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Revista Eletrônica Novo Enfoque, ano 2010, v. 09, n. 09, p. 87 – 106
CARACTERIZAÇÃO DA CAPACIDADE DE SUPORTE LINFOPOIÉTICO DAS
CÉLULAS ESTROMAIS DO ÚTERO DE MURINOS.
SILVA JUNIOR, H da.
Índice
1- Introdução ............................................................................................................................... 89
2- Hematopoiese Central ou Medular ....................................................................................... 90
3- Hematopoiese Periférica ou Extramedular .......................................................................... 91
4- Microambiente Hematopoiético ............................................................................................ 91
5- O fenômeno da gravidez e a linfopoiese ................................................................................ 92
Células NK e o IFN-γ............................................................................................................... 93
6- Modelos animais ...................................................................................................................... 94
7- Objetivos .................................................................................................................................. 94
8- Materiais e Métodos………………………………………….....…………………………….8
Animais: ................................................................................................................................... 94
Obtenção de células do estroma uterino ............................................................................... 95
Obtenção de células não aderentes de medula óssea e coculturas ...................................... 95
Obtenção de esplenócitos e produção de células LAK ......................................................... 95
Citometria de fluxo.................................................................................................................. 96
Tabela 1: marcadores para citometria ............................................................................... 97
Irradiação γ das culturas celulares ........................................................................................ 97
ELISA para GM-CSF de sobrenadante das culturas .......................................................... 97
Imunocitoquímica.................................................................................................................... 98
Tabela 2: anticorpos primários .......................................................................................... 99
Tabela 3: anticorpos secundários ...................................................................................... 99
RT-PCR .................................................................................................................................... 99
Tabela 4: primers ............................................................................................................ 100
9- Resultados .............................................................................................................................. 101
Cultura e cocultura de células da medula óssea e do estroma uterino ............................. 101
ELISA para GM-CSF ........................................................................................................... 101
Imuncitoquímica.................................................................................................................... 103
RT-PCR .................................................................................................................................. 104
Citometria de Fluxo .............................................................................................................. 104
Perspectivas............................................................................................................................ 104
10- Referências ............................................................................................................................ 20
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1- INTRODUÇÃO
A viviparidade é uma característica peculiar que trouxe sucesso evolutivo aos mamíferos,
mas também alguns problemas para a manutenção da homeostase. O estudo da gravidez humana
demonstra um bom exemplo deste fato. O conhecimento detalhado deste processo fisiológico tão
complexo torna-se cada vez mais necessário com o aumento do número de abortos espontâneos,
do interesse pela reprodução assistida e relatos de que menos de 30% dos embriões têm
capacidade de implantação. Muitas são as reações responsáveis pelas perdas dos conceptos e
algumas destas estão relacionadas com o sistema imune, mais especificamente com as células
natural killer (NK).
As células NK são uma linhagem de linfócitos citotóxicos considerados primitivos por
sua atividade relativamente inespecífica. Elas compõem a imunidade celular inata e possuem
muitas características em comum com Linfócitos T citotóxicos CD8+. Já foram descritas como
uma das principais células secretoras de citocinas inflamatórias, dentre elas o IFN-γ (interferongama), IL-2 (interleucina-2) e TNF-α (fator de necrose tumoral - alfa), e estão sendo apontadas
como protagonistas de uma cascata de eventos que culminam numa boa implantação do embrião
no endométrio. No entanto, esta capacidade inflamatória precisa ser cuidadosamente controlada,
pois seus efeitos podem ser prejudiciais tanto para a saúde materna quanto fetal.
Numa breve descrição do importante papel destas células no processo de reprodução, é
possível citar os seguintes eventos: 1- na implantação, a presença do IFN-γ faz com que haja um
afrouxamento dos vasos sanguíneos do endométrio, o que facilita a formação da placenta
hemocorial dos mamíferos eutérios; e 2- após a implantação bem sucedida é necessário que estas
células sejam retiradas ou eliminadas deste sítio, para que não haja a possibilidade de rejeição
imunológica da presença do feto que possui antígenos paternos, os quais não são reconhecidos
pelas células imunes maternas como antígenos próprios da mãe.
A ocorrência de células NK já foi descrita em situações como: aborto espontâneo, préeclâmpsia, eclâmpsia e mesmo no processo da expulsão do feto num parto normal. Em modelos
animais, foi demonstrado que estas células estão envolvidas em reações imunes deletérias
quando o sistema imune da mãe é estimulado por uma infecção durante a gravidez. Estas reações
deletérias podem ser controladas pelo tratamento dos animais com interleucinas antiinflamatórias, tais como IL-4 e IL-10 ou com anticorpos contra IFN-γ, IL-2 etc.
Um tecido hematopoiético, ou pelo menos linfopoiético, extramedular no útero também
seria composto de toda a maquinaria necessária para suportar a diferenciação dos distintos tipos
celulares. Isso inclui proteínas de matriz extracelular como laminina, fibronectina, colágeno etc,
além de fatores formadores de colônias (CSFs). No tecido hematopoiético central, que é a
medula óssea, as células estromais e seus componentes de matriz e CSFs são essenciais para o
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desenvolvimento das diferentes linhagens celulares. Pouco é conhecido sobre a influência destes
componentes no ambiente uterino. Muito menos o efeito deles sobre o fenótipo destas células
uNK.
2- HEMATOPOIESE CENTRAL OU MEDULAR
O fenômeno da hematopoiese é caracterizado por eventos de diferenciação celular, os
quais culminam na produção das linhagens celulares sanguíneas, a partir de um precursor
comum denominado “célula tronco” (stem cell) (Till & McCulloch, 1980). Didaticamente a
hematopoiese pode ser dividida em dois setores: a linfopoiese, onde prima a formação dos
linfócitos B, células NK (natural killer) e precursores comprometidos com a linhagem dos
linfócitos T, cuja diferenciação e maturação terminará no timo; e a mielopoiese que é
responsável pela diferenciação e desenvolvimento dos eritrócitos e dos leucócitos, como os
megacariócitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monócitos etc (Heyworth et al, 1988).
Cronológica e ontologicamente o tecido hematopoiético é primeiramente reconhecido em
pequenas ilhotas sanguíneas na estrutura extraembrionária denominada saco vitelínico. Com o
desenvolvimento do embrião, as células precursoras passam a migrar para as regiões
intraembrionárias da AGM (aorta-gonada-mesonephron) e PAS (para-aortic splanchnopleura).
Mais tarde, a produção hematopoiética se concentra no fígado e baço fetais, até que a medula
óssea tenha maturidade suficiente para receber, manter e caracterizar-se como o sítio central da
produção sanguínea (Dzierzak et al, 1998 e Cumano &Godin, 2001).
É importante ressaltar que o sucesso da cascata de reações que regem este processo de
diferenciação celular, depende muito da “informação” fornecida às células precursoras. O
microambiente no qual ocorre a hematopoiese cada vez mais se torna alvo de estudos, pois sua
composição estrutural parece ser a chave para tamanha diversidade e capacidade de suportar o
desenvolvimento desses tipos celulares (Dorshkind, 1990).
O objetivo desta dissertação é contribuir com o entendimento desta estrutura de apoio
hematopoiético, denominada estroma, onde se pode mencionar alguns componentes como as
células reticulares adventiciais, o endotélio vascular, moléculas de suporte (colágenos,
fibronectinas, proteoglicanas etc.) e fatores solúveis, além de outros. Alguns destes citados serão
analisados com maior detalhamento um pouco adiante neste trabalho.
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3- HEMATOPOIESE PERIFÉRICA OU EXTRAMEDULAR
Num organismo maduro e desenvolvido com situação fisiológica normal, a demanda e a
produção sanguíneas estão em homeostase e ocorrem na medula óssea, como descrito acima.
Com o aprofundamento dos estudos no contexto da hematopoiese, observou-se que a
produção celular pode ocorrer em sítios extramedulares, como já descrito em fígado e baço
durante o desenvolvimento (embrião e feto). Numa infecção, numa patologia medular, numa
disfunção do sistema hematopoiético, ou seja, em qualquer momento fisiológico desfavorecido
no qual seja necessário um aumento da produção das células do sangue, os processos de
diferenciação podem ser deslocados para sítios periféricos no intuito de suprir a nova demanda
(Borojevic et al. 1983; Perez et al, 1993 e Alvarez-Silva et al, 1994).
Destes locais extramedulares nos casos de patologias, também estão o fígado e o baço,
sugerindo uma manutenção da capacidade de suporte hematopoiético nestes órgãos. Além disso,
recentemente está sendo demonstrado que muitos tecidos possuem células precursoras que
passam por seus processos de desenvolvimento (relativamente semelhante à hematopoiese),
como no cérebro, intestino, pele etc (Morrison, 2001). Talvez a capacidade de suporte da
diferenciação celular não esteja restrito aos tecidos já bem caracterizados, como estes citados até
aqui. Sendo assim, é preciso conhecer melhor sobre quais as necessidades estruturais de um
microambiente para que este processo ocorra.
4- MICROAMBIENTE HEMATOPOIÉTICO
Com um microambiente bastante estudado, a medula óssea apresenta uma organização
complexa entre as trabéculas ósseas medulares. Estes espaços são recobertos por uma camada
endosteal, formada por osteoblastos, e são muito irrigados por arteríolas e vênulas.
Histologicamente encontram-se também uma estrutura complexa de redes de moléculas
estruturais como colágeno, fibronectina e outras, que servem de suporte tanto para as células que
ali habitam, quanto fatores solúveis que auxiliam nos distintos microambientes hematopoiéticos
(Dorshkind, 1990; Wilkins et al, 1992 e Dzierzak et al 1998).
Toda esta maquinaria de sustentação também é composta por células. Dentre elas:
miofibroblastos – fazem deposição de matriz extracelular e possuem capacidade contráctil;
células reticulares adventícias – apoiadas nos seios venosos emitem prolongamentos que mantêm
contato com células hematopoiéticas e outras estromais; fibroblastos – também depositam
matriz; e tecido adiposo – relacionado com uma produção normal das células sanguíneas
(Stevens & Lowe, 1995).
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Através de um ponto de vista bem superficial, é importante pensar que o sucesso da
hematopoiese só é alcançado quando todos os componentes até aqui citados estão relacionados
diretamente. Ou seja, as moléculas de sustentação, células de suporte e células hematopoiéticas
estão em contato íntimo entre si, além de estarem num microambiente onde a secreção de fatores
de crescimento, por exemplo, afeta a fisiologia de todos. Sendo assim, quando o objetivo de um
estudo é a diferenciação celular, é necessário caracterizar todo este microambiente e os efeitos de
modificações induzidas sobre o sistema em questão.
5- O FENÔMENO DA GRAVIDEZ E A LINFOPOIESE
O entendimento da manutenção da gravidez em animais eutérios requer algumas
considerações na área da imunologia. O desenvolvimento de um organismo com antígenos que
não são encontrados no organismo materno, já que o feto possui metade do genoma que vem do
pai, intriga o sistema imune e os imunologistas. Várias teorias para o sucesso ou falha no
processo do desenvolvimento completo do feto já foram propostas, mas nenhuma delas explica
por completo este fenômeno tão impressionante da natureza.
Numa breve síntese, o embrião quando chega no endométrio inicia um processo de
invasão intersticial em uns e destrutivo em outros mamíferos. Esta invasão põe o embrião em
contato direto com o organismo da mãe. Isso deveria causar uma resposta imune pela mãe
semelhante à causada contra um transplante. De fato, existem muitas modificações fisiológicas
para garantir o sucesso da gravidez (Mellor & Munn, 2000).
No período pré-implantação, os componentes do esperma masculino já desencadeiam
uma série de cascatas metabólicas que, dentre outras consequências, inicia uma reação
inflamatória mediada por IFN-γ e outras citocinas, para que haja um remodelamento vascular e
tecidual do endométrio (Ashkar & Croy, 1999). Com a implantação bem sucedida, o sistema
imune da mãe precisa ser suprimido e então estas células NK e a produção de citocinas
inflamatórias cessam e somente retornam próximo ao momento do parto (King, 2000). Em
situações de aborto espontâneo e induzido este mesmo fenômeno também está relacionado,
reforçando a importância de se entender como este processo é controlado.
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Células NK e o IFN-γ
As células natural killer são linfócitos citotóxicos que compõem a imunidade inata,
considerados primitivos por exercerem suas funções imunes relativamente inespecíficas. Elas
dividem muitas características funcionais com os Linfócitos T CD8+ citotóxicos, como a
expressão de perfurina e granzimas (promotoras de morte programada nas células-alvo) nos seus
grânulos citoplasmáticos. Entretanto, diferente dos CD8+, a ontogenia das células NK é menos
centralizada. Já foi descrito o desenvolvimento desta linhagem no timo e medula óssea
(Yokoyama, 1999).
Dentre as principais características destas células estão a ausência da expressão de CD3ε,
receptores como os TCRs (T cell receptors) e cadeias associadas (CD4 e CD8), e estão mais
relacionadas com respostas imunes a tumores (Yokoyama, 1999). Como descrito acima, as
células NK do útero (uNK) possuem um papel importante no processo de implantação do
embrião no endométrio materno. Umas das razões mais bem descritas para esta participação é
que estas células são as principais produtoras da citocina inflamatória denominada IFN-γ
(Ashkar & Croy, 1999).
O aspecto mais relacionado a este projeto diz respeito ao controle exercido sobre as
células NK na gravidez. Recentemente foi demonstrada a importância da presença das células
NK no ambiente uterino durante períodos bem determinados fisiologicamente. Fora destas
janelas temporais estas células já não são necessárias e passam a ser um perigo iminente para que
uma gravidez dure a termo. Muitos autores demonstram que estas células são 70% dos leucócitos
encontrados no endométrio nos períodos de pré-implantação e parto (King, 2000).
Em alguns trabalhos foi relatado o fato de que alguns modelos animais que possuem
pouca ou nenhuma presença detectável destas células NK nos tecidos periféricos, as uNK estão
presentes em números normais (Mellor & Munn, 2000). Além disso, foi demonstrado que as
células NK periféricas, como no baço, possuem um perfil molecular “agressivo”, expressando
grande densidade de CD16 e pouco ou nenhum CD56, portanto são CD16hi56-. Já as uNK são o
inverso, CD16-56hi. No entanto, as duas populações possuem maquinaria citotóxica “abastecida”
e pronta para atividade (King, 2000).
A origem das células uNK já foi relacionada com a medula óssea e baço. Porém, ainda
não foi provada a capacidade de modulação destas células pelo ambiente uterino (Ashkar et al,
2000). Mais que isso, não foi demonstrado se precursores linfóides são capazes de sofrer o
processo de diferenciação que é sugerido ocorrer no timo, baço e fígado fetais e medula óssea,
para a formação de células NK maduras no útero.
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Neste projeto pretendemos avaliar a importância dos componentes do tecido uterino nesta
modulação, ou mesmo numa possível capacidade do estroma uterino suportar a diferenciação
destes linfócitos.
6- MODELOS ANIMAIS
Dentre os vários modelos possíveis e factíveis para o desenvolvimento deste projeto,
escolhemos o modelo de camundongos deficientes do receptor alfa para o interferon gama (IFNγRα-/-). Neste modelo já havia sido descrito uma incapacidade de responder aos estímulos do
IFN-γ e o processo de implantação estava prejudicado por falha no remodelamento do tecido
endometrial, apesar da presença das uNK (Ashkar et al, 2000). Como controle para os
fenômenos que serão estudados, utilizaremos também animais das linhagens 129, C57Bl/6 e
Balb/c.
7- OBJETIVOS
Baseados nos dados acima apresentados, nossos objetivos neste projeto de doutorado são:
•
Caracterizar o microambiente uterino e analisar sua capacidade de linfopoiese in
vitro;
•
Estabelecer as condições ideais de cocultivo de células do estroma uterino e
células NK maduras;
•
Estabelecer as condições ideais de cocultivo de células do estroma uterino e
células tronco ou precursoras (stem cells);
•
Avaliar e caracterizar os diferentes estágios de diferenciação das células NK
relacionados com o estroma uterino.
8- MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Camundongos das linhagens C57Bl/6, Balb/c e 129 Knockout para o receptor do
interferon gama (IFN-γR-/-) e selvagem, utilizados em todos os experimentos, são obtidos a partir
do Instituto Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz – Salvador – Bahia – Brasil,
com idade entre 2 e 3 meses. Todos os animais são transportados e manipulados segundo as
normas de uso de animais do CAUAP (Conselho de Avaliação do Uso de Animais de Pesquisas).
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Obtenção de Células do Estroma Uterino
Com auxílio de tesouras e pinças, os úteros das fêmeas de camundongos das
linhagens estudadas são retirados e levados a uma placa de Petri de 60mm com meio de cultura
DMEM (Sigma) pH7,4, preparado segundo o fabricante. Dos órgãos são retirados tecidos de
gordura com seus vasos sanguíneos, ovidutos e ovários. Tudo isto para evitar ao máximo a
contaminação da futura cultura com células que não façam parte do tecido uterino.
Após a limpeza do órgão ele é recortado em pedaços aleatoriamente e passam pelos
processos de dissociação enzimática com colagenase IA 0,1%(Sigma). A primeira etapa de
1h/37oC, da qual a população celular proveniente desta é descartada, já que existem muitos
componentes ainda de tecidos não uterinos que não são passíveis de remoção manual.
Já a população celular proveniente da segunda dissociação pela colagenase é levada a
cultivo em meio DMEM (Sigma), suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 1mM
Piruvato de sódio (Sigma), 2mM L-glutamina (Sigma), 1% aminioácidos essenciais (Sigma), 105
M β-mercaptoetanol (Sigma) e 1% penicilina/streptomicina (Life Technologies).
Obtenção de Células Não Aderentes de Medula Óssea e Coculturas
Com auxílio de tesouras e pinças, os dois fêmures do camundongo são retirados, a
cavidade medular é exposta e com auxílio da agulha numa seringa com meio de cultura, a
medula óssea é expulsa por “flushing” em tubo Falcon de 15ml. A amostra é homogeneizada
com a pipeta Pasteur em aproximadamente 5ml de meio D-MEM (Sigma), suplementado como
descrito anteriormente. A suspensão é transferida para duas placas de Petri de 60mm, e esta é
mantida a 37oC em estufa úmida com atmosfera de CO2 por 1h e ½, visando a diminuir a
população das células aderentes.
Após a incubação, a placa é levemente homogeneizada, transferindo o sobrenadante com as
células não aderentes, para um tubo Falcon de 15ml, contendo Ficoll (Sigma) na densidade de
1,077g/cm3, centrifugando por 30min/1500rpm, na tentativa de concentrar as células precursoras.
As células são lavadas, contadas e cultivadas sobre uma monocamada de estroma uterino, obtida
como descrito acima.
Obtenção de Esplenócitos e Produção de Células Lak
Baços dos animais em estudo são dissecados com assepsia e macerados com bulbo de
seringa em uma peneira de malha fina apoiada dentro de uma placa de Petri com meio RPMI1640. Após a maceração as células são transferidas para tubos de 50ml e concentradas por
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centrifugação. As células obtidas do baço são ressoltas em 10ml de tampão de lise de hemáceas
contendo 1mM KH2CO3, 150mM NH3Cl, 0,1mM EDTA em pH7,4 e incubadas por 10min à
temperatura ambiente num tubo de 50ml. Após a incubação o volume do tubo é completado para
50ml com meio RPMI-1640 e 10mM NaHCO3 pH7,4 para restabelecer a isotonicidade do meio.
O tubo é submetido à centrifugação e o pellet ressolto em 4ml de meio de cultura RPMI-1640
(Sigma), contendo 10% de soro fetal bovino (Gibco), 10mM NaHCO3 (Sigma) e 1% de
penicilina/streptomicina (Gibco), pH 7,4 a 37oC. Esses 4ml de meio com células são aplicados
numa coluna de lã de nylon, previamente preparada em uma seringa de 20ml, e incubada por 1h
em estufa com 5% de CO2 a 37oC (Nuaïre).
A lã é limpa numa incubação com H2O-3% HCl por 30min, depois lavada 3 vezes com
água deionizada fervente. Só então desfiada, empacotada em seringa e esterilizada em autoclave
20min a 120oC. Após o processo de esterilização da coluna a lã é umedecida com meio RPMI1640, 10mM NaHCO3 (Sigma) e 1% de penicilina/streptomicina (Gibco) pH 7,4, e depois
embebida com meio de cultura RPMI-1640 (Sigma) contendo 10% de soro fetal bovino (SBF)
(Gibco), 10mM NaHCO3 (Sigma), 1% de penicilina/streptomicina (Gibco), pH 7,4 a 37oC. O
sistema de retenção da coluna é feito com uma válvula de três vias (Socimed – Socibra Ltda. RJ).
As células são eluídas com 50ml de meio RPMI-1640 (Sigma) contendo 10% de soro
fetal bovino (Gibco), 10mM NaHCO3 (Sigma), 1% de penicilina/streptomicina (Gibco), pH 7,4 a
37oC. O eluído é centrifugado e o pellet ressolto numa concentração de 2x106 células/mL de
meio LAK (RPMI-1640 + 10% de soro fetal bovino + 10mM NaHCO3 + 1% de
penicilina/streptomicina (Sigma) + 1% PHA-M (Sigma) + 1000 U/ml rIL-2h (CetusTM
Corporation – Emeryville CA 94608) + 10-5M β-mercaptoethanol (Sigma), pH 7,4 a 37oC) e
cultivadas 12-48 h em estufa com 5% de CO2 a 37oC (Nuaïre).
Citometria de Fluxo
Nesta etapa as células para estudo são mantidas o tempo todo a baixa temperatura (0oC a
4oC). Em contagem na câmara de Newbauer (Sigma), as células são obtidas entre 105 e 106 por
poço, lavadas duas vezes em PBS pH7,4 e concentradas por centrifugação em placas de 96 poços
com fundo em U (Nunklon). A reação de marcação para citometria de fluxo inicia-se por uma
incubação de 30min em PBS-BSA 3% para bloqueio de sítios inespecíficos. Logo após
centrifugação, o anticorpo primário é devidamente diluído nesta mesma solução e adicionado a
cada poço em questão, incubando-se por 30min. Lava-se então os poços com o mesmo PBSBSA 3% por três vezes de 5min, utilizando a centrifugação em cada passo.
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Quando em marcação direta as células são ressoltas em PBS-paraformaldeído 4% pH7,4
e levadas ao citômetro de fluxo (BD – FACSCALIBUR) para análise, ou armazenadas a 4oC
para futura análise em no máximo uma semana. Quando em marcação indireta, as células são
submetidas à incubação de 30min ou com anticorpo secundário ou com streptavidina, todos
associados com a devida combinação de fluorocromos disponíveis. Após esta terceira incubação
as células sofrem o tratamento de fixação e análise, como citado acima.
Tabela 1: Marcadores para Citometria
Marcador
Fluorocromo
CD4
FITC e PE
CD8
FITC e PE
CD3
PE
B220
FITC e PE
NK1.1
BIOTIN
Pan NK
BIOTIN
cKIT
BIOTIN
Thy1.2
BIOTIN e purificado
CD16
FITC e purificado
Streptavidin
PE e FITC e TRICOLOR
IgG de rato
FITC
Irradiação γ das Culturas Celulares
As garrafas com cultura de células são irradiadas com 2500rads no irradiador gama com
fonte de sal de césio (137Cs) do Departamente de Produtos Naturais em Farmanguinhos –
FIOCRUZ – Rio de Janeiro.
ELISA para GM-CSF de Sobrenadante das Culturas
O teste de ELISA é procedido com o GM-CSF mouse ELISA system (Pharmacia)
utilizando o sobrenadante das culturas de células, conforme o manual do fabricante. Em resumo,
os poços a serem trabalhados com as amostras, são preparados com uma incubação de 2hs/37oC
após adicionarmos 50µL do reagente de placa (fornecido no kit) e 50 µL das amostras. Estas
placas, então, são lavadas cinco vezes de 400µL com o tampão de lavagem e adicionado 100µL
do conjugado GM-CSF e incubadas 1h/37oC. As mesmas lavagens são feitas e adiciona-se
100µL do substrato TMB, incubando 30min a temperatura ambiente (no escuro). Segue-se o
processo de parada da reação adicionando 100µL do tampão de parada e determina-se a
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densidade óptica usando um espectrofotômetro a 450nm. Os resultados são plotados em gráfico
logarítmico como recomendam as fórmulas de conversão do fabricante.
Imunocitoquímica
As células são cultivadas por 5 dias sobre lamínulas de vidro, em placas de 24 poços
(Nunclon), em baixa confluência (3 x 103 células por poço), em DMEM (Sigma) suplementado
com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), 1mM Piruvato de sódio (Sigma), 2mM L-glutamina
(Sigma), 1% aminoácidos essenciais (Sigma), 10-5M 2-mercaptoetanol (Sigma) e 1%
penicilina/streptomicina (Life Technologies). As células são fixadas com solução de
paraformaldeído (Sigma) 4% em PBS pH7,4 durante 60 min/4oC.
Após a fixação as células são lavadas 5 vezes em PBS pH 7,4 para retirar o fixador, as
amostras são incubadas 30min em cloreto de amônio (NH4Cl) 50 nM em PBS, para neutralização
e remoção dos grupamentos aldeídicos livres (Burke et al., 1982). A reação de bloqueio de sítios
inespecíficos é feita numa incubação de 30min em PBS-BSA (Sigma) 3%.
A reação segue na incubação com anticorpo primário durante 90min, conforme tabela
abaixo. Lava-se em PBS, 3 ou 4 vezes de 5min e incuba-se com o anticorpo secundário durante
1h e 30min, conforme a tabela abaixo. Lava-se 3 ou 4 vezes em PBS e uma vez, rapidamente, em
água destilada.
As lamínulas são montadas em lâminas de vidro com N-propilgalato (Sigma) e
observadas em microscópio de fluorescência (Zeiss) acoplado a um sistema de câmera
fotográfica.
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Tabela 2: Anticorpos Primários
Anticorpos
Diluição
policlonal antilaminina murina
1/100
monoclonal anti-4-prolil-hidroxilase
1/100
monoclonal antidecorina
1/100
monoclonal antitubulina
1/100
policlonal anticolágeno I
1/100
policlonal anticolágeno IV humano
1/100
policlonal antifibronectina
1/100
monoclonal anti-α-actina de músculo liso murino
1/400
policlonal antitrombospondina
1/100
Soro normal de coelho (SNC) (usado como controle
negativo)
1/100 e 1/200
Obs.: Para controle negativo dos anticorpos primários monoclonais, será utilizado PBS.
Tabela 3: Anticorpos Secundários
Anticorpos
anti imunoglobulina (IgG) de coelho conjugado a tetrametilrodamina
(TRITC)
Anti imunoglobulina (IgG) de camundongo conjugado a tetrametilrodamina
(TRITC)
Diluição
1/80
1/80
RT-PCR:
O RNA total das células é extraído com Trizol (Gibco) conforme o protocolo do
fabricante. Resumindo, um pellet de 106-107 células em um eppendorf de 1,5ml é ressolto 1ml de
solução de Trizol. Após uma incubação de 15min à temperatura ambiente deste lisado, é
adicionado 200µL de clorofórmio (Merk) e homogeneizado por 15seg, seguindo para uma
centrifugação de 15min/14000rpm/≈14000g (Microspin 1450- Eppendorf).
A fase aquosa transparente é transferida para um eppendorf novo e a ela é adicionado
500µL de 2-propanol (Merk), seguindo uma incubação de 30min à temperatura ambiente. Após a
fase de precipitação a solução é novamente centrifugada gerando um pellet, que é lavado com
etanol (Merk) 70% a 4oC, centrifugado 5min/14000rpm/14000g e posto a secar. O pellet é então
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dissolvido em água. A concentração de RNA foi estimada pela leitura de absorbância em
espectrofotômetro, dada em D.O (densidade óptica), no comprimento de onda de 260nm,
multiplicado pelo fator 40 ([ ]µg/µL = 40 x DO x diluição do RNA).
A retrotranscrição é feita com First Strand cDNA Kit (Pharmacia) segundo o protocolo do
fabricante. Resumindo, o RNA utilizado tinha um valor na razão260nm/280nm, leitura em D.O., em
torno de 1,8. Cerca de 3µg deste RNA total é utilizado para produzir cDNA (ácido
desoxirribonucleico complementar) numa reação de 33µL com 6mM DTT, 0,2µg primers
randômicos ou oligos-dT, 11µL mix reaction (First Strand cDNA Kit - Pharmacia). Esta solução
é incubada 1h/37oC.
A reação de polimerização em cadeia (PCR) é feita com 2µL da solução resultante da
reação de retrotranscrição, como sugere o fabricante, ou com 10ng de DNA genômico. As
condições e o ciclo térmico ideais para cada par de primers variou: 1,75-2,5µM MgCl2, 10µM de
cada primer, 10µM de cada dNTP e 5U Taq polimerase recombinante (Gibco); e o ciclo térmico:
4min/95oC, 40 vezes - 1min/94oC, 1min/55-57oC, 1min/72oC - 10min/72oC e 5min/4oC (PTC100 Progammable Thermal Controller). São utilizados primers (tabela 4 abaixo) para diferentes
fatores, dentre eles citocinas e fatores formadores de colônia.
Tabela 4: Primers
primers
β-actina
sequência
5´ GTGGGCCGCTCTTAGGCACCA 3´
tamanho esperado
540pb
5´ GCTCTTTAGGCTTTCCAGGAAGTC 3´
GM-CSF
5´ AGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCG 3´
313pb
5´ ATTCCAAGTTCCTGGCTCATCATTACGC 3´
Cx 40
5´
5´
Cx 43
5´
5´
100
9- RESULTADOS
Cultura e Cocultura de Células da Medula Óssea e do Estroma Uterino
O principal objetivo deste projeto é avaliar a capacidade de suporte da diferenciação e/ou
modulação das células NK por células que compõem o estroma do útero. Sendo assim, o
primeiro passo foi a tentativa de estabelecer culturas celulares das células uterinas, in vitro.
Culturas de medula óssea foram feitas em paralelo como um controle positivo desta técnica.
Todo material de experimento foi obtido como descrito e mantido em cultura com
sucesso por mais de três meses. As células do estroma uterino ganharam morfologia de
miofibroblastos, como esperado, e tinham grande capacidade proliferativa. As células estromais
da medula óssea eram obtidas da cultura após cinco dias do cultivo de medula total. Depois deste
período estas células eram repicadas a cada três dias pelo método de tripsinização, até que a
cultura aparentasse maior homogeneidade morfológica.
Estas culturas de células estromais ganhavam confluência em cultivo muito rapidamente.
Por isso, foi associado a elas um alto índice proliferativo, o que poderia ser prejudicial para um
acompanhamento a longo prazo de coculturas induzidas para a diferenciação das células NK (a
partir de precursores concentrados). Então, o próximo passo foi a irradiação gama destas
culturas, na tentativa de frear esta alta proliferação e manter culturas estromais quiescentes em
longa duração. Após a irradiação as culturas perderam quase totalmente a capacidade
proliferativa e permaneceram aparentemente saudáveis durante todo o período acompanhado
(pelo menos três meses).
O laboratório agora possui um protocolo bem estabelecido para obtenção e manutenção a
longo prazo de cultura das células de suporte para futuros experimentos de cocultivo e
diferenciação induzida in vitro das células NK.
ELISA para GM-CSF
GM-CSF foi recentemente avaliado na linfopoiese (Muench et al, 2000). Muito já está
descrito sobre os efeitos deste fator na diferenciação das linhagens mieloides. No entanto, pouco
foi explorado no desenvolvimento dos linfócitos.
Além disso, dados da literatura indicam que o fator GM-CSF parece ser importante no
processo de supressão imune durante a gravidez de cruzamento de modelos animais (Clark et al,
1994 e Robertson et al, 1999). Ao mesmo tempo já possuíamos também informações de que
citocinas como IL-2 são importantes no processo de diferenciação dos linfócitos citotóxicos.
101
Então, para avaliarmos a capacidade secretora nas culturas previamente estabelecidas nas
condições próximas ao descrito como normal da linfopoiese citotóxica, utilizamos culturas
estimuladas ou não com IL-2 e dosamos a concentração de GM-CSF no sobrenadante destas
culturas.
Culturas não estimuladas não apresentaram quantidades detectáveis deste fator. As
estimuladas com interleucina-2 demonstraram uma grande quantidade de GM-CSF. No entanto,
experimentos adicionais serão necessários para esclarecer se as culturas não estimuladas não
possuem secreção ou o fator está formando complexos com componentes secretados da matriz
extracelular.
Estas amostras vieram de culturas com quatro dias de cultivo suplementadas com
interleucina-2, o que simula um dos muitos estímulos já descritos anteriormente como favoráveis
para a produção de células NK a partir de precursores (King et al, 1999). As concentrações de
GM-CSF encontradas nos sobrenadantes das culturas em questão estão expressas no gráfico
abaixo.
A cultura de medula óssea total dos modelos animais da linhagem 129/IFNγR-/- e seu
controle de reação, os “selvagens” 129, não demonstraram níveis detectáveis de GM-CSF em
ELISA, como visto em 1 e 3. Quando estimuladas com IL-2, citocina ativadora de linfócitos
citotóxicos, os níveis de GM-CSF subiram consideravelmente, como visto em 2 e 4. Como este
fator já havia sido descrito como produto de secreção de linfócitos T, utilizamos a técnica de
produzir células LAK para avaliar o efeito da estimulação nas células destes modelos animais em
estudo. O sobrenadante da cultura de células LAK do IFNγR-/- possuía uma concentração muito
maior que os sistemas anteriores e do que as células LAK de outra linhagem murina (Balb/c),
como visto em 5 e 6.
Será necessário repetir estas culturas para confirmar estatisticamente o potencial secretor
destas células, e adicionar os demais fatores envolvidos na diferenciação das células NK, como
IL-15 e outros. Além disso, é preciso demonstrar que as culturas sem estímulo não possuem
secreção deste fator ou se a secreção existe, mas as moléculas produzidas ficam retidas na matriz
extracelular, geradas na cultura.
102
ELISA GM-CSF
500
1.
2.
3.
4.
5.
6.
pg/mL
400
300
200
100
Medula óssea de 129
Medula óssea de 129 + IL-2
Medula óssea de IFNγR-/Medula óssea de IFNγR-/- + IL-2
LAK IFNγR-/LAK Balb/c
0
1
2
3
4
5
6
sobrenadantes
Imunocitoquímica
A hematopoiese medular conta com uma rede complexa de suporte denominada estroma,
que trabalha em conjunto com as células hematopoiéticas (Dorshkind, 1990). O estroma possui
componentes importantes como fatores solúveis, células acessórias, matriz mineral etc. Está
amplamente descrito o grande papel destes coadjuvantes no processo homeostásico da
diferenciação das células sanguíneas (Mazini et al, 1998). Como um dos nossos objetivos é
averiguar o
potencial
do
estroma uterino
em
eventos
semelhantes,
utilizamos
a
imunocitoquímica para iniciar a caracterização destas células.
A importância da composição de um microambiente que suporte a hematopoiese já foi
exaustivamente confirmada nos diferentes sistemas estudados (Dorshkind, 1990 e Dzierzak et al,
1998). Sendo assim, utilizamos a técnica de imunocitoquímica para caracterizar os componentes
que formam este ambiente em nossos sistemas in vitro. Utilizando os anticorpos descritos em
materiais e métodos, foi demonstrado que moléculas estruturais tanto da matriz extracelular
quanto intracelular, como α-actina, 4-prolil hidroxilase, colágeno I, e tubulina tinham uma
expressão bastante difundida na cultura de estroma uterino de animais C57Bl/6. No entanto,
decorina e fibronectina foram pouco encontradas. Menos ainda trombospondina, colágeno IV e
laminina. Já havia relatos positivos de imunocitoquímica para laminina na literatura.
Trombospondina e colágeno IV eram esperados, mas talvez a expressão destes componentes seja
mais tardia do que o analisado.
Estes resultados serão repetidos e acrescidos com novas reações nos diferentes modelos e
marcadores. Assim, teremos condições de conhecer melhor e explorar experimentalmente o
microambiente gerado nestas culturas numa futura cocultura de avaliação da influência deste na
diferenciação das células NK.
103
RT-PCR
Utilizamos a técnica de RT-PCR para complementar os dados do ELISA e da
imunocitoquímica. Este método nos permitiu demonstrar que existe uma transcrição em níveis
relativamente semelhantes de GM-CSF nas culturas anteriormente negativas para este fator livre
no sobrenadante, reforçando a hipótese de que ele pode estar formando um complexo com a
matriz extracelular. Ou mesmo, que as culturas estimuladas podem estar perdendo a estrutura da
matriz e liberando o fator para o meio.
Outro conceito importante nos processos hematopoiéticos é o da importância das
interações celulares. Uma das mais importantes destas interações são através das gap junctions.
Esta técnica também demonstrou que os níveis relativos de expressão das conexinas 40 e 43
parecem ser os mesmos na cultura de estroma uterino de C57Bl/6. Estes resultados somam na
importância de caracterizar melhor este sistema in vitro.
Citometria De Fluxo
Alcançar o objetivo final deste projeto, que é acompanhar o desenvolvimento das células
NK num microambiente de estroma uterino, inclui a capacidade de caracterizar os diferentes
estágios de diferenciação destas células. Para isso, utilizaremos a citometria de fluxo através de
anticorpos associados a fluorocromos.
Em testes preliminares para conhecermos as peculiaridades de se trabalhar com células
NK, utilizamos tanto células de medula óssea e células do baço como cultura de células LAK.
Marcadores como CD3, CD4, CD8, CD16, B220, NK1.1 e outros foram testados nas células em
questão. Entretanto, evidenciar a população de células NK não foi um processo fácil. Células NK
maduras estão em pequena quantidade nos sistemas citados e não foi possível afirmar uma
população homogênea destas. Outras fontes conhecidamente ricas nestas células, como fígado
fetal, serão utilizadas futuramente para tal objetivo.
Perspectivas
Deste ponto em diante pretendemos concretizar os resultados até aqui obtidos e
prosseguir com as caracterizações celulares iniciadas nos modelos animais propostos. Esperamos
com este projeto demonstrar que o estroma uterino é capaz de suportar a diferenciação das
células NK, com todas as suas características fenotípicas maduras e funções citotóxicas normais.
Além disso, pretendemos evidenciar a capacidade deste mesmo estroma na modulação dos
marcadores fenotípicos das NKs periféricas.
Tudo isso, objetivando entender a relação materno-fetal a nível de tolerância imune,
tentando explicar imunologicamente o fenômeno da gravidez marsupial e eutéria.
104
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