Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de

1
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação
Tecnológica em Medicamentos
Efeitos da administração aguda e crônica de topiramato sobre as respostas
comportamentais de ratos naive e abstinentes ao etanol
Aluno: Décio Dutra Junqueira Ayres
Orientadora: Profa. Dra. Elaine
Cristina Gavioli
Co-orientadora: Profa. Dra. Vanessa
de Paula Soares-Rachetti
Natal
2015
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Décio Dutra Junqueira Ayres
Efeitos da administração aguda e crônica de topiramato sobre as respostas
comportamentais de ratos naive e abstinentes ao etanol
Tese submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Desenvolvimento e
Inovação
Tecnológica
em
Medicamentos da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de
Doutor
em
Desenvolvimento
e
Inovação
Tecnológica
em
Medicamentos.
Orientadora: Profa. Dra. Elaine
Cristina Gavioli
Co-orientadora: Profa. Dra. Vanessa
de Paula Soares-Rachetti
Natal
2015
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“Ainda que eu ande
Pelo vale da sombra da morte
O teu amor lança fora o medo
Ainda que eu me encontre
Bem no meio das tempestades da vida
Não voltarei, pois perto estás
Eu não temerei o mal
Pois o meu Deus comigo está
E se o meu Deus comigo está
A quem eu temerei? A quem eu temerei?
Oh, não! Nunca me deixou
Na tempestade ou na paz
Oh, não! Nunca me deixou
Quando bem ou quando mal
Oh, não! Nunca me deixou
Oh, o Senhor nunca me deixou
Eu posso ver a luz
Que está vindo ao coração que espera
Incomparável, gloriosa luz
E haverá um fim aos problemas
Mas até este dia
Viverei sabendo que estás aqui
Eu não temerei o mal
Pois o meu Deus comigo está
E se o meu Deus comigo está
A quem eu temerei? A quem eu temerei?
Oh, não! Nunca me deixou
Na tempestade ou na paz
Oh, não! Nunca me deixou
Quando bem ou quando mal
Oh, não! Nunca me deixou
Oh, o Senhor nunca me deixou”
Juliano Som
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Dedico este trabalho aos meus pais, Newton Emmanuel Junqueira Ayres in
memoriam e Maria Jose dos Santos Dutra, pelo amor e apoio incondicional a
todos os meus sonhos e objetivos.
6
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por tudo, pois sua vontade é boa, perfeita e em todo
tempo Deus é bom!
Nayara Santos e Aldair Sarnento que compartilharam do nosso desafio em sair
do Maranhão e juntos tentarmos o doutorado na UFRN,
À professora Dra. Telma Lemos e ao Professor Dr. Cícero que nos receberam
em Natal e nos direcionaram ao Programa de Pós-Graduação,
À professora Dra. Elaine Gavioli, por ter acreditado em nossa força de vontade
em querer crescer; por ter confiado em mim quando nem mesmo eu acreditava.
Por ter incentivando mais do que eu poderia imaginar, por muitas vezes fazer
acreditar
que
era
possível,
mesmo
quando
as
circunstâncias
eram
desfavoráveis, por sempre apresentar aquela palavra acolhedora. E, claro, por
sua orientação, sem a qual seria absolutamente impossível chegar até aqui!
Sua forma contagiante e motivadora em conduzir este trabalho, foi a peça
fundamental para minha formação e amadurecimento científico.
À co-orientadora, Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti, pela dedicação e
paciência nos meus primeiros passos na pesquisa. Por acreditar em mim! Por
nunca desanimar, apesar do meu despreparo. Pelo apoio em todos os
momentos! Pelo caminho, por me fazer enxergar pequenos detalhes
fundamentais na pesquisa e por ter contribuindo não só para minha formação
científica, mas também para a minha formação pessoal.
Toda a minha gratidão às Profas. Elaine e Vanessa que imprimiram em mim
uma parte de sua história, me marcando durante essa jornada, sem dúvida
parte do meu sucesso também é de vocês!
Aos bastidores do laboratório de Farmacologia Comportamental, representado
por amigos como Manara, Nathaly, Ephifânio, Mara, Rebeca, Camila, Marana,
Jarmilla, Aldo, Anthony e Raliny! Pela companhia agradável e pelos momentos
de descontração nos experimentos, tornando o trabalho no laboratório ainda
mais prazeroso.
7
À Lisiane, Victor, Íris, Júlia, Laila, amigos fundamentais que sempre
participaram em épocas distintas e indispensáveis de discussão e formação de
ideias e hipóteses que contribuíram enormemente com cada experiência
compartilhada! Pela disponibilidade em ensinar, de fato, vocês foram preciosos
em minha formação.
A minha querida esposa, Adriana Junqueira em sonhar os meus sonhos,
fortalecer em minhas fragilidades, cuidar de minha vida, me amar como sempre
me amou, não deixar o nosso sonho morrer, ser um alicerce em nossa casa,
ser uma inspiração em minha vida. Por ter me dado a honra de ser pai, duas
vezes em meio ao doutorado. Certamente, o seu apoio, preocupação, carinho e
amor foram indispensáveis para que eu concluísse mais essa etapa da minha
vida.
Ao meu pai, in memoriam, minha primeira fonte de inspiração e admiração. A
minha mãe por todo apoio, amor incondicional, fonte inesgotável de motivação
doação, abdicação, ensinamento, amparo e paciência durante a minha
existência. Por me fornecerem todas as condições para escolher o meu futuro,
me amparando financeiramente em todo o meu caminho, por todo amor e
carinho dedicados a mim durante a minha vida e pela certeza que eu sempre
terei a qualquer momento, alguém para me apoiar e me dar forças para seguir
em frente.
Aos meus queridos irmãos Hermília, Gypson e Hilda por estarem ao meu lado
sempre que precisei, por mostrarem que sem família não somos absolutamente
nada, pelo apoio financeiro, espiritual, emocional e motivacional.
Lalá, nossa querida babá, que com tanto zelo cuida de nossa filha nos
permitindo concentrar e estudar nesta etapa tão importante de nossas vidas.
A todos os meus familiares (sogro, sogra, cunhado e cunhada) e amigos, que
estão sempre em meu coração e fazem parte da minha vida seja na igreja, seja
na universidade, seja onde for. Mesmo com a distância sempre foram
presentes e importantes na minha vida. Vocês contribuíram diretamente para
mais essa conquista.
8
A todos os professores e funcionários do programa de Pós-Graduação em,
Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos que contribuíram
para a minha formação científica, em especial aos técnicos dos laboratórios de
Farmacologia, Flávio, Carla e César.
À UFRN, ao PPgDITM e ao órgão de fomento CAPES.
Enfim, pelo início, pelo meio e pelo que há de vir. Muito obrigado, meu Deus!
9
RESUMO
O topiramato é um agente antiepiléptico que tem se mostrado promissor no
tratamento da enxaqueca, controle da obesidade e em diversos transtornos
psiquiátricos, incluindo o transtorno bipolar. Estudos clínicos apontam o uso do
topiramato para alívio da impulsividade comportamental associada ao consumo
abusivo, fissura e sintomas psíquicos decorrentes da retirada do etanol.
Considerando o perfil farmacocinético, farmacodinâmico e a alta tolerabilidade
do topiramato na clínica comparada aos ansiolíticos e antidepressivos
disponíveis, é de grande interesse investigar o potencial ansiolítico e
antidepressivo deste fármaco em ratos naive e abstinentes ao etanol. No
presente estudo, foi investigado se o tratamento agudo e crônico com
topiramato altera comportamentos relacionados à ansiedade, à depressão, e
aos decorrentes da retirada do etanol após consumo crônico forçado. Ratos
Wistar adultos machos foram tratados com topiramato (10 e 40 mg/Kg/mL) ou
solução salina, por gavagem, 60 minutos antes dos testes do labirinto em cruz
elevado (LCE), campo aberto (CA) e teste de natação forçada (TNF).
Observou-se que tanto a administração aguda quanto a administração crônica
do topiramato (40 mg/Kg/mL) promoveu ação ansiolítica em animais naive e
ação antidepressiva, após tratamento agudo, sem alteração da atividade
locomotora. Em outra série experimental, ratos foram submetidos a
concentrações crescentes de etanol (2-6%) durante 21 dias, como única fonte
de dieta líquida, enquanto que o grupo controle recebeu água ad libitum. Após
a exposição crônica, o etanol foi substituído por água e os animais foram
avaliados no LCE, CA, rota-rod, reconhecimento de objetos e TNF. Os ratos
expostos cronicamente ao etanol exibiram comportamento ansiogênico, 72 h
após a retirada da droga. Além disso, déficits de memória e comportamento do
tipo depressivo, sem alteração na atividade locomotora e coordenação motora,
foram observados em ratos abstinentes em longo prazo. Em uma terceira etapa
desta pesquisa, foi avaliado o efeito da administração aguda e crônica de
topiramato (40 mg/Kg/mL) no LCE, CA e TNF em ratos abstinentes (a curto e
longo prazo) ou não abstinentes a exposição forçada com etanol por 21 dias. A
administração aguda e crônica com topiramato (40 mg/Kg/mL) reverteu o
comportamento ansiogênico de ratos abstinentes em curto e longo prazo, sem
afetar a locomoção. No entanto, a administração crônica de topiramato não
contrabalanceou o comportamento do tipo depressivo de ratos abstinentes ao
etanol. Em conclusão, o topiramato induziu um efeito ansiolítico após a
administração aguda e crônica em ratos naive e abstinentes ao etanol.
Também foi visto que, a administração aguda do topiramato provoca ação do
tipo antidepressiva em ratos naive, porém este efeito se dissipa após
tratamento crônico. O modelo animal aqui proposto para estudar o efeito da
retirada do etanol simula os comportamentos ansiogênicos e depressivos
encontrados em humanos. Neste modelo, o topiramato não foi bem sucedido
em aliviar o comportamento tipo depressivo de ratos abstinentes. Contudo,
topiramato parece ser uma opção terapêutica relevante para o tratamento da
ansiedade, inclusive aquela provocada pela retirada do etanol.
Palavras-chave: topiramato; abstinência ao etanol; ansiedade; transtorno de
humor; rato.
10
ABSTRACT
Topiramate is an antiepileptic agent that has shown promise in treating
migraine, obesity control and several psychiatric disorders, including bipolar
disorder. Clinical studies report the use of topiramate for relief of behavioral
impulsivity associated with abuse, cracking and psychological symptoms
resulting from ethanol withdrawal. Considering its pharmacokinetic and
pharmacodynamic properties and its high tolerability compared to the available
clinical anxiolytics and antidepressants, it is interesting to investigate the
anxiolytic and antidepressant potential of this drug in naive and ethanol
abstinent rats.The present study investigated the effects of acute and chronic
treatment with topiramate in behaviors related to anxiety, depression, and
ethanol withdrawal after forced chronic consumption. Adult male Wistar rats
were treated with topiramate (10 and 40 mg/kg/ml) or saline by gavage 60
minutes prior to the elevated plus maze tests (EPM), open field (OF) and forced
swimming test (FST). It was observed that acute and chronic administration of
topiramate (40 mg/kg/ml) promoted anxiolytic actions in naive animals and
antidepressant effects after acute administration without impairment of
locomotor activity. In another experimental series, rats were submetted to
increasing concentrations of ethanol (2-6 %) for 21 days as the only source of
liquid diet while the control group received water ad libitum. After chronic
exposure, the ethanol was replaced by water, and the animals were evaluated
in the EPM, OF, rota-rod, object recognition and FST. The rats chronically
exposed to ethanol exhibited anxiogenic-like behavior 72 h after withdrawal.
Furthermore, memory deficits and depressive-like behavior without alteration in
locomotor activity and coordination were observed in protracted abstinent rats.
In a third moment of this study, we evaluated the effect of acute and chronic
administration of topiramate (40 mg/kg/ml) in the EPM, OF and FST in naïve
and in early and protracted abstinent rats. Acute and chronic administration of
topiramate (40 mg/kg/ml) induced anxiolytic-like effects in early and protracted
abstinent rats, without affecting locomotion. By contrast, the chronic
administration of topiramate did not counteract the depressive-related behavior
of ethanol abstinent rats. Indeed, the acute administration of topiramate induces
antidepressant-like effects in naive rats, but it dissipates after chronic treatment.
In conclusion, topiramate showed anxiolytic effects after acute and chronic
treatment in naive and abstinent rats. Additionally, acute topiramate induced
antidepressive-like behavior in naïve rats, but this effect dissipates after chronic
administration. The animal model herein proposed to study the ethanol
abstinence induced anxiogenic- and depressive-like behaviors, similar to that
found in humans through withdrawal. In this animal model, topiramate did not
reverse the depressant-like effects of ethanol withdrawal. Finally, topiramate
seems to be an interesting therapeutic approach for the treatment of anxiety,
including that caused by ethanol abstinence.
Keywords: topiramate; abstinence to ethanol; anxiety; mood disorder; rats.
11
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
5-HT
Serotonina
ACTH
Hormônio Adrenocorticotrófico
AMPA
Ácido α-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico
ANOVA
Análise De Variância
ATV
Área Tegmental Ventral
AVP
Vasopressina
BDNF
Fator Neurotrófico Derivado Do Cérebro
BZD
Benzodiazepínicos
CA
Campo Aberto
Ca+2
Íon cálcio
CEUA
Comissão De Ética No Uso De Animais
Cl-
Íon cloreto
CRF
Hormônio liberador de corticotropina
DA
Dopamina
DRL-72
Differential Reinforcement of Low rate
EtOH
Etanol
GABA
Ácido gama-aminobutírico
GIRK
Canais de Potássio responsivos a receptores acoplados à
proteína G
GLU
Glutamato
Gly
Glicina
GlyR
Receptor de Glicina
HCO3
Bicarbonato
HPA
Eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal
IMAO
Inibidores da Enzima Monoamino Oxidase
i.p.
Via Intraperitoenal
ISRS
Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina
LCE
Labirinto em Cruz Elevado
MAO
Monoamina Oxidase
Na+
Íon sódio
12
NAc
Núcleo Accumbens
nAChR
Receptor Nicotínico Neuronal de Acetilcolina
NF
Nado Forçado
NMDA
N-Metil D-Aspartato
NPY
Neuropeptídeo Y
PVN
Núcleos Paraventriculares Hipotalâmicos
RNA
Ácido Ribonucleico
RNAm
RNA Mensageiro
RO
Reconhecimento de Objetos
SNC
Sistema Nervoso Central
TA
Tempo Gasto Explorando o Objeto Familiar A
TB
Tempo Gasto Explorando o Novo Objeto B
TDM
Transtorno Depressivo Maior
TAG
Transtorno de Ansiedade Generalizada
TNF
Teste do Nado Forçado
v.o.
Via Oral
13
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1: Sinais e Sintomas para diagnóstico de depressão maior .............
22
Tabela 2: Principais sistemas de neurotransmissores envolvidos na
mediação dos efeitos do etanol..................................................................
29
Tabela 3: Principais sítios de ação do topiramato.....................................
35
Tabela
4:
Cronograma
de
tratamento
com
topiramato
e
testes
comportamentais............................................................................................ 44
14
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1: Fisiopatologia da Depressão.................................................
Figura
2:
Esquema
simplificado
do
sistema
25
dopaminérgico
mesocorticolímbico no encéfalo humano................................................
27
Figura 3: Estrutura química do topiramato...........................................
33
Figura 4: Esquema representativo do protocolo de consumo forçado
de etanol e do período de abstinência..................................................
45
Figura 5: Esquema representativo da administração aguda de
topiramato no período de abstinência....................................................
46
Figura 6: Esquema representativo da administração sub-crônica de
topiramato no período de abstinência....................................................
47
Figura 7: Efeito do tratamento com diazepam em ratos naive
submetidos ao teste labirinto em cruz elevado.......................................
49
Figura 8: Efeito do tratamento com nortriptilina 30 mg/kg, vo, em ratos
naive submetidos ao teste da natação forçada.......................................
49
Figura 9: Efeito da administração aguda de topiramato (10 e 40 mg/kg,
v.o.) em ratos naive submetidos ao teste de LCE...................................
50
Figura 10: Efeitos agudo (A, C) e sub-crônico (B, D) da administração
de topiramato (10 e 40 mg/kg, v.o) em ratos naive no teste de campo
aberto......................................................................................................
51
Figura 11: Efeito agudo (A) e sub-crônico (B) da administração de
topiramato (10 e 40 mg/kg, v.o) no teste da natação forçada................
51
Figura 12: Comportamento de ratos abstinentes ao etanol em curto
prazo (72 h) submetidos ao labirinto em cruz elevado............................ 53
Figura 13: Comportamento de ratos abstinentes em curto (5 dias) e
longo prazo (19 dias) ao etanol submetidos ao campo aberto.............
54
Figura 14: Comportamento de ratos abstinentes em longo prazo
submetidos ao teste do rota-rod .............................................................
54
Figura 15: Efeitos da retirada em longo prazo do etanol sobre os
índices de reconhecimento em ratos abstinentes ou não ao etanol.......
55
15
Figura 16: Comportamento de ratos abstinentes em longo prazo ao etanol
submetidos ao teste da natação forçada......................................................
56
Figura 17: Efeitos da administração aguda de topiramato (40 mg/kg, v.o.)
em ratos abstinentes ou não ao etanol submetidos ao teste do
LCE............................................................................................................
57
Figura 18: Efeitos da administração sub-crônica de topiramato (40 mg/kg,
v.o.) em ratos abstinentes ou não ao etanol submetidos ao teste do
LCE............................................................................................................
58
Figura 19: Efeito agudo (A) e sub-crônico (B) da administração de
topiramato (40 mg/kg, v.o.) em ratos abstinentes em curto e longo prazo
ou não abstinentes ao etanol no teste de campo aberto................................ 59
Figura 20: Efeito da administração sub-crônica de topiramato (40 mg/kg,
v.o.) em ratos abstinentes em longo prazo ou não abstinentes ao etanol no
tempo de imobilidade no teste da natação forçada........................................ 59
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................
17
1.1 Transtornos Psiquiátricos: Bases Neurais e Farmacoterapia .........................
17
1.1.1 Transtornos de ansiedade.....................................................................
17
1.1.1.1 Bases neurais da ansiedade................................................................ 18
1.1.1.2 Farmacoterapia da ansiedade............................................................
20
1.1.2 Transtornos depressivos.......................................................................
21
1.1.2.1 Etiopatologia da depressão ..............................................................
22
1.1.2.2 Farmacoterapia da depressão.............................................................
25
1.1.3 Toxicodependência do etanol................................................................
26
1.2 Topiramato.......................................................................................................
32
1.2.1 Aspectos farmacodinâmicos e farmacocinéticos................................... 32
1.2.2 Transtornos psiquiátricos e o topiramato..............................................
35
2. OBJETIVOS.......................................................................................................
38
2.1 Geral................................................................................................................. 38
2.2 Específicos.......................................................................................................
38
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................
39
3.1 Animais............................................................................................................. 39
3.2. Habituação ao experimentador.......................................................................
39
3.3. Drogas.............................................................................................................
40
3.4. Aparatos..........................................................................................................
41
3.4.1. Labirinto em cruz elevado (LCE).................................................................
41
3.4.2 Rota-rod......................................................................................................... 41
3.4.3. Campo aberto (CA) .....................................................................................
42
3.4.4. Avaliação da memória de reconhecimento de objetos................................. 42
17
3.4.5. Teste de natação forçado (TNF) .................................................................
43
3.5 Desenho experimental.....................................................................................
44
3.5.1 Procedimento experimental 1 ....................................................................... 44
3.5.2 Procedimento experimental 2 .....................................................................
44
3.5.3 Procedimento experimental 3 .....................................................................
45
3.6 Análise estatística............................................................................................. 47
4. RESULTADOS................................................................................................... 48
4.1. Efeito comportamental do topiramato em animais naive................................. 48
4.2. Padronização do protocolo de abstinência ao etanol...................................... 52
4.3. Efeito comportamental do topiramato em animais abstinentes ao etanol.......
56
5. DISCUSSÃO......................................................................................................
60
6. CONCLUSÃO....................................................................................................
72
7. REFERÊNCIAS.................................................................................................. 73
APÊNDICE.............................................................................................................
99
ANEXO................................................................................................................... 100
18
1. INTRODUÇÃO
1.1 Transtornos psiquiátricos: bases neurais e farmacoterapia
1.1.1 Transtornos de ansiedade
A ansiedade em si é um fenômeno emocional comum e útil aos seres
humanos, que antecipa o perigo e organiza os comportamentos de defesa
apropriados, funcionando com valor adaptativo frente às alterações do meio
ambiente que nos cerca (Farb e Ratner, 2014). Entretanto, em sua forma
patológica, pode interferir significativamente com a vida do indivíduo e afetar
desde processos fisiológicos até o convívio social (Nuss, 2015).
Segundo Hettema (2001), a ansiedade é uma doença caracterizada por
um excesso de preocupação, medo e tensão que leva a uma incapacidade do
indivíduo na realização das suas tarefas diárias. O Manual Diagnóstico e
Estatístico de Transtornos Mentais, quinta edição (DSM-V), afirma que a
ansiedade deve ser considerada patológica quando "a preocupação ou os
sintomas físicos causam sofrimento clinicamente significativo ou prejuízo em
áreas sociais e ocupacionais”. Ainda, de acordo com o DSM-V, os transtornos
de ansiedade identificam-se como o excesso de ansiedade e preocupação por
um período superior a 6 meses e podem ser classificados em: transtorno de
ansiedade de separação; transtorno de pânico; agorafobia; fobia específica;
transtorno de ansiedade social (fobia social); transtorno de ansiedade
generalizada (TAG); transtorno de ansiedade induzido por substância química,
dentre elas, o etanol; transtorno de ansiedade associado a outra condição
médica e transtorno de ansiedade sem outra especificação.
Atualmente os índices de transtornos de ansiedade têm aumentado de
forma significativa. O TAG é um tipo de transtorno, que apresenta-se como um
importante problema de saúde pública, visto que é um transtorno bem
prevalente em locais de assistência à saúde pública, representando 11,5% dos
atendimentos, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS, 2013). O TAG
é mais prevalente em adultos, especialmente do sexo feminino, do que em
19
adolescentes e idosos, porém o prognóstico clínico é considerado pior quando
identificado antes dos 25 anos de idade (Fernandes e Osório, 2015).
Em todos os transtornos de ansiedade, existem alguns componentes
sintomáticos presentes que se dão pela ativação ou desativação do eixo
hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), acarretando em manifestações cognitivas,
somáticas, comportamentais e emocionais (Grillon, 2002). As manifestações
cognitivas expressam os pensamentos de apreensão, sensação de tensão,
irritabilidade, nervosismo, insegurança e mal-estar indefinido. Asmanifestações
somáticas
englobam
sintomas
físicos
ousomáticos
relacionados
à
hiperatividade autonômica (boca seca, taquicardia, hiperpnéia, falta de ar,
sudorese, náusea, diarréia, disfagia, entre outros), hiperventilação (tontura,
pressão no peito, parestesia, tremores, dores, entre outros) etensão muscular.
As manifestações comportamentais são expressas por meio da insônia,
inquietação, comportamentos fóbicos e rituaiscompulsivos. As manifestações
emocionais envolvem vivências subjetivas de desconforto e desprazer (Braga
et al., 2011).
1.1.2 Bases neurais da ansiedade
Segundo Graeff e Hetem (2004), o circuito em nível cerebral envolvido
na ansiedade inclui estruturas encefálicas formadas pela amígdala, hipocampo,
hipotálamo medial, substância cinzenta periaquedutal, tálamo e córtex préfrontal. A amígdala possui conexões nervosas com o neocórtex e estruturas
límbicas mais profundas e funciona como interface sensório-emocional entre
elas, avaliando e classificando o tipo e o grau do estímulo. O resultado é
transmitido ao hipotálamo medial e substância cinzenta periaquedutal. Esta,
então, seleciona e organiza as reações comportamentais e fisiológicas de
defesa apropriadas. O hipotálamo medial regula o funcionamento da hipófise
que, através da secreção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), estimula as
glândulas suprarrenais a secretar cortisol e epinefrina.
Como as situações de ameaça geralmente necessitam de atividade
vigorosa (luta ou fuga), há ativação do córtex adrenal, bem como do ramo do
sistema nervoso autônomo, ao levarem a liberaçãode glicocorticóides, cujas
ações nos tecidos-alvos são catabólicas, que ajudarão a promover a
20
mobilização de fontes de energia do corpo para enfrentamento da situação
ameaçadora (Graeff, 2007; Braga et al., 2011).
Nos transtornos de ansiedade, Seedat e colaboradores (2004)
demonstraram haver hiperativação da amígdala em contraste com uma
hipoativação do córtex pré-frontal medial, do córtex anterior do cíngulo e do
hipocampo. A hiperatividade da amígdala leva a uma resposta exagerada ao
medo, que se torna persistente; enquanto que, a hipoatividade do córtex préfrontal leva a uma reduzida capacidade para regular o medo e a sua extinção
(Seedat et al., 2004).
Na
etiopatologia
dos
transtornos
da
ansiedade,
vários
neurotransmissores são implicados, uma vez que eles participam, em maior ou
menor grau, da modulação e regulação dos comportamentos defensivos. A
noradrenalina é uma monoamina comumente implicada na defesa e na
ansiedade. A teoria geral do papel da noradrenalina nos transtornos da
ansiedade é que os pacientes afetados poderiam ter uma regulação
noradrenérgica deficitária, com aumentos ocasionais de atividade. De todos os
transtornos de ansiedade, o transtorno de pânico e o de estresse póstraumático são os que apresentam evidências mais importantes de
anormalidade de função noradrenérgica (Sun et al., 2015).
A serotonina (5-HT) participa em inúmeros processos fisiológicos e
patológicos dos transtornos mentais. A neurotransmissão serotoninérgica está
envolvida na regulação do sono, do humor, na vigilância e funções cognitivas,
como o processo de aprendizagem e memória. Além da regulação destes
processos, esta tem demonstrado exercer um duplo papel na regulação da
ansiedade; esta parece exercer um papel ansiogênico na amígdala, enquanto
que ansiolítico na substância cinzenta periaquedutal dorsal (Lin et al., 2014).
Em situações de perigo, há a estimulação do sistema de defesa por meio da
amígdala e a ativação dos neurônios serotoninérgicos situados nos núcleos
dorsais da rafe que inervam a amígdala e a susbtância cinzenta periaquedutal,
facilitando a defesa na primeira e inibindo nesta última, tendo, portanto, um
sentido adaptativo (Lin et al., 2014).
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no sistema
nervoso central (SNC) dos mamíferos. Ele está envolvido numa grande
variedade de processos fisiológicos que estão associadas com funções
21
emocionais, cognitivas e motoras. O glutamato atua sobre receptores
ionotrópicos (NMDA, AMPA e cainato) e metabotrópicos (mGluR). Evidências
experimentais consistentes indicam que as anomalias da transmissão
glutamatérgica estão envolvidas na fisiopatologia da ansiedade (Pitsikas N.,
2014). Em particular, tem sido sugerido que as perturbações de ansiedade são
o resultado de interrupções do equilíbrio entre a inibição e excitação das redes
neuronais, devido a uma maior atividade excitatória do sistema glutamatérgico
(Linden e Schoepp, 2006; Wieronska e Pilc, 2009).
O GABA, por ser um neurotransmissor encontrado em todo o sistema
nervoso central, exerce uma ação inibitória sobre neurônios serotoninérgicos
dos núcleos dorsais da rafe, na substância cinzenta periaquedutal e no sistema
extrapiramidal (Mohler, 2012). O papel do GABA na ansiedade é sustentado
em razão da eficácia dos benzodiazepínicos na diminuição da ansiedade,
sobretudo no TAG (Mohler, 2012).
Existem 2 subtipos de receptores GABA: GABAA e GABAB. O GABAB
possui um papel importante na ansiedade, dado que, em determinados estudos
efetuados em ratos verificou-se que uma deleção do GABAB denota um
fenótipo ansiogênico nos mesmos. Similarmente, agonistas do receptor
GABAB, como o baclofeno, possuem propriedades ansiolíticas (Nuss, 2015). A
neurotransmissão GABAérgica na amígdala tem respostas promissoras para a
modulação de comportamentos relacionadas com a ansiedade. De fato, as
infusões dos agonistas do receptor GABAA na amígdala diminuem as medidas
de medo e ansiedade em várias espécies animais, enquanto que infusões de
antagonistas do GABAA tendem a produzir efeitos ansiogênicos (Barbalho et
al., 2009).
1.1.1.2 Farmacoterapia da ansiedade
Na clínica, as substâncias mais frequentemente utilizadas com fins
ansiolíticos são os benzodiazepínicos e os antidepressivos inibidores da
recaptação de serotonina. O mecanismo de ação dos benzodiazepínicos se
caracteriza pela ativação do sítio benzodiazepínico no receptor GABAA. Um
dos efeitos colaterais mais pronunciados dessa classe de substâncias é o
potencial significativo para a tolerância e dependência (Blednov et al., 2015). Já
22
os antidepressivos que inibem a recaptação de serotonina são eficazes no
controle da ansiedade, porém apresentam alguns pontos negativos, tais como
demora em produzir efeito terapêutico (2 a 8 semanas), além de promoverem
disfunção sexual (Nestler et al., 2002). Considerando estas limitações
terapêuticas, novos fármacos ansiolíticos com menos desvantagens clínicas
são mandatórios.
1.1.2 Transtornos depressivos
Assim como a ansiedade, a depressão também está inclusa nos
transtornos psiquiátricos crônicos mais prevalentes na sociedade e afeta 350
milhões de indivíduos de todas as idades ao redor do mundo (OMS, 2012). A
depressão maior (denominação oficial), de acordo com o DSM-V (2013), é uma
doença incapacitante, que compromete a saúde física e limita a atividade dos
indivíduos acometidos. Produz alteração do humor e causa perturbações
cognitivas e afetivas, afetando de forma negativa a qualidade de vida dos
pacientes (Accortt et al., 2008). Apesar de ser a principal causa de
incapacitação de indivíduos de ambos os sexos, a prevalência da depressão é
50% maior entre as mulheres (OMS, 2012).
É evidente que o diagnóstico da depressão em oposição à maior parte
das doenças, não se baseia em testes de diagnóstico objetivos, mas sim em
um conjunto altamente variável de sinais e sintomas. A depressão não deve ser
vista como uma doença única, mas uma síndrome heterogênea composta por
numerosas doenças de causas e fisiopatologias diferentes (Nestler et al.,
2002).
De acordo com o DSM-V (2013), o transtorno depressivo maior é um
transtorno psiquiátrico caracterizado por cinco ou mais entre os nove sintomas
citados na Tabela 1 e exige a presença de, pelo menos, um dos dois primeiros
sintomas mencionados (humor deprimido ou anedonia), presentes na maior
parte do tempo, com uma duração mínima de duas semanas.
23
Tabela 1. Sinais e sintomas utilizados no diagnóstico de depressão maior.
Sinais e sintomas
Humor deprimido
Anedonia
Perda ou ganho de peso (>5% de alteração em um mês)
Insônia ou hipersonia
Retardo ou agitação psicomotora
Fadiga ou perda de energia
Sentimentos de culpa ou baixa auto-estima
Diminuição da capacidade de concentração
Pensamentos recorrentes de morte ou suicídio
Fonte: DSM-V (2013)
O DSM-V (2013) estabelece subtipos de depressão definidas por
conjuntos de sintomas específicos, dentre eles destaca-se: transtorno
depressivo maior; transtorno disruptivo da desregulação do humor, transtorno
depressivo persistente; transtorno disfórico pré-mestrual; transtorno depressivo
induzido por substância química (por exemplo, etanol); transtorno depressivo
associado à outra condição médica; transtorno depressivo sem outra
especificação e outros transtornos depressivos não especificados.
1.1.2.1 Etiopatologia da depressão
A origem da depressão possui vários eventos envolvidos, dentre elas as
causas genéticas e ambientais, além dos circuitos neurais na base de diversos
mecanismos
neurobiológicos.
Estudos
epidemiológicos
mostram
que
aproximadamente 40% dos quadros depressivos têm origem genética (Kerner,
2015). Apesar de muitos esforços para consolidar essa informação em
laboratório, tem sido difícil delinear um modelo para dar base genética ou
identificar fatores de risco específicos. Há muitas razões para esta dificuldade,
incluindo o fato de que a depressão é um fenômeno complexo, com muitos
genes possivelmente envolvidos, assim, qualquer único gene pode produzir um
efeito
relativamente
pequeno
e,
portanto,
seria
difícil
de
detectar
experimentalmente. É também possível que diferentes genes possam contribuir
24
para a depressão em cada caso, o que complica ainda mais a procura dos
genes da depressão (Kerner, 2015).
Em meados de 1960, surgiu a primeira hipótese para explicar a etiologia
da depressão. A hipótese monoaminérgica postula que a depressão é causada
por
uma
deficiência
monoaminérgica
na
fenda
sináptica
envolvendo
principalmente 5-HT e noradrenalina (Schildkraut, 1965), as quais são
restabelecidas pela farmacoterapia antidepressiva. De fato, a medicação
antidepressiva tem por objetivo aumentar a concentração de monoaminas na
fenda sináptica, o que consequentemente acarreta em longo prazo, na
plasticidade nos circuitos neuronais (Nemeroff e Owens, 2002).
O tratamento da depressão foi descoberto por acaso, por duas classes de
agentes antidepressivos eficazes: os antidepressivos tricíclicos e os inibidores
da monoamina oxidase. Os agentes tricíclicos originais surgiram a partir
pesquisa de anti-histamínico, enquanto que os inibidores da monoamina
oxidase foram derivados de trabalho sobre drogas anti-tuberculose (Nestler et
al., 2002).
A disponibilidade de antidepressivos clinicamente ativos também tornou
possível desenvolver e validar uma ampla gama de testes comportamentais
que estuda os fenótipos da depressão em modelos animais. Além disso, esses
medicamentos e testes comportamentais representam importantes ferramentas
para estudar a função cerebral em condições normais e para identificar uma
gama de proteínas no cérebro que possam servir como alvos para novos
tratamentos antidepressivos (Nestler et al., 2002).
Muitas regiões do cérebro têm sido implicadas na regulação das
emoções, incluindo as regiões do córtex pré-frontal e córtex cingulado,
hipocampo, estriado, amígdala e tálamo. O conhecimento da função dessas
regiões cerebrais, em condições normais sugere os aspectos da depressão:
neocórtex e hipocampo, podem mediar aspectos cognitivos da depressão, tais
como deficiências de memória e sentimentos de inutilidade, desesperança,
culpa e tendências suicidas. O estriado, particularmente o estriado ventral ou
núcleo accumbens [NAc] e amígdala, são áreas do cérebro relacionadas à
memória emocional e poderiam, como resultado, mediar os sintomas de
anedonia, ansiedade e apatia (Lener e Iosifescu, 2015). Dada à importância
dos chamados sintomas neurovegetativos de depressão, incluindo o excesso
25
ou falta de sono ou apetite, bem como uma perda de energia de interesse em
outras atividades agradáveis. O papel do hipotálamo também tem sido
especulado (Lener e Iosifescu, 2015; Wise et al., 2014).
Evidências também relacionam o desenvolvimento da depressão com a
hiperestimulação do eixo HPA, sendo a descoberta biológica mais consistente
para o estudo da fisiopatologia da depressão maior (Pariante e Lightman, 2008;
Frodl e O'Keane, 2013; Maric and Adzic, 2013). Percebe-se que em uma
situação de risco, as células dos núcleos paraventriculares hipotalâmicos,
secretam CRF e vasopressina que atuam sinergicamente na ativação do eixo
HPA. Na hipófise anterior, CRF e vasopressina estimulam a liberação do
ACTH, que por sua vez atua no córtex da glândula suprarrenal, promovendo a
síntese e liberação de glicocorticoides, como o cortisol em humanos e a
corticosterona em roedores (Nemeroff, 1996; Cunha et al., 2010). Em suporte a
esta hipótese, pesquisas demonstram níveis aumentados de cortisol na saliva,
plasma e urina, bem como aumento de tamanho e atividade das glândulas
hipófise e suprarrenal na maioria dos pacientes com diagnóstico de depressão
maior (Nemeroff e Vale, 2005; Pariante e Lightman, 2008).
Pesquisas têm relacionado a disfunção dos fatores de crescimento
neuronal com a neurobiologia da depressão. Esta hipótese surgiu originalmente
a partir da descoberta que eventos estressores agudos ou crônicos diminuem a
expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) no hipocampo em
roedores e que diversas classes de antidepressivos revertem tal efeito,
prevenindo os efeitos deletérios do estresse que foram produzidos a partir do
excesso de glicorticóide (Duman et al., 1997; Duman, 2004). Suportando tal
hipótese, níveis reduzidos de BDNF hipocampal também foram encontrados
em cérebros post-mortem de pacientes deprimidos (Chen et al., 2001).
Outra evidência que fornece suporte a esta hipótese, está em estudos
que mostram que a atrofia neuronal e a perda de células em regiões límbicas é
de fundamental importância no desenvolvimento da depressão (Duman e
Monteggia, 2006; Sapolsky, 2001). A atrofia observada primeiramente em
estudos post-mortem é mais notável no hipocampo, região responsável pelo
aprendizado, memória e controle do eixo HPA e que também se encontra
alterada na depressão (Duman e Monteggia, 2006). Estudos mostram que a
atrofia pode ser consequência da retração dendrítica, inibição da neurogênese
26
ou neurotoxicidade e morte dos neurônios hipocampais (Sapolsky, 2001). O
principal suspeito para tais danos são os hormônios esteróides produzidos pela
glândula suprarrenal em resposta ao um evento de estresse; o hipocampo
possui
muitos
receptores
para
glicocorticóides
que
quando
ativados
cronicamente podem promover apoptose neuronal (McEwen, 1999). Ainda,
corroborando com a atrofia hipocampal já descrita para o quadro de depressão,
estudos
mostraram
que
várias
formas
de
estresse,
como
choques
imprevisíveis, isolamento social, privação materna, diminuem a expressão de
BDNF no hipocampo de animais (Duman e Monteggia, 2006). Todos estes
fatores que influenciam na fisiopatologia da depressão apesar de distintos
podem interagem entre si, como ilustra a figura 1.
Figura 1. Fatores que contribuem para a fisiopatologia da depressão.
1.1.2.2 Farmacoterapia da depressão
Os fármacos utilizados no tratamento da depressão maior atualmente têm
como objetivo aumentar a concentração de monoaminas na fenda sináptica, o
que consequentemente acarreta em longo prazo, na plasticidade nos circuitos
neuronais (Nemeroff e Owens, 2002). Tal evento ocorre porque o tratamento
com antidepressivos estimula a atividade neuronal e promove aumento da
27
expressão do BDNF (Russo-Neustadt e Chen, 2005). No tratamento crônico,
mas não no agudo, os antidepressivos aumentam o nível de proliferação
neuronal hipocampal (Sairanen et al., 2005).
Os
antidepressivos
atualmente
usados
na
clínica
são
divididos
didaticamente em quatro grandes classes: inibidores seletivos da recaptação
de serotonina (ISRS), antidepressivos tricíclicos, inibidores da enzima
monoamino oxidase (IMAO) e, os recentemente aprovados para uso, agonistas
de receptores de melatonina (Catena-Dell'Osso et al., 2012; Berton e Nestler,
2006; Krishnan e Nestler, 2008).
Os efeitos terapêuticos dessas classes de fármacos aparecem após
semanas de uso, conferindo de início somente efeitos adversos, o que dificulta
a adesão ao tratamento (Lafer et al., 2009; Thase e Denko, 2008). Como
exemplo de efeitos colaterais, destacam-se: problemas sexuais, perda ou
ganho
de
peso,
desconforto
no
trato
gastrointestinal
e
alterações
cardiovasculares (Duman e Monteggia, 2006). Baseando-se na gama de
efeitos colaterais, eficácia limitada e na demora em produzir o efeito
antidepressivo, é necessário identificar novos alvos terapêuticos para o
tratamento da depressão maior (Berton e Nestler, 2006).
1.1.3 Toxicodependência do etanol
A dependência ao etanol é um importante problema de saúde pública com
reflexos
sócio-econômicos
em
todo
o
mundo
(American
Psychiatric
Association, 2013). Dentre as drogas de abuso existentes na atualidade, o
etanol é uma das mais frequentemente utilizadas; por ser lícita na maioria dos
países, alcança um grande número de pessoas em todo o planeta. A
prevalência anual do uso mundial de álcool chega a ser oito vezes maior que a
do abuso de drogas ilícitas, chegando a 42 % da população mundial segundo a
organização mundial de saúde (2009).
O termo adição, também conhecido como toxicodependência ou
dependência de substâncias psicoativas, de acordo com o DSM-V (2013), é
conceituada como uma doença crônica e recorrente caracterizada com um
conjunto de sintomas cognitivos, comportamentais e fisiológicos que indicam
que o indivíduo perdeu o controle do uso da substância e continua a usá-la
28
apesar de reconhecer as consequências adversas deste uso. Além disso, a
toxicodependência pode ser definida didaticamente como um ciclo que inclui
diversas fases, como aquisição/experimentação da droga, dependência,
tolerância, abstinência e recaída (Peck e Ranaldi, 2014).
A abstinência é um conjunto de modificações orgânicas que se dão em
razão da suspensão brusca do consumo da droga geradora de dependência e
o componente final do ciclo de dependência de drogas é a recaída, ou seja, a
retomada do uso da droga (Peuker et al., 2010)
Há provas consideráveis, a partir de modelos animais e de seres
humanos, que todas as drogas de abuso convergem em um circuito comum no
sistema límbico do cérebro (Koob e Le Moal, 2001). A via dopaminérgica
mesolímbica tem sido alvo de estudos sobre drogas de abuso ao longo do
tempo. Essa via inclui os neurônios dopaminérgicos da área tegmental ventral
(ATV) do mesencéfalo e suas projeções para o córtex pré-frontal e para o
núcleo accumbens (NAc). O etanol, através da ação principalmente no receptor
GABAA, pode inibir terminais GABAérgicos na ATV e, portanto, desinibir os
neurônios dopaminérgicos da ATV e, da mesma forma, inibir terminais
glutamatérgicos que inervam os neurônios do NAc (Koob e Le Moal, 2001),
como pode ser visto na figura 2.
Figura 2. Esquema simplificado do sistema dopaminérgico mesocorticolímbico no encéfalo
humano. Os neurônios dopaminérgicos se originam na área tegmental ventral (ATV) em
direção
ao
núcleo
accumbens
(NAC)
http://www.medicinageriatrica.com.br, 2014)
e
ao
córtex
pré-frontal
(Fonte
29
No SNC, o etanol atua em diversos receptores e sinapses neuronais
(Spanagel, 2009). Após a administração aguda dessa droga, ocorre um
aumento da inibição mediada pelos neurotransmissores GABA e glicina. Ocorre
também uma inibição da entrada de Ca2+ pelos canais de cálcio dependentes
de voltagem, a ativação de alguns tipos de canais de K+, a inibição dos
receptores ionotrópicos de glutamato e a inibição do transporte de adenosina
(Harris et al., 2008). O etanol facilita a abertura dos canais de Cl- e aumenta a
ação de GABA nos receptores GABAA.
O etanol, assim como a taurina e a β-alanina, parece também ativar os
receptores de glicina (GlyR) possivelmente pela interação do etanol com a
subunidade α1 desse receptor mediado pela ativação de fosfoquinase C. O
resultado dessa ativação é o aumento da liberação de dopamina no NAc. A
taurina, particularmente, parece aumentar a liberação de dopamina pela
ativação simultânea de GlyR e dos receptores nicotínicos de acetilcolina
(nAChR) (Ericson et al., 2011; Molander e Söderpalm, 2005).
Os neurônios dopaminérgicos da ATV expressam diversas subunidades
de nAChR e sua ativação aumenta a taxa de disparo dos neurônios
dopaminérgicos, principalmente da região posterior de ATV, os quais
conectam-se ao NAc (Leslie, 2013). Dessa forma, o consumo agudo de etanol
aumenta os níveis de acetilcolina na ATV, os quais ativam os nAChR e
aumentam a liberação de dopamina no NAc (Joslyn et al., 2008).
A inibição dos efeitos excitatórios de glutamato pelo etanol ocorre nas
mesmas concentrações cujo etanol produz os efeitos depressivos no SNC
(Krystal, 2003).
O etanol também inibe a abertura de canais de cálcio sensíveis à
voltagem, reduzindo a despolarização do nervo terminal e, consequentemente,
diminuindo a liberação de neurotransmissores para a fenda sináptica. A
diminuição da excitabilidade neuronal ocorre pela ativação dos canais de
potássio ativados por receptores acoplados à proteína G (GIRK) (Bodhinathan
e Slesinger, 2013). Em suma, o etanol interage com múltiplos sistemas de
neurotransmissores, conforme resumido na tabela 2.
30
Tabela 2. Principais sistemas de neurotransmissores envolvidos na mediação dos efeitos do
etanol.
Sistema de
Neurotransmissor
GABAA
NMDA
Efeitos produzidos pelo etanol
Liberação de GABA e aumento da densidade do
receptor
Inibição dos receptores pós-sinápticos NMDA;
no uso crônico de etanol, superexpressão
Dopamina
Aumento
DA
sináptica
e
dos
efeitos
recompensadores ligados ao NAc
Glicina
Opióides
Aumenta a liberação de glicina no NAc e
ativação de GlyR
Liberação de β-endorfinas e encefalina após
Acetilcolina
administração aguda de etanol; liberação de
dinorfina durante abstinência
Aumenta a liberação de ACh após administração
aguda de etanol e ativação de nAChR seguido
de um aumento da liberação de dopamina no
NAc
Adenosina
Aumento da liberação de adenosina no estriado
e ativação de receptores A1 e A2A
A exposição aguda ao etanol está relacionada, dependendo da dose,
com efeitos ansiolíticos, sedativos, anticonvulsivantes e prejuízos na
coordenação
motora,
devidos,
principalmente,
a
facilitação
na
neurotransmissão GABAérgica mediada por receptores de tipo GABAA e/ou
prejuízo da neurotransmissão glutamatérgica mediada por receptores de tipo
N-Metil-D-Aspartato (NMDA), promovendo uma depressão do SNC (Krystal,
2003).
Com a exposição prolongada ao etanol ocorrem alterações adaptativas
(plasticidade ou alostasia) nos sistemas de neurotransmissores. Assim, Cagetti
et al. (2003) observaram, em regiões hipocampais de ratos abstêmios ao etanol
consumido cronicamente, uma redução funcional do receptor GABAA
acompanhada por alterações no RNAm e expressão protéica de subunidades
deste receptor (aumento da expressão das subunidades α4 e γ2, e diminuição
da expressão das subunidades α1 e δ).
31
Além disso, estudos demonstram redução do complexo de receptores
GABAA - benzodiazepínicos, principalmente no lobo pré-frontal de etilistas (AbiDargham et al., 2014). Similarmente foi visto, no núcleo central da amígdala de
ratos sob privação de etanol após seu consumo crônico, um aumento da
função do receptor NMDA devido a um aumento na expressão de várias
subunidades deste receptor associado a um aumento no nível de RNAm destas
subunidades (Roberto et al., 2006).
A redução ou a completa descontinuação do consumo crônico do etanol
resulta nos sinais e sintomas da síndrome de abstinência. Esta síndrome
decorre de alterações neurobiológicas em níveis moleculares, celulares e de
sistemas que ocorrem nos mesmos sistemas de neurotransmissores
envolvidos com a administração aguda da droga e que são alterados com a
dependência (Koob e Le Moal, 2001).
A síndrome de abstinência ao etanol é um processo diverso e
temporalmente dinâmico, tem início 6 a 8 horas após a parada da ingestão,
sendo caracterizada por agitação, ansiedade, alteração do humor, náuseas,
vômitos, taquicardia e hipertensão arterial, podendo ocorrer complicações
como alucinações e convulsões. A persistência de alguns destes sintomas,
principalmente a ansiedade e alterações do humor, está relacionada com a
recaída de etilistas abstêmios (Peuker et al., 2010). Estas alterações ocorrem,
de certo modo, devido a uma hiperexcitabilidade do SNC, principalmente
devido à diminuição na neurotransmissão GABAérgica e um aumento da
função glutamatérgica (Batistela, 2009). Neste sentido, Tsai et al. (2014)
mostraram um aumento no nível de glutamato e uma redução no nível de
GABA no fluído cerebroespinal de etilistas durante a retirada da droga.
O aumento da liberação de noradrenalina, afeta diversos sistemas do
organismo através da ativação simpática, resultando em reações fisiológicas,
tais como taquicardia por ativação de receptores β-adrenérgicos, hipertensão
por ativação de receptores α-adrenérgicos, aumento da força de contração do
músculo cardíaco por ação adrenérgica inotrópica positiva, náuseas e vômitos
devido à redução do esvaziamento gástrico, piloereção, midríase, tremores,
aumento do consumo de oxigênio e aumento da temperatura corporal em até 2
°C (Laranjeira et al., 2000). É sugerido que a elevação na liberação de
noradrenalina ocorra por hiperexcitação de neurônios noradrenérgicos,
32
promovido pela liberação de glutamato e, por uma diminuição da inibição
destes neurônios através da redução funcional de adrenoreceptores inibitórios
pré-sinápticos do subtipo α2 (Nutt et al., 1990).
Uma diminuição de dopamina e 5-HT no NAc também foi observada na
retirada do etanol. Esta diminuição tem sido relacionada ao reforço negativo e
sintomas afetivos negativos, como disforia e ansiedade, observados durante
abstinência da droga (Weiss et al., 1996). Estes sintomas afetivos negativos
estão associados com a recaída de etilistas abstêmios.
Inúmeros estudos clínicos mostram que pacientes com dependência ao
etanol, com ou sem transtorno de ansiedade ou depressão associada, exibem
marcantes sintomas de ansiedade e depressão após a retirada da droga e que
os mesmos diminuem, na maioria dos casos, após quatro a cinco semanas
sem o etanol (Wetterling e Junghanns, 2000; Driessen et al., 2001; Willinger et
al., 2002; Haynes et al., 2005).
A farmacoterapia da síndrome de abstinência ao etanol possui duas
fases: o tratamento da crise de abstinência e a manutenção. Os dependentes
em crise de abstinência de etanol devem ser tratados em local silencioso e com
baixa iluminação. Para evitar lesões devido à agitação, deve ser fornecida
sedação adequada, além das correções de desequilíbrios eletrolíticos e
nutrição necessária (Kattimani e Bharadwaj, 2013). Os benzodiazepínicos são
os medicamentos mais utilizados nesta etapa, uma vez que agem reduzindo
gradualmente os efeitos causados pelo uso do etanol e, assim, minimizando os
sintomas de abstinência. O objetivo principal da farmacoterapia na crise de
abstinência é a prevenção de alguns sintomas como convulsões, arritmias e
delírios; podendo ser dividida em duas fases: a substituição do etanol por uma
droga sedativo-hipnótica de ação prolongada e, posteriormente, a retirada
dessa droga de maneira gradativa (Kattimani et al., 2013).
Quando o dependente apresenta delírio na abstinência de etanol,
utilizam-se benzodiazepínicos por via intravenosa, acompanhado ou não de
antipsicóticos, os benzodiazepínicos exercem seus efeitos de sedativos
hipnóticos através do seu mecanismo de ação, pois são agonistas GABA, ou
seja, medeiam a transmissão sináptica inibitória através do SNC (Ritvo e Park,
2007). Porém, devido ao potencial de indução de dependência, estudos estão
sendo realizados para se buscar uma alternativa ao uso desta classe de
33
fármacos (Friedmann et al., 2008; Krupitsky et al., 2007). Existindo assim uma
grande lacuna a ser ocupada no desenvolvimento de fármacos para esse fim.
Com isso, neste estudo avaliou-se a possibilidade de incluir no
tratamento da crise de abstinência, o topiramato, visando o emprego de um
agente terapêutico mais bem tolerado na clínica que os benzodiazepínicos e
que pudesse apresentar eficácia na redução da severidade dessa síndrome.
1.2 Topiramato
1.2.1 Aspectos farmacodinâmicos e farmacocinéticos
O topiramato foi inicialmente sintetizado em 1979 como um fármaco
antidiabético, por atuar inibindo a enzima frutose-1,6-bisfosfatase e, assim, a
via da gliconeogênese. Contudo, a inabilidade do topiramato em reduzir os
níveis glicêmicos em ratos determinou a interrupção prematura desta linha de
pesquisa. A similaridade estrutural do topiramato com a acetazolamida, a qual
produz efeitos anticonvulsivantes, encorajou pesquisas para testar uma
possível atividade anticonvulsivante deste composto. Nos dias de hoje, o
topiramato é conhecido devido sua ação antiepiléptica (Khan et al., 2003;
Jonhson et al., 2003).
O nome químico do topiramato é 2,3:4,5-Di-O-isopropilideno-beta-Dfrutopiranose sulfamato e sua fórmula molecular é C12H21NO8S, como ilustrada
na Figura 1 (Kenna et al., 2009). O topiramato possui peso molecular de 339
g/mol e constante de dissociação (pKa) de 8,7, além de alta solubilidade em
água (Langtry et al., 1997). Em geral, o topiramato tem características
farmacocinéticas mais favoráveis do que outros anticonvulsivantes, como a
carbamazepina, o valproato, a fenitoína ou o fenobarbital, favorecendo a
adesão do paciente ao tratamento.
O perfil farmacocinético do topiramato é caracterizado por absorção
rápida e quase completa com pico de concentração plasmática de 2 horas da
administração, não afetada por alimentos, cinética linear, tornando-se possível
prever mudanças na concentração de plasma com alterações da dose ou
regimes de dosagem (Kenna et al., 2009). Além disso, o topiramato é eliminado
34
predominantemente na urina, com uma meia-vida de eliminação de 21 h, e não
é extensivamente metabolizado in vivo. Seu metabolismo é 30 % hepático e 70
% excretado via renal, de maneira inalterada na urina (Kenna et al., 2009;
Shank et al., 2000). Ainda, devido à fraca ligação às proteínas plasmáticas (917 %), diferentemente de anticonvulsivantes benzodiazepínicos e da fenitoína,
a probabilidade de interação com outros medicamentos devido este aspecto é
bastante remota (Bourin et al., 2009).
Figura 3. Estrutura química do topiramato (Fonte: www.drugs.com/pro/topiramate-tablets.html).
Com relação aos aspectos farmacodinâmicos do topiramato, testes in vitro
sugerem que este fármaco afeta a atividade neuronal e produz seu efeito por
vários mecanismos, incluindo a modificação dos potenciais de ação
dependentes de Ca+2 e Na+, o aumento da atividade GABAérgica e inibição da
condutância mediada por receptores de glutamato do tipo AMPA (Gryder e
Rogawski, 2003).
Em cultura de neurônios neocorticais, o topiramato reduz a ativação da
corrente de Na+ (Mclean et al., 2000) e, em cultura de neurônios hipocampais,
em concentrações compatíveis com doses terapêuticas, reduz a frequência e a
duração do potencial de ação (White et al., 2005). Sugere-se que a atenuação
do canal de Na+ voltagem-dependente promovido pelo topiramato possa ser
devido à estabilização deste canal no seu estado inativo (Rigoulot et al., 2004).
Este mecanismo de ação atribuído ao topiramato é compartilhado com outros
anticonvulsivantes, tais como fenitoína, carbamazepina, lamotrigina (White,
1997). Ainda, conforme mencionado acima, o topiramato é responsável pela
modulação negativa do canal de Ca+2 tipo L, o que limita as funções do sistema
de segundos mensageiros dependentes de cálcio (McKinney e Murphy, 2006).
Estudos demonstraram também que o topiramato aumenta a frequência
da ativação de receptores GABAA em culturas de neurônios cerebelares e
corticais; e que este não age por meio dos sítios de ligação GABA ou
35
benzodiazepínicos no receptor GABAA, devendo, portanto, exercer o seu efeito
nas correntes GABAA mediada por interação com outros sítios do receptor
GABAA (White et al., 2000), e reduz a atividade do glutamato por indução de
um efeito inibitório nos receptores do tipo AMPA/cainato (Gibbs et al., 2000;
Gryder e Rogawski, 2003).
Os receptores GluR5 do Cainato, são considerados o primeiro sítio de
ação do topiramato. Estes receptores estão presentes nos terminais
gabaérgicos das células piramidais e interneurônios do núcleo basolateral da
amígdala. Os GluR5KRs na região pré-sináptica, modulam a liberação do
GABA de forma bidirecional e dependente da concentração de agonistas
(Braga et al., 2003).
O topiramato também tem efeito inibitório sobre algumas isoenzimas da
anidrase carbônica, mais especificamente as isoenzimas II e IV (Rigoulot et al.,
2003). Nos trabalhos de Sun e Alkon (2001), foi demonstrado que ativadores
da anidrase carbônica fazem com que haja um aumento no efluxo de HCO3nos receptores gabaérgicos, de forma a fazer com que o mecanismo inibitório
que ocorre normalmente devido à entrada de Cl- (hiperpolarização), se torne
excitatório (despolarização).
A inibição da anidrase carbônica pelo topiramato, faz com que haja um
aumento da ação inibitória GABAérgica (Rigoulot et al., 2003), corroborando
com White et al. (2000). Resumidamente, os sítios alvo de ação do topiramato
estão descritos na tabela 3. A este respeito, o topiramato pode ser uma
ferramenta farmacológica interessante para o tratamento de diversos
transtornos psiquiátricos, a citar, a ansiedade, a depressão e os sintomas
psíquicos decorrentes da retirada do etanol.
Tabela 3. Principais sítios de ação do topiramato.
Local de ação
Mecanismo de ação
Receptores AMPA
Inibição dos receptores
Receptores Cainato GluR5
Dessensibilização
Anidrase Carbônica (II e IV)
Inibição da atividade
Receptores GABAA
Ativação
Canal de Ca+2
Modulação negativa (inibição)
36
Canal de Na+
Atenuação e/ou estabilização no estado inativo
1.2.2 Transtornos psiquiátricos e o topiramato
O topiramato tem sido promissor em várias situações na clínica, como é
possível observar em algumas literaturas aqui citadas. Além da ação
antiepiléptica, o topiramato tem mostrado ação neuroprotetora (Khan et al.,
2003; Jonhson et al., 2003) por promover redução do dano neuronal e tem
atuado na prevenção da enxaqueca (Silberstein et al., 2007). Porém, este
fármaco tem ganhado destaque principalmente pelo seu uso no controle da
obesidade (Reas e Grilo, 2015; Khorassani, et al., 2015). Ainda, estudos têm
demonstrado que o topiramato é um medicamento que apresenta bons
resultados quando administrado em pacientes com transtorno de estresse póstraumático (Berlant, 2002; Berlant, 2004; Batki et al., 2014). Assim, como é
usado para o tratamento da avidez e controle do consumo excessivo de
alimentos e cocaína (McElroy et al, 2012; Kampman et al., 2013). Segundo o
estudo duplo cego (Berlin, et al., 2013) e o estudo controlado com placebo,
(Rosenberg et al., 2013), sugere-se que o topiramato possa ser efetivo no
tratamento de pessoas viciadas em jogos.
O topiramato tem sido investigado como um tratamento para uma
variedade de transtornos psíquicos, incluindo a fobia social (Van Ameringen et
al., 2004), transtorno obsessivo-compulsivo (Berlin et al., 2013), transtornos
afetivos, tanto uni quanto bipolar (Mclntyre et al., 2002; Mowla e Kardeh, 2011).
Há evidências de que o topiramato possa ser útil no tratamento
simultâneo da dependência de álcool e tabagismo (Johnson, 2004). Em um
estudo clínico duplo-cego randomizado Johnson et al. (2003a), demonstraram
que o topiramato foi eficaz em reduzir a avidez pelo consumo da droga e
melhorou a qualidade de vida dos indivíduos etilistas que receberam, durante
12 semanas, o tratamento com o topiramato. Evidências mais recentes vêm
confirmando o potencial do topiramato no tratamento da dependência ao etanol
(Johnson et al., 2007, Arbaizar et al., 2010, Johnson et al., 2010, Johnson e AitDaoud, 2010). Além disso, tem sido investigado o uso do topiramato para
aliviar a impulsividade comportamental associada ao consumo abusivo, fissura
37
e sintomas psiquiátricos da retirada do etanol (Johnson et al., 2003; Johnson et
al., 2004; Johnson et al., 2007; Rubio et al., 2009; Paparrigopoulos et al., 2011;
Blodgett et al., 2014; Kranzler et al., 2014; Martinotti et al., 2014).
Um número cada vez maior de estudos pré-clínicos referenda os efeitos
benéficos do tratamento com topiramato em modelos animais de dependência
ao etanol (Gabriel e Cunningham, 2005; Hargreaves e McGregor, 2007;
Nguyen et al., 2007; Farook et al., 2009; Breslin et al., 2010; ZalewskaKaszubska et al., 2013). Por outro lado, poucos estudos pré-clínicos têm
investigado o potencial ansiolítico e antidepressivo do topiramato em ratos
naive (Hargreaves e McGregor, 2007; Molina-Hernandez et al., 2010; MolinaHernández et al., 2013). Ainda, poucos estudos em animais visaram investigar
os efeitos do topiramato nos sintomas psíquicos induzidos pela retirada do
etanol (Cagetti et al., 2004; Farook et al., 2007).
Com relação aos efeitos colaterais do topiramato, convém destacar que
este medicamento possui um perfil favorável quanto aos efeitos adversos
quando comparado a outras medicações antiepilépticas, sendo os sintomas
classificados como leves a moderados. Em humanos, foram observados com
mais frequência, parestesias, alteração do paladar, anorexia e fadiga (Fritz et
al., 2005). Ainda, um dos efeitos colaterais mais frequentes, apresentado por
cerca de 10 % dos indivíduos que tomam o topiramato, é a dificuldade cognitiva
(Biton et al., 2001). Com o uso do topiramato foram evidenciadas diminuição da
concentração, da fluência verbal, da memória de reconhecimento de objetos e
memória de trabalho (McCabe e Eslinger, 2000; Werz, 2006; De Lima et al.,
2007). De fato, quando utilizado em pacientes com epilepsia, avaliados através
de ressonância magnética funcional, foi observado que o topiramato provoca
um declínio na ativação do córtex pré-frontal que é responsável entre outras
funções, pela memória de trabalho (Jansen et al., 2006).
Desta forma, observa-se um cenário que ilustra a baixa disponibilidade
farmacológica para tratar os transtornos psiquiátricos oriundos da retirada do
etanol e que apresenta limitações para o uso, além de consideráveis efeitos
adversos que prejudicam a adesão ao tratamento.
Como visto anteriormente, o topiramato parece ser promissor para o
tratamento da ansiedade e da depressão, assim como na toxicodependência
do álcool, devido às vantagens apresentadas, com perfil favorável com relação
38
aos efeitos colaterais em relação aos fármacos atuais. Portanto, é de grande
interesse a validação pré-clínica e clínica de um fármaco com o perfil
farmacocinético e farmacodinâmico do topiramato no alívio de tais transtornos
psiquiátricos.
39
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
O objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do tratamento com
topiramato sobre os comportamentos relacionados à ansiedade, à depressão e
locomoção em ratos naive e abstinentes ao etanol.
2.2 Específicos
1) Investigar os efeitos do tratamento agudo e crônico com topiramato em
ratos naive submetidos ao labirinto em cruz elevado (LCE), campo
aberto (CA) e teste do nado forçado (TNF);
2) Avaliar os efeitos causados pela abstinência ao etanol em curto e longo
prazo nos comportamentos relacionados à ansiedade, atividade
locomotora, memória e depressão, a fim de validar o modelo de retirada
do etanol em nossas condições experimentais;
3) Avaliar o efeito do tratamento agudo com topiramato em ratos
abstinentes em curto prazo ao etanol submetidos ao teste do LCE e CA;
4) Investigar o efeito do tratamento sub-crônico com topiramato em ratos
abstinentes em longo prazo ao etanol submetidos ao teste do LCE, CA e
teste do nado forçado (TNF).
40
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
Para a realização deste estudo, foram utilizados ratos Wistar machos
com um tempo de vida de aproximadamente 90 dias no início do experimento,
provenientes do biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (DBF-UFRN). Os animais
permaneceram em ambiente controlado sob ciclo claro-escuro de 12 horas
(ciclo claro das 06:00 às 18:00) e temperatura ambiente de 23ºC ± 1ºC. Todos
os animais foram mantidos em número de 5 em gaiolas plásticas de polietileno
de 41x34x16 cm.
Todos os procedimentos experimentais deste estudo foram realizados
sob aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRN
(protocolo N° 007/2012), sendo realizadas todas as adequações para minimizar
o número de animais usados e o seu sofrimento. Ao final dos procedimentos
experimentais, a eutanásia dos animais foi realizada com tiopental sódico (dose
superior a 100 mg/Kg/mL).
3.2. Habituação ao experimentador
Anteriormente ao início dos experimentos (dois dias), cada animal foi
manuseado pelo experimentador (habituação ou handling) numa sessão de
cinco minutos durante dois dias. Este procedimento permitiu aos animais uma
melhor adaptação ao pesquisador durante os testes, reduzindo alterações
comportamentais causadas pelo estresse da manipulação.
41
3.3. Drogas
Topiramato (Laboratórios Eurofarma Ltda, São Paulo, Brasil) foi
solubilizado em solução salina, administrado via oral (v.o.) agudamente ou por
21 dias nas doses de 10 e 40 mg/Kg. O topiramato foi administrado 60 minutos
antes dos testes comportamentais.
Nortriptilina 30 mg/Kg/mL (Novartis Biociências, São Paulo, Brasil), um
antidepressivo tricíclico, foi solubilizada em solução salina e administrada v.o.
30 minutos antes do teste da natação forçada.
Diazepam 1mg/Kg/mL (Cristália Laboratório Farmacêutico, São Paulo,
Brasil), um ansiolítico benzodiazepínico, foi solubilizado em Tween 80 (0,5%) e
soluça salina e administrado por via intraperitoenal (i.p.), 30 minutos antes do
teste labirinto em cruz elevado.
Os animais controles foram administrados com os mesmos veículos,
pelas mesmas vias e utilizando os mesmos volumes que os fármacos acima
citados. Etanol 99% (Neon comercial Ltda, São Paulo, SP, Brasil) solubilizado
em água potável foi disponibilizado à vontade para os animais em
concentrações crescentes (2 % durante os 3 primeiros dias, 4 % por mais
3dias, 6 % durante os 15 dias restantes de exposição ao etanol). Durante os
experimentos com ingestão forçada de etanol, os animais foram divididos em
dois grupos: grupo controle e grupo etanol. No grupo etanol, os animais
recebiam como única fonte de dieta líquida, o etanol e ração à vontade. Já no
grupo controle, estes receberam por 21 dias, água e ração ad libitum.
42
3.4. Aparatos
3.4.1. Labirinto em cruz elevado (LCE)
O LCE consiste de um aparato com dois braços abertos (48 x 10 cm) e
dois braços fechados (48 x 10 cm) com as mesmas dimensões. Ambos se
originam de uma plataforma central (10 x 10 cm) e estão dispostos de forma
que os dois pares de braços idênticos estejam opostos um ao outro. O aparato
está erguido a 50 cm do chão e possui o piso na cor de madeira clara, mas de
forma que contrasta com o indivíduo analisado (branco). No início do teste,
cada animal foi colocado na plataforma central com a face voltada para o braço
fechado. Após o término do teste de cada indivíduo (5 min), o labirinto foi
cuidadosamente limpo com um papel toalha embebido de água.
O teste no LCE foi realizado no período entre 7:00 e 12:00 hs da manhã.
O comportamento do animal foi registrado por uma câmera filmadora, acoplada
a um computador, sob baixa iluminação (lâmpada vermelha de 60 watts voltada
para a parede). Os seguintes parâmetros foram avaliados: número de entradas
em cada braço do labirinto; tempo gasto nos braços abertos; nos braços
fechados e na plataforma central. Conforme previamente descrito por Pellow et
al. (1985), um aumento seletivo nos parâmetros espaço-temporais de
exploração dos braços abertos do labirinto revela um efeito do tipo ansiolítico.
3.4.2 Rota-rod
A avaliação da coordenação motora dos ratos foi feita pelo teste do
rota-rod como previamente descrito por Rozas et al. (1997). O aparelho é
constituído basicamente por um cilindro distante da superfície da mesa, o qual
roda a uma velocidade selecionada pelo experimentador e acionado por um
motor. Para a sessão de treino, os ratos foram submetidos ao aparelho de rotarod em duas velocidades distintas: 8 e 20 rpm, por 5 minutos para cada uma.
Com o objetivo de avaliar a coordenação motora, uma sessão de teste foi
realizada 24 h após a sessão de treino. Na sessão de teste, as seguintes
43
velocidades foram adotadas: 8, 14, 20, 26 e 32 rpm. A latência para cair da
barra de rotação na sessão de teste para cada uma das velocidades testadas
foi registrada.
3.4.3. Campo aberto (CA)
O teste do CA foi introduzido por Calvin Hall em 1934 (Hall, 1934) e é
baseado na observação da atividade locomotora espontânea dos roedores
quando expostos a um novo ambiente. O aparato consiste de uma caixa de
fórmica branca, com fundo negro quadrado, com dimensões de 60 x 60 x 60
cm.
Durante o teste, cada animal foi posicionado no centro do aparato. O
parâmetro avaliado para esse estudo foi a distância percorrida, em metros,
pelos animais ao longo de 15 minutos. A atividade do animal foi registrada por
uma câmera de vídeo, que foi posteriormente analisada com auxílio do
software ANYMaze (Stoelting, USA). O teste foi realizado em uma sala
silenciosa, com temperatura constante de 22ºC ± 1ºC e luz branca indireta (20
W) sob o CA. Após o teste com cada animal, foi realizada a limpeza do aparato
com papel-toalha embebido em água.
3.4.4. Avaliação da memória de reconhecimento de objetos
O teste foi realizado no aparato do CA, conforme previamente descrito
Reus et al. (2008). Todos os animais foram submetidos a uma habituação ao
CA, por 10min para livre exploração na ausência de objetos. 24 horas depois
da sessão de habituação, o treinamento foi realizado pela exposição de dois
objetos idênticos (A1 e A2) inseridos no CA por 5min (sessão treino),
posicionados em cantos adjacentes, 10 cm das paredes. 24 horas depois da
sessão de treino, a tarefa foi repetida a fim de avaliar a memória de longa
duração.
No dia do teste, um objeto anteriormente apresentado (A2) foi
substituído por um objeto novo (B) e esta sessão teve a duração de 5min.
Todos os objetos tinham texturas semelhantes (liso), cores (azul) e tamanhos
44
(peso 150-200 g), mas formas diferentes. O índice de reconhecimento foi
calculado nas sessões de treino e teste, e este índice reporta a seguinte
relação: TB / (TA + TB) (TA = tempo gasto explorando o objeto familiar A; TB =
tempo gasto explorando novo objeto B). Entre o período de exploração de cada
animal, os objetos foram lavados com água.
O comportamento de exploração dos objetos foi definido manualmente
através da cronometragem do tempo gasto cheirando ou tocando o objeto com
o nariz e/ou patas dianteiras. O parâmetro de locomoção (ou seja, distância
percorrida) no aparato foi analisado pelo software AnyMaze (Stoelting, USA).
3.4.5. Teste do nado forçado (TNF)
O TNF é um teste comportamental para avaliação da atividade
antidepressiva de alguns compostos e se baseia na exposição dos animais a
uma situação aversiva e desconfortável. Para a realização do teste do nado
forçado foi utilizado um recipiente circular com 40 cm de altura e 30 cm de
diâmetro, contendo aproximadamente 25 cm de água com temperatura de
22ºC ± 1ºC (adaptado de Porsolt, 1978).
Neste teste, os animais foram colocados individualmente em um cilindro
plástico. Os animais foram colocados no recipiente por dois momentos,
denominados de sessão treino e sessão teste. Na sessão treino, os animais
foram mantidos na água durante 15 min. e nenhum comportamento foi
registrado. Já na sessão de teste, 24 h após a sessão treino, os animais foram
mantidos no cilindro com água por 5 minutos, e os seguintes comportamentos
foram registrados: tempo de imobilidade, tempo de climbing e tempo de
natação, todos em segundos. Foi considerado como imobilidade quando o
animal se movimentava apenas o necessário para manter a cabeça fora da
água. Já o climbing foi considerado quando o animal realizava o
comportamento de escalada das paredes do cilindro, na tentativa de sair da
situação. O comportamento de natação foi avaliado através da subtração do
tempo de duração total do teste (i.e., 300 s) e dos comportamentos de
imobilidade e climbing. O comportamento de cada animal foi registrado por
uma vídeo câmera e a água do recipiente foi trocada para cada animal.
45
3.5. Desenho experimental
3.5.1 Etapa 1: Efeitos comportamentais do topiramato em ratos naives
Nesta etapa, avaliou-se o efeito do topiramato em animais naive com
base nas doses utilizadas em estudo prévios da literatura (Cagetti et al., 2004;
Hargreaves e McGregor, 2007). Inicialmente, investigou-se os efeitos da
administração aguda (v.o.) de topiramato nas doses de 10 e 40 mg/Kg/ ou
solução salina em ratos submetidos aos testes do labirinto em cruz elevado,
campo aberto e teste do nado forçado.
Posteriormente, a fim de avaliar os efeitos da administração repetida,
ratos naive tratados por 21 dias (v.o.) com topiramato 10 e 40 mg/Kg/ ou
solução salina foram submetidos aos testes do campo aberto e nado forçado
de acordo com o esquema ilustrado na tabela 1). Foram utilizados o diazepam
e a nortriptilina como controle positivo para os testes do LCE e (TNF),
respectivamente.
Tabela 4. Representação ao longo do tempo dos testes comportamentais realizados em ratos
Sub
crônico
Agudo
naive e tratados com topiramato.
Administração (v.o.) de
topiramato 10 ou 40 mg/kg
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
…
Dia 20
Dia 21
Dia 22
Teste
comportamental
LCE
CA
TNF (sessão treino)
TNF (sessão teste)
…
CA
TNF (sessão treino)
TNF (sessão teste)
LCE labirinto em cruz elevado; CA: campo aberto; TNF: teste de nado forçado
3.5.2 Etapa 2: Padronização do protocolo de abstinência ao etanol
O modelo de abstinência ao etanol aqui utilizado foi adaptado do estudo
de Cabral et al. (2006). Ao atingirem aproximadamente 60 dias de vida, os
animais do grupo etanol foram submetidos a exposição forçada de etanol,
46
como única fonte de dieta líquida em concentrações crescentes, visando
reduzir uma possível aversão à bebida. Nos três primeiros dias de exposição
ao etanol, os animais receberam uma solução líquida contendo 2 % de etanol;
em seguida, esta foi substituída para a concentração de 4 %, na qual
permaneceu por três dias e, por fim, foi substituído por uma solução líquida
contendo uma concentração de 6 % de etanol, mantendo-se durante 15 dias,
totalizando o regime de consumo crônico forçado de etanol de 21 dias.
No 21º dia, a solução de etanol foi substituída por água potável ad
libitum durante todo o período de abstinência. Avaliações comportamentais em
animais abstinentes foram realizadas através dos LCE, CA, rota-rod,
reconhecimento de objetos e TNF, como ilustrado na figura 4. Para os animais
do grupo controle foi disponibilizada água potável ad libitum durante o período
que os animais do grupo etanol receberam solução de etanol. Os ratos foram
divididos em dois grupos, os quais foram tratados com água (grupo controle) e
solução de etanol durante 21 dias (grupo experimental – ratos abstinentes). Os
testes comportamentais iniciaram 72 h após a substituição do etanol por água.
Figura 4. Esquema representativo do protocolo de consumo forçado de etanol e do período de
abstinência. Conforme demonstrado, a concentração de etanol foi crescente ao longo do
período de consumo, permanecendo na concentração de 6 % até o 21° dia. Após o consumo,
seguiu-se o período de retirada do etanol, cujos animais foram submetidos, nos tempos aqui
determinados, aos seguintes testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo
aberto (CA), rota-rod, reconhecimento de objetos (RO) e natação forçada (TNF).
3.5.3 Etapa 3: Efeito da administração aguda e subcrônico de topiramato em
animais abstêmios ao etanol
47
Os animais abstêmios foram tratados de modo agudo e subcrônico, por
21 dias, com topiramato 40 mg/Kg/mL, por via oral. Os animais controles foram
administrados com solução salina no mesmo volume e via do topiramato.
Experimento 1) Efeito da administração aguda de topiramato sobre
comportamentos relacionados à ansiedade e atividade locomotora em ratos
abstêmios
Decorridos 21 dias de consumo forçado de etanol, a solução de etanol
foi substituída por água e, após 72 horas de abstinência, os animais foram
tratados com topiramato (40 mg/Kg/mL, v.o.) ou solução salina e, 60 minutos
depois, estes foram submetidos ao teste de LCE. No dia seguinte, os mesmos
animais foram novamente administrados com topiramato (40 mg/Kg/mL) ou
salina e, 60 minutos mais tarde, submetidos ao teste do CA.
Figura 5. Esquema representativo da administração aguda de topiramato (dias 24 e 25) após 3
e 4 dias de abstinência ao etanol. Após o consumo crônico de etanol, seguiu-se o período de
retirada do etanol, cujos animais foram submetidos, nos tempos aqui determinados, aos
seguintes testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE) e campo aberto (CA).
Experimento 2) Efeito da administração subcrônico de topiramato sobre
comportamentos relacionados à ansiedade, depressão e atividade locomotora
em ratos abstêmios.
Decorridos 21 dias de consumo forçado de etanol, a solução de etanol
foi substituída por água e os animais foram tratados sub-cronicamente por 23
dias com topiramato (40 mg/Kg/mL) ou solução salina, 60 min após a
administração de topiramato, os animais foram submetidos ao teste de CA e,
24 h depois, ao teste do TNF.
48
Um outro grupo de animais, também abstinentes ao etanol de longo
prazo (21 dias), após a substituição do etanol por água, foram tratados por 21
dias com topiramato (40 mg/Kg/mL) ou solução
e, 60 min após a última
administração, foram avaliados no teste do LCE.
Figura 6. Esquema representativo da administração subcrônico de topiramato (23 dias) após 21
dias de abstinência ao etanol. Após o consumo crônico de etanol, seguiu-se o período de
retirada do etanol, cujos animais foram submetidos, nos tempos aqui determinados, aos
seguintes testes comportamentais: labirinto em cruz elevado (LCE), campo aberto (CA) e
natação forçada (TNF).
3.6. Análise Estatística
Todos os dados foram analisados utilizando GraphPad InStat 3.0 e
Statistica 7.0. Todos os dados são expressos como média ± SEM. Os dados
foram analisados pelo teste t de Student, ANOVA de uma via seguido do teste
post-hoc (o teste de Tukey). Os dados referentes ao efeito do topiramato em
animais abstinentes ao etanol (Etapa 3 do desenho experimental) foram
avaliados através da ANOVA de duas vias (variáveis independentes:
abstinência ao etanol e tratamento com topiramato), seguida do teste de posthoc de Duncan, conforme detalhado nas legendas das figuras. As diferenças
foram consideradas significativas quando P<0,05.
49
4. RESULTADOS
Diante dos objetivos propostos, a presente tese foi desenvolvida em três
grandes etapas, onde a primeira investigou-se o efeito comportamental do
topiramato em animais naive. Na segunda propõe-se um modelo para
investigar os efeitos da retirada do etanol em ratos, enquanto que na terceira,
investigou-se o efeito comportamental do topiramato em animais abstinentes.
4.1 Efeito comportamental do topiramato em animais naive
O efeito de substâncias de referência para a ação do tipo ansiolítica está
representado na figura 4 assim como para ação antidepressiva na figura 5. A
replicação do comportamento ansiolítico induzido pelo diazepam (1 mg/Kg/mL),
em ratos submetidos ao LCE, é de grande importância, pois valida as
condições
experimentais
utilizadas
neste
estudo.
Da
mesma
forma,
padronizou-se o TNF com antidepressivo clássico nortriptilina (30 mg/Kg/mL),
que reduziu o tempo de imobilidade dos ratos submetidos ao teste, indicando
um perfil de resposta do tipo antidepressivo.
Para validar as condições experimentais do LCE, o diazepam foi injetado
em ratos naive. A análise dos dados através do Teste t de Student indicou um
aumento significativo na exploração dos braços abertos no teste de LCE pelos
animais tratados com diazepam comparado com os animais controle. Ocorreu
um aumento significativo no tempo gasto em (Figura 7A; t=5,63, df=12,
*P<0,05), e no número de entradas nos braços abertos (Figura 7B; t=2,79,
df=12, *P<0,05). Além disso, o tratamento com diazepam não afetou o número
de entradas nos braços fechados (Figura 7B; P>0,05).
(A)
200
Número de entrada nos braços
Tempo nos braços abertos (s)
50
*
150
100
50
0
Salina
Diazepam
(B)
20
*
Salina
Diazepam
15
10
5
0
Aberto
Fechado
Figura 7. Efeito do tratamento com diazepam em ratos naive submetidos ao teste labirinto em
cruz elevado. Neste teste os seguintes parâmetros foram avaliados; (A) tempo nos braços
abertos e (B) frequência de entradas nos braços abertos e fechados. As barras representam a
média ± SEM de 6–8 animais por grupo. *P<0.05 vs. grupo controle (teste t de Student).
Para validar as condições experimentais do TNF a nortriptilina foi
injetada em ratos naive. Como indicado pelo teste t de Student, os animais que
receberam este antidepressivo exibiram menor tempo de imobilidade do que o
grupo tratado com veículo (Figura 8; t=3,18, df=11, P<0,05) e maior tempo na
escalada (t=3,23, df=11, P<0,05). Não foram observados efeitos significativos
no tempo de natação entre os grupos.
*
Tempo (s)
150
Salina
Nortriptilina
100
*
50
0
Imobilidade
Escalada
Natação
Figura 8. Efeito do tratamento com nortriptilina 30 mg/kg, vo, em ratos naive submetidos ao
teste da natação forçada quanto aos tempos de: imobilidade, natação e escalada. As barras
representam a média ± SEM de 7-8 animais por grupo. *P<0,05 vs. salina (teste t de Student).
51
Prosseguiu-se este estudo, avaliando inicialmente os efeitos do
tratamento agudo e subcrônico com topiramato em ratos naive na ansiedade e
depressão experimental.
Como mostrado na figura 9, a análise dos resultados por ANOVA
seguido pelo teste post-hoc de Tukey indicou que o tratamento com topiramato
40 mg/kg causou aumento estatisticamente significativo no tempo gasto (Figura
9A; F(2,36)=5,43; P<0,05) e no número de entradas (Figura 9B; F(2,36)=4,26;
P<0,05) nos braços abertos do LCE, sugerindo um efeito do tipo ansiolítico
para dose de 40 mg/kg. Não foram observadas diferenças no número de
entradas nos braços fechados do LCE (Figura 9C; F(2,36)=1,07; P>0,05)
considerando nenhuma alteração da atividade locomotora confirmada pelos
parâmetros comportamentais do CA. Não foram observadas alterações no
comportamento dos animais tratados com topiramato 10 mg/kg em
comparação com os tratados com solução salina no teste do LCE.
*
200
150
100
50
0
Nº Entradas nos braços fechados
Tempo nos braços abertos (s)
250
Nº Entradas nos braços abertos
(B)
(A)
10
*
8
6
4
2
0
(C)
10
8
Salina
Top 10 mg/kg
Top 40 mg/kg
6
4
2
0
Figura 9. Efeito da administração aguda de topiramato (10 e 40 mg/kg, v.o.) em ratos naive
submetidos ao teste de LCE: tempo gasto nos braços abertos (A), entradas nos braços abertos
52
(B), e entradas nos braços fechados (C). As barras representam a média ± SEM de 10-14
animais por grupo. *P<0,05 (ANOVA, teste de Tukey).
A fim de avaliar o efeito de diferentes doses do topiramato sobre a
atividade locomotora espontânea dos animais, ratos tratados com topiramato
(10 e 40 mg/kg, v.o) foram expostos ao CA. ANOVA seguida pelo teste de
Tukey, não demonstrou qualquer alteração na distância total percorrida durante
15 minutos ou a cada bloco de 5 minutos de observação no CA. A
administração aguda (Figura 10A) e sub-crônico (Figura 10B) de topiramato (10
e 40 mg/kg, v.o.) não apresentou qualquer alteração significativa na distância
percorrida em comparação com o grupo que recebeu solução salina.
Tratamento agudo
20
15
10
5
0
Distância percorrida (m)
Distância percorrida (m)
10
5
0
Salina
Top 10 mg/kg
20
Top 40 mg/kg
15
10
5
0
(D)
(C)
15
0
Tratamento sub-crônico.
(B)
Distância percorrida acumulada (m)
Distância percorrida acumulada (m)
(A)
5
10
Tempo (min)
15
20
15
Salina
Top 10 mg/kg
Top 40 mg/kg
10
5
0
0
5
10
15
20
Tempo (min)
Figura 10. Efeito agudo (A, C) e sub-crônico (B, D) da administração de topiramato (10 e 40
mg/kg, v.o) em ratos naive no teste de campo aberto. Distância total percorrida durante 15
minutos (A, B) e a distância percorrida a cada 5 minutos (C, D). Os resultados são expressos
como média ± SEM de 8-14 animais por grupo (ANOVA, teste de Tukey).
Objetivando estudar o efeito das diferentes doses de topiramato na
depressão experimental, avaliando o tempo de imobilidade os ratos foram
submetidos ao teste da natação forçada. A análise por ANOVA seguido pelo
teste post-hoc de Tukey no teste de TNF indicou que o tratamento agudo com
topiramato 40 mg/kg, mas não a 10 mg/kg, reduziu significativamente o tempo
53
de imobilidade em comparação com o grupo tratado com solução salina (Figura
11A; F(2,19)=4,31; P<0,05). Estes dados sugerem um efeito do tipo
antidepressivo para a dose de 40 mg/kg de topiramato. Já o tratamento subcrônico com topiramato (10 e 40 mg/kg, vo) não produziu qualquer alteração no
tempo de imobilidade no TNF (Figura 11B; F(2,37)=0,46, P>0,05).
(B) Tratamento sub-crônico
Tratamento agudo
200
150
100
50
0
*
Tempo de imobilidade (s)
Tempo de imobilidade (s)
(A)
200
Salina
Top 10 mg/kg
Top 40 mg/kg
150
100
50
0
Figura 11. Efeito agudo (A) e sub-crônico (B) da administração de topiramato (10 e 40 mg/kg,
v.o) no teste da natação forçada. O parâmetro avaliado foi o tempo de imobilidade dos animais.
Os resultados estão representados média ± SEM de 7-8 animais por grupo. *P<0,05 (ANOVA,
teste de Tukey).
4.2. Padronização do protocolo de abstinência ao etanol
A partir de agora será investigado os comportamentos relacionados à
ansiedade, atividade locomotora, memória e depressão no protocolo de
abstinência ao etanol a curto e longo prazo em vários testes.
Visando investigar aos efeitos comportamentais dos ratos abstinentes
em curto prazo ao etanol, o teste t de Student indicou uma redução significativa
na exploração nos braços abertos no teste de LCE pelos animais abstinentes
ao etanol comparando com os que receberam solução salina. Ocorreu uma
diminuição significativa no percentual de tempo gasto (Figura 12A; t=2,68,
df=12, P<0,05) e no número de entradas nos braços abertos (Figura 12A;
t=2,59, df=12, P<0,05). Além disso, a abstinência ao etanol não afetou o
número de entradas nos braços fechados neste teste (Figura 12B; P>0,05).
54
(B)
50
40
30
20
*
10
0
Controle
Abstinente
Número de entrada nos braços
Tempo nos braços abertos (s)
(A)
Controle
12
Abstinente
10
8
6
4
*
2
0
Aberto
Fechado
Figura 12. Comportamento de ratos abstinentes ao etanol a curto prazo (72 h) submetidos ao
labirinto em cruz elevado. (A) tempo nos braços abertos e (B) número de entradas nos braços.
As barras representam a média ± SEM de 6–8 animais por grupo. *P<0.05 vs. grupo controle
(teste t de Student).
Como conclusão do experimento anterior, pode-se observar que os
animais
abstinentes
ao
etanol
(72h
após
a
retirada)
apresentaram
comportamento do tipo ansiogênico em comparação aos não abstinentes,
conforme demonstrado pela redução na exploração nos braços abertos do
LCE.
A atividade locomotora e coordenação motora de ratos abstinentes
foram avaliadas no CA e rota-rod. O teste t de Student não apresentou
qualquer alteração na distância percorrida acumulada durante 15 minutos de
observação em animais em abstinência ao etanol em curto e longo prazo
(Figura 13; P>0,05). Utilizando o teste do rota-rod, também não foram
detectadas
diferenças
estatísticas
na
coordenação
motora
dos
ratos
abstinentes ao etanol comparado ao grupo controle salina, sugerindo, assim,
não existir alterações motoras devido à retirada em curto e longo prazo do
etanol (Figura 14; p>0,05).
Distância percorrida acumulada (m)
55
30
Controle
Abstinente
25
20
15
10
5
0
5 Dia
19 Dia
Figura 13. Comportamento de ratos abstinentes a curto (5 dias) e longo prazo (19 dias) ao
etanol submetidos ao campo aberto. Distância percorrida acumulada durante 15 minutos. As
Tempo na barra de rotação (s)
barras representam a média ± SEM de 6-8 animais por grupo.
200
Controle
Abstinente
150
100
50
0
2
8
14
20
26
32
38
Velocidade (rpm)
Figura 14. Comportamento de ratos abstinentes a longo prazo submetidos ao teste do rota-rod.
Latência para a primeira queda na barra rotativa do rota-rod. Os dados representam médias ±
SEM de 6-8 animais por grupo.
A Figura 15 ilustra o impacto causado pela retirada do etanol no
desempenho dos ratos no teste de reconhecimento de objetos. Os ratos
controle apresentaram um aumento estatisticamente significante no índice de
reconhecimento na sessão de teste em comparação com a sessão de treino
(Figura
15;
t=3,55,
df=12,
P<0,05),
sugerindo
que
a
memória
de
reconhecimento foi adquirida durante esta tarefa. No entanto, para os ratos
abstinentes ao etanol, foi observado prejuízo significativo na evocação da
56
memória. De fato, na sessão de teste, o índice de reconhecimento de objetos
dos ratos abstinentes não diferiu estatisticamente dos valores alcançados
Indice de reconhecimento
durante a sessão de treino (Figura 15; t=0,57, df=12, P>0,05).
0.8
*
Treino
24 h
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Controle
Abstine nte
Figura 15. Efeitos da retirada a longo prazo do etanol sobre os índices de reconhecimento em
ratos abstinentes ou não ao etanol submetidos ao teste de reconhecimento de objetos. As
barras representam a média ± SEM de 6-8 animais por grupo. *P<0,05 vs. sessão de treino
(teste t de Student).
Visando investigar os efeitos comportamentais de ratos abstinentes ao
etanol no teste de natação forçada. O Teste t de Student indicou um efeito
significativo. De fato, os ratos abstinentes mostraram aumento do tempo de
imobilidade (Figura 16; t=6,17, df=12, P<0,05), e diminuição do tempo de
natação (Figura 16; t=2,46, df=12, P<0,05) em comparação com os controles.
Não houve diferença significativa no tempo de escalada entre ratos controle e
abstinentes (Figura 16; P>0,05). Em conjunto, estes dados sugerem que os
ratos abstinentes em longo prazo (23 dias da retirada) mostraram um
comportamento do tipo depressivo no TNF.
57
250
200
Tempo (s)
Controle
Abstinente
*
150
100
*
50
0
Escalada
Imobilidade
Natação
Figura 16. Comportamento de ratos abstinentes a longo prazo ao etanol submetidos ao teste
da natação forçada. Neste teste, os seguintes parâmetros comportamentais avaliados foram
tempo de imobilidade, de natação e de escalada. As barras representam a média ± SEM de 6-8
animais por grupo. *P<0,05 (teste t de Student).
4.3 Efeito comportamental do topiramato em animais abstinentes ao etanol
Os ratos abstinentes em curto prazo (72h após a retirada) exibiram
alterações significativas no teste de LCE, como observado na redução do
tempo gasto nos braços abertos (Figura 17A; ANOVA de duas vias, efeito da
abstinência ao etanol: F(1,37)=4,27, P=0,04; efeito da administração de
topiramato: F(1,37)=14,98, P=0,0004) e o número de entradas nos braços
abertos (Figura 17B; ANOVA de duas vias, efeito da abstinência ao etanol:
F(1,37)=4,43, P=0,04; efeito da administração de topiramato: F(1,37)=8,45;
P=0,006), sugerindo um comportamento do tipo ansiogênico.
O tratamento agudo com topiramato 40 mg/kg bloqueou os efeitos
ansiogênicos da retirada do etanol (Figura 17A). Vale ressaltar que o
topiramato 40 mg/kg por si só aumentou a exploração nos braços abertos do
aparato, sugerindo, assim, um efeito de tipo ansiolítico (Figura 17A) em animais
não abstinentes. Além disso, o tratamento agudo com topiramato não afetou o
número de entradas nos braços fechados do LCE em ratos abstêmios ou não
(Figura 17C).
58
Tratamento agudo
200
*
#
150
100
*
50
0
(C)
Nº Entradas nos braços abertos
(B)
250
Nº Entradas nos braços fechados
Tempo nos braços abertos (s)
(A)
Tratamento agudo
14
12
10
*
*
8
6
4
2
0
Tratamento agudo
14
12
10
8
H2O/Salina
H2O/Top 40 mg/kg
Etanol/Salina
Etanol/Top 40 mg/kg
6
4
2
0
Figura 17. Efeitos da administração aguda de topiramato (40 mg/kg, v.o.) em ratos abstinentes
ou não ao etanol submetidos ao teste do LCE: tempo gasto nos braços abertos (A), entradas
nos braços abertos (B) e entradas nos braços fechados (C). Os resultados são expressos como
média ± SEM de 10 animais por grupo. *P <0,05 vs. H2O/Salina, e #P <0,05 vs. Etanol/Salina
(ANOVA de duas vias, teste de Duncan).
Os ratos abstinentes em longo prazo não exibiram alterações
significativas no teste de LCE (Figuras 18A, 18B e 18C) em comparação com
os animais não abstinentes. No entanto, a administração crônica de topiramato
40 mg/kg provocou efeitos de tipo ansiolítico em ambos os grupos (Figura 18A;
ANOVA de duas vias, efeito da administração de topiramato: F(1,33)=6,47,
P=0,015; Figura 18B, ANOVA de duas vias, efeito da administração de
topiramato: F(1,33)=10,68; P=0,0025). Além disso, os ratos tratados subcronicamente com topiramato não exibiram alteração significativa no número
de entradas nos braços fechados do LCE (Figura 18C).
Tratamento sub-crônico
250
200
*
150
100
50
0
Nº Entradas nos braços fechados
Tempo nos braços abertos (s)
(A)
(C)
*
Nº Entradas nos braços abertos
59
(B)
Tratamento sub-crônico
14
12
10
*
*
8
6
4
2
0
Tratamento sub-crônico
14
12
10
8
H2O/Salina
H2O/Top 40 mg/kg
Etanol/Salina
Etanol/Top 40 mg/kg
6
4
2
0
Figura 18. Efeito da administração sub-crônica de topiramato (40 mg/kg, v.o.) em ratos
abstinentes ou não ao etanol submetidos ao teste do LCE: tempo gasto nos braços abertos (A),
entradas nos braços abertos (B) e entradas nos braços fechados (C). Os resultados são
expressos como média ± SEM de 10 animais por grupo. ⃰P <0,05 vs. H2O/Salina, e #P <0,05
vs. Etanol/Salina (ANOVA de duas vias, teste de Duncan).
No teste de CA, a ANOVA de duas vias revelou que os ratos abstinentes
em curto ou longo prazo não apresentaram diferenças significativas no
comportamento locomotor em comparação com os não abstinentes ao etanol
(Figura 19A e 19B). O tratamento agudo ou sub-crônico com topiramato 40
mg/kg não afetou significativamente a distância percorrida acumulada durante
os 15 minutos de observação (Figura 19A; tratamento agudo: F(1,33)=1,38;
P>0,05); Figura 19B; tratamento sub-crônico: F(1,33)=3,92; P>0,05).
(A)
Tratamento agudo
Distância percorrida acumulada (m)
Distância percorrida acumulada (m)
60
25
20
15
10
5
0
(B)
Tratamento sub-crônico
25
20
H2O/Salina
H2O/Top 40 mg/kg
Etanol/Salina
Etanol/Top 40 mg/kg
15
10
5
0
Figura 19. Efeito agudo (A) e sub-crônico (B) da administração de topiramato (40 mg/kg, v.o.)
em ratos abstinentes a curto e longo prazo ou não abstinentes ao etanol no teste de campo
aberto. Distância percorrida total durante 15 minutos de observação. Os resultados são
expressos como média ± SEM de 6-8 animais por grupo.
No teste da natação forçada, a ANOVA de duas vias mostrou um
comportamento tipo depressivo em ratos abstinentes em longo prazo (Figura
20; efeito da abstinência ao etanol: F(1,39)=4,09; P=0,04). Foi observado um
aumento significativo no tempo de imobilidade de ratos abstinentes em
comparação com os animais não abstinentes (Figura 20). É importante
ressaltar que o tratamento sub-crônico com topiramato não reverteu o
comportamento depressivo dos ratos em abstinência, nem produziu qualquer
Tempo de imobilidade (s)
alteração no tempo de imobilidade em ratos não abstinentes (Figura 20).
250
200
150
*
H2O/Salina
H2O/Top 40 mg/kg
Etanol/Salina
Etanol/Top 40 mg/kg
100
50
0
Figura 20. Efeito da administração sub-crônica de topiramato (40 mg/kg, v.o.) em ratos
abstinentes a longo prazo ou não abstinentes ao etanol no tempo de imobilidade no teste da
natação forçada. Os resultados são expressos como a média ± SEM de 10-11 animais por
grupo. *P <0,05 vs. H2O/Salina (ANOVA de duas vias, teste de Duncan).
61
6. DISCUSSÃO
Este estudo dedicou-se a investigar se o tratamento com topiramato altera
comportamentos relacionados à ansiedade, à depressão e à locomoção em
ratos naive e abstinentes ao etanol. A tese foi desenvolvida em três etapas: na
primeira, investigou-se os efeitos do tratamento agudo e sub-crônico com
topiramato em ratos naive sobre a ansiedade e depressão experimental.
Posteriormente, foi validado um protocolo de abstinência ao etanol a curto e
longo prazo, visando investigar os comportamentos relacionados à ansiedade,
atividade locomotora, memória e depressão. Na terceira etapa, investigou-se o
efeito da administração aguda e sub-crônica de topiramato no LCE, no CA e
teste da natação forçada em ratos abstinentes (em curto e longo prazo) ao
etanol.
Em síntese, o topiramato é um antiepiléptico que atua facilitando a
neurotransmissão GABAérgica (White et al., 2000), inibindo os canais de
cálcio, diminuindo a excitabilidade dos canais de sódio (Taverna et al., 1999) e
reduzindo a atividade do glutamato por indução de um efeito inibitório nos
receptores do tipo AMPA/cainato (Gryder e Rogawski, 2003). Considerando o
papel dos receptores GABAA na modulação dos estados de ansiedade (Mohler,
2012) e o potencial antidepressivo de antagonistas de receptores de glutamato
não metabotrópicos (Musazzi et al., 2013), o topiramato poderia apresentar
potencial efeito ansiolítico e antidepressivo.
Neste trabalho, pôde-se observar que a administração aguda de
topiramato produziu comportamento tipo ansiolítico no teste do LCE, de modo
semelhante ao descrito para o diazepam. E, quando tratados cronicamente
com topiramato (23 dias), os ratos ainda apresentaram um aumento da
exploração nos braços abertos no LCE, embasando, assim, um efeito do tipo
ansiolítico após a administração em curto e longo prazo em ratos naive.
O efeito do tipo ansiolítico do topiramato já foi evidenciado em estudos
utilizando roedores. De fato, Hargreaves e McGregor (2007) mostraram
redução significativa da ansiedade com o tratamento agudo de topiramato 20
mg/Kg em ratos no LCE e teste de emergência (teste que utiliza o mesmo
princípio da caixa claro-escuro). Khan e Liberzon (2004) descreveram que o
62
topiramato induz uma atenuação do sobressalto acústico em um modelo animal
de transtorno de estresse pós-traumático. Além disso, foi observado um
aumento significativo na exploração dos braços abertos no LCE em ratos
(Molina-Hernández et al., 2010; Molina-Hernández et al., 2013) e em
camundongos por Farook et al. (2007). Portanto o efeito do tipo ansiolítico
apresentado pelo topiramato nesta etapa está de acordo com a literatura.
É importante ressaltar que os dados mostraram que a administração
crônica de topiramato induz efeito do tipo ansiolítico de forma semelhante ao
que foi encontrado após administração aguda. Em relação aos efeitos subcrônicos do topiramato na ansiedade, os dados aqui apresentados são
pioneiros na pesquisa pré-clínica e reforçam o potencial ansiolítico após a
administração repetida com topiramato em ratos naive.
Considerando que a possível alteração na locomoção espontânea pode
enviesar a interpretação do comportamento dos ratos no LCE, os ratos foram
avaliados no teste de CA nas mesmas condições experimentais. A
administração aguda ou sub-crônica de topiramato não afetou a locomoção
espontânea dos ratos naive, em concordância com a literatura (Alaverdashvili
et al., 2005; Bourin et al., 2009; Molina et al., 2010)
Nesta mesma etapa, a administração aguda do topiramato 40 mg/Kg
aumentou o tempo de imobilidade no teste da natação forçada. Estes dados
sugerem que o topiramato induziu ações do tipo antidepressivas, semelhantes
à nortriptilina, um antidepressivo tricíclico. O efeito do tipo antidepressivo da
administração aguda do topiramato tem sido relatado na literatura para
roedores, nas mesmas doses aqui testadas. Hargreaves e McGregor (2007)
mostraram um comportamento do tipo antidepressivo significativo no teste de
da natação forçada em ratos machos tratados com topiramato 80 mg/Kg, de
modo semelhante, os efeitos antidepressivos também foram relatados por
Molina-Hermandez et al. (2010) em ratos tratados agudamente com topiramato
20 e 30 mg/kg no DRL-72. O DRL-72 é utilizado como um teste
comportamental sensível aos efeitos agudos de antidepressivos (Cryan et al.,
2002). Efeitos do tipo antidepressivo do topiramato agudo (16 e 32 mg/kg)
também foram descrito para ratos no teste de natação forçada (Bourin et al.,
2009).
63
No entanto, no presente estudo, o efeito do tipo antidepressivo do
topiramato em ratos naive desapareceu quando foi realizada a administração
sub-crônica desta droga por 21 dias. Considerando a literatura, efeitos distintos
foram relatados para tratamento sub-crônico com topiramato em roedores.
Semelhante ao encontrado no presente trabalho, foi reportado por MolinaHernandez et al. (2014), que o topiramato (10 mg/kg) não afetou o tempo de
imobilidade em ratas no teste de natação forçada, mesmo após 14 dias de
administração. Diferentemente, Nowakowska et al. (2009) não observaram
qualquer redução significativa do tempo de imobilidade após a administração
aguda de topiramato 15 mg/kg. Entretanto, este mesmo estudo, só foi possível
observar os efeitos antidepressivos do topiramato após 14 e 21 dias de
tratamento, enquanto que nenhuma ação foi observada após tratamento agudo
(Nowakowska et al., 2009).
Com base nos resultados atuais, a ausência de efeito antidepressivo após
administração sub-crônica de topiramato não parece ser devido à tolerância por
indução enzimática, uma vez que as ações ansiolíticas também foram
observadas
mesmo
nas
administrações
repetidas
deste
fármaco.
Possivelmente, a ausência de efeitos do tipo antidepressivo durante o
tratamento sub-crônico é mediada por mudanças adaptativas que ocorrem na
neurotransmissão central pela exposição repetida de topiramato.
Na segunda etapa deste trabalho, pôde-se observar que a abstinência ao
etanol em curto e longo prazo, após consumo forçado durante 21 dias, foi
consistentemente efetiva em induzir comportamentos semelhantes aos
observados em humanos abstinentes. De fato, 72h após a retirada, os ratos
exibiram comportamento ansiogênico, enquanto que déficits de memória e
comportamento do tipo depressivo ainda estavam presentes após longos
períodos de abstinência. Além disso, nenhuma alteração na atividade
espontânea e coordenação motora foram observadas em ratos abstinentes
submetidos ao protocolo aqui proposto quando comparados com animais
controles.
Estudos clínicos mostram que pacientes abstêmios ao etanol, exibem
sintomas de ansiedade após a retirada e que os sintomas diminuem, na
maioria dos casos, após quatro a cinco semanas sem o uso do etanol
(Wetterling e Junghanns, 2000; Driessen et al., 2001; Haynes et al., 2005). O
64
aumento da ansiedade na abstinência também é evidenciado em estudos préclínicos utilizando roedores tratados cronicamente com etanol e que, após um
curto período sem a droga, foram submetidos a diferentes modelos animais de
ansiedade, como os testes no LCE, caixa claro-escuro, de interação social, de
agressividade (Wilson et al., 1998; Gatch et al., 1999; Knapp et al., 2005;
Cabral et al., 2006; Overstreet et al., 2006; Zhang et al., 2007).
Nestes estudos, o consumo crônico de etanol foi realizado utilizando-se
diferentes protocolos experimentais, como por exemplo, administração de
vapor de ar em uma atmosfera controlada (Zhao et al., 2007) e inclusão de
etanol a uma dieta líquida como única fonte de alimentação (Wilson et al.,
1998; Gatch et al., 1999; Knapp et al., 2005; Cabral et al., 2006).
Fazendo um comparativo com outros estudos sobre os efeitos da retirada
do etanol na ansiedade, Kliethermes (2005), discrimina vários fatores
relevantes para a indução de um estado ansiogênico decorrente da retirada,
como: período de exposição ao etanol (de 4 até 42 dias), vias de administração
e até mesmo as linhagens de ratos (Wistar, Sprague-Dawley, Long-Evans,
Lister) empregados nos estudos. Nesta revisão, Kliethermes também destaca
estudos que observaram comportamentos do tipo ansiogênico no LCE após
curto período de retirada (6 a 12 h) e após longos períodos (por exemplo, 28
dias) (Valdez et al., 2002; Valdez et al., 2004).
Contudo, há testes em que períodos prolongados de exposição ao etanol
também apresentaram eficácia na indução de comportamentos relacionados à
ansiedade no LCE. Por exemplo, Pandey e colaboradores observaram
comportamentos relacionados à ansiedade 24h após a retirada do etanol – em
ratos cuja exposição à droga foi de 15 dias (Pandey et al., 1999; Pandey et al.,
2003). Utilizando concentrações de etanol semelhantes às utilizadas neste
estudo, Cabral et al.(2006) encontraram um aumento significativo da ansiedade
em ratos devido a retirada (48h) após a exposição crônica (21 dias).
Zhao e colaboradores (2011), em um estudo com administração diária de
etanol por 28 dias, também observaram um aumento significativo da ansiedade
em ratos após 72h de retirada. Isto posto, observa-se que os resultados
encontrados no modelo de retirada aqui proposto estão de acordo com a
literatura, e sugerem sinais de ansiedade evidenciados no LCE durante a
abstinência.
65
Os animais submetidos a 5 e 19 dias de abstinência ao etanol não
apresentaram qualquer alteração na distância percorrida acumulada durante 15
minutos de observação no CA. Simultaneamente, esses dados podem ser
fortalecidos pelo fato de que a abstinência ao etanol em curto prazo, também
não promoveu alterações na frequência de entradas nos braços fechados do
LCE (Figura 12).
Portanto, a ausência de alterações motoras devido à abstinência descarta
um possível viés na avaliação da ansiedade no LCE. Em concordância com os
achados apresentados neste trabalho, alguns estudos também encontraram
comportamento de ansiedade em ratos abstêmios, sem qualquer alteração na
atividade locomotora dos animais (Coleman et al., 2014; Guccione et al., 2013;
Kumar et al., 2013). Por outro lado, alguns estudos evidenciarem redução da
atividade locomotora em ratos abstinentes submetidos à administração crônica
de etanol (Kampov-Polevoy et al., 2000; Gatch et al., 2000; Jung et al., 2000).
Em relação à avaliação da coordenação motora em animais abstinentes,
também não foram detectadas diferenças estatísticas nos ratos abstinentes ao
etanol comparados aos controles, quando submetidos ao teste do rota-rod. Em
concordância, Oliveira et al. (2014) e Verleye et al. (2009) não encontraram
deficiência na coordenação motora em roedores no rota-rod 48 h após a
retirada do etanol. Estes achados sugerem que a retirada do etanol após
exposição crônica não afeta a coordenação motora dos animais.
Em relação à memória, neste estudo foi observada diminuição
significativa na memória de reconhecimento de objetos de ratos abstinentes
após exposição crônica ao etanol. Os ratos controle apresentaram um aumento
significativo no índice de reconhecimento de objetos na sessão de teste em
comparação com a sessão de treino, sugerindo que a memória de
reconhecimento foi adquirida durante esta tarefa. No entanto, para os ratos
abstinentes ao etanol, foi observado prejuízo na evocação desta memória, uma
vez que, na sessão de teste, o índice de reconhecimento de objetos dos ratos
abstinentes não diferiu da sessão de treino.
A memória é didaticamente dividida em aquisição, formação, conservação
e evocação de informações (Izquierdo et al., 2002). A aquisição representa a
aprendizagem, enquanto que a formação e a conservação estão relacionadas
com a memória de longa duração e imediata. A evocação, por outro lado, é a
66
recordação, a lembrança daquilo que foi aprendido anteriormente (Squire,
2004).
Com relação ao etanol, estudos mostram que há uma associação entre
processos neurodegenerativos e o consumo dessa droga, com ação direta
sobre os tecidos ou indireta sobre vários sistemas de neurotransmissores,
incluindo acetilcolina, dopamina, peptídios opióides e aminoácidos excitatórios
(Boehm et al., 2004) ou por meio da presença de metabólitos tóxicos,
estimulando a produção de espécies reativas de oxigênio, bem como redução
das
defesas
antioxidantes
(Das
e
Vasudervan,
2012),
gerando
comprometimento de algumas funções cerebrais (Reynolds et al., 2007).
Dessa forma, o consumo crônico de álcool está associado com um
aumento na incidência de degeneração do sistema nervoso central (Brooks,
2000). As consequências do álcool sobre o sistema nervoso central podem
ocorrer em qualquer nível do neuroeixo. Em dependentes crônicos, os danos
cerebrais são caracterizados pela atrofia cerebral ou no cerebelo, e
comprometimento da função neuronal no hipocampo e córtex frontal (Bleich et
al., 2003). Os etilistas apresentam deficiências cognitivas e motoras, déficits
colinérgicos e demência (Brooks, 2000; Harper e Matsumoto, 2005).
Déficits de memória têm sido observados em ratos abstinentes sujeitos a
distintas tarefas, tais como o labirinto aquático de Morris, labirinto de Barnes ou
teste de reconhecimento de objetos (Cagetti et al, 2004; Kuzmin et al, 2012;
Zhao et al, 2013). Estas alterações cognitivas possuem um paralelo com a
neurotoxicidade do etanol, gerando perda neuronal do hipocampo (Lukoyanov
et al., 2000; Cagetti et al., 2004; Zhao et al., 2013).
Além disso, o papel desempenhado pelo hipocampo no desempenho da
tarefa comportamental é amplamente discutido na literatura (Cohen e
Stackman, 2014). Esses achados reforçam a visão de que, possivelmente, um
dano no hipocampo resultante da exposição ao etanol poderia ser a base das
deficiências cognitivas apresentadas pelos ratos abstinentes no presente
trabalho.
Em relação aos efeitos comportamentais dos ratos abstinentes em longo
prazo ao etanol, animais em retirada apresentaram aumento do tempo de
imobilidade e diminuição do tempo de natação em comparação com os
controles quando submetidos ao teste de nado forçado. Estes dados sugerem
67
que os ratos abstinentes em longo prazo (23 dias da retirada) apresentam um
comportamento do tipo depressivo. Estes dados embasa o fato de que o
modelo aqui proposto de retirada do etanol é sensível para detectar os efeitos
em longo prazo da abstinência ao etanol.
O estado depressivo é encontrado repetidamente em proporções
elevadas entre os indivíduos que procuram tratamento com transtornos
relacionados ao álcool (Tomasson e Vaglum, 1995; Kessler et al., 1997). Os
sintomas do tipo depressivo induzidos pelo consumo crônico de etanol e sua
retirada têm sido observados em alguns estudos pré-clínicos utilizando ratos ou
camundongos tratados cronicamente com etanol (Burda-Malarz et al., 2014;
Pang et al., 2013; Briones e Woods, 2013; Smith e Lynch, 2012; Walker et al.,
2010).
De fato, o comportamento do tipo depressivo induzido pelo consumo
crônico de etanol e a sua retirada foram investigados em alguns estudos com
roedores submetidos a procedimentos diversos como: concentração de etanol,
tempo e modo de tratamento e período de abstinência.
Vale a pena ressaltar que reduções significativas no nível de BDNF
periférico em pacientes com dependência ao etanol diagnosticados com
depressão maior já foram observadas (Köhler et al 2013). Briones e Woods
(2013) em seu estudo relataram diminuição significativa dos níveis de proteína
BDNF, redução do volume do hipocampo e comportamento anedônico em
ratos que receberam tratamento crônico com etanol durante o período de
abstinência. Neste contexto, propõe-se que o comportamento do tipo
depressivo observado no presente estudo poderia estar em parte associado à
redução do hipocampo e diminuição do BNDF causado pela exposição crônica
ao etanol.
Na terceira etapa deste trabalho, investigou-se o efeito da administração
aguda e crônica de topiramato na ansiedade, depressão e locomoção em ratos
abstinentes (a curto e longo prazo) ao etanol. A administração aguda com
topiramato reverteu o comportamento de ansiedade dos animais abstinentes
em curto prazo. Da mesma forma, a administração sub-crônica de topiramato
produziu ações significativas do tipo ansiolítico mesmo em ratos abstinentes
em longo prazo.
68
Evidências clínicas apontam o efeito ansiolítico do topiramato na
abstinência ao etanol (Blodgett et al., 2014; Kranzler et al., 2014).Porém,
apenas um estudo pré-clínico relatou os potenciais efeitos ansiolíticos do
topiramato em animais abstinentes ao etanol. Cagetti et al. (2004) constatou
que o topiramato (10-20 mg/Kg) foi eficaz em aliviar alguns dos sintomas de
abstinência produzida em ratos em regime intermitente da exposição crônica
ao etanol no teste de LCE (Cagetti et al., 2004). Neste contexto, o topiramato
foi eficaz na redução da ansiedade em ratos abstinentes.
Além disso, neste trabalho, os ratos abstinentes a curto ou longo prazo
não apresentaram diferenças significativas no comportamento locomotor em
comparação com não abstinentes ao etanol. Esses dados podem ser
fortalecidos pelo fato de que a abstinência ao etanol também não promoveu
alterações na frequência de entradas nos braços fechados do LCE.
De acordo com a literatura, não há achados que apontam para ações
sedativas do topiramato nas doses testadas neste trabalho (Hargraeves e
McGregor, 2007; Molina-Hermandez et al., 2010; Molina-Hernandez et al.,
2014). Portanto, a ausência de alterações motoras, descarta um possível viés
na avaliação da ansiedade no LCE e do efeito ansiolítico do topiramato. Estas
observações são bastante relevantes para confirmar que o topiramato na
retirada do etanol apresentaram efeitos específicos sobre os comportamentos
de ansiedade em ratos.
Algumas especulações podem ser feitas a fim de sugerir um possível
mecanismo de ação pelo qual o topiramato induz os seus efeitos
comportamentais. O sistema GABAérgico está altamente relacionado com a
regulação de emoções, assim é possível que os efeitos ansiolíticos do
topiramato sejam mediados através da ativação da neurotransmissão
GABAérgica (White et al., 1997; White et al., 2000).
Embora não haja estudos disponíveis ligando o efeito antiglutamatérgico
do topiramato para suas ações ansiolíticas, um crescente corpo de evidências
(Bergink et al., 2004; Garakani et al., 2006; Vaquero-Lorenzo et al., 2008)
sugere que a neurotransmissão glutamatérgica pode estar envolvida nos
mecanismos biológicos subjacentes a resposta ao estresse e transtornos
relacionados à ansiedade. Neste ponto de vista, drogas com ação
antiglutamatérgica, tais como topiramato, poderiam ser candidatos promissores
69
para o tratamento da ansiedade (Riaza et al., 2012). Entretanto, investigações
adicionais
são
necessárias
para
compreender
se
o
bloqueio
da
neurotransmissão de glutamato contribui para os efeitos ansiolíticos do
topiramato.
Outro possível sistema envolvido nas ações do topiramato é o sistema do
neuropeptídeo Y (NPY). O NPY é um dos neuropeptídeos com maior
concentração no SNC, sendo co-armazenado com vários neurotransmissores
clássicos como noradrenalina e GABA, modulando também receptores
glutamatérgicos NMDA (Tollefson, 2000). Achados da literatura apontam para o
papel desempenhado pelo NPY na patogênese dos transtornos de humor e de
ansiedade (Eaton et al., 2007).
Evidências suportam um efeito ansiolítico (Serova et al., 2014; Serova et
al., 2013) e antidepressivo (Duman et al., 2014) do NPY. Concomitantemente,
outras pesquisas apoiam um papel para o NPY na mediação das ações
ansiolíticas e antidepressivas do topiramato. Hernandez-Molina et al. (2010)
mostraram um efeito sinérgico entre o topiramato e NPY em reduzir a
ansiedade e comportamentos relacionados com o humor. Husum et al. (2003)
sugeriram que o tratamento crônico com topiramato restaura para os níveis
normais a neurotransmissão NPYérgica de células imunorreativas no
hipocampo de ratos deprimidos.
De forma similar ao topiramato, um estudo farmacológico observou que o
tratamento crônico com drogas benzodiazepínicas induz aumento da
expressão do receptor Y1 na amígdala (Oberto et al., 2000). Em adição, as
principais projeções neuronais para o núcleo basolateral da amígdala são
glutamatérgicas, e, provavelmente, atuam sob controle da atividade inibitória do
NPY (Gutman, 2009).
Além disso, o NPY atua controlando a neurotransmissão de noradrenalina
e do CRF, reduzindo a excitabilidade em áreas do cérebro relacionadas com a
resposta ao estresse (Hastings et al., 2004; Heilig, 2004; Sah e Geracioti,
2012). Ainda, segundo Heilig (2004), o balanço entre CRF e NPY na amígdala
é determinante para os estados de ansiedade/medo de um animal. Além disso,
estudos sugerem que o NPY tem um significativo papel na resposta
neurobiológica ao etanol, incluindo o consumo, dependência e retirada
(Carvajal et al., 2006).
70
Em resumo, o tratamento sub-crônico com topiramato pode aumentar a
expressão do NPY, assim contribuindo para o alívio dos comportamentos
relacionados com a ansiedade em ratos naive e abstinentes.
Neste trabalho, pôde-se observar que os animais abstinentes em longo
prazo apresentaram comportamentos relacionados com a depressão, uma vez
que foi observado aumento do tempo de imobilidade no teste da natação
forçada em comparação com ratos não abstinentes.
No entanto, a administração em longo prazo de topiramato 40 mg/Kg não
foi capaz de reverter o comportamento do tipo depressivo de ratos abstinentes
etanol, da mesma forma como não induziu efeito do tipo antidepressivo em
ratos naive.
Vale ressaltar que não existem trabalhos pré-clínicos publicados no banco
de dados PUBMED (revisão realizada em junho 2015) sobre os efeitos do
topiramato no comportamento tipo depressivo em ratos abstinentes ao etanol.
Os estudos clínicos demonstraram que o topiramato pode atuar como
terapia adjuvante para o tratamento da dependência de etanol, uma vez que é
bem tolerado e eficaz na redução do desejo pelo consumo da droga, bem como
nos sintomas de depressão e a ansiedade presentes durante a fase da retirada
(Johnson et al., 2004; Paparrigopoulos et al., 2011).
Um relevante número de pesquisas também tem evidenciado o uso do
topiramato como terapêutica adjuvante para transtorno bipolar resistente ao
tratamento como os medicamentos: lítio, carbamazepina, bupropiona ou
valproato (Vieta et al. 2000; McIntyre et al., 2000; Vieta et al., 2003; Lykouras e
Hatzimanolis, 2004; Roy et al., 2006). Em todas essas pesquisas o topiramato
demonstrou resultados promissores. Apenas um estudo com a depressão
maior foi realizado de forma que o topiramato também foi promissor como
adjuvante no tratamento da depressão quando associado a fluoxetina,
citalopram ou sertralina (Mowla e Kardeh et al., 2011).
Um único estudo clínico vem mostrando efeito antidepressivo para
topiramato. Nickel et al. (2005) realizou um estudo, randomizado, duplo-cego,
controlado com placebo, tratamento com topiramato durante 10 semanas, com
64 indivíduos do sexo feminino a partir da população em geral, que
preencheram os critérios para transtorno depressivo maior.
71
O estudo demonstrou que o topiramato foi eficaz na redução dos
sintomas depressivos e na melhoria da qualidade de vida em mulheres
depressivas. No presente estudo, o efeito do topiramato foi testado em ratos
machos, o que poderia explicar a ausência de efeito antidepressivo após o
tratamento crônico.
No entanto, a pouca informação proveniente de estudos clínicos com o
topiramato na depressão maior limita afirmar que a ausência de efeito
antidepressivo decorrente do tratamento sub-crônico pode ser cogitada como
um efeito falso-negativo. Outra possibilidade que visa explicar a ausência do
efeito do topiramato crônico também pode ser explicada pelo fato deste
fármaco ter sido testado sozinho e não como adjuvante, como a maioria das
pesquisas clínicas tem relatado.
Vale ressaltar que o teste da natação forçada é amplamente utilizado para
prever a atividade antidepressiva de drogas em humanos. O tempo de
imobilidade
dos
roedores
neste
teste é
reduzido
pela
maioria
dos
antidepressivos tricíclicos e incluindo antidepressivos atípicos, inibidores da
MAO e inibidores da recaptação de 5-HT (Porsolt et al., 1977; Bourin et al.,
1991) e a sua eficácia está correlacionada de forma significativa com seu
potencial na clínica (Willner, 1984). No entanto, este modelo animal também
tem algumas limitações representadas pela possibilidade de obter resultados
falsos positivos ou negativos (Borsini e Meli, 1988; Detke e Lucki, 1996).
Nguyen et al. (2014) relataram que tratamento agudo com um antihistamínico dextrometorfano diminuiu a duração de imobilidade no teste da
natação forçada,
mas que este efeito desapareceu após a administração
crônica. Baseado no efeito tipo antidepressivo para o topiramato encontrado
nos animais naive, sugere-se então que o efeito encontrado possa ter sido um
falso positivo, que desaparece com o tratamento crônico assim como ocorre
com o anti-histamínico (Nguyen et al., 2014). Portanto, é pouco provável que a
redução induzida por topiramato agudo no tempo de imobilidade de ratos seja
de fato devido à ação antidepressiva. Neste contexto, seria de relevância
avaliar os efeitos do topiramato em um modelo de depressão mais bem
validado, como é o desamparo aprendido já que o mesmo responde para uma
vasta gama de tratamentos clinicamente eficazes e esse modelo apresenta
uma ampla seletividade, em que somente fármacos com características
72
antidepressivas conseguem restabelecer o déficit no comportamento de escape
(Pryce et al., 2011). A ausência de efeito antidepressivo decorrente do
tratamento crônico com topiramato também pode ser cogitada como sendo um
efeito falso positivo do teste.
73
7. CONCLUSÃO
Em conclusão, o modelo experimental proposto para as nossas condições
experimentais, de retirada do etanol foi sensível para investigar os efeitos da
abstinência ao etanol em curto e longo prazo. Este modelo baseia-se no
consumo forçado de etanol adicionado à água potável durante 21 dias. Após 72
horas de abstinência ao etanol, ocorre o aumento da ansiedade, sem afetar a
locomoção. Além disso, déficit de memória e comportamento do tipo
depressivo foi observado em ratos abstinentes em longo prazo. Ao todo, o
modelo proposto reproduz em ratos abstinentes os sintomas mais prevalentes
e relevantes que foram observados na clínica. Além de que, este modelo serve
como uma ferramenta para a investigação do efeito do topiramato no
tratamento de sintomas da abstinência ao etanol.
O topiramato induz um efeito ansiolítico após a administração aguda e
crônica em ratos naive e abstinentes ao etanol, estando de acordo com os
achados clínicos. Também foi visto que, a administração aguda do topiramato
provoca efeitos antidepressivos em ratos naive, porém ele se dissipa após
tratamento crônico. Além disso, o topiramato não foi bem sucedido em aliviar o
comportamento tipo depressivo de ratos em abstinência ao etanol. Tomados
em conjunto, os resultados desta pesquisa oferecem evidências adicionais, a
partir de uma abordagem pré-clínica, de que o topiramato parece ser uma
opção terapêutica interessante para o tratamento da ansiedade, inclusive
àquela provocada pela retirada do etanol.
74
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100
APÊNDICE
LISTA DE TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS
1- Junqueira-Ayres, D.D.; Dore, C.M.P.G.; Leite, E.L.; Soares-Rachetti,
V.P.; Gavioli, E.C.. Avaliação dos efeitos do tratamento agudo e crônico
com topiramato em ratos submetidos aos testes do labirinto em cruz
elevado e natação forçada. XXXVII Congresso Anual da SBNeC, 2013,
Belo Horizonte.
2- Junqueira-Ayres, D.D.; Soares-Rachetti, V.P.; Gavioli, E.C. Effects of
topiramate on anxiety related behaviors in ethanol abstinent rats. 46º
Brazilian Congress of Pharmacology and Experimental Therapeutics SBFTE, 2014, Fortaleza.
3- Junqueira-Ayres, D.D.; Soares-Rachetti, V.P.; Gavioli, E.C.. Effects of
topiramate on anxiety related behaviors in alcohol abstinent rats. 9º
World Congress of the International Brain Research Organization –
IBRO, 2015, Rio de Janeiro, Brazil.
LISTA DE ARTIGOS SUBMETIDOS À PUBLICAÇÃO
1- Junqueira-Ayres, DD; Silveira, MA; Pinto, IAS; André, E; Tirapelli, CR;
Padovan, CM; Gavioli, EC; Soares-Rachetti, VP.. Topiramate reduces
anxiety in naïve and in early and protracted ethanol abstinent rats.
Behavioural pharmacology: submitted, 2015.
2- Junqueira-Ayres, DD; Ayres, ASFSJ; Lobão-Soares, B; Soares-Rachetti,
VP; Gavioli, EC.. Behavioral effects of short and long-term ethanol
withdrawal in wistar rats. Journal of psychopharmacology: submitted,
2015.