
20
F
TGF
n=4
p = 0,37
10
5
0
JCJ8c
PPS6m
Figura 8. Expressão de mRNA para IL-1β (A e B), mRNA IL-10 (C e D) e
mRNA TGFβ (E e F) em PBMCs (1,5 x 106 células/500 μL) de doadores sadios
estimuladas por formas amastigotas de leishmânias (3 x 105 leishmânias/500 μL)
oriundas de pacientes com lesão cutânea (JCJ8c, RPL5c ou CSA7c) ou mucosa
(PPS6m, JBC8m ou ASL9m) comparado ao não infectado (NI) após 48 horas de
incubação. n indica o número de doadores seguido pelo valor respectivo de p. * indica
diferença entre células estimuladas por JCJ8c e PPS6m (p < 0,05). Para estas análises
foi utilizado o teste t de student pareado.
36
6 DISCUSSÃO
Na infecção humana com L. (V.) braziliensis observa-se que cerca de 1 a 10%
dos pacientes desenvolvem a leishmaniose mucosa, cujas lesões são encontradas apenas
na mucosa (oral, nasal ou orofaringe) ou na pele e na mucosa de forma contígua ou
isolada (Marsden 1994). Neste tipo de doença, observa-se que apesar de poder ocorrer
uma cura da lesão primária, uma lesão metastática desenvolve-se na mucosa com
extensa destruição do tecido mole subjacente e da cartilagem, o que indica que a
erradicação do parasito não tinha acontecido na realidade (Saravia et al. 1990). Os
fatores que promovem o reaparecimento de lesões em mucosas não são conhecidos,
porém, fatores inerentes ao hospedeiro e aos parasitos certamente participam deste
reaparecimento.
Em nosso estudo foi demonstrado que formas amastigotas obtidas de lesões
mucosas induzem menos IL-1β que isolados obtidos de lesões cutâneas (Figuras 4A e
7A). Como a lesão na mucosa é caracterizada por ser mais grave e exacerbada, poderia
ser esperado encontrar uma maior produção de citocinas pró-inflamatórias pelas PBMCs
quando estimuladas com isolados de lesões mucosas. Foi encontrada em biópsias da
mucosa de pacientes com leishmaniose mucosa uma maior produção de citocinas
indutoras do perfil Th17 (IL-1β, IL-23, IL-6 e TGFβ) em relação à mucosa de um
paciente sadio, além de um grande infiltrado de neutrófilos na lesão, porém não foi
avaliado se há alguma diferença na produção destas citocinas em pacientes com
leishmaniose mucosa comparado com pacientes apresentando apenas lesões cutâneas
(Boaventura et al. 2010).
O papel da IL-1 na leishmaniose tem sido explorado, mas continua pouco
esclarecedor. Experimentos utilizando o modelo murino infectado por L. major sugerem
que, no início da infecção, a IL-1 é importante para a ativação de uma resposta efetora
do tipo Th1 e para o controle da infecção (Von Stebut 2003; Kostka et al. 2006). Em
camundongos susceptíveis infectados com formas promastigotas de L.major o mRNA
para IL-1 encontrava-se substancialmente mais expresso quando comparada com
camundongos resistentes infectados (Heinzel et al. 1989). A IL-1 tem se mostrado
importante na geração de um perfil Th2 ou Th17 em modelos murinos da infecção por
Leishmania ou outros modelos de infecção por L. major (Kostka et al. 2006; Nylen &
Gautam 2010). Entretanto, o excesso de IL-1 pode favorecer uma resposta inflamatória
local com aumento de migração de células mielóides imaturas predispondo a infecção e
37
a disseminação da doença (Voronov et al. 2010) ou seja, se não tiver IL-1 a doença é
mais lenta. Nossos resultados corroboram com resultados anteriores que mostram que o
o crescimento da lesão em camundongos inoculados com um isolado oriundo de lesão
mucosa (PPS6m) teve um início mais tardio, porém com o passar do tempo a lesão
caracterizou por apresentar um tamanho e uma gravidade maior do que em
camundongos infectados com um isolado oriundo de lesão cutânea (Leite et al. 2012).
Em experimentos, entretanto, com camundongos C57BL/6 deficientes de IL-1 α e β
infectados com L. major não houve alteração no progresso da doença em relação aos
camundongos selvagens (Kautz-Neu et al. 2010). No caso da infecção por L.
amazonensis, a IL-1 é capaz de melhorar a capacidade de apresentar antígenos pelas
células dendríticas, porém, isto não foi capaz de induzir uma resposta imune eficiente
contra o parasito (Xin et al. 2007).
Em L. (V.) braziliensis foi observado que células dendríticas cultivadas com
formas promastigotas oriundas de lesão mucosa infectaram duas vezes mais do que as
células cultivadas com formas promastigotas oriundas de lesão cutânea, porém as
células com as formas promastigotas oriundas de lesão mucosa expressaram uma menor
quantidade de MHCII e moléculas co-estimulatórias em relação às células infectadas
com formas promastigotas de lesão cutânea (Leite et al. 2012). Associando estes
achados com os nossos experimentos podemos hipotetizar que a menor quantidade de
IL-1 produzida por células de pacientes com lesões mucosas estaria prejudicando a
apresentação de antígenos de leishmânia pelas células dendríticas, o que facilita a
sobrevivência do parasito associando com uma maior gravidade da doença. A baixa
produção de IL-1 pode dificultar a formação de uma resposta imune adquirida eficiente,
embora diminua a migração de células hospedeiras para o parasito. Desta forma, o
parasito teria a possibilidade de sobreviver por mais tempo no hospedeiro de uma
maneira silenciosa, o que é uma das características da leishmaniose mucosa, a qual
aparece mais tardiamente nos indivíduos infectados, geralmente meses ou anos após a
cura clínica da lesão cutânea.
Em nosso estudo, também foi avaliado que formas amastigotas obtidas de lesões
mucosas expressam menos mRNA para IL-1β que isolados obtidos de lesões cutâneas
(Figuras 8A e 8B), mostrando que estas diferenças já são observadas na regulação da
trasncrição (indução) da IL-1. Uma das fontes de produção da IL-1 depende da ativação
do inflamassoma. O inflamassoma é um complexo multiprotéico que desempenha um
papel chave na imunidade inata participando na produção das citocinas pró38
inflamatórias IL-1 β e Interleucina-18 (IL-18). Estas duas citocinas são produzidas
como precursores inativos: pró-IL1 β e pró IL-18 e compartilham um mecanismo
comum de maturação dependente de caspase-1. A ativação desta caspase-1 ocorre
dentro da montagem do inflamassoma (Chen et al. 2011). O inflamassoma mais bem
caracterizado é o NLRP3, que é composto pela proteína NLR, o adaptador ASC e a prócaspase-1 (Bauernfeind et al. 2011a; Chen et al. 2011). O consenso geral é que a
maturação e a liberação de IL-1 β requerem dois sinais distintos: o primeiro sinal leva à
síntese de pró-IL-1 β e do próprio NLRP3 e outros componentes do inflamassoma, o
segundo sinal resulta na montagem total do inflamassoma NLRP3, ativação da caspase1 e secreção de IL-1 β. A ativação do inflamassoma NRLP3 pode ser desencadeada por
diferentes estímulos. Os padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) podem
ativar o inflamassoma NLRP3 e induzir a síntese de IL-1 β na presença de ATP. Além
disso, o inflamassoma NLRP3 pode ser ativado por moléculas associadas ao estresse ou
perigo (DAMPs) (Bauernfeind et al. 2011a; Chen et al. 2011), incluindo cristais e
partículas, como o ácido úrico (Ghaemi-Oskouie & Shi 2011), estímulos que induzem o
efluxo de potássio e indutores da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)
(Bauernfeind et al. 2011a). Os parasitos em geral, incluindo a leishmânia, têm padrões
moleculares associados à patógenos (PAMPs) que serão reconhecidos por receptores de
células do hospedeiro e serão essenciais na geração da resposta imune inata
(Wojtkowiak 2007). Uma das maneiras que os parasitas de lesão mucosa podem
estimular uma menor produção de IL-1 é pelo bloqueio do inflamassoma. Em nosso
laboratório, foi demonstrado que os mesmos isolados oriundos de lesões mucosas
utilizados neste estudo expressaram uma maior quantidade de TSA (thiol-specific
antioxidant protein) na sua superfície em relação aos isolados oriundos de lesões
cutâneas (Ávila et al. 2012). A TSA é uma proteína antioxidante expressa nas
superfícies celulares de formas promastigotas e formas amastigotas de leishmânia
(Tabatabaie 2007). O acúmulo de ROS pode ser regulado pela ação coordenada de
diversas proteínas antioxidantes como a TSA (Phelan 1999). A nossa hipótese é que a
maior expressão de TSA de leishmânias que causam a leishmaniose mucosa estaria
bloqueando e regulando as ROS e consequentemente formando menos IL-1 β, porém
em nossos experimentos nós também observamos uma menor expressão de mRNA para
IL-1 β nas células quando foram induzidas com parasitos oriundos de lesão mucosa. Isto
está de acordo com novos estudos, em que foi observado que os ROS estariam
relacionados com a indução do NLRP3, e não na ativação (Bauernfeind et al. 2011b).
39
Em nossos experimentos foi detectada uma produção de IL-6 por PBMCs de
doadores sadios induzidas por formas amastigotas de L.(V). braziliensis (Figura 2B).
Foi observada diferença estatisticamente significativa entre três isolados, porém estas
diferenças não foram relacionadas a forma clínica (cutânea ou mucosa), indicando que
estas diferenças foram uma particularidade dos isolados (Figura 6). Em um modelo de
leishmaniose visceral com L. donovani comparou-se camundongos sem IL-6 com
camundongos selvagens e observou-se que os camundongos sem IL-6 apresentaram um
melhor controle da doença e do parasito direcionando uma maior resposta Th1 (Murray
2008). Em relação à L. (V.) braziliensis observou que a IL-6 pode regular respostas do
tipo 1, relacionando o nível de IL-6 com o risco de LM (Castellucci et al. 2006). Em
nossos experimentos, além de produzirem IL-6, as células também expressaram TGFβ
quando foram estimuladas com os isolados utilizados. Sabe-se que a combinação de IL6, TGFβ e IL-1 é crucial para a diferenciação do perfil Th17, que tem como citocina de
assinatura a IL-17, a qual está relacionada com a indução da lesão tecidual mediada pela
atração de neutrófilos e liberação de proteinases. Este perfil tem sido implicado em
diversos processos inflamatórios e alguns estudos também sugerem o envolvimento na
leishmaniose mucosa (Boaventura et al. 2010; Ghoreschi et al. 2010).
Para promover uma infecção eficiente, os parasitos do gênero Leishmania devem
ser internalizados por macrófagos e no interior destas células proliferarem na forma
amastigota. Após a lise das células infectadas, as formas amastigotas são liberadas e
novamente devem penetrar em novos macrófagos para manter uma infecção eficiente
(McMahon-Pratt & Alexander 2004). Ao reconhecer os parasitos, os macrófagos são
capazes de produzir vários mediadores inflamatórios e anti-inflamatórios. É importante para
o hospedeiro e para os parasitos que os macrófagos produzam mediadores antiinflamatórios, pois estes, vão interferir com a geração de uma resposta imune específica e
na função microbicida dos macrófagos. Em nossos experimentos foi observada a indução
da produção das citocinas anti-inflamatórias IL-10 (Figura 2C) e TGF-β (Figura 8D) em
PBMCs de doadores sadios estimulados com formas amastigotas, porém não
observamos diferenças na produção desta citocina entre isolados oriundos de lesões
cutâneas e mucosas (Figura 7 e 8C). A IL-10 contribui significantemente para a
regulação da resposta imune em seres humanos infectados com L. (V.) braziliensis,
tendo como principais fontes de sua produção os monócitos circulantes e as células
Tregs (Salhi et al. 2008). PBMCs de indivíduos que tiveram e curaram da forma cutânea
da leishmaniose produziram mais IL-10 do que PBMCs de indivíduos que tiveram e
40
curaram da forma mucosa quando foram estimuladas com antígenos de L. (V.)
braziliensis (Gomes-Silva et al. 2007). No tecido inflamatório observou-se níveis
semelhantes de IL-10 produzidas por células de pacientes com leishmaniose cutânea ou
mucosa, porém a expressão do receptor para IL-10 foi menor em lesões de leishmaniose
mucosa do que em lesões de leishmaniose cutânea (Faria et al. 2005). Em nossos
experimentos apenas um isolado induziu significantemente mais IL-10 do que os outros
(Figura 7G e H), onde o isolado de lesão cutânea (CSA7c) induziu uma maior produção
de IL-10 comparado com os isolados de lesão mucosa (PPS6m e JBC8m), porém esta
tendência não foi observada com outros isolados oriundos de lesões cutâneas, o que
reforça a utilização de vários isolados para o estudo.
De acordo com nossos resultados, não foi possível detectar a indução da
produção de TNFα por PBMCs de doadores sadios estimuladas com formas amastigotas
(Figura 3 C). Com 12 horas nós conseguimos detectar uma pequena produção de TNF,
porém não observamos diferenças na detecção desta citocina por células sem estímulo
em relação às células estimuladas com formas amastigotas de leishmânia, mostrando
que esta citocina é liberada provavelmente pela própria manipulação das células. Em
outro trabalho, macrófagos de doadores sadios também não produziram TNFα quando
foram estimulados com formas promastigotas de L. (V.) braziliensis (Souza et al. 2010).
A produção desta citocina foi observada quando PBMCs foram infectadas com formas
promastigotas metacíclicas de outras espécies (L. (L.) infantum e L. (L.) major). (Sartori
et al. 1997; Meddeb-Garnaoui et al. 2009). Na leishmaniose mucosa causada pela L. (V.)
braziliensis observa-se altos níveis de TNF na lesão (Cabrera et al. 1995). Em nosso
trabalho foi observado que esta citocina foi induzida quando as PBMCs foram
estimuladas com Escherichia coli e Listeria monocytogenes mortas pelo calor, mas não
com amastigotas de leishmânia no tempo decorrido de 12 horas (Figura 3 D). É possível
que a produção de TNF estimulada por formas amastigotas de L. (V.) braziliensis
dependa de outros fatores existentes in vivo (Cabrera et al. 1995).
Neste trabalho também não foram detectadas as citocinas IL-17 e IFNγ (Figura 3
A e 3 B). Estas duas citocinas são produzidas principalmente por linfócitos durante a
resposta imune adquirida, caracterizando respectivamente os linfócitos dos perfis Th17
e Th1 (McMahon-Pratt & Alexander 2004; Pappu et al. 2008), entretanto, outras células
como as células NK também são capazes de produzir estas citocinas durante a
imunidade inata em infecção por Leishmania spp (Liew & O'Donnell 1993; Scharton &
Scott 1993; Passos 2010). Além disto, células NKT, macrófagos, neutrófilos, células T
41
γδ e outras células da imunidade natural também podem produzir IL-17 (Boaventura et
al. 2010; Reynolds et al. 2010). A IL-17 desempenha um papel fundamental na
inflamação e na auto imunidade. Foi mostrado que linfócitos obtidos de pacientes com
leishmaniose mucosa e cutânea produzem níveis altos de IL-17 em relação aos
indivíduos não infectados, tendo uma tendência dos linfócitos obtidos de lesões
mucosas produzirem mais IL-17. Não foi observado um papel patológico desta citocina
nestas lesões (Bacellar et al. 2009), e possivelmente, ela contribui para o controle da
infecção por L. (V.) braziliensis (Novoa et al. 2010). Um antígeno recombinante de
leishmânia chamado LeiF direciona uma resposta do tipo 1 com IFNγ e produção de IL12 em PBMCs de indivíduos infectados comparados com PBMCs de indivíduos sadios
(Skeiky et al. 1995), em experimentos com L. (V.) braziliensis visando o
desenvolvimento de uma vacina recombinante os resultados encontrados foram
negativos em relação a uma imunidade protetora do tipo 1 (Salay et al. 2007). Nossos
dados sugerem que as formas amastigotas de L. (V.) braziliensis não são capazes de
induzir a produção de IFNγ e IL-17 por células da imunidade inata.
Todos os isolados utilizados neste trabalho foram confirmados sendo
pertencentes à espécie L. (V.) braziliensis. Em nosso trabalho foi demonstrado que em
um mesmo grupo de doadores, os isolados oriundos de leishmaniose cutânea ou mucosa
podem apresentar diferenças na indução de citocinas. Embora não seja possível definir
um padrão de que todos os isolados oriundos de lesão cutânea e mucosa tenham um
padrão similar, os nossos dados claramente indicam que existem fatores do parasito que
interferem na produção de citocinas. Foi observado que leishmânias isoladas de um
mesmo paciente com lesões cutâneas e mucosas foram avaliadas e apresentaram
diferenças genéticas entre si (Cuervo et al. 2004). Também observou que isolados
oriundos de pacientes com leishmaniose mucosa apresentaram níveis maiores de
atividade de arginase em relação a outras formas clínicas de leishmaniose tegumentar
(Vendrame et al. 2010). Também foi observada uma grande variação na hidrólise de
ATP, ADP e AMP por diferentes isolados de L. (V.) braziliensis (Leite et al. 2012).
Em resumo, nós observamos que as formas amastigotas de L. (V.) braziliensis
ativam as células mononucleares de doadores sadios a produzirem citocinas da
imunidade inata importantes na geração do perfil Th17 e de células Tregs. Também foi
observado que isolados oriundos de lesões mucosas induzem uma menor produção de
IL-1 em relação aos isolados oriundos de lesão cutânea, o que poderia estar dificultando
a formação de uma resposta imune eficiente, relacionando com a progressão da doença.
42
7 CONCLUSÕES
7.1 Formas amastigotas de L. (V.) braziliensis induzem a produção de IL-1β, IL6, IL-10 e TGF-β PBMC de doadores sadios.
7.2 A produção de IL-1β, IL-6 e IL-10 por PBMC de doadores sadios induzidas
por formas amastigotas de L. (V.) braziliensis são detectadas em níveis mais altos no
período de 24 h após o estímulo.
7.3 Formas amastigotas de L. (V.) braziliensis isoladas de lesão cutânea induzem
mais IL-1β do que formas amastigotas obtidas de lesões mucosas.
7.4 Formas amastigotas de L. (V.) braziliensis não induzem a produção das
citocinas IFNγ, IL-17 e TNFα em PBMC de doadores sadios.
7.5 Existem fatores do parasito e do hospedeiro que interferem na produção de
citocinas.
7.6 Os resultados deste trabalho e de outros semelhantes são fundamentais para
compreensão da imunopatogênese da leishmaniose.
43
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9 ANEXOS
9.1 Anexo 1
65
9.2 Anexo 2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO – Banco de
Sangue
Você está sendo convidado (a) a participar, como voluntário, em uma
investigação sobre como as células brancas do sangue (leucócitos) reagem em
tubos de ensaio ou em placas de cultura de célula ao contato com Leishmania
sp., o parasito causador da leishmaniose. Maiores informações sobre a
pesquisa será dada a seguir. Caso você aceite em participar desta
investigação, por favor, assine ao final deste documento, que está em duas
vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Caso você não
queira participar da pesquisa você não sofrerá nenhum prejuízo. As
informações serão fornecidas para que você leia ou será lida por um
pesquisador do grupo de pesquisa antes de ser iniciada a doação de sangue.
Meu nome é:______________________ (pesquisador participante do projeto).
O estudo terá a duração de dois anos (01 do setembro de 2008 a 30 de agosto
de 2010) e você poderá contactar o responsável pela pesquisa Dr. Milton A. P.
Oliveira pelo telefone (62)32096126 a qualquer momento para obter maiores
informações sobre esta caso esteja interessado. Em caso de dúvidas sobre os
seus direitos nesta pesquisa você poderá entrar em contato com o Comitê de
Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás
pelos telefones (62) 3269.8338-3269.8426.
Informações sobre a pesquisa
Título da Pesquisa: Citocinas relacionadas ao perfil Th17 induzidas pela
interação de células mononucleares do sangue periférico humano com
formas amastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis isoladas de
pacientes com leishmaniose mucosa ou cutânea. Instituição: Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP).
Pesquisador Responsável: Dr. Milton Adriano Pelli de Oliveira/IPTSP
(32096126)
Descrição da Pesquisa.
66
Recentemente foram descobertas proteínas secretadas por leucócitos que
estão relacionadas à destruição do tecido em doenças auto-imunes. Neste
projeto queremos avaliar se proteínas secretadas pelos leucócitos estimulados
por Leishmanias que causam uma forma destrutiva da leishmaniose
(leishmaniose mucosa) correspondem àquelas que estão relacionadas a
destruição de tecidos em doenças auto-imunes. Este conhecimento poderá
servir como um importante auxilio na forma que se trata a leishmaniose
mucosa.
Procedimento da pesquisa
Caso você aceite em participar da pesquisa, serão coletados mais 10 mL de
sangue, além do retirado para o Banco de Sangue, em um tubo a vácuo
contendo anticoagulante. Este sangue será rotulado com um código contendo
as três primeiras letras do seu nome, seguido de sua idade e sexo. Um número
de identificação junto ao Banco de sangue também será levado com intuito
apenas de saber o resultado da sua sorologia. Nenhuma informação adicional
será levada ao Laboratório de Pesquisa do IPTSP além destas. Ao chegar ao
Laboratório, as células brancas serão separadas e cultivadas com leishmanias.
O líquido desta cultura será avaliado quanto a presença de diferentes produtos
químicos produzidos pelas células brancas para avaliar se estas estão sendo
estimuladas a produzirem substâncias que geram destruição do tecido. A
capacidade das suas células brancas destruir as leishmanias também será
avaliada.
Ressaltamos que sua participação é voluntária e não irá além da coleta dos 10
mL de sangue que será levada para o Laboratório do IPTSP, não havendo
nenhum tipo de risco à sua saúde ou integridade física, a não ser os riscos
mínimos de uma doação de sangue. Entretanto, caso algum dano a sua
pessoa seja causado pelo desenvolvimento desta pesquisa, você tem o direito
de solicitar indenização pelo dano causado. Não haverá nenhum benefício
direto a sua pessoa por esta pesquisa, porém, você estará contribuindo para
estudos que tentam melhorar a qualidade de vida de pessoas infectadas por
leishmania
Confidencialidade
Os resultados da pesquisa serão usados apenas pelos pesquisadores do
projeto para fins científicos. Nenhum resultado individual que possibilite a sua
identificação será divulgado. Você poderá desistir do consentimento a qualquer
momento da pesquisa sem qualquer ônus. Após o término da cultura e análise
do liquido da cultura todo o material será esterilizado em autoclave e
descartado em lixo hospitalar adequadamente, não sendo guardado nenhum
material biológico oriundo desta pesquisa.
Consentimento
Eu li as informações/ As informações do estudo foram lidas para mim. Eu estou
informado e ciente de minha participação como voluntário no estudo e que será
retirada uma única amostra de 10 mL de sangue específica para esta pesquisa.
Estou também de acordo com a publicação dos dados obtidos desta pesquisa
em forma de artigos ou resumos científicos. Informo que aceito em participar do
estudo. Fui devidamente informado pelo pesquisador____________________
sobre a pesquisa, os procedimentos nela envolvidos, assim como os possíveis
riscos e benefícios decorrentes de minha participação. Foi me garantido o
67
direito de que posso retirar o meu consentimento a qualquer momento, sem
que isto leve a qualquer penalidade.
Assinatura do Participante/impressão digital_________________________________________
Assinatura da testemunha________________________________________________________
Assinatura do entrevistador_______________________________________________________
Goiânia, _____de ______________de 20__
68
9.3 Anexo 3
Leishmania (Viannia) braziliensis amastigotes stimulate production of cytokines
related to Th17 and regulatory T cells by peripheral blood mononuclear cells
from healthy donors.
C. M. Gomes,1 L. R. Ávila,1 S. A. Pinto,2 F. B. Duarte,3 L. I. A. Pereira,1 I. A.
Abrahamsohn,4 M. L. Dorta,1 L. Q. Vieira,5 F. Ribeiro-Dias1 & M. A. P. Oliveira1
1
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de
Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil, 2Instituto Goiano de Oncologia e Hematologia,
Goiânia, Goiás, Brazil, 3Hospital Unique, Goiânia, Goiás, Brasil, 4Instituto de
Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes
1730, São Paulo, 05508 900, Brazil,
5
Departamento de Bioquímica e
Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil.
Correspondence: Milton A. P. Oliveira: Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública, Universidade Federal de Goiás, Rua 235 S/N Setor Universitário,
Goiânia, GO. 74605-050, Brazil. Tel: (5562) 3209-6126; Fax (5562) 3209-6363;
E-mail: [email protected]
Running title: Human cytokines induced by L. braziliensis amastigotes.
Keywords: Leishmania braziliesis, amastigotes IL-1, IL-6, IL-10, TGF-β,
human, leishmaniasis
69
SUMMARY
Leishmania (Viannia) braziliensis causes cutaneous and mucosal
leishmaniasis in several countries in Latin America. In mammals the parasites
live as amastigotes, interacting with host immune cells and stimulating cytokine
production that will drive the type of the specific immune responses. Generation
of Th17 lymphocytes is associated with tissue destruction and depends on IL-1,
IL-6, TGF-β and IL-23 production, whereas induced regulatory T cells depend
on IL-10 and TGF-β and are associated with tissue protection. Here, we
evaluate whether amastigotes stimulate cells from the innate immune system to
produce the cytokines responsible for the generation of Th17 or regulatory T
cells. Seven L (V.) braziliensis isolates from patients with different clinical forms
of leishmaniasis were expanded in interferon-knockout mice to obtain
amastigotes and in culture to get promastigotes. The parasites were used to
stimulate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors and
cytokine production was evaluated by ELISA or PCR. Amastigotes and
promastigotes induced IL-1 and IL-10 production in PBMC; however, only
amastigotes induced IL-6 and TGF-β. These data demonstrate for the first time
that L. (V.) braziliensis amastigotes directly stimulate production of cytokines
that can contribute to the generation of Th17 or regulatory T cells.
70
INTRODUCTION
American tegumentary leishmaniasis (ATL) is a zoonotic tropical disease
caused by parasites of the genus Leishmania. These parasites have a
dimorphic life cycle consisting of extracellular promastigotes that develop inside
the vector and are inoculated into the skin of the vertebrate host. In the skin,
parasites are internalized by host cells and rapidly differentiate to intracellular
amastigotes, which reside and multiply within mononuclear phagocytes (Kima
2007; Soong, Henard et al. 2012). The initial lesion usually develops at the
vector bite site, and several different clinical forms of ATL are recognized .The
species Leishmania (Viannia) braziliensis is the major cause of ATL in Brazil
(Marsden 1994; Goto and Lindoso 2010; Soong, Henard et al. 2012) and the
majority of patients infected with L. braziliensis develop the localized form of
cutaneous leishmaniasis (LCL), characterized by a single or few skin ulcers,
which respond well to the treatment or can undergo spontaneous healing. About
1-10% of patients develop mucosal leishmaniasis (ML), which generally
appears months or years after the healing of the cutaneous lesion, (Marsden
1994; Goto and Lindoso 2010). The nose and/or oropharynx mucosa are most
affected in ML; the intense cellular immune response causes severe tissue
destruction and organ deformities (Marsden 1994; Goto and Lindoso 2010;
Soong, Henard et al. 2012).
Healing of leishmaniasis requires an effective immune response that,
although capable of killing the parasites, should not damage the host tissues.
Cytokines such as IFN and TNF-α are important macrophage activators to
parasite killing (Soong, Henard et al. 2012) whereas L-10 and TGF-β participate
in the control of immunopathology in leishmaniasis (Faria, Gollob et al. 2005;
71
Carvalho, Passos et al. 2012; Castellucci, Jamieson et al. 2012; Soong, Henard
et al. 2012). In fact, exacerbated production of IFN and TNF-α, accompanied
by low IL-10 production or by low expression of its receptor have been
associated with tissue destruction in patients with severe ML (Bacellar, Lessa et
al. 2002; Faria, Gollob et al. 2005; Bacellar, Faria et al. 2009). In addition, the
production of IL-17, in association with IL-1 and IL-6 were also correlated with
tissue destruction in ML patients (Boaventura, Santos et al. 2010)
Studies analyzing the interaction of Leishmania antigens with peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) from infected hosts revealed that L. (V.)
braziliensis soluble antigens derived from promastigotes are able to stimulate
the production of a variety of cytokines such as IFN, TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10,
IL-12, IL-17 and IL-23 (Bacellar, Lessa et al. 2002; Amato, de Andrade et al.
2003; Faria, Gollob et al. 2005; Boaventura, Cafe et al. 2006; Vieira, Keesen et
al. 2013). Moreover, the production of cytokines by promastigote-stimulated
PBMCs from patients correlates with the cytokine pattern observed in the
respective biopsies (Amato, de Andrade et al. 2003; Boaventura, Cafe et al.
2006; Nogueira, Goto et al. 2008; Bacellar, Faria et al. 2009; Boaventura,
Santos et al. 2010). Importantly, in all these studies, parasite antigens failed to
stimulate cytokine production by PBMC from healthy donors, indicating that
responsiveness to those antigens mostly depends on the presence of specific
primed T cells in the patients’ blood. However, cultures of PBMC-derived
human monocyte/macrophages stimulated with live L. (V.) braziliensis
promastigotes can produce low levels of IL-10, IFN, CCL3 and CXCL10 but not
TNF-α or IL-12 (Sartori, Oliveira et al. 1997; Souza, Giudice et al. 2010; VargasInchaustegui, Hogg et al. 2010).
72
With few exceptions, the in vitro studies on the responsiveness of cells to
L. braziliensis parasites or its derived antigens have addressed the reactivity to
promastigote antigens. Additionally, these studies investigated interaction
between amastigotes and mouse cells (Balanco, Pral et al. 1998; VargasInchaustegui, Xin et al. 2008; Leite, Gomes et al. 2012; Soong, Henard et al.
2012). Obtaining L. (V.) braziliensis amastigotes is a difficult process and few
researchers work with this form of the parasite (Teixeira, de Jesus Santos et al.
2002), although some work has been done with axenic amastigotes generated
in cell-free liquid cultures.(Balanco, Pral et al. 1998; Vargas-Inchaustegui, Xin et
al. 2008; Soong, Henard et al. 2012). However the insect–transmitted
promastigotes are only present for a very short time at the site of infection
before their entry into host skin cells where they transform into amastigotes that
divide and perpetuate the infection. In fact, amastigotes are the main
Leishmania forms that the host innate and specific immune systems have to
cope with. Although promastigotes and amastigotes share many antigens,
amastigotes have particular antigens (Balanco, Pral et al. 1998; Mensa-Wilmot,
Garg et al. 1999; Teixeira, de Jesus Santos et al. 2002; Naderer, Vince et al.
2004; Kima 2007) which possibly elicit distinct responses from the immune
system. We described a method using IFN knockout mice to isolate L. (V.)
braziliensis from patient biopsies, making it possible to obtain large number of
amastigotes and to study their interaction with the host (Oliveira, Pires et al.
2010).
In the present work, we investigated the production of cytokines related
to the generation of Th17 or Treg cells by PBMC from healthy human donors
73
stimulated with L. (V.) braziliensis amastigotes isolates obtained from patients
suffering from localized or mucosal forms of ATL.
MATERIALS AND METHODS
Animals
Male or female C57BL/6 mice with disrupted IFN genes (IFN KO mice)
were bred at the animal facilities of Federal University of Goiás/IPTSP, Brazil.
IFN KO mice were originally purchased from Jackson Laboratories, ME/USA
(B6.129S7-ifngtm1Ts). The mice used were 6-12 week old and were maintained
in a clean conventional mouse facility with ad libitum access to water and food.
Peripheral blood mononuclear cells
Peripheral blood was obtained by venipuncture from adult healthy donors
at the blood bank of Clinical Hospital of Goias using EDTA as anticoagulant.
PBMC were separated by Ficoll-Paque® PLUS (GE Healthcare, Uppsala,
Sweden) and cultured (1.5 X 106 cells/well) in 24-well plates (TPP,
Trasadingen, Switzerland) in RPMI 1640 medium (Sigma Chem. Co., St. Louis,
MO, USA) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Cripion, São Paulo,
Brasil), 2 mM L-glutamine (Sigma), 100 U/mL penicillin (Sigma), 100 g/mL
streptomycin (Sigma) and 50 M 2- mercaptoethanol (Sigma). Supernatants
were harvested 24 h after stimulation with amastigotes or promastigotes.
74
Parasites
Seven Leishmania isolates were obtained from ATL patients attending
the outpatient facility of the Anuar Auad Tropical Diseases Hospital in the city of
Goiânia, state of Goiás, Brazil.
The Leishmania isolates used in this work were representative of the
clinical forms of tegumentary leishmaniasis: LCL, ML and MCL. The patients
originated from the North, Northeast and Center of Brazil, where they were most
likely infected. Two patients that had provided biopsies did not receive any
treatment, because they failed to return after diagnosis was made. Four patients
were treated with Pentavalent antimonial for 20 days and became clinically
cured. One patient with ML had a relapse and was treated with pentoxifylline
with clinical cure. All isolates were infective for IFN KO mice.
Three isolates were obtained from LCL patients: MHOM/BR/2005/RPL5c,
MHOM/BR/2008/JCJ8c, and MHOM/BR/2007/CSA7. Three Isolates were
obtained from ML patients: MHOM/BR/2009/ASL9m, MHOM/BR/2006/PPS6m
and MHOM/BR/2008/JBC8m and one isolate was from a patient with
simultaneous cutaneous and mucosal lesion (MCL) MHOM/BR/2007/SMB7cm.
The parasites were isolated from lesion biopsies performed as part of the
diagnostic procedure. Skin fragments were homogenized in sterile 0.01M
phosphate-buffered 0.15 M NaCl at pH 7.0 (PBS)
with antibiotics and
inoculated into the footpad of IFN KO mice as described; after 2-3 weeks the
mice were killed and the removed paws were the processed for the extraction of
amastigotes as described (Oliveira, Pires et al. 2010). The isolates were
screened by ribosomal DNA PCR and by glucose-6-phosphate dehydrogenase
75
gene as described (Castilho, Shaw et al. 2003) and identified as L. (V.)
braziliensis. The patients came from different States of Brazil: Goiás (n=2),
Tocantins (n = 1), Pará (n = 2), Mato Grosso (n = 1) and Bahia (n = 1).
The parasites obtained from the footpads were frozen soon after isolation
and stored as amastigotes in the Leishbank-IPTSP/UFG/GO. In order to obtain
parasites to stimulate PBMC, 1x106 amastigotes were inoculated into IFN KO
mice footpads; when the footpad lesion reached 3-4 mm thickness, the mice
were sacrificed, the footpad was macerated and the amastigotes were
separated as described before (Lang, Goyard et al. 2005). Promastigote
parasites were obtained from amastigotes cultured in 24-well culture plates at 1
× 106 promastigotes per mL in Grace’s Insect Medium (Sigma) supplemented
with inactivated 20% FCS (Cripion), 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin and
100 μg/mL streptomycin (Sigma). The parasites from the stationary growth
phase were harvested at 8 days after starting the cultures and washed three
times in sterile (PBS) before use as stimulus to PBMC cultures.
Cytokine quantification
The cytokines IL-1, IL-6, IL-10, TGF-β, IL-17A and IL-23 were assayed
in supernatants from PBMC cultures. IL-1, IL-17A and IL-23 were assayed
using the commercial kits Ready-Set-Go (eBioscience, San Diego,CA, USA)
according to the manufacturer’s instructions. IL-6 was assayed by kit 900-K16
(PeproTech, Rock Hill, NJ, USA), TGF-β was assayed by kit G1230 (Promega,
Madison, WI, USA) and IL-23 heterodimer by Cytoset (Invitrogen Corporation,
Camarillo, CA, USA). IL-10 was assayed as described before (Cua, Groux et al.
76
1999)
by sandwich immunoenzymatic assay (ELISA) using monoclonal
antibodies (JES-9D7 for capture and JES-12G8 for detection) which were
purified from hybridomas.
The quantification of IL-1β, IL-6, IL-10 and TGF-β mRNAs was performed
by real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR) in the cells remaining in the
wells after supernatant removal. The PCR complementary DNA was
synthesized by using 1 mg of RNA by a reverse transcription reaction as
described before (Barbosa Silva, Vieira et al. 2008).The PCR was performed
under standard conditions as follows: a holding stage at 95C (10 minutes); a
cycling stage of 40 cycles at 95C (15 seconds) followed by 60C (1 minute); and
a melt curve stage at 95C (15 seconds), 60C (1 minute), and 95C (15 seconds).
Sequences were designed using PRIMEREXPRESS software (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) based on nucleotide sequences available in
the GenBank database. The real-time PCR assay was performed using Step
One Real-time PCR Systems (Applied Biosystems). A Syber-Green detection
system (Applied Biosystems) was used to assay primer amplification.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a
housekeeping gene for normalization. All samples were run in duplicates.
Reactions were performed in a volume of 25 µL and contained 1 mg of
complementary DNA. Sequence Detection Software version v 2.0 (Applied
Biosystems) was used to analyze the data after amplification. Results were
obtained as threshold cycle values. Expression levels were then calculated
using the comparative threshold cycle (CT) method (Schmittgen and Livak
2008). The values were calculated as the mean value of the duplicates for each
patient, and the expression levels of mRNA in all samples were defined as the
77
ratio of each specific primer to GAPDH expression. The primer sequences used
for quantitative PCR analysis of IL-1β mRNA, IL-6 mRNA, IL-10 mRNA, TGF-β
mRNA and GAPDH were IL-1β: FW (5’-3’) AAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC
CAG G ; RV (5’-3’) TGG AGA ACA CCA CTT GCT CCA; IL-6: FW (5’-3’) TCA
GAA CGA ATT GAC AAA CA; RV (5’-3’) TTG AAT CCA GAT TGG AAG C; IL10: FW (5’-3’) GGT TGC CAA GCC TTG TCT GA; RV (5’-3’) TCC CCC AGG
GAG TTC ACA T; TGF-β: FW (5’-3’) TAC CTG AAC CCG TGT TGC TCT; RV
(5’-3’) ATC GCC AGG AAT TGT TGC TG; GAPDH:FW (5’-3’) GCA CCA CCA
ACT GCT TAG CA; RV (5’-3’) TGG CAG TGA TGG CAT GGA.
Ethical considerations
The Ethical Committee for Human and Animal research of the "Hospital
das Clínicas" of the Federal University of Goiás approved all procedures
reported in this study (Protocol 094/08). All blood donors and patients were fully
informed and consented to participate in this study.
Statistical analysis
The data were presented as mean ± SD and were compared for
significance by paired Student's t test, ANOVA followed by Bonferroni test or
Pearson correlation using the Graph-Pad Prism Software 5.0 (Inc. San Diego,
CA ,USA). p <0.05 was considered significant.
78
RESULTS
Cytokine levels in supernatants of PBMC cultures from healthy
persons stimulated with L. braziliensis amastigotes
The amastigote-stimulated production of IL-1, IL-6, IL-10, TGF-β, TNF-α,
IFN, IL-17 and IL-23 in PBMC from healthy donors was assayed by ELISA
after 24 h or 48 h culture. The production of IL-1, IL-6, IL-10 and TGF-β at 24 h
was never lower than in 48 h and TNF-α, IFN-, IL-17 and IL-23 were not
significantly induced at these times of culture (data not shown).
Production of IL-1 presented great variability among cultures from
different donors and the unstimulated basal production in culture varied from 0.6
to 9.8 ng/mL (average 3.02 ± 2.27 ng/mL) (Figure 1). Amastigotes obtained
from patients with distinct clinical forms of leishmaniasis all stimulated IL-1
production. In some cultures and for some amastigote isolates, the IL-1 levels
obtained in the supernatants were similar or even lower than the ones detected
in the unstimulated PBMC cultures of the same donor. When all data were
considered together, there was a positive correlation between high basal IL-1
levels with higher production of the same cytokine detected in amastigotestimulated cultures (r = 0.41 p < 0.001).
Significant induction of IL-6 production was also observed after
stimulation of the cultures with most isolates (Figure 2). The basal levels of IL-6
showed a much wider dispersion among the patients and reached values
varying between 1.8 and 18.6 ng/mL (average 9.6 ± 4.8 ng/mL). Similar to IL-1
production, higher IL-6 production stimulated by amastigotes correlated with
higher basal production of this cytokine (r = 0.71 p < 0.001), and a great
79
variability in responses to amastigotes among different donors was also
observed. For most donors, the isolates RPL5c and SMB7mc failed to induce
production of IL-6 in levels superior to those obtained in unstimulated cultures;
however, a few donors responded to these same isolates with IL-6 production
(Figure 2).
IL-10 was also induced by all isolates (Figure 3) and the basal levels of
this cytokine varied between 0.01 and 0.2 ng/mL (average 0.07 ± 0.05 ng/mL).
Production of IL-10 induced by amastigotes was also highly correlated to the
basal levels observed in culture supernatants of unstimulated PBMC (r = 0.83
p<0.001).
Production of TGF-β stimulated by amastigotes (Figure 4) varied from
0.13 to 5 ng/mL (average 1.75 ± 1.30 ng/mL). A positive correlation between
basal levels and production of amastigote-stimulated TGF-β was also observed
(r = 0.58 p < 0.001).
The Th17- related cytokines IL-23 and IL-17 were not induced by any of
the L. (V.) braziliensis isolates in any of the PBMC cultures. The supernatants
were removed at 12, 24, 48 and 72 h after stimulation and were always
negative for IL-23 or IL-17 (data not shown).
Cytokine mRNA expression by PBMC cultures from healthy persons
stimulated with L. braziliensis amastigotes
To verify whether the induction of cytokine secretion was accompanied
by increase in mRNA expression, the PBMC from amastigote-stimulated
cultures were tested by qPCR for the several cytokines. It was observed that
80
almost all amastigote isolates induced significant increases of mRNA
expression for IL-1, IL-6 , Il-10 and TGF-β in the stimulated PBMCs (Figure 5),
except for the PPS6m isolated, which did not induce IL-6 mRNA (Figure 5 B)
and for SMB7mc, which that did not induced TGF-β mRNA (Figure 5D).
Cytokine levels in supernatants of PBMC cultures from healthy
persons stimulated with L. braziliensis promastigotes.
In order to compare the detected cytokine responses of the innate
immune system to amastigotes with those elicited by the promastigotes, PBMC
cultures from 28 healthy donors were stimulated with promastigote forms
derived from the previously tested L. (V.) braziliensis isolates. Each group of
four PBMC cultures (from different donors) were stimulated with promastigotes
of one of the seven isolates. For simplicity, the data of all 28 cultures are
presented in each graph of Figure 6 without identifying the particular
Leishmania isolate used for stimulation.
Promastigote parasites failed to stimulate significant levels of IL-6 (Figure
6 B), and the mean values of TGF-β concentrations were even lower than those
in unstimulated cultures (Fig 6 – D). However, IL-10 as well as IL-1 production
was stimulated by promastigotes in normal PBMC cultures. (Figure 6 A and C)
DISCUSSION
In this study we demonstrate for the first time that L. (V.) braziliensis
amastigotes are able to interact with innate immune cells from healthy donors to
81
stimulate mRNA synthesis and protein secretion of IL-1, IL-6, IL-10 and TGF-.
IL-1 and IL-6 are pro-inflammatory cytokines that act on endothelial cells
increasing the number of adhesion molecules and the migration of leukocytes to
the inflammatory site (Taga and Kishimoto 1997; Clahsen and Schaper 2008;
Dinarello 2011). In addition, high IL-1 production was related with severity of
leishmaniasis caused by L. mexicana (Fernandez-Figueroa, Rangel-Escareno
et al. 2012) and polymorphism of the IL-6 promoter is a risk factor for ML
(Castellucci, Menezes et al. 2006). In humans, the combination of IL-1 and IL-6
was demonstrated to be sufficient for generation of IL-17-producing Th17 cells
from naive precursors (Acosta-Rodriguez, Napolitani et al. 2007; Ghoreschi,
Laurence et al. 2010; Sallusto, Zielinski et al. 2012). Production of IL-17 is
mainly associated to chronic inflammatory and autoimmune diseases, but there
is also evidence that this cytokine collaborates in the protection against fungal,
bacteria and protozoa infection (Matsuzaki and Umemura 2007; Khader and
Gopal 2010; Zhang, Wang et al. 2012). The cytokines IL-1 and IL-6, and also
IL-17, favor tissue damage by increasing inflammation, attracting and activating
neutrophils (Taga and Kishimoto 1997; Clahsen and Schaper 2008; Pelletier,
Maggi et al. 2010; Dinarello 2011). However, activated neutrophils also
contribute to parasite killing in the early steps of experimental leishmaniasis
(Novais, Santiago et al. 2009).
Presence of IL-17 was observed in mucosal and cutaneous lesions of L.
(V.) braziliensis infected patient (Boaventura, Cafe et al. 2006; Bacellar, Faria et
al. 2009). The authors were unable to associate high IL-17 production with a
specific clinical form of leishmaniasis; however, they associated high levels of
IL-17 with more severe lesions. In our experiments we were not able to detect
82
Leishmania amastigote-induced IL-17 production. Probably, IL-17 is produced
mainly by effector Th17 cells in leishmaniasis, whilst we addressed the innate
immune response to the parasite. We also failed to find any correlation between
the clinical forms of the patients from whom the parasites were isolated and
their ability to induce (or not) the production of any of these cytokines in normal
PBMC cultures.
Beyond IL-1 and IL-6, amastigotes induced TGF-β production by normal
PBMC, which are another major factor required for Th17 generation
(Santarlasci, Maggi et al. 2009; Hirahara, Ghoreschi et al. 2010; Sallusto,
Zielinski et al. 2012). TGF-β has multiple and often opposite actions on
immunity. It inhibits macrophage activation and microbicidal activity (BarralNetto, Barral et al. 1992; Li, Wan et al. 2006; Das, Ren et al. 2009; Hemdan,
Birkenmeier et al. 2012; Liu, Islam et al. 2012). TGF- acts with IL-2 on naïve T
cells stimulating the generation of Treg cells (Sakaguchi, Ono et al. 2006).
However, TGF-β plus IL-6 favor the differentiation of naïve T cells to Th17 cells
(Bettelli, Carrier et al. 2006). In addition, TGF- inhibitsTh1/Th2 generation in
human and mice, which may favor Th17 development (Santarlasci, Maggi et al.
2009; Liu, Islam et al. 2012) although in high concentrations TGF-β has
inhibitory effect also on Th17 cells (Sallusto, Zielinski et al. 2012).
Our results show that, unlike amastigotes, promastigotes are unable to
induce significant production of IL-6 and TGF-β in PBMC from healthy donors. It
has been shown, in an experimental model, that the initial cycles of Leishmania
major replication at the infection site occur silently without induction of
inflammatory response and the specific immune response is slow to develop
(Belkaid, Kamhawi et al. 1998; Belkaid, Mendez et al. 2000). It could be
83
speculated that the expression of TGF-β would balance the inflammatory
response otherwise triggered by IL-1 and IL-6, providing an environment that
would be more friendly for the growth of the parasite. This hypothesis is
supported by the report showing, in the murine model, that the pathogenic
profile of Th17 cells arises in absence of TGF-β (Ghoreschi, Laurence et al.
2010).
IL-10 shares with TGF-β its inhibitory effects on the leishmanicidal
activity
of
phagocytes,
on
the
inflammatory
response
and
Th1/Th2
differentiation (Carvalho, Passos et al. 2012). Additionally, IL-10 is a potent
cytokine to generate human regulatory T cells (Treg) from naive precursors
(Roncarolo, Gregori et al. 2006) and it has been described that L-10 can control
the proliferation of IL-17 producing cells in human mucosal and inhibit
production of pro-inflammatory cytokines stimulated by IL-17 (Ciccia, AccardoPalumbo et al. 2010). In leishmaniasis, IL-10 is important to prevent
exacerbation of lesion (Faria, Gollob et al. 2005; Campanelli, Roselino et al.
2006; Carvalho, Passos et al. 2012). However, the role of IL-10 in human
leishmaniasis is described as a double edge sword. IL-10 deactivates
macrophages, favoring the growth of the parasite and prevents complete
parasite elimination. In addition, blocking both IL-10 and TGF-β is more
effective than neutralization of either cytokine at reducing L. tropica loads in the
murine model (Anderson, Lira et al. 2008).
Although in our experiments almost all isolates were able to induce the
production of IL-1, IL-6, IL-10 and TGF-, we observed that some isolates failed
to induce significant production of IL-6 or TGF-. Determining whether one
isolate would induce more or less cytokine than another is difficult because of
84
the great variation in cytokine production levels among different donors. A
positive correlation between high basal levels with high cytokine production was
observed for IL-1, IL-6, IL-10 and TGF-β. It suggests that to detect differences
in the ability of Leishmania isolates to induce cytokine production, a large cohort
of donors must be individually tested with a panel of different isolates. These
experiments are being performed in our laboratory.
Few papers demonstrated that interaction of L. (V.) braziliensis
promastigotes with PBMC or monocytes from healthy donors induced cytokine
production (Souza, Giudice et al. 2010; Vargas-Inchaustegui, Hogg et al. 2010).
Here we showed that in agreement with the former studies, promastigotes
induce IL-10, but not TNF-α production. In addition, ours is the first report
demonstrating that L. (V.) braziliensis amastigotes isolated from different clinical
forms of ATL directly induce the major cytokines responsible for the generation
of Th17 and Treg profiles. The ability of different amastigote isolates to
stimulate particular cytokine patterns can, in association with the hosts’ genetic
susceptibility factors, lead to the different clinical forms of leishmaniasis.
85
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by CNPq, CAPES and FAPEG. CMG and LRA had a
fellowship from CAPES and LQV and FRD are CNPq fellows.
Authors contributions:
Gomes, CM performed most of the experiments; designed the research study;
analyzed the data; wrote the manuscript.
Avila, LR helped perform some experiments and analyzed the data.
Pinto, SA; Duarte, FB and Pereira, LIA followed the patients and helped in
parasite isolation and species characterization.
Vieira, LQ helped in qPCR experiments, data analyses and critically reviewed
the manuscript.
Dorta ML, Abrahamsohn IA and Ribeiro-Dias F helped to design the research
study, analyzed the data, and helped writing and reviewed the manuscript.
Oliveira MAP designed the research study; analyzed the data, reviewed the
manuscript, obtained the grant and coordinated the research.
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90
LEGENDS TO THE FIGURES
Conferir e corrigir todas as legendas para o nome do teste.
Figure 1: L.(V.) braziliensis amastigotes induce production of IL-1 in PBMC from
healthy donors. A PBMCs (1.5 x 106 cells/500 μL) from healthy donors were
cultured for 24 h in the absence (control- CT) or in the presence of L. (V.)
brazilienis amastigotes (3 x 105 parasites/500 μL) obtained from patients with
cutaneous (JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosal (PPS6m, JBC8m e ASL9m) or
cutaneous-mucosal (SMB7mc) leishmaniasis. Each symbol represents the
amount of cytokine in culture supernatants of each donor measured by ELISA.
The lines connect the cytokine values produced by the same donor.* indicates
statistical difference by paired Student´s t test between CT and amastigotestimulated PBMCs (p < 0.05). B Correlation between the amastigote-stimulated
IL-1 production and the respective IL-1 basal levels from individual normal
PBMC donors.
Figure 2: L.(V.) braziliensis amastigotes induce IL-6 production in PBMC from
healthy donors. A PBMCs (1.5 x 106 cells/500 μL) from healthy donors were
cultured for 24 h in the absence (control- CT) or in the presence of L. (V.)
brazilienis amastigotes (3 x 105 parasites/500 μL) obtained from patients with
cutaneous (JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosal (PPS6m, JBC8m e ASL9m) or
cutaneous-mucosal (SMB7mc) leishmaniasis. Each symbol represents the
amount of cytokine in culture supernatant of each donor measured by ELISA.
The lines connect the cytokine values produced by the same donor.* indicates
statistical difference by paired Student´s t test between CT and amastigotestimulated PBMCs (p < 0.05). B Correlation between the amastigote-stimulated
IL-6 production and the respective IL-6 basal levels from individual normal
PBMC donors.
Figure 3: L.(V.) braziliensis amastigotes induce IL-10 production in PBMC from
healthy donors. A PBMCs (1.5 x 106 cells/500 μL) from healthy donors were
cultured for 24 h in the absence (control- CT) or in the presence of L. (V.)
brazilienis amastigotes (3 x 105 parasites/500 μL) obtained from patients with
cutaneous (JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosal (PPS6m, JBC8m e ASL9m) or
cutaneous-mucosal (SMB7mc) leishmaniasis. Each symbol represents the
amount of cytokine in culture supernatant of each donor measured by ELISA.
The lines connect the cytokine values produced by the same donor.* indicates
statistical difference by paired Student´s t test between CT and amastigotestimulated PBMCs (p < 0.05). B Correlation between the amastigote-stimulated
IL-6 production and the respective IL-10 basal levels from individual normal
PBMC donors.
Figure 4: L.(V.) braziliensis amastigotes induce TGFβ production in PBMC from
healthy donors. A PBMCs (1.5 x 106 cells/500 μL) from healthy donors were
cultured for 24 h in the absence (control- CT) or in the presence of L. (V.)
brazilienis amastigotes (3 x 105 parasites/500 μL) obtained from patients with
cutaneous (JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosal (PPS6m, JBC8m e ASL9m) or
cutaneous-mucosal (SMB7mc) leishmaniasis. Each symbol represents the
amount of cytokine in culture supernatant of each donor measured by ELISA.
The lines connect the cytokine values produced by the same donor.* indicates
91
statistical difference by paired Student´s t test between CT and amastigotestimulated PBMCs (p < 0.05). B Correlation between the amastigote-stimulated
TGFβ production and the respective IL-10 basal levels from individual normal
PBMC donors.
Figure 5: L.(V.) braziliensis amastigotes induce IL-1, IL-6, IL10 and TGF
mRNA expression in PBMC from healthy donors. PBMCs (1.5 x 10 6 cells/500
μL) from healthy donors were cultured for 24 h in the absence (control- CT) or in
the presence of L. (V.) brazilienis amastigotes (3 x 105 parasites/500 μL)
obtained from patients with cutaneous (JCJ8c, RPL5c e CSA7c), mucosal
(PPS6m, JBC8m e ASL9m) or cutaneous-mucosal (SMB7mc) leishmaniasis.
Each bar represents the mean fold change ± SD of cytokine mRNA measured
by real time PCR relative to the house keeping gene, GAPDH.
Figure 6: L.(V.) braziliensis promastgotes induce IL-1 and IL-10 production, but
inhibit TGFβ production in PBMC from healthy donors. PBMCs (1.5 x 10 6
cells/500 μL) from healthy donors were cultured for 24 h in the absence
(control) or in the presence of L. (V.) braziliensis promastigotes (3 x 105
parasites/500 μL) obtained from patients with cutaneous (JCJ8c, RPL5c e
CSA7c), mucosal (PPS6m, JBC8m e ASL9m) or cutaneous-mucosal (SMB7mc)
leishmaniasis. Each symbol represents the amount of cytokine in culture
supernatant of each donor measured by ELISA. The lines connect the cytokine
levels produced by the same donor. Each group of 4 PBMC donors was tested
with each isolate so that a total of 28 donors were tested against the seven
isolates;. *indicates statistical difference by paired Student´s t test between
control and promastigote-stimulated PBMCs (p < 0.05).
92
Gomes, et al; Figure 1
JCJ8c
A
*
n = 28
p < 0,0001
10
20
10
0
0
PPS6m
20
10
0
IL-1 ng/mL
IL-1 ng/mL
30
n = 25
p < 0,0001
PPS6m
Control
20
*
n = 11
p = 0,03
20
10
0
Control
SMB7mc
CSA7c
ASL9m
30
*
n = 27
p = 0,002
10
*
20
n = 18
p = 0,007
10
0
Control
SMB7mc
30
n = 08
p = 0,006
10
RPL5c
0
Control
*
JBC8m
*
30
20
0
Control
JCJ8c
IL-1 ng/mL
Control
IL-1 ng/mL
n = 13
p = 0,01
IL-1 ng/mL
*
CSA7c
30
JBC8m
Control
Production of IL-1 (ng/mL)
after amastigote stimulation
20
RPL5c
30
IL-1 ng/mL
IL-1 ng/mL
30
ASL9m
r = 0.41 p < 0.001
30
B
20
10
0
0
5
10
15
Basal production of IL-1 (ng/mL)
93
Gomes, et al; Figure 2
JCJ8c
RPL5c
n = 24
p < 0,0001
20
10
n = 11
p = 0,21
20
10
0
0
Control
PPS6m
10
IL- 6 - ng/mL
15
Control
0
ASL9m
*
n = 23
p = 0,0002
20
10
0
SMB7mc
IL- 6 - ng/mL
40
n = 10
p = 0,1
30
20
10
0
Control
SMB7mc
30
n = 12
p = 0,01
*
20
10
0
Control
JBC8m
Production of IL-6 (ng/mL)
after amastigote stimulation
PPS6m
CSA7c
40
5
Control
10
RPL5c
30
n = 21
p < 0,0001
n = 07
p = 0,01
20
JBC8m
*
20
*
30
0
Control
JCJ8c
25
IL- 6 - ng/mL
IL- 6 - ng/mL
*
A
40
IL- 6 - ng/mL
30
CSA7c
30
IL-6 - ng/mL
IL-6 - ng/mL
40
Control
40
ASL9m
r = 0.71 p < 0.001
B
30
20
10
0
0
5
10
15
20
Basal production of IL-6 (ng/mL)
94
Gomes, et al; Figure 3
n = 26
p < 0,0001
0.3
0.2
0.1
0.0
*
0.3
n = 12
p = 0,0015
0.2
0.1
JCJ8c
PPS6m
Control
ASL9m
*
0.3
n = 29
p < 0,0001
0.2
0.1
0.0
PPS6m
SMB7mc
0.4
*
0.3
n = 13
p = 0,0018
0.2
0.1
0.0
Control
SMB7mc
0.3
*
n = 16
p = 0,003
0.2
0.1
0.0
Control
JBC8m
Production of IL-10 (ng/mL)
after amastigote stimulation
0.0
CSA7c
0.4
IL-10 ng/mL
0.1
IL-10 ng/mL
n = 27
p = 0,0008
0.2
Control
0.1
JBC8m
*
n = 08
p = 0,001
0.2
RPL5c
0.4
0.3
*
0.3
0.0
Control
0.4
IL-10 ng/mL
0.4
0.0
Control
IL-10 ng/mL
CSA7c
0.4
IL-10 ng/mL
A
IL-10 ng/mL
RPL5c
*
IL-10 ng/mL
JCJ8c
0.4
Control
ASL9m
B
0.4
r = 0.83 p<0.001
0.3
0.2
0.1
0.0
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Basal production of IL-10(ng/mL)
95
0.25
Gomes, et al; Figure 4
JCJ8c
n=9
p = 0,04
3
2
5
n=6
p = 0,04
4
4
TGF- ng/mL
A
1
3
2
1
0
JCJ8c
PPS6m
RPL5c
Control
JBC8m
*
2
TGF- ng/mL
3
5
n = 12
p = 0,01
4
n = 11
p = 0,03
2
1
0
0
PPS6m
*
4
3
1
CSA7c
ASL9m
*
5
Control
2
0
Control
5
4
n=5
p = 0,26
3
1
0
Control
TGF- ng/mL
CSA7c
*
5
TGF- ng/mL
TGF- ng/mL
4
RPL5c
*
TGF- ng/mL
5
n=5
p = 0,02
3
2
1
Control
0
JBC8m
Control
ASL9m
SMB7
*
TGF- ng/mL
4
n=5
p = 0,02
3
2
1
0
Control
SMB7mc
Production of TGF (ng/mL)
after amastigote stimulation
5
6
r = 0.58 p < 0.001
B
4
2
0
0
1
2
3
4
Basal production of TGFb(ng/mL)
96
97
c
m
B
7m
SL
9
SM
A
8m
c
B
7m
m
8m
SL
9
SM
A
JB
C
c
m
PL
5
PP
S6
R
c
IL-1
JB
C
m
IL-10
PP
S6
0
c
5
PL
5
10
R
0
JC
J8
5
Fold change
(relative to unstimulated)
10
c
15
Fold change
(relative to unstimulated)
c
B
7m
m
8m
SL
9
SM
A
JB
C
c
c
m
PL
5
PP
S6
R
JC
J8
Fold change
(relative to unstimulated)
15
JC
J8
c
B
7m
m
8m
SL
9
SM
A
JB
C
c
c
m
PL
5
PP
S6
R
JC
J8
Fold change
(relative to unstimulated)
Gomes, et al; Figure 5
IL-6
15
10
5
0
TGF-
50
40
30
20
10
0
Gomes, et al; Figure 6
10
6
4
20
10
2
0
0
0.6
1.5
*
n=28
p=0,02
0.4
0.2
0.0
Control
Promastigotes
TGF- ng/mL
IL-10 ng/mL
n=28
p=0,56
30
IL-6 ng/mL
n=28
p=0,03
8
IL-1 ng/mL
40
*
1.0
*
n=28
p=0,04
0.5
0.0
Control
Promastigotes
98