Meiose - Citogenética

Laboratório de Citogenética e Diversidade Vegetal
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Obtenção de fases da Meiose em plantas
Antes de preparar as lâminas, é importante entender como as flores e inflorescências estão
organizadas. Quando há muito tecido cobrindo as anteras, maior será a dificuldade de uma boa
fixação das células alvo (meiócitos) no saco polínico, já que o fixador terá que atravessar muitas
barreiras até alcançar os meiócitos. Assim, é fundamental dissecar as flores. O melhor é fixar
somente as anteras, mas para muitas espécies isso é difícil por conta da textura das flores e do
tamanho das anteras. Normalmente, botões florais coletados e fixados sem uma dissecção prévia
não rendem preparações perfeitas. Sempre haverá citoplasma corado mais densamente e
cromossomos meióticos amontoados.
A renovação do fixador uma hora após a primeira fixação, a constante agitação da solução e um
volume de fixador 10 vezes maior que o de tecido, poderá ajudar bastante a melhorar a qualidade
das amostras. A solução de etanol: ácido acético (3:1, v:v) funciona muito bem, desde que seja
preparado momentos antes do uso. A vantagem desta fixação é que as amostras poderão ser
usadas para preparações convencionais (qualquer uma), bandeamento cromossômico,
hibridização in situ e imunolocalização com anti-5-metilcitosina.
Para acertar o tamanho das anteras, você pode dissecar 10 botões florais de tamanhos diferentes,
colocá-los em uma lâmina com uma gota de ácido acético de 45 a 60%, organizados do menor
para o maior. Faça um corte nas anteras, uma de cada vez, e cheque a fase da meiose de cada
uma das anteras, usando um microscópio convencional com o condensador abaixado. Estabeleça
uma relação tamanho-fase e passe a fixar somente as anteras naquele trecho de tamanho préselecionado. Se as anteras forem fixadas diretamente, uma hora de fixação é o suficiente para a
obtenção de boas células. Caso contrário, as anteras podem permanecer até 24 horas à
temperatura ambiente e depois estocadas em freezer por tempo indeterminado.
Preparo das lâminas
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lave as anteras em água destilada. Pelo menos três lavagens de cinco minutos cada;
hidrolise em HCl 1M a 60 graus por 5 a 8 minutos;
transfira as anteras para água destilada;
deixe as anteras em ácido acético 45 a 60% por 10 minutos;
disseque as anteras em uma gota de ácido acético 45 a 60%;
cuide para a expulsar os meiócitos em uma gota pequena, para não perder células quando
cobrir com lamínula;
cubra com lamínula e faça uma leve pressão usando um papel de filtro;
remova a lamínula usando após congelamento em nitrogênio líquido;
deixe a lâmina secar e core com Giemsa 2%;
monitore a coloração observado-a em microscópio após o primeiro minuto;
lave a lâmina com um jato leve de água, seque e monte-a permanente.