de dissertação em pdf - Pós

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISA GONÇALO MONIZ
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODOS PARA ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE ÓRGÃO
ESPECÍFICA DO BAÇO DE CÃES: UMA CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DA
LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
SILVANA ORNELAS SANTOS
Salvador – Bahia
2008
SILVANA ORNELAS SANTOS
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODOS PARA ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE ÓRGÃO
ESPECÍFICA DO BAÇO DE CÃES: UMA CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DA
LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
Dissertação apresentada a Escola de Medicina
Veterinária da Universidade Federal da Bahia como
requisito para a obtenção do título de Mestre em
medicina Veterinária Tropical, na área de Saúde
animal.
Orientadora: Profa. Dra. Stella Maria Barrouin Melo
Salvador – Bahia
2008
FICHA CATALOGRÁFICA
ELABORADA PELA BIBLIOTECA DE EMEV - UFBA
Santos, Silvana Ornelas
Padronização de métodos para análise da resposta imune órgão específica do baço
de cães: uma contribuição ao estudo da leishmaniose visceral canina/ Silvana
Ornelas Santos – 2008. 112 f.
Orientadora: Pra. Dra. Stella Maria Barrouin Melo
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina
Veterinária.
1. leishmaniose visceral 2. Leishmania chagasi 3. Cão
4. baço 5. cell blokk 6. citometria de fluxo
PADRONIZAÇÃO DE MÉTODOS PARA ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE ÓRGÃO
ESPECÍFICA DO BAÇO DE CÃES: UMA CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DA
LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
SILVANA ORNELAS SANTOS
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária
Tropical
Salvador, 28 de julho de 2008
Comissão Examinadora:
___________________________________________________
Profª. Dra. Stella Maria Barrouin Melo
Orientadora
____________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Delfin Chávez Olórtegui
_____________________________________________________
Profª. Dra. Fernanda Washington de Mendonça Lima
Dedico este trabalho a minha família, em especial a
meus pais Sandoval Pereira Santos e Silvia Mary
Ornellas Santos, e a meus irmãos Sandoval e
Sidnei a quem amo incondicionalmente e devo toda
a minha formação. Agradeço pelo imenso amor,
compreensão e estímulo, sem os quais não seria
possível superar as dificuldades e alcançar meus
objetivos.
AGRADECIMENTOS
A Deus que em sua grandeza me concedeu a vida e a oportunidade de evoluir como ser humano,
iluminando meu caminho durante toda a minha trajetória, permitindo a concretização de mais um
sonho.
A meu Mestre Prof. Dr. Washington Luis Conrado dos Santos, que com muita competência e
conhecimento, me mostrou o quão é importante e interessante o desenvolvimento da ciência.
Agradeço toda sua atenção, dedicação e apoio.
A Dra. Stella Maria Barrouin Melo, minha orientadora, pela oportunidade de evoluir
profissional e intelectualmente. Agradeço pelo incentivo, confiança e exemplo de determinação.
A Dr. José Vassallo, Dr. Eduardo Ramos, Dr. Geraldo Gileno e Dr. Lain Pontes de
Carvalho pelas colaborações e sugestões efetivas durante a realização deste trabalho.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia pelo apoio financeiro através da
concessão da bolsa de Mestrado e auxílio dissertação.
Ao Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz (CPqGM/FIOCRUZ-BA), e Laboratório de
Infectologia Veterinária (LIVE/EMEV-UFBA), onde este trabalho foi realizado, pela
disponibilização de recursos e infra-estrutura.
Aos amigos do LIVE, em especial a Bárbara, Adriano, Maíra, Jamille, Zoraida, Sabinne e
Fred pela ajuda no desenvolvimento deste trabalho e pelo ombro amigo sempre disponível.
Aos amigos do LPBI, em especial a Claudia, Micely, Joselli, Leina, Daniela, Virgínia, Tiago,
Cristiane e Lívia pela colaboração e por tornarem meio trabalho no laboratório mais agradável e
estimulante.
Bom mesmo é ir à luta com determinação,
abraçar a vida com paixão,
perder com classe
e vencer com ousadia,
porque o mundo pertence a quem se atreve
e a vida é "muito" pra ser insignificante.
Charles Chaplin
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
10
LISTA DE FIGURAS
11
LISTA DE GRÁFICOS
12
LISTA DE ABREVEATURAS
13
RESUMO
14
ABSTRACT
15
1. INTRODUÇÃO
16
2. JUSTIFICATIVA
18
3. OBJETIVOS
20
3.1. OBJETIVO GERAL
20
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
20
4. REVISÃO DE LITERATURA
21
4.1. Leishmaniose visceral: uma doença mundialmente distribuída
21
4.2. O agente etiológico da leishmaniose visceral canina no Brasil:
22
a Leishmania chagasi
4.3. A leishmaniose canina e as tentativas de controle da zoonose no Brasil
23
4.4. Fisiopatologia da leishmaniose visceral no cão
25
4.5. A resposta imunológica do cão à infecção por L. chagasi
27
4.6. A resposta imune órgão-específica do baço na leishmaniose visceral
29
canina
4.7. Métodos para avaliação da resposta imune esplênica do cão: um campo a 32
ser desenvolvido
5. ABORDAGEM EXPERIMENTAL
34
5.1. População canina estudada e aspectos éticos
35
5.2. Avaliação clínica dos animais
36
5.3. OBTENÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS
36
5.3.1. Sangue periférico
36
5.3.2. Aspirado esplênico
36
5.4. TÉCNICAS UTILIZADAS
37
5.4.1. Imunodiagnóstico – ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti- 37
Leishmania
5.4.2. Cultivo de aspirados de baço em meio bifásico para diagnóstico de
37
Leishmania
5.4.3. Padronização do cell block para avaliação estrutural e fenotípica de
38
amostras esplênicas
5.4.4. Ensaio de imunohistoquímica para avaliação das amostras de cell
39
block
5.4.5. Padronização da citometria de fluxo para avaliação de aspirado
40
esplênico de cães
5.5. ESTUDO ESTATÍSTICO
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Cell block
42
43
43
6.1.2. Cell block com agarose a 1%
46
6.1.3. Cell block com leucócitos purificados a partir de aspirado esplênico
47
6.1.4. Imunohistoquímica em lâminas de cell block
48
6.2 Padronização da citometria de fluxo com AcMo em aspirados esplênicos
50
de cão
7. DISCUSSÃO
55
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
63
9. PERSPECTIVAS
64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
65
APÊNDICE 1 – Manuscrito I
77
APÊNDICE 2 - Manuscrito II
101
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análise qualitativa quanto à representatividade e estruturas presentes nas amostras de
aspirado esplênico de cães sadios (não infectados por Leishmania) e infectados através da técnica
de cell block._________________________________________________________________46
Tabela 2. Análise qualitativa quanto à representatividade e estruturas presentes nas amostras de
aspirado esplênico de cães sadios (não infectados por Leishmania) e infectados através da técnica
de cell block com preparo de células mononucleares.__________________________________48
Tabela 3. Percentagem das populações celulares presentes nas amostras de sangue periférico de
cães com leishmaniose e cães sadios, através da técnica de citometria de fluxo, amostras
controles.____________________________________________________________________50
Tabela 4. Percentagem das populações celulares presentes nas amostras de aspirado esplênico de
cães com leishmaniose e cães sadios, através da técnica de citometria de fluxo, utilizando
tratamento enzimático com colagenasi dispasi (1 mg/mL)._____________________________51
Tabela 5. Percentagem das populações celulares presentes nas amostras de sangue periférico de
cães com leishmaniose e cães sadios, através da técnica de citometria de fluxo._____________51
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Preparação citocentrifugada de aspirado esplênico de cão, coradas por HE (Arquivo de
lâminas do LPBI/CPqGM/FIOCRUZ) _____________________________________________34
Figura 2. Histologia de aspirado esplênico, processadas pelo cell block, corados com HE material esplênico e sanguíneo.__________________________________________________ 44
Figura 3. Histologia de aspirado esplênico, processadas pelo cell block, corados com HE - polpa
vermelha (A) e polpa branca (B)._________________________________________________ 44
Figura 4. Histologia de aspirado esplênico, processadas pelo cell block, corados com: HE arteríola peniciliar (A), arteríola comum (B); PASM – Fibras reticulares (C); PAS – fibras
reticulares e celularidades a ela ligadas (D)._________________________________________45
Figura 5: Populações celulares esplênicas através do cell block, coradas com HE - linfócitos e
macrófagos (A), plasmócitos e polimorfonucleares (B), megacariócito (C) e Leishmanias –
amastigotas (D)._______________________________________________________________45
Figura 6: Avaliação semi-quantitativa das populações celulares esplênicas através do cell block.
Os valores apresentados são os resultados das médias dos escores.______________________ 45
Figura 7: Imunoistoquímica em amostras de aspirado esplênico, processadas pelo cell block,
marcadas com: CD3 (A), KI76 (B), S100 (C), CD79α (D), CD45RA (E)._________________49
Figura 8: Amostras de aspirado esplênico incluídas em gel de agarose 1%.________________57
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Aquisição e análise dos dados de células do sangue periférico não tratadas (a);
tratadas com colagenase dispasi 1mg/mL + albumina bovina10 mg/mL (b); tratadas com
colagenase dispasi 1mg/mL + 10% de leite em pó desnatado (c); tratadas com colagenase dispasi
1mg/mL (d), com marcação para AB6, CD4 e CD8.__________________________________53
Gráfico 2. Aquisição e análise dos dados de células do sangue periférico não tratadas (a);
tratadas com colagenase dispasi 1mg/mL + 10% de leite em pó desnatado (b); células de aspirado
esplênico tratadas com colagenase dispasi 1mg/mL + 10% de leite em pó desnatado (c), com
marcação para AB6, CD4 e CD8._________________________________________________54
LISTA DE ABREVEATURAS
AIDS
Síndrome da imunodeficiência adquirida
BSA
Soro albumina bovina
CCZs
Centros de Controle de Coonoses
EDTA
Ethylenediamine Tetraacetic Acid -Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA
Ensaio imunoenzimatico
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorter
FITC
Fluorescein isothiocyanate
HBSS
Hank's Buffered Salt Solution
HE
Hematoxilina-Eosina
IgG
Imunoglobulina G
IL
Interleucina
IFN
Interferon
LV
leishmaniose visceral
LVC
L. brasiliensis
leishmaniose visceral canina
Leishmania brasiliensis
L. tropica
Leishmania tropica
L. donovani
Leishmania donovani
L. chagasi
Leishmania chagasi
L. infantum
LPBI/CPqGMFiocruz
Leishmania infantum
Laboratório de Patologia e Bio-Intervenção/Centro de Pesquisas Golçalo
Moniz – Fundação Oswaldo Cruz
OMS
Organização Mundial de Saúde
OPD
Orthophenylene-diamine
PAS
Ácido Periódico de Schiff
PAMS
Ácido Periódico Prata Metenamin
PBS
Phosphate buffered saline – Tampão fosfato salino
PBS-T
Phosphate buffered saline + Tween 20
3Rs
Reduction, Refinement e Replacement
SFB
Soro fetal bovino
SPSS
STATISTICAL PACK SOCIAL SCIENCE
TGF
Fator de crescimento tumoral
Th1
“Linfócitos T auxiliares tipo 1”
TNF
Fator de necrose tumoral
RESUMO
SANTOS SO. Padronização de métodos para análise da resposta imune órgão específica do
baço de cães: uma contribuição ao estudo da leishmaniose visceral canina. Salvador-Bahia,
2008 115f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Tropical) Escola de Medicina
Veterinária –UFBA.
Nesta dissertação, apresentamos dados fenotípicos de esplenócitos de cães, obtidos por biópsia
aspirativa com agulha fina, avaliados comparativamente pelas técnicas de cell block e citometria
de fluxo (FACS). O objetivo do presente estudo foi comparar técnicas de imunofenotipagem,
padronizadas para o estudo da resposta imune in situ em amostras de baço obtidas no cão vivo,
visando a identificação de métodos adequados ao monitoramento da resposta imune canina em
estudos experimentais e no diagnóstico da LV canina. Foram estudados 16 cães na padronização
da citometria de fluxo, sendo 12 soronegativos para anticorpos anti-Leishmania e quatro
soropositivos, dos quais nenhum apresentou cultura positiva. Na padronização da técnica de cell
block, 59 cães foram estudados, sendo 22 soronegativos e 37 soropositivos, dos quais 13
apresentaram cultura positiva. Os animais estudados foram provenientes de Salvador e região
metropolitana, e no município de Jequié. Os cães foram sedados para obtenção das amostras de
baço por biópsia aspirativa. Para a padronização da técnica de cell block, os aspirados esplênicos
foram conservados em formalina e submetidos a três diferentes processamentos: (1) inclusão
direta em parafina, (2) inclusão em agarose a 1% e posteriormente em parafina, e (3) lise de
eritrócitos e inclusão em parafina. Cortes seriados de 5-8 μM foram corados pelas técnicas HE,
PAS e PASM, e analisados em microscópio óptico para verificação das estruturas esplênicas e
células características do tecido esplênico. Segundo os parâmetros de representatividade das
amostras, a inclusão direta em parafina mostrou ser melhor que os demais processamentos.
Foram identificadas estruturas como, polpa vermelha, polpa branca, vasos, trabéculas e as células
como, linfócitos, macrófagos, plasmócitos, polimorfonucleares e megacariócitos. Foi observado
um predomínio de plasmócitos (p < 0,0302) nas amostras dos cães infectados e de linfócitos (p =
0,0167) nas amostras dos sadios. Em quatro amostras dos animais com cultura positiva, foi
verificada a presença de amastigotas de Leishmania. Para a padronização da avaliação dos
esplenócitos por citometria de fluxo, amostras de sangue periférico e aspirado de baço foram
adicionadas em meio RPMI heparinizado e submetidas à lise de eritrócitos. As amostras de baço
foram submetidas a três tipos de tratamento enzimático com colagenase dispasi (1 mg/mL), para
dissociação do parênquima esplênico e purificação dos leucócitos: (1) colagenase a 1 mg/mL em
HBSS, (2) colagenase a 1 mg/mL em HBSS contendo albumina bovina a 1mg/mL, e (3)
colagenase a 1 mg/mL em HBSS com 10% de leite em pó desnatado. Para a identificação
imunofenotípica por FACS, foram utilizados os anticorpos monoclonais anti-CD4, anti-CD8 e
AB6. O tratamento que incluiu leite desnatado foi o que permitiu a melhor identificação das
diferentes populações celulares esplênicas. Foi possível concluir que a técnica de cell block
aplicada em amostras obtidas por punção esplênica, mostrou-se útil para a avaliação estrutural e
qualitativa das células, sendo promissora como ferramenta para o diagnóstico e monitoramento
das alterações esplênicas dos cães, enquanto que a citometria de fluxo possibilita dados
quantitativos, ambas com uso potencial na clínica e estudos experimentais visando à
compreensão de mecanismos importantes na imunopatologia da infecção canina por Leishmania.
Palavras chave: leishmaniose visceral; Leishmania chagasi; cão; baço; cell block; citometria de
fluxo.
ABSTRACT
SANTOS SO. Standardization of a method for the analysis of organ-specific immune
response of spleen in dogs: a contribution to the study of canine visceral leishmaniosis.
Salvador-Bahia, 2008 115f. Dissertation (Masters in Tropical Vetrinary Medicine) Medical
Veterinary Scholl- UFBA.
In this study, we presented phenotypic data of dogs’ splenocytes, obtained by aspirative biopsies
with a thin needle, comparatively evaluated by cell block techniques and flow cytometry (FACS).
The aim of the present study was the comparison of the standardize immunophenotyping for the
study of the immune response in situ in spleen samples of alive dogs, aiming to identify suitable
methods for the tracking of the canine immune response in experimental studies and in the
canine VL diagnosis. Sixteen dogs were studied in the cytometry standardizing, 2, among them,
were serum negative to anti-Leishmania antibodies and four were serum positive, in which there
was not any positive culture. In the standardizing of the cell block technique, 59 dogs were
studied, 22, among them, were serum negative and 37, serum positive, in which 13 presented
positive culture. The studied animals were from Salvador and metropolitan area and from Jequié
district. The dogs were sedated for the obtainment of spleen samples by aspirative biopsies. For
the standardizing of the cell block technique, the splenic aspirates were conserved in formalin and
submitted to three different procedures: (1) direct paraffin inclusion, (2) inclusion in agarosis gel
at 1% and lately in paraffin and (3) lyses of the erythrocytes and paraffin inclusion. Serial cuts of
5-8 μM were stained through HE, PAS and PASM techniques and analyzed in opticalal
microscope for the verification of splenic structures and characteristic cells of the splenic tissue.
According to the representativity parameters of the samples, the direct inclusion in paraffin
showed better results than the other procedures. There were identified structures as, red pulp,
white pulp, vessels, trabeculus, and cells like, lymphocytes, macrophages, plasmocytes,
polymorphonuclears and megakaryocytes. It was observed a predominance of plasmocytes (p <
0, 0302) in infected dogs’ samples and of lymphocytes (p = 0,0167) in healthy dogs’ samples. In
four of the samples, which belonged to animals that presented positive cultive, it was verified the
presence of Leishmania amastigotes. For the standardizing of the splenocytes evaluation by flow
citometry, peripheral blood samples and spleen aspirate were added in a heparinized RPMI mean
and submitted to erythrocytes lyses. The spleen samples were submitted to three kinds of
enzymatic treatment with colagenase dispasi (1 mg/mL), for the dissociation of the splenic
parenquime and leucocytes purification: (1) 1 mg/mL colagenase in HBSS, (2) 1 mg/mL
colagenase in HBSS containing 1 mg/mL bovine albumine and, (3) 1 mg/mL colagenase in
HBSS with 10% of skimmed powder milk. For the immunophenotypic identification using
FACS, anti-CD4, anti-CD8 e AB6 monoclonal antibodies were used. The treatment which
included skimmed powder milk was the one that allowed the best identification of different
splenic cell population. It was possible to conclude that the cell block technique applied in splenic
samples obtained by splenic puncture, showed to be useful for cells structural and qualitative
evaluation, being a promising tool for the diagnosis and tracking of splenic alterations in dogs,
meanwhile the flow cytometry allows quantitative data, both having potential use in clinic and in
experimental studies aiming the comprehension of important mechanisms of the
immunopathology of the canine infection by Leishmania.
Key Words: visceral Leishmaniasis; Leishmania Chagasi; dog; spleen; cell block; flow
cytometry.
16
1. INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública nos países tropicais e
mediterrâneo. No Brasil, mais de 90% dos casos notificados ocorrem nos estados da Bahia,
Ceará, Maranhão e Piauí (BRASIL, 2003). No ambiente doméstico, o cão é o principal
reservatório do parasito, podendo a prevalência da LV atingir de 20% a 40% da população canina
em áreas endêmicas (IKEDA et al. 2003). A leishmaniose apresenta manifestações clínicas que
variam desde lesões cutâneas, com tendência à cura espontânea, até graves manifestações
sistêmicas, quase sempre fatais na ausência de tratamento, podendo também provocar surtos
epidêmicos com elevadas taxas de morbi-mortalidade (ALVES et al., 1998; BRASIL, 2003).
Estes dados indicam a necessidade de maiores pesquisas na busca de mecanismos para o
controle da doença. Estudos sobre a imunofenotipagem de esplenócitos de cão poderão contribuir
para um progresso substancial na compreensão de eventos imunológicos que ocorrem em órgãosalvo envolvidos na resposta imune protetora ou lesiva ao hospedeiro, sendo o baço um dos sítios
mais importantes de crescimento parasitário e de modificações fisiopatológicas induzidas pelas
cepas viscerotrópicas de Leishmania (NATAMI et al., 2000; BLAVIER et al., 2001; TAFURI et
al., 2001).
Visto que o conhecimento sobre a evolução da leishmaniose visceral nos cães e a sua
resposta imune ao parasito serão úteis no aprimoramento das medidas de controle, como o
desenvolvimento de vacinas e/ou de imunoterápicos, e monitoramento da doença.
A maioria das análises citológicas do baço de cão tem sido realizada através da utilização
de fragmentos esplênicos obtidos pos-mortem, auxiliada por técnicas de coloração convencional,
imunohistoquímica, imunofluorêscencia e citometria de fluxo. Apenas recentemente amostras de
aspirado esplênico obtidas in vivo, vêm sendo utilizadas para avaliação citológica. A técnica
mostrou-se segura e fornece material representativo do baço, sem a necessidade de sacrificar os
cães para estudo. Contudo ainda não foram completamente exploradas as possibilidades de
17
aplicação do material obtido por punção, sendo necessária avaliação com diferentes técnicas
imunocito ou histoquímicas.
O desenvolvimento de uma técnica prática e eficaz para o estudo da resposta imune in situ
no baço de cão, que permita traçar um perfil fenotípico associado à susceptibilidade ou
resistência nos animais expostos à infecção. Tanto a técnica em si quanto os dados serão úteis em
estudos subseqüentes, voltados para o monitoramento da evolução da doença, bem como a
avaliação da dinâmica da resposta imune esplênica no decorrer de ensaios experimentais in vivo
para imunoterapia e/ou vacina contra LVC.
18
JUSTIFICATIVA
No Brasil a Leishmaniose visceral humana vem crescendo e gerando novas áreas
endêmicas que incluem regiões anteriormente livres da doença como áreas periurbanas e urbanas.
Atualmente os cães são considerados os principais reservatórios. Os programas de controle da
doença brasileiros seguem as determinações da OMS que preconizam: a identificação e
tratamento de casos humanos, o controle do vetor e erradicação de cães sorologicamente
positivos (WHO, 1990). Tal medida não tem sido eficiente na redução da incidência da doença
humana, além de ser bastante onerosa (SILVA et al., 2001).
Estudos que permitam uma melhor compreensão da interação parasito/hospedeiro, em
animais naturalmente infectados podem auxiliar a esclarecer fatores de risco. Dessa forma podese elaborar um quadro mais realista da doença natural causada nos cães pela Leishmania chagasi.
O conhecimento sobre a evolução clínica da doença nos cães e a sua resposta imune ao agente
etiológico da LV, subsidiará a elaboração de melhores métodos de controle desta zoonose. Os
avanços tecnológicos na área de diagnóstico permitir-nos-ão lançar mão de técnicas mais
acuradas para complementar o trabalho de elaboração de um perfil clínico e imunológico que
possa servir como base para elaboração de diagnósticos mais seguros.
O potencial diagnóstico e os possíveis benefícios de métodos sistemáticos de análise dos
componentes imunológicos do baço canino na LV ainda carecem de atenção. Em um estudo
prévio, verificamos que a biópsia aspirativa com agulha fina, realizada no animal vivo, é passível
de ser repetida seqüencialmente (BARROUIN-MELO et al., 2006a). Os dados obtidos a partir de
exames seqüenciais de cães poderiam complementar outros estudos realizados em amostras de
sangue periférico ou obtidas post-mortem. Com o emprego de técnicas bem padronizadas com os
avanços da medicina diagnóstica, como a citometria de fluxo e anticorpos monoclonais, torna-se
possível a avaliação da resposta de cães a vacinas ou tratamento contra LV. Tais informações
seriam importantes para o desenvolvimento de métodos úteis ao controle da infecção em áreas
endêmicas, como vacinas e substâncias imunoterápicas, além de atender imperativos éticos para
utilização de animais em pesquisa (3Rs), reduzindo o número de animais utilizados nas
19
pesquisas. Considerando-se ainda que o cão sofre de uma série de doenças que também ocorrem
na espécie humana, como imunodeficiências primárias, autoimunidade e outros distúrbios
patológicos de etiologia infecciosa ou neoplásica, envolvendo o sistema imune, métodos
padronizados para a avaliação da imunidade esplênica órgão-específica seriam ferramentas úteis
em estudos experimentais e no diagnóstico, tanto na rotina na clínica veterinária, quanto na
pesquisa básica para a compreensão de doenças humanas.
20
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Padronizar técnicas de processamento de material esplênico obtidos in vivo, para análise
morfológica e fenotípica, visando à identificação de métodos adequados ao monitoramento da
resposta imune canina em estudos experimentais e no diagnóstico da LVC.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
I-
Padronizar a técnica de cell-block para análise imunofenotípica e distribuição
estrutural de esplenócitos de cão em aspirado de baço;Padronizar a técnica de
citometria de fluxo para análise imunofenotípica de esplenócitos de cão, obtidos por
aspirado esplênico.
III-
Comparar os resultados de imunofenotipagem de esplenócitos por cell-block e
citometria de fluxo em aspirado esplênico de cão.
21
IV-
Aplicar o método selecionado para avaliação fenotípica de leucócitos esplênicos em
um grupo de cães de área endêmica, em diferentes condições clínicas, incluindo cães
portadores ou não de infecção pelo parasita, para estudos de correlação.
4. REVISÃO DE LITERATURA
4.1. Leishmaniose visceral: uma doença mundialmente distribuída
A designação leishmaniose é atribuída a um grupo de doenças causadas por diferentes
espécies de protozoários do gênero Leishmania. Embora seja difícil distinguir espécies de
Leishmania com relação à morfologia, modernos métodos taxonômicos demonstraram a
existência de seis espécies principais, que se correlacionam amplamente com as características
geográficas, epidemiológicas e clínicas das doenças que causam no homem. Três dessas espécies
ocorrem no cão: a Leishmania tropica (causando leishmaniose cutânea ou “botão-do-Oriente”,
com lesões desenvolvendo-se no local da picada do inseto), a L. brasiliensis (causando lesões
semelhantes às da L. tropica) e a L. (chagasi) infantum (causando leishmaniose visceral, ou
“calazar”, com infecção sistêmica) (URQUHART et al., 1998).
Em todo o mundo existem, aproximadamente, 12 milhões de pessoas infectadas e mais 350
milhões vivendo em áreas de risco (GRIMALDI, TESH e McMAHON-PRATT, 1989). É uma
doença emergente e re-emergente que acomete, além do homem, canídeos, felídeos, roedores e
marsupiais (BONATES, 2003; ALVES et al., 1998; BRASIL, 2003), sendo apontada como
22
problema de saúde pública em cerca de 80 países da Ásia, África, América Latina e na região do
Mediterrâneo, onde estima-se que cerca de sete milhões de cães estejam expostos à infecção
(MAIA, 2005). A LV já foi notificada em pelo menos 12 países da America latina. O Brasil
responde por mais de 90% dos casos do continente, sendo que 94% dos casos do país são
originados na região Nordeste (BRASIL, 2003).
Nas Américas Central e do Sul, a leishmaniose caracteriza-se por apresentar aspectos
distintos das do Velho Mundo quanto a sua etiologia e epidemiologia (GRIMALD, TESH e
McMAHON-PRATT, 1989). A LV é causada pela Leishmania infantum na Europa e pela
Leishmania chagasi nas Américas, sendo ambas pertencentes ao complexo Leishmania donovani
(WHO, 1990). No entanto, pesquisas baseadas em comparações moleculares indicam que a L.
chagasi e a L. infantum são indistinguíveis, sendo consideradas por alguns autores como uma só
espécie (MILES et al. 1999). A doença tem ampla distribuição na Ásia, na Europa, no Oriente
Médio, na África e nas Américas, onde é também denominada LV Americana (ALVES et al.,
1998; BONATES, 2003; BRASIL, 2003).
A LV encontra-se atualmente entre as seis endemias consideradas prioritárias no mundo
(BRASIL, 2003). Estima-se que o crescimento mundial da LV humana seja da ordem de 500.000
novos casos anuais, com envolvimento crescente de novas áreas endêmicas, inclusive em países
anteriormente livres da doença (WHO, 2000) e regiões para onde ocorre migração e adaptação do
inseto vetor, como as áreas peri-urbanas e urbanas (COSTA et al., 1990; MICHALIK et al., 1992;
NASCIMENTO et al., 1992; MARZOCHI et al., 1994; MORENO e ALVAR, 2002).
A doença é descrita como própria de áreas montanhosas e de vales, de clima seco e
precipitação pluviométrica anual inferior a 800mm (BRASIL, 2003). A leishmaniose
inicialmente estabeleceu-se em áreas rurais e, mais recentemente, em áreas urbanas. Esta
mudança se deve as transformações do ambiente provocadas pelo processo migratório, o
empobrecimento conseqüente da distorção na distribuição de renda, a urbanização crescente, o
esvaziamento rural e as secas periódicas, acarretam a expansão das áreas endêmicas e o
aparecimento de novos casos (BONATES, 2003). Fatores como a desnutrição (BADARÓ et al.,
1986) e a deficiência ou ausência de saneamento básico, característicos da maioria das regiões
23
endêmicas, e o advento da AIDS, determinando um comprometimento do sistema imune,
favorecem e agravam a situação (PARANHOS-SILVA et al., 1996; VALLADARES et al.,
1998).
4.2. A Leishmania chagasi : agente etiológico da leishmaniose visceral canina no Brasil
O parasito é transmitido para o homem e para os animais susceptíveis através da picada de
flebótomos do gênero Lutzomyia no Novo Mundo e Phlebotomus no Velho Mundo
(CIARAMELLA et al., 1997). No Brasil, o protozoário Leishmania chagasi, é transmitido entre
os animais susceptíveis e humanos, através da picada de flebótomos infectados, fêmeas, da
espécie Lutzomyia longipalpis. Existem relatos sobre possíveis transmissões diretas, através do
contato com secreções inflamatórias, transfusões sanguíneas ou intrauterinas. Entretanto, estas
vias não ocupam importância epidemiológica e, por isso, devem ser consideradas excepcionais
(RIBEIRO e MICHALIK, 2001).
Segundo a Fundação Nacional de Saúde, o gênero Leishmania possui formas características
de parasitismo no vertebrado e no inseto vetor. No mamífero, o parasito apresenta-se sob forma
aflagelada, denominada amastigota, que se multiplica no interior das células do sistema
mononuclear fagocitário. Após serem sugadas pelo flebotomíneo, estas se transformam na forma
flagelada, denominada promastigota (SHERLOCK, MAIA e DIAS-LIMA, 1996).
4.3. A leishmaniose canina e as tentativas de controle da zoonose no Brasil
No Brasil, onde ocorrem cerca de 90% dos casos de LV humana relatados nas Américas
Central e do Sul, cães domésticos e raposas (Cerdocyon thous e Dusycion vetulus) são
considerados os principais reservatórios naturais do parasito (DEANE et al., 1955;
COURTENAY et al., 1996). No ambiente urbano, o cão é considerado o mais importante
reservatório da infecção. Entre as razões citadas para justificar essa afirmativa incluem-se: o
convívio próximo entre o cão e o homem; o fato do cão servir como fonte de repasto para o vetor,
24
atraindo-o para perto do homem; sua alta densidade populacional, estimada entre 10 a 20% da
população humana; a sua susceptibilidade às várias espécies de Leishmania, a elevada proporção
de infecções caninas não aparentes e ao desenvolvimento de parasitismo sanguíneo e epdermico
(IKEDA et al., 2003; THOMÉ, 1999).
A LVC no Brasil coexiste com a doença humana em todos os focos conhecidos, precedendo
a ocorrência de doença humana. Do ponto de vista epidemiológico, a doença canina é
considerada mais importante que a doença humana, pois, além de ser mais prevalente, apresenta
grande contingente de animais assintomáticos albergando parasitos na pele. Os caninos
domésticos são responsabilizados pela dispersão da doença a partir de focos enzoóticos
(MARZOCHI et al., 1985; SHERLOCK, 1997).
Os programas governamentais para controle da doença seguem as determinações da
Organização Mundial de Saúde (OMS), que preconizam a identificação e o tratamento dos casos
humanos, o uso de inseticidas para controle do vetor e o sacrifício dos cães que apresentem
anticorpos contra Leishmania em inquéritos sorológicos (WHO, 1990). As ações tomadas contra
o reservatório são a identificação e diagnóstico imediato e a eliminação destes animais, visando
reduzir as fontes de infecção para os flebótomos. Nas áreas onde ocorre um índice de
soropositividade canina até 1%, recomenda-se uma vigilância epidemiológica e, em regiões onde
este índice for maior que 1%, está indicada a eliminação de cães positivos e estudos entomoepidemiológicos para determinar a abrangência do problema (MONTEIRO, LACERDA e
ARIAS, 1994). Entretanto, essa medida não tem apresentado o resultado esperado, visto que
apesar da média anual de 18.000 cães sacrificados pela Fundação Nacional de Saúde, a incidência
humana de LV no Brasil aumentou de 1.500 casos em 1989 para 2.400 em 1993 (SILVA et al.,
2001). Alem disso, o sacrifício indiscriminado de cães soropositivos, é uma medida onerosa, e
encontra resistência ética e emocional (NEOGY et al., 1994).
DYE (1996) comparando a efetividade dos vários métodos de controle da LVC e da LV
humana, conclui que o sacrifício dos animais soropositivos é decididamente a pior opção de
controle, sendo a vacinação o método mais adequado. O problema cita o autor, é que os cães
sacrificados são imediatamente substituídos por filhotes que são altamente susceptíveis ao
25
protozoário, adquirindo rapidamente a infecção, num período de aproximadamente dois meses,
quando introduzidos em áreas conhecidamente endêmicas.
O insucesso dos programas de controle da LV no Brasil, entre outros fatores, pode ser
atribuído a testes pouco sensíveis, rotineiramente utilizados para inquéritos sorológicos, como a
reação de imunofluorescência indireta. Assim, uma parcela de cães infectados não é identificada,
permanecendo como reservatório por longos períodos (PARANHOS-SILVA et al., 1996). Além
disso, o combate ao inseto vetor é prejudicado pelo desconhecimento dos seus locais de
reprodução e pelo alto custo dos inseticidas indicados, gerando freqüentes descontinuidades
(JERONIMO et al., 1994). Por outro lado, as medidas de controle dos reservatórios silvestres são
de difícil execução, tendo em vista que sua biologia é pouco conhecida, além do fato de que a
captura e o sacrifício desses animais poderiam contribuir para a extinção de algumas espécies
(GENARO, 1992).
É necessário, portanto, o desenvolvimento de técnicas mais sensíveis para a identificação
dos animais infectados, assim como de métodos mais eficazes para seu controle, como o emprego
de vacinas e imunoterápicos, impedindo ou eliminando a infecção nos cães.
Agentes imunomoduladores, associados ou não a quimioterapia, poderiam ser capazes de
tornar cães portadores de infecção ativa em indivíduos não transmissores e resistentes a uma
possível reinfecção. A manutenção desses animais nas áreas endêmicas minimizaria a introdução
de novos animais, freqüentemente
jovens e
susceptíveis,
geralmente propensos ao
desenvolvimento de altas cargas parasitárias cutâneas após a infecção natural (GUARGA et al.,
2000; TRAVI et al., 2001), representando também uma alternativa ao sacrifício de animais de
estimação. Para a obtenção desses agentes, torna-se fundamental o conhecimento sobre a resposta
imunológica do cão na LVC.
4.4. Fisiopatologia da leishmaniose visceral no cão
26
A infecção ocorre pelo repasto sangüíneo dos flebótomos, sendo as formas infectantes da
Leishmania depositadas na derme do cão junto com a saliva do inseto e fagocitadas pelos
macrófagos, onde se transformam em amastigotas (BONATES, 2003). Estas sofrem
multiplicação no interior dos vacúolos digestivos, o que provoca o rompimento dos macrófagos e,
conseqüentemente, invasão de novas células do sistema fagocítico, ampliando cada vez mais sua
carga infectante e disseminando, posteriormente, o agente pelo organismo do indivíduo infectado,
por via hematogênica, com invasão de linfonodos, fígado e medula óssea e do baço (THOMÉ,
1999; BONATES, 2003).
Os cães infectados pela Leishmania (chagasi) infantum apresentam um espectro de
características clínicas que pode variar do aparente estado sadio ao severo estágio final,
admitindo-se um período de incubação (pré-patente) de 3 a 6 meses até vários anos. Este evolui
para os estados latente ou patente que, por sua vez, em períodos variáveis de semanas, meses ou
anos, acompanhada ou não de sintomas, pode evoluir para a cura espontânea ou evoluir para a
forma aguda, subaguda ou crônica (MARZOCHI et al., 1985). A forma de evolução aguda e
grave leva o animal a óbito em poucas semanas.
As alterações clínicas mais comuns apresentadas são: diminuição da atividade física, lesões
de pele, perda de peso progressiva apesar de apetite normal, sinais de falha renal, epistaxe
intermitente ou severa, lesões oculares, distúrbios locomotores, onicogrifose e linfadenopatia
(SLAPPENDEL e GREENE, 1990; ABRANCHES et al., 1991; KONTOS e KOUTINAS, 1993).
As lesões de pele que estão entre os achados mais freqüentes incluem dermatite exfoliativa,
onicogrifose, úlceras, nódulos, pústulas e hiperqueratose nasal e digital. Geralmente são lesões de
natureza crônica, não pruriginosas e simétricas. Os sinais de dermatite iniciam-se na cabeça,
espalhando-se pelo resto do corpo, caracterizando-se por seborréia, alopecia e hipotricose,
principalmente no focinho, olhos e orelhas. Úlceras que não cicatrizam localizam-se
principalmente em pontos de atrito, junções mucocutâneas, coxins e orelhas (MARZOCHI et al.,
1985; SLAPPENDEL e GREENE, 1990; KONTOS e KOUTINAS, 1993).
27
Achados de glomerulonefrite membrano-proliferativa crônica de caráter moderado a severo
e
nefrite
túbulo-intersticial
moderada,
principalmente
causadas
pela
deposição
de
imunocomplexos, são comuns. As lesões renais severas são acompanhadas por proteinúria
intensa e podem culminar com falha renal crônica e síndrome nefrotóxica. Essa é a principal
causa de morte nos cães afetados (FONT et al. 1993; KONTOS e KOUTINAS, 1993; NASH,
1993; FONT et al., 1994; KOUTINAS et al., 1995; PALACIO, LISTE e GASCON, 1995;
LOPEZ et al., 1996).
Apesar da epistaxe ser um sinal relativamente comum, de caráter intermitente, moderado e
unilateral, pode ocorrer sangramento nasal severo e profuso, levando o animal à morte. A causa
da epistaxe ainda não foi bem esclarecida, estando associada a lesões inflamatórias e ulcerativas
na mucosa nasal e diátese hemorrágica relacionada à hiperglobulinemia, paraglobulinemia e
trombocitopenia (FONT et al., 1993; NASH, 1993; FONT et al., 1994).
As lesões oculares são muito variadas, freqüentemente apresentando-se como uma
conjuntivite simples ou granulomatosa, ceratite superficial ou profunda, uveíte anterior, esclerite,
opacidade da córnea e bleflarites associadas com dermatite facial (MARZOCHI et al., 1985;
SLAPPENDEL e GREENE, 1990; KONTOS e KOUTINAS, 1993).
Os problemas locomotores, não muito comuns na LVC, manifestam-se como claudicação
decorrente de poliartrite, polimiosite e lesões ósseas, bem como paresia dos membros posteriores
(NASH, 1993; SPRENG, 1993; WOLSCHRIJN et al., 1996).
Apesar do quadro de linfadenomegalia periférica com hipertrofia ser um achado freqüente,
pode ocorrer diminuição dos linfonodos nos casos de doença prolongada, especialmente aqueles
que envolvem falhas renais ou hepáticas (KONTOS e KOUTINAS, 1993).
Com base nesses dados, diferentes autores classificam os animais em assintomáticos
(ausência de sinais sugestivos da infecção por Leishmania), oligossintomáticos (presença dois a
três sinais como linfadenopatia, perda de peso ou lesões cutâneas) e sintomáticos (acima de três
sinais mais comuns da doença como as alterações cutâneas, emagrecimento onicogrifose,
28
linfadenopatias e ceratoconjuntivite) (MOLINA et al., 1994; TRAVI et al., 2002; FEITOSA et
al., 2000; REIS et al., 2006a).
4.5. A resposta imunológica do cão à infecção por L. chagasi
A LVC é considerada uma doença imunomediada, devido à capacidade do parasita em
modificar a resposta imunológica do hospedeiro (PINELLI et al., 1994). Em cães, a Leishmania
coloniza todos os órgãos, em contraste com que ocorre em seres humanos, nos quais o parasito
está total ou quase totalmente restrito ao sistema hematopoiético (SLAPPENDEL e GREENE,
1990; BERRAHAL et al., 1996).
Sanchez et al. (2004) relata que existe uma diferença notável entre a carga parasitária de
cães assintomáticos e sintomáticos infectados naturalmente com L. (chagasi) infantum. Outros
autores têm demonstrado que uma infecção reduzida deve-se a um controle mais eficiente da
replicação do parasito em cães assintomáticos, exercido pelo sistema imune (REIS et al., 2006b;
GIUNCHETTI et al., 2008).
Alguns resultados experimentais indicam que o controle da infecção canina segue um
padrão de resposta predominantemente celular (DEPLAZES et al., 1995; PINELLI et al., 1995),
do tipo Th1, o mesmo se observado nos modelos humanos e murino. Este padrão de resposta
imune tem sido também relacionado à resistência contra a infecção por Leishmania no
camundongo e no homem (LIEW, O’DONNELL 1993; REINER et al., 1995), nos quais
verificou-se que a formação de granulomas organizados está associada ao controle da infecção
em órgãos-alvo, como o fígado (ENGWERDA e KAYE, 2000). A LVC ativa é caracterizada por
uma intensa resposta imune humoral e uma incapacidade dos linfócitos T de responder aos
antígenos de Leishmania in vitro. Modificações nas sub-populações de linfócitos ocorrem em
uma fase bastante precoce da infecção, levando a uma intensa depressão do funcionamento dos
linfócitos T, cuja intensidade é diretamente proporcional à gravidade do quadro clínico (PINELLI
et al., 1994; MORENO et al., 1999; GUARGA et al., 2002).
29
Como a Leishmania é um parasito intracelular obrigatório, a defesa imunológica do
hospedeiro vertebrado dependerá fortemente da atividade das células T. Estudos em cães doentes
demonstraram um decréscimo da percentagem de células T e um aumento das células B. Dentro
dos fagócitos de cães susceptíveis, as formas amastigotas são capazes de escapar aos mecanismos
de destruição dos fagolisossomos. Esta tem sido considerado a principal característica da resposta
imune de susceptibilidade canina na LV. Sem a ativação devida das células Th1, os macrófagos
são incapazes de destruir as formas amastigotas, que se disseminam nos tecidos do hospedeiro
(SLAPPENDEL e GREENE, 1990). A resposta imune associada à susceptibilidade à infecção é
caracterizada pela presença das citocinas IL-4 e IL-10, que inibem a produção de citocinas
indutoras da resposta celular, como o IFN-γ e a IL-12 (LI et al., 1997; MBOW et al., 1998;
KOLE et al., 1999; SATO et al., 2000). A ativação excessiva de células B, histiócitos e
macrófagos é considerada um mecanismo imunológico compensatório que resulta em
linfadenopatia generalizada, hepatoesplenomegalia e respostas intensas de imunoglobulinas
(SLAPPENDEL e GREENE, 1990; KONTOS e KOUTINAS, 1993). No cão, foi descrita uma
anergia causada por intensa perda de células T auxiliadoras CD4+, decorrente de uma possível
apresentação defeituosa dos antígenos de Leishmania pelos macrófagos infectados, levando a
apoptose dos linfócitos (MORENO et al., 1999). Uma associação entre redução nas proporções
de células T do sangue periférico de cães susceptíveis e uma alta infectividade a flebótomos já foi
também demonstrada (GUARGA et al., 2000).
Diversos fatores, como a virulência da cepa infectante de Leishmania, a composição
genética do hospedeiro, as suas condições de saúde por ocasião da inoculação do parasito (DYE
1992), a dose inoculante (MENON e BRETSCHER 1998; POWER et al., 1998; ROGERS e
CROFT 1999), o sítio de inoculação (NABORS et al., 1995) e substâncias presentes na saliva do
vetor (MBOW et al., 1998) parecem contribuir para uma resposta imune favorável ou
desfavorável do hospedeiro. Vários autores têm demonstrado a importância das citocinas do tipo
Th1 na capacidade do hospedeiro canino, como do murino, em combater a infecção por
Leishmania (PINELLI et al., 1995; MAEKAWA et al., 1998) e responder à quimioterapia (LI et
al., 1997; KOLE et al., 1999; MORENO et al., 1999; ENGWERDA et al., 2002). Nestes
indivíduos, uma ativação de macrófagos por citocinas Th1, principalmente o IFN-γ, conduziria à
30
destruição ou inibição do crescimento das formas parasitárias intracelulares, envolvendo a
produção de óxido nítrico (REINER e LOCKSLEY, 1995).
4.6. A resposta imune órgão-específica do baço na leishmaniose visceral canina
Nos últimos anos, o conhecimento das bases imunológicas órgão-específicas de doenças
auto-imunes ou dos mecanismos utilizados por vírus ou bactérias para resistir à resposta imune
do hospedeiro em seus órgãos de eleição vem tendo um avanço significativo (ENGWERDA e
KAYE, 2000). Estudos com modelos murinos de LV têm contribuído para um progresso
substancial na compreensão de eventos imunológicos e inflamatórios que ocorrem em órgãosalvo envolvidos na resposta imune protetora ou lesiva ao hospedeiro no curso da infecção
(BRADLEY e KIRKLEY, 1977; WILSON et al., 1996; MELBY et al., 2001; KAYE et al.,
2004). Em camundongos geneticamente susceptíveis (SMELT et al., 1997), assim como em seres
humanos (GUERIN et al., 2002) ou em cães (NATAMI et al., 2000; TAFURI et al., 2001), a
medula óssea, o fígado e o baço são os sítios mais importantes de crescimento parasitário e de
modificações fisiopatológicas induzidas pelas cepas viscerotrópicas de Leishmania.
Dadas as funções do baço, como órgão linfóide secundário, incluindo fagocitose, imunoregulação, resposta imune a antígenos, hematopoiese e hemocaterese, associadas ao seu contato
intrínseco com o sangue (CHRISTOPHER, 2003), a avaliação citológica e a caracterização de
elementos imunitários desse órgão tornam-se indispensáveis para a compreensão da resposta
imune canina em diversas condições patológicas, particularmente aquelas de origem infecciosa e
linfoproliferativa. Na LVC, a ocorrência consistente de esplenomegalia (BLAVIER et al., 2001) e
o fato do baço albergar e concentrar mais parasitos que outros órgãos linfóides (NATAMI et al.,
2000) são indicativos de seu papel importante no curso da infecção.
O baço corresponde ao maior acúmulo de tecido linfóide do organismo. Como único órgão
linfóide interposto na circulação sanguínea, é o principal responsável pela eliminação de
partículas/patógenos em suspensão no sangue. O parênquima esplênico é subdividido em polpa
branca e polpa vermelha, as quais possuem funções distintas e complementares. As funções
imunes estão relacionadas primariamente com a polpa branca. A polpa vermelha, prioritariamente
31
relacionada com as funções de hematopoiese, armazenamento de sangue e hemocaterese,
funciona também como via de saída para a maioria das células linfóides recirculantes. A presença
de plasmócitos e macrófagos nessa região favorece a opsonização e fagocitose de antígenos
presentes no sangue (ROOIJEN et al., 1989; BALOGH et al., 2004; MEBIUS e KRAAL, 2005).
Alterações histológicas podem ser observadas tanto na polpa vermelha quanto na polpa
branca de cães infectados com Leishmania. Formações granulomatóides na polpa vermelha e
presença de vários macrófagos infectados foram descritas por Tryphonas et al. (1977). Diferente
do granuloma hepático, relacionado com a regressão local da infecção, o granuloma esplênico
parece não refletir o controle parasitário (ENGWERDA et al., 1998). Na LVC, os animais podem
apresentar folículos linfóides do baço hiperplasiados, com presença de hialinose (TRYPHONAS
et al., 1977) ou atrofiados (TAFURI et al., 2001). Espessamento e intenso parasitismo capsular e
subcapsular com reação inflamatória crônica difusa foram descritas por Tafuri et al. (2001), em
baço de cães, indicando hiperplasia das células do sistema mononuclear fagocitário, como
resposta ao parasitismo.
Na infecção experimental com Leishmania, ocorre no fígado murino um rápido
crescimento de formas amastigotas até 28 dias, seguido de desaparecimento do parasito em torno
de 60 dias pós-infecção (ENGWERDA et al., 2004). A eficiência da resposta imune em controlar
e eliminar a infecção no fígado é atribuída à formação eficiente de granulomas em torno de
células de Kupffer infectadas, associada à presença de citocinas TNF, IL-12 e IFN-γ, e à geração
de derivados reativos de oxigênio e nitrogênio (KAYE et al., 2004). Por outro lado, no baço e na
medula óssea, a infecção torna-se crônica, perdurando por toda a vida do animal (BRADLEY e
KIRKLEY, 1977; WILSON et al., 1996), associada a uma série de alterações patológicas,
principalmente definidas na arquitetura e nas funções imunológicas esplênicas (MELBY et al.,
2001; ENGWERDA et al., 2002). Nesses órgãos, ocorre aumento da expressão de IL-10 e TGFβ, citocinas inibidoras das funções fagocitárias (MELBY et al., 2001). A presença de formas
amastigotas inibe ativamente a produção de IL-12 pelos macrófagos, por meio de vias entre as
quais ocorre produção de TGF-β, em fases iniciais da infecção (ENGWERDA et al., 2004).
32
A dicotomia observada entre a resposta imune hepática e esplênica à infecção, ambas sob a
influência do TNF-α, demonstra a importância do conhecimento dos eventos imuno-inflamatórios
peculiares a cada órgão, na compreensão dos mecanismos ligados à resistência ou
susceptibilidade do hospedeiro à infecção pela Leishmania (ENGWERDA et al., 2004).
Muito pouco se sabe acerca de componentes e eventos ligados à eficiência ou a distúrbios
inerentes à resposta imune in situ, nos órgãos-alvo da infecção canina por L. chagasi ou L.
infantum (SANCHEZ et al., 2004). Apenas recentemente, com o desenvolvimento de reagentes
capazes de identificar moléculas de superfície das células caninas envolvidas na resposta imune
(COBBOLD e METCALFE, 1994), vem sendo possível o estudo das bases celulares da
modulação da resposta imune nos cães portadores de LV, que apresentam uma intensa resposta
de anticorpos e inibição da imunidade celular à infecção, tornando-os refratários ao tratamento
(MORENO et al., 1999).
4.7. Métodos para avaliação da resposta imune esplênica do cão: um campo a ser
desenvolvido
A maioria dos dados caracterizando leucócitos de cão, obtidos por meio de técnicas de
imunofenotipagem, é concernente a células do sangue periférico (WILLIAMS, 1997; BYRNE et
al., 2000a, 2000b; CHABANNE et al., 2000; FALDYNA et al, 2001; GREELEY et al., 2001;
OTANI et al., 2002; REIS et al., 2005). Alguns autores têm avaliado a presença, distribuição e /
ou atividade de subgrupos de leucócitos em outros órgãos e fluidos biológicos, como o fluido
cérebro-espinhal (TIPOLD et al., 1998), lavado bronco-alveolar (OUT et al., 2002), fígado
(SAKAI et al., 2003), fluido pericárdico (GUGLIELMINO et al., 2004), cérebro (STEIN et al.,
2004) e órgãos linfáticos (FALDYNA et al., 2005). As informações adquiridas nesses estudos
vêm contribuindo para o conhecimento acerca de componentes da resposta imune canina nos
sítios estudados.
A análise citológica do baço, a partir de amostras obtidas por meio de biópsia aspirativa
com agulha fina, auxiliada por métodos de coloração convencional, imunocitoquímica e / ou por
meio de citometria de fluxo, tem se mostrado factível na análise diagnóstica em uma grande
33
variedade de condições patológicas humanas (HAQUE et al., 1993; ZEPPA et al., 1994, 2003;
ZANDER et al., 1994; LISHNER et al., 1996; BONIFACIO et al., 2000; KALEEM et al., 2001).
Algumas neoplasias têm sido investigadas, na medicina veterinária, por meio da aplicação de
métodos imunocitoquímicos em aspirados esplênicos (CHRISTOPHER, 2003).
Apesar de ser o baço um sítio de interesse para a compreensão dos eventos envolvidos na
resistência ou na susceptibilidade do cão na LV, nas diversas fases e condições naturais do
processo infeccioso, até recentemente apenas um trabalho pioneiro reporta dados de citometria de
fluxo para identificação de sub-populações de leucócitos em amostras de baço na LVC
(SANCHEZ et al., 2004), contrastando com a abundância observações disponíveis sobre aspectos
imunológicos esplênicos na LV murina (KAYE et al., 2004).
A produção e disponibilização de anticorpos monoclonais específicos para antígenos de
superfície de células de cão têm possibilitado o desenvolvimento de estudos voltados para a
compreensão dos mecanismos e componentes da imunidade canina (WILLIAMS, 1997; REIS et
al., 2005). Constantes esforços de aprimoramento de técnicas de imunofenotipagem são exigidos
à medida que novos anticorpos, específicos para o cão, vão sendo desenvolvidos. Entretanto,
diferentemente do que ocorre com o conhecimento da resposta imune murina e humana, cujo
estabelecimento vem sendo auxiliado pela larga disponibilidade de anticorpos comerciais
específicos para uma diversidade de moléculas de superfície celular (BYRNE et al., 2000b),
muitos dos estudos voltados para a imunidade canina ainda estão no campo da padronização de
técnicas e estabelecimento de parâmetros da normalidade e obtenção de anticorpos específicos
(TIPOLD et al., 1998; BYRNE et al., 2000a; FALDYNA et al., 2001; SAKAI et al., 2003;
HOGENESCH et al., 2004; REIS et al., 2005).
34
5. ABORDAGEM EXPERIMENTAL
Modificações em populações de leucócitos esplênicos, associadas à leishmaniose visceral,
foram recentemente descritas em um estudo de aspirados esplênicos de cão (BARROUIN-MELO
et al., 2006b). O estudo demonstrou que animais portadores da infecção apresentam redução das
proporções de linfócitos e de células CD45RA, em análises de preparações citocentrifugadas
coradas
por
Hematoxilina-Eosina
e
marcadas
com
anticorpos
monoclonais,
em
imunocitoquímica. Porém, através desta técnica não foi possível analisar a celularidade presente
nos pequenos fragmentos esplênicos (Figura 1) obtidos com a punção.
Figura 1: Preparação citocentrifugada de aspirado esplênico de cão, coradas por HE
(Arquivo de lâminas do Laboratório de Patologia e Bio-intervenção, CPqGM/FIOCRUZ)
.
Para estudar as células retidas nos agregados, propusemos utilizar duas técnicas: (1) realizar
a dispersão desses agregados utilizando enzimas e analisar por citometria de fluxo, ou (2) incluir
as amostras obtidas por punção esplênica em parafina, para obtenção de secções, através da
técnica de cell block. Esta técnica foi padronizada, no presente trabalho, para os aspirados
esplênicos por ser indicada à análise citológica em amostras de fluidos corporais e na avaliação
de tumores.
35
Para tanto, grupos de cães de áreas endêmicas e não endêmicas para leishmaniose visceral,
classificados sob parâmetros clínico, sorológico e parasitológico foram estudados na
padronização dos métodos com o objetivo de avaliar a resposta imune órgão-específica do baço.
Amostras de baço dos animais foram analisadas pelas técnicas de cell block, utilizando métodos
de coloração convencional e imunohistoquímica com anticorpos monoclonais, e pela técnica de
citometria de fluxo, ambas para avaliação das subpopulações de leucócitos. A metodologia e os
resultados estão relatados na forma de manuscrito, com a descrição de ambas as técnicas
imunoquímicas para avaliação imunofenotípica de amostras de baço de cão obtidas in vivo.
5.1. População canina estudada e aspectos éticos
Nas etapas de padronização da citometria de fluxo foram utilizadas amostras de 16 cães, e
na padronização da técnica cell block foram utilizadas amostras de 59 cães, de ambos os sexos,
com idades e raças variadas. Todos os cães naturalmente infectados por Leishmania examinados
neste estudo foram selecionados em áreas urbanas e peri-urbanas situadas no Litoral Norte do
Estado da Bahia, ao longo da Estrada do Coco e da Linha Verde, e no município de Jequié, onde
a LVC é endêmica e casos humanos são anualmente notificados. Os trabalhos foram
desenvolvidos em colaboração com os respectivos centros de controle de zoonoses (CCZs) que
aplicam a eutanásia em cães soropositivos de acordo com a Resolução n° 714, de 20 de junho de
2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinária. O sacrifício dos animais, nas dependências
dos CCZs, foi realizado com anestésico geral, sob cujo efeito foram feitas as coletas de aspirado
esplênico e de sangue periférico. Foram incluídos no estudo animais considerados não-infectados,
quando apresentaram saúde clínica, soronegatividade para anticorpos anti-Leishmania e
diagnóstico parasitológico, sendo estes selecionados em Salvador (área não endêmica). Todos os
procedimentos realizados nos animais seguiram as normas definidas pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz,
Bahia.
36
5.2. Avaliação clínica dos animais
Todos os cães foram examinados para verificação e catalogação quantitativa e qualitativa
de alterações clínicas. Alterações cutâneas, na cor e integridade das mucosas, crescimento
anormal das unhas, alterações oculares e palpebrais, presença de secreções anormais, perda de
peso, alterações comportamentais e do estado geral, alteração no tamanho dos linfonodos e do
baço, além de histórico e evidências clínicas de outras infecções foram pesquisadas.
5.3. OBTENÇÃO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS
5.3.1. Sangue periférico
Amostras foram obtidas de todos os animais, com seringas e agulhas descartáveis, das veias
cefálica ou jugular, e mantidas em tubos sem anticoagulante (EDTA), no gelo, até processamento
em laboratório para separação de soro.
5.3.2. Aspirado esplênico
As amostras foram obtidas sob sedação com 0,5 mg / kg de acepromazina, com seringas e
agulhas descartáveis, de acordo com técnica previamente descrita por Barrouin et al. (2006a).
Resumidamente, os cães foram sedados por meio de uma injeção intravenosa com acepromazine
e posicionados em decúbito lateral direito. Foi realizada assepsia da região a ser puncionada com
álcool iodado a 2%. A punção esplênica foi realizada no flanco esquerdo dos animais, próximo à
borda caudal das últimas costelas, utilizando-se uma agulha 40 x 12 mm acoplada a uma seringa
de 20mL. Os aspirados esplênicos foram colocados individualmente em meio bifásico de cultura
para diagnóstico parasitológico, em formalina 10% para realização da técnica de Cell block e em
meio RPMI heparinizado para a realização da citometria de fluxo.
37
5.4. TÉCNICAS UTILIZADAS
5.4.1. Imunodiagnóstico – ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti-Leishmania
Microplacas de 96 poços foram sensibilizadas com 100µL/poço do lisado antigênico obtida
por sonicação e centrifugação dos parasitos, na concentração de 10µg de proteína por mL, diluída
em tampão carbonato-bicarbonato 0,05 M e pH 9,6 e incubada durante a noite a 4ºC. Para o
bloqueio das placas foram utilizados 200µL de PBS-T com 5% de leite em pó desnatado, e
incubadas por 1h à temperatura ambiente, seguida de quatro lavagens com PBS-T. Foram
incubadas com 100µL de soro por poço, na diluição de 1:400 em PBS-T com 5% de leite em pó
desnatado durante 1h à temperatura ambiente. Após quatro lavagens, 100µL de conjugado antiIgG de cão conjugada a peroxidase (Sigma, St. Louis, MO, EUA), diluído a 1:25000 em PBS-T
com 5% de leite em pó desnatado, foram acrescentados e incubados durante 1h à temperatura
ambiente. As placas foram lavadas a revelação feita com peróxido de hidrogênio (0,03%) e OPD
(5mg/mL) em tampão de citrato-fosfato (ácido cítrico 0.1 M e fosfato de sódio 0.2 M). A reação
foi interrompida com 50µL de ácido sulfúrico 1 N por poço e a placa lida imediatamente em
espectrofotômetro com filtro de 492 nM.
5.4.2. Cultivo de Leishmania em amostras de aspirados de baço em meio bifásico para
diagnóstico da LVC
Amostras de aspirados esplênicos (100-200 µL) foram colocadas em cultivo em um meio
bifásico, contendo 1,5 mL de meio sólido (ágar-sangue) e 2 mL de meio Schneider’s
suplementado com 20% de soro fetal bovino. As amostras foram mantidas em cultivo a 23°C e
examinadas semanalmente por microscopia ótica durante quatro semanas. O diagnóstico positivo
foi dado pelo achado de formas promastigotas móveis.
38
5.4.3. Padronização do cell block para avaliação estrutural e fenotípica de amostras
esplênicas
As amostras obtidas por aspiração de baço (100-200 µL) adicionadas em 30 mL de
formalina 10% foram fixadas por 24 h, centrifugadas e os sedimentos colocados em cassetes e
incluídos em parafina.
Cell block com agarose a 1%: as amostras obtidas por aspiração de baço (100-200 µL)
adicionadas em 30 mL de formalina 10% foram fixadas por 24 h, centrifugadas, o sobrenadante
descartado, adicionado agarose 1%, um volume igual ao do sedimento, e em seguida foram
fixadas com formalina 10% (quantidade para completar o tubo) por mais 48 h. As amostras então
foram colocadas em cassetes e incluídos em parafina.
Preparo de células mononucleares a partir de aspirado esplênico para Cell block: amostras
de aspirados esplênicos (100-200 µL) foram adicionados individualmente a 10 mL de RPMI com
200µL de heparina, em tubo de polietileno com tampa e conservado em gelo. No laboratório, o
material foi centrifugado a 1800 rpm, a 4º C, por 10 minutos. Os sedimentos foram tratados com
solução de lise de hemácias (solução de cloreto de amônio a 10%, diluído em H2 O, pH 7,4) por
10 minutos. Após uma etapa de lavagem, os sedimentos foram ressuspensos com 10mL de
formalina 10% e fixados por 24 h. O material foi centrifugado a 3000 rpm, a 4 º C, por 5 minutos,
os sedimentos foram incluídos em gel de agarose a 1%, colocados em cassetes e incluídos em
parafina.
Análise das amostras de Cell block com os diferentes processamentos: foram realizados cortes
seriados de 5-8 μM das amostras, as secções foram coradas pelas técnicas Hematoxilina-Eosina
(HE), Ácido Periódico de Schiff (PAS) e Ácido Periódico – Prata Metenamina (PASM), e
analisadas em microscópio óptico, individualmente, por três pessoas, sem o conhecimento prévio
dos resultados dos testes sorológico e parasitológico, ou seja, foi realizado um estudo cego. As
amostras foram analisadas quanto: (1) A sua representatividade, sendo classificada como ruim,
razoável ou boa, de acordo com a quantidade e qualidade do material obtido; (2) Identificação
das estruturas esplênicas como, polpa vermelha, polpa branca e vasos, de acordo com a presença
39
ou ausência das mesmas; (3) A celuraridade como, linfócitos, macrófagos, plasmócitos,
polimorfonucleares e megacariócitos, sendo estes classificados como, ausente, discreto,
moderado ou bastante. Os resultados relatados dos três observadores foram posteriormente
correlacionados.
5.4.4. Ensaio de imunohistoquímica para avaliação das amostras de cell block
Anticorpos utilizados: Rabbit - anti-human CD3 - Dako; Mouse - anti-human CD79αcy (clone
HM57) – Dako; Rabbit anti-cow S100 - Dako; Mouse - anti-human KI67 antigen (clone MIB-1) DakoCytomation; Rat - anti-canine CD45RA (clone YKIX 753.22) cedido gentilmente por Dr.
Cobbold (Cobbold e Metcalfe, 1994). Como controle negativo foram usados, IgG de rato ou de
camundongo ou de coelho normal, diluído à 1: 500. Anti-IgG de rato biotinilado na diluição de
1:500 (para o CD45RA), anti-IgG de coelho biotinilado na diluição de 1:800 (para o S100) e antiIgG de camundungo biotinilado na diluição de 1:500 (para o KI67) foram utilizados como
anticorpos secundários, e Streptavidina conjugada com peroxidase (Pierce) na diluição de 1:500.
Confecção e processamento das lâminas: Cortes seriados de 5-8 µM foram colocados em
lâminas cobertas com poly-L-lysine (Sigma) e mantidas a temperatura ambiente para secar.
Posteriormente as lâminas foram embebidas em xilol, re-hidratadas em vários gradientes de
álcoois até a água destilada. Em seguida foram submetidas a um tratamento de recuperação de
antígeno mediado por calor, que seguem o protocolo descrito por Shi et al. (2001). Foram
colocados em um recipiente plástico contendo tampão citrato de sódio (pH 6,0) ou tris-EDTA
(pH 9,0) e aquecido em panela de vapor por 30 minutos. Uma vez esfriados, o material foi lavado
duas vezes em PBS, por 5 minutos cada. Em seguida fez-se o bloqueio da peroxidase endógena
com peróxido de hidrogênio e azida sódica diluídos em PBS (Shi et al., 2001). Realizou-se o
bloqueio das reações inespecíficas com PBS + BSA 5%. O anticorpo monoclonal (CD45RA na
diluição de 1:100) e controle negativo foram adicionados e incubados durante a noite a 4°C.
Depois foram realizadas duas lavagens de 5 minutos cada com PBS, e então incubadas com o
anticorpo secundário, por 45 min a 37°C. Em seguida foram incubados com streptavidina
conjugada com peroxidase (Pierce) na diluição de 1:500. Depois de duas lavagens com PBS, a
40
atividade da peroxidase foi desenvolvida com a mistura de 0,25 µg de 3,3-diamidine-benzidine
(Sigma) e 0,05% de peróxido de hidrogênio diluídos em PBS, incubando por dois minutos.
Foram lavadas em água destilada, contra-coradas com hematoxilina, gradualmente desidratadas
com álcoois e montadas em bálsamo canadense (Riedel Haen AG). Por fim foram observadas em
microscópio óptico.
Os anticorpos S100 e KI67, nas diluições de 1:1000 e 1:140 respectivamente, foram
testados utilizando o kit de amplificação de sinal, LSAB + System-HRP (Dakocytomation). E os
anticorpos CD3 e CD79αcy, nas diluições de 1:400 e 1:150 respectivamente, foram testados com
o kit Novolink Max Polimer Detection System (Novacastra), seguindo o protocolo descrito
anteriormente até a etapa da recuperação antigênica, as demais etapas seguiram as instruções do
fabricante.
5.4.5. Padronização da citometria de fluxo para avaliação de aspirado esplênico de cães
Preparo de células mononucleares a partir de sangue periférico e aspirado esplênico: As
amostras de aspirado esplênico (100-200µL) e sangue periférico (3mL) foram adicionadas
individualmente a 10 mL de RPMI com 200µL de heparina, em tubo de polietileno com tampa e
conservado em gelo. No laboratório, os materiais foram centrifugados a 1800 rpm, a 4º C, por 20
minutos. Os sedimentos tratados com solução de lise de hemácias (solução de cloreto de amônio
a 10%, diluído em H2 O, pH 7,4) por 10 minutos. Após uma etapa de lavagem, o sedimento de
cada uma foi ressuspenso em 1mL de RPMI. Para contagem das células viáveis, foram
preparadas alíquotas diluídas 1:2 com Azul de Tripan, e as células contadas em Câmara de
Newbauer. Foram adicionados às amostras aproximadamente 30 mL de RPMI, os materiais
foram colocados em gelo e mantidos na geladeira durante a noite. No dia seguinte, as amostras de
sangue utilizadas como controle (amostra de sangue sem tratamento com colagenase) foram
mantidas no gelo, enquanto que as demais amostras foram centrifugadas a 1800 rpm, a 4º C, por
10 minutos e submetidas a um tratamento com Colagenase dispase 1 mg/mL (Boehringer
Mannheim) por uma hora, a 37º C. Seguido por filtração com gase estéril e adição de
aproximadamente 30 mL de HBSS. Neste momento todas as amostras de aspirado esplênico e de
41
sangue, incluído os controles, foram centrifugadas a 1800 rpm, a 4º C, por 10 minutos, o
sedimento de cada uma foi ressuspenso em 1mL de tampão de FACS 1 (PBS + 0,1% de azida
sódica + 5% de SFB + 5% de soro de coelho), e então foi realizada uma nova contagem de
células viáveis. Por fim, as células foram ajustadas para 1x106 células / poço com tampão de
FACS 1.
Amostras de aspirado esplênico e sangue periférico também foram testadas utilizando
tratamento com Colagenase dispasi (1 mg/mL) + Albumina bovina (10 mg/mL), e com
Colagenase dispasi (1 mg/mL) + Leite em pó desnatado (10%), seguindo o mesmo protocolo
descrito anteriormente.
Processamento das células para citometria de fluxo: As células obtidas por punção esplênica e
venosa foram avaliadas por fluorescência com o anticorpo monoclonal desenvolvido no LPBICPqGM (AB6 - Aguiar et al., 2004b) e os anticorpos anti-CD4 (CA 13.1E4) e anti-CD8 (CA
9.JD3) (adquiridos de Peter Moore, LABL, USA). Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas
foram testados primariamente pela análise de citometria de fluxo. Os procedimentos, incluindo a
seleção de tampões estão de acordo com o protocolo recomendado pelo Canine Leukocyte
Antigen Workshop - CLAW (Cobbold e Metcalfe, 1994). As amostras foram adicionadas em
uma placa de 96 poços de poliestireno, na concentração final de 1x106 células / poço. A placa foi
centrifugada a 2000 rpm, 10 segundos a 4°C, o sobrenadante desprezado e adicionado os
anticorpos primários (AB6, anti-CD4 e anti-CD8) 25 µL/ poço, incubada por 20 minutos, a 4ºC.
Em seguida foi centrifugada a 2000 rpm, 10 segundos a 4°C, o sobrenadante desprezado e
incubada com o anticorpo secundário de coelho (anti- IgG de camundondo biotinilado - Dako),
25 µL/ poço, diluído 1: 500 em tampão de FACS 1, e incubada por 20 minutos, a 4º C. Submetida
a centrifugação a 2000 rpm, 10 segundos a 4°C, o sobrenadante desprezado e adicionado
Streptavidina conjugada a FITC (Amersham) diluído 1:800 em tampão de FACS 1, e incubadas
por 20 minutos, a 4ºC, no escuro. Foi centrifugada a 2000 rpm, 10 segundos a 4°C e lavada três
vezes com tampão de FACS 1. Por fim, as amostras foram ressuspensas em tampão de FACS 2
(PBS + 0,1% de azida sódica), em tubos de poliestireno previamente identificados de acordo com
o anticorpo utilizado. Para diluição e retirada total das amostras da placa, foram adicionados 100
µL de tampão de FACS 2 em cada poço, homogeneizado e então adicionados a 400 µL em cada
42
tubo de poliestireno, e então analisadas no citômetro de fluxo (Becton Dickinson, FACSort,
Mountain View, CA, USA).
5.5. ESTUDO ESTATÍSTICO
A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o programa SPSS (STATISTICAL
PACK SOCIAL SCIENCE v. 12.0), constando de cálculos de médias e desvios-padrão dos
parâmetros estudados e comparação entre médias através do teste Mann Whitney.
43
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1. Cell block
Nesta etapa de padronização, dos 31 cães estudados, 18 foram soropositivos e 13
soronegativos, identificados pelo teste ELISA indireto para anticorpos anti-Leishmania. Dos 18
soropositivos, seis apresentaram cultura positiva.
Na análise histológica das amostras coradas por HE, foi realizada uma avaliação geral das
células presentes, com identificação de material esplênico e sanguíneo, pois a coloração é
adequada para evidenciar características estruturais, visto que a hematoxilina cora os núcleos e a
eosina cora o citoplasma de todas as células. Com a coloração PAS, foi possível uma melhor
visualização das células, pois essa técnica é usada principalmente para corar estruturas contendo
uma
alta
proporção
de
macromoléculas de
carboidratos
(glicogênio,
glicoproteínas,
proteoglicanos), não corando bem as hemácias. Com a coloração PASM, que cora fibras
reticulares e membrana basal, foram observados elementos da arquitetura esplênica, o que
confirmou que o material obtido era representativo do baço e não apenas sangue (Figura 2). As
estruturas identificadas foram, polpa branca, polpa vermelha (Figura 3), vasos e trabéculas
(Figura 4). Células características do tecido esplênico como linfócitos, macrófagos, plasmócitos,
polimorfonucleares e megacariócitos também foram identificadas (Figura 5). A presença de
formas amastigotas do parasito (Figura 5) foi verificada em quatro das amostras anteriormente
classificadas como positivas pelo cultivo.
A análise qualitativa baseou-se nos seguintes parâmetros: representatividade e identificação
das estruturas esplênicas (polpa branca, polpa vermelha e vasos). Segundo o parâmetro
representatividade, 20 (64,5%) das 31 amostras foram classificadas como boas/adequadas, sendo
13 (65%) de cães infectados e sete (35%) de sadios; 11 (35,5%) foram consideradas
ruins/insuficientes para análise, não havendo diferença estatística significativa entre os grupos.
Das 20 amostras classificadas como boas, foram identificadas polpa branca em 16, polpa
vermelha em 19 e vasos sangüíneos em todas (Tabela 1). Cada bloco de parafina contendo o
44
volume de um aspirado esplênico possibilitou a obtenção de uma média de 18 secções. Este
número relativamente pequeno de secções deveu-se ao fato das amostras se disporem de forma
dispersa na largura (base) do bloco de parafina.
Na avaliação semi-quantitativa, onde os valores obtidos foram as médias dos escores das
populações celulares, foi possível identificar um predomínio de plasmócitos (p < 0,0302) nas
amostras de animais infectados, um predomínio de linfócitos (p = 0,0167) nas amostras dos
sadios, e predomínio de macrófagos nas amostras dos cães sadios, não havendo por sua vez, uma
diferença estatística significativa entre os dois grupos (Figura 6).
A
Figura 2: Histologia de aspirado
esplênico, processadas pelo cell block,
corados com HE - material esplênico e
sanguíneo
B
Figura 3: Histologia de aspirado esplênico,
processadas pelo cell block, corados com HE polpa vermelha (A) e polpa branca (B)
45
A
B
C
D
Figura 4: Histologia de aspirado esplênico,
processadas pelo cell block, corados com:
HE - arteríola peniciliar (A), arteríola
comum (B); PASM – Fibras reticulares
(C); PAS – fibras reticulares e
celularidades a ela ligadas (D)
A
B
C
D
Figura 5: Populações celulares esplênicas
através do cell block, coradas com HE linfócitos e macrófagos (A), plasmócitos e
polimorfonucleares (B), megacariócito (C) e
Leishmanias – amastigotas (D)
1
Plasmócitos
2
3
Macrófagos
2
Macrófagos
Plasmócitos
3
Linfócitos
2
Animais sadios
Linfócitos
Animais infectados
Figura 6: Avaliação semi-quantitativa das populações celulares esplênicas através do cell
block. Os valores apresentados são os resultados das médias dos escores.
46
Tabela 1. Análise qualitativa quanto à representatividade e estruturas presentes nas amostras de
aspirado esplênico de cães sadios (não infectados por Leishmania) e infectados pela técnica de
cell block.
Representatividade
Polpa branca
Polpa vermelha
Vasos
n = 20
n = 20
n = 20
Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente
Boa
Ruim
Sadio
7
6
5
2
6
1
7
0
Infectado
13
5
11
2
13
0
13
0
6.1.2. Cell block com agarose a 1%
Nessa etapa, foram analisadas amostras de 20 cães, sendo 16 soropositivos e quatro
soronegativos, identificados pelo teste ELISA indireto para anticorpos anti-Leishmania. Dos 16
soropositivos, seis tiveram o diagnóstico parasitológico da infecção confirmado por cultivo.
A análise histológica das amostras coradas pela técnica HE revelou a presença de estruturas
esplênicas e material sanguíneo. As estruturas identificadas foram polpa branca, polpa vermelha e
vasos. Com a inclusão das amostras em agarose a 1%, obtivemos uma média de dois blocos por
amostra, com conseqüente aumento no número de secções. Porém as amostras foram
classificadas como insuficientes para análise quantitativa, pois encontravam-se dispersas no
comprimento do bloco de agarose, impossibilitando a avaliação real das estruturas esplênicas
obtidas através da punção.
A coloração por PAS possibilitou uma melhor visualização da celularidade, com
identificação de linfócitos, macrófagos, plasmócitos, polimorfonucleares e megacariócitos. A
coloração pelo PASM permitiu a identificação de fibras estruturais esplênicas. Nas secções destas
amostras não foram encontradas formas amastigotas do parasito.
47
6.1.3. Cell block com camada leucocitária a partir de aspirado esplênico
Foram analisadas amostras de leucócitos purificados a partir de aspirado esplênico de oito
cães, sendo três soropositivos e cinco soronegativos pelo ELISA indireto. Dos três soropositivos,
um apresentou cultura positiva.
Na análise histológica das amostras coradas pelas técnicas HE, PAS e PASM foram
identificadas estruturas esplênicas, assim como material sanguíneo. As estruturas identificadas
foram, polpa branca, polpa vermelha e vasos. Células características do tecido esplênico como,
linfócitos, macrófagos, plasmócitos, polimorfonucleares e megacariócitos também foram
identificadas. A presença do parasito não foi encontrada nas amostras.
Na análise qualitativa da representatividade das oito amostras, sete foram classificadas
como boas/adequadas, sendo duas de cães infectados e cinco de sadios, e ruim/insuficiente para
análise em uma. Das sete amostras classificadas como adequadas, foram identificadas polpa
branca em duas, polpa vermelha em todas e vasos em seis (Tabela 2).
A ausência de identificação de polpa branca pode ter sido decorrente das manipulações,
como a utilização do tampão de lise de eritrócitos, que pode promover a destruição dos
leucócitos, quando exposto por tempo excessivo a solução, assim como as lavagens e filtração
que as amostras foram submetidas.
Com a lise das hemácias, foi possível reduzir significativamente o diâmetro da secção e
com a inclusão das amostras em agarose a 1%, foram obtidos blocos maiores e conseqüentemente
um aumento significativo no número de secções. Porém, observou-se que as células
apresentavam alterações morfológicas devido ao tratamento com o tampão de lise de eritrócitos,
o que poderia interferir com a interpretação das análises imunofenotípicas com anticorpos
monoclonais, visto que o tampão de lise pode ocasionar alterações nas estruturas terceárias e/ou
quaternárias dos antígenos, tornando-os inacessíveis para os anticorpos.
48
Tabela 2. Análise qualitativa quanto à representatividade e estruturas presentes nas amostras de
aspirado esplênico de cães sadios (não infectados por Leishmania) e infectados, pela técnica de
cell block com preparo de células mononucleares.
Representatividade
Boa
Ruim
Sadio
5
0
Infectado
2
1
Polpa branca
Polpa vermelha
Vasos
Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente
n= 7
n=7
n=7
n= 7
n= 7
n=7
2
3
5
0
5
0
0
2
2
0
1
1
6.1.4. Imunohistoquímica em lâminas de cell block
Secções obtidas das amostras processadas pela técnica de cell block, sem a etapa de lise de
eritrócitos e confeccionadas sem agarose a 1%, foram submetidas a imunohistoquímica. Nessa
etapa, foram utilizados os anticorpos monoclonais anti-CD3 (marcador de linfócitos T), antiCD79α (marcador de linfócitos B), S100 (marcador de células dendríticas), KI-67 (marcador da
proteína nuclear KI67, expressa durante a proliferação celular) e CD45RA (marcador de
linfócitos T ativados). Foi observada boa marcação para todos os anticorpos testados, podendo-se
concluir que o material submetido a esta técnica pode ser utilizado para imunofenotipagem de
esplenócitos (Figura 7).
49
A
B
C
D
E
Figura 7: Imunohistoquímica em amostras de aspirado esplênico, processadas pelo cell
block, marcadas com: CD3 (A), KI76 (B), S100 (C), CD79α (D), CD45RA (E).
50
6.2 Padronização da citometria de fluxo com AcMo em aspirados esplênicos de cão
Para padronização da técnica de citometria de fluxo utilizando amostras de aspirado
esplênico, foram testados três diferentes tratamentos enzimáticos para separação das células
presentes nos fragmentos obtidos com a punção. Todos eles utilizaram amostras de sangue
periférico como controle de marcação, pois é um material que não necessita de tratamento
enzimático para ser submetido à técnica. O primeiro deles utilizou amostras de aspirado de baço
de sete cães, sendo quatro animais soropositivos e três soronegativos, identificados pelo teste
ELISA indireto para anticorpos anti-Leishmania. Dos quatro cães soropositivos, um apresentou
cultura positiva. Nessa etapa de padronização, as amostras de baço foram tratadas com
colagenase dispasi (1 mg/mL), por uma hora, a 37ºC. Observamos que os espécimes tratados com
a enzima apresentavam menor proporção (animal 6) ou praticamente ausência de marcação dos
linfócitos T, quando comparados com as amostras de sangue não tratadas (Tabela 3 e 4).
Tabela 3. Percentagem das populações celulares presentes nas amostras de sangue periférico de
cães com leishmaniose e cães sadios, pela técnica de citometria de fluxo, amostras utilizadas
como controle.
Anticorpos Animal 1* Animal 2* Animal 3* Animal 4* Animal 5 Animal 6 Animal 7
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
AB6
79,81
92,65
84,93
81,83
78,42
95,71
94,75
IH1
2,71
4,14
3,06
2,83
2,42
13,46
21,52
Anti-CD4
9,75
7,16
20,78
21,36
16,83
29,20
50,68
Anti-CD8
27,31
78,91
25,17
25,15
24,91
30,11
23,71
* Animais infectados
51
Tabela 4. Percentagem das populações celulares presentes nas amostras de aspirado esplênico de
cães com leishmaniose e cães sadios, através da técnica de citometria de fluxo, utilizando
tratamento enzimático com colagenasi dispasi (1 mg/mL).
Anticorpos Animal 1* Animal 2* Animal 3* Animal 4* Animal 5 Animal 6 Animal 7
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
AB6
18,62
89,25
13,22
76,36
86,86
75,20
15,91
IH1
1,90
2,72
1,73
3,77
2,55
11,13
4,75
Anti-CD4
1,49
1,17
0,97
1,18
1,15
1,48
1,25
Anti-CD8
1,73
4,70
3,63
1,44
4,97
20,10
5,99
* Animais infectados
Para verificar se a ausência de marcação era decorrente do tratamento enzimático ou
problemas com as amostras de baço, amostras de sangue de sete cães, todos com resultados
sorológicos e parasitológicos negativos, foram testadas com o mesmo protocolo. Utilizando
sempre amostras de sangue periférico não submetidas ao tratamento enzimático como controle.
Dessa forma, foi verificado que com este teste as amostras de sangue tratadas com a colagenase
dispasi apresentaram a mesma redução na marcação dos linfócitos T (Tabela 5).
Tabela 5. Percentagem das populações celulares presentes nas amostras de sangue periférico de
cães com leishmaniose e cães sadios, através da técnica de citometria de fluxo.
Amostras sem tratamento enzimático (%)
Anticorpos
Animal 1
Animal 2
Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Animal 7
AB6
74,83
6,70
42,33
53,98
80,59
45,47
34,74
Anti-CD4
9,72
4,31
20,33
1,85
9,65
4,09
2,25
Anti-CD8
12,58
15,75
1,17
12,50
17,07
9,48
9,45
Amostras tratadas com colagenase dispasi (%)
Anticorpos
Animal 1
Animal 2
Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6 Animal 7
AB6
77,97
61,51
65,95
57,27
63,30
84,87
61,71
Anti-CD4
0,15
0,18
0,30
0,59
0,35
0,77
0,07
Anti-CD8
4,06
3,21
2,76
3,57
2,81
3,92
1,85
52
Com isso, verificou-se que, possivelmente devido à presença de impurezas como tripsina e
outras proteases na solução da colagenase dispasi estaria havendo alterações nas moléculas de
superfície dos linfócitos. Para tentar solucionar este problema foram testados mais dois diferentes
tratamentos enzimáticos, um utilizando a colagenasi dispasi (1 mg/mL) contendo albumina
bovina (10 mg/mL) e outro com colagenasi dispasi (1 mg/mL) contendo leite em pó desnatado
(10%). Neste teste foram utilizados também o tratamento com colagenase dispase (1 mg/mL)
como comparativo e sangue sem tratamento como controle. Foram testadas apenas amostras de
sangue periférico, obtidas de um animal com sorologia e parasitologia negativas. Então,
observou-se que as amostras tratadas com colagenase e leite apresentaram uma proporção de
linfócitos T marcados semelhante ao controle, enquanto que as células submetidas aos demais
tratamentos enzimáticos apresentaram uma menor proporção (Gráfico 1).
Com base nesse resultado, partimos para a aplicação da técnica em amostra de aspirado
esplênico, obtida de um animal soropositivo e parasitológico negativo. E observamos que o
tratamento enzimático utilizando colagenase dispasi e leite permitiu a identificação das
subpopulações de linfócitos T (Gráfico 2).
53
AB6
CD4
CD8
A
Nº de células
B
C
D
Intensidade de fluorescência
Gráfico 1. Aquisição e análise dos dados de células do sangue periférico não tratadas (a);
tratadas com colagenase dispasi 1mg/mL + albumina bovina10 mg/mL (b); tratadas com
colagenase dispasi 1mg/mL + 10% de leite em pó desnatado (c); tratadas com colagenase dispasi
1mg/mL (d), com marcação para AB6, CD4 e CD8.
54
AB6
CD8
CD4
B
Nº de células
A
C
Intensidade de fluorescência
Gráfico 2. Aquisição e análise dos dados de células do sangue periférico não tratadas (a);
tratadas com colagenase dispasi 1mg/mL + 10% de leite em pó desnatado (b); células de aspirado
esplênico tratadas com colagenase dispasi 1mg/mL + 10% de leite em pó desnatado (c), com
marcação para AB6, CD4 e CD8.
55
7. DISCUSSÃO
O presente estudo dá continuidade à linha de pesquisa de avaliação do uso potencial de
amostras de baço de cão, obtidas por meio de biópsia aspirativa com agulha fina, com o objetivo
de comparar técnicas imunoquímicas na avaliação fenotípica de esplenócitos. Métodos bem
padronizados contribuirão para o conhecimento na área experimental e no diagnóstico da
leishmaniose visceral canina (LVC), permitindo o desenvolvimento de ferramentas úteis para
medidas de controle e monitoramento da doença. Em trabalhos anteriores, foi demonstrada a
aplicabilidade de tais amostras para o diagnóstico parasitológico da LVC, a segurança da técnica
de biópsia aspirativa com agulha fina em cães, e sua viabilidade para análise imunofenotípica de
amostras esplênicas de cães com diferentes perfis clínicos (BARROUIN-MELO et al., 2006a;
2006b). O presente estudo descreve a aplicação de amostras de aspirado esplênico na
padronização das técnicas de cell block com marcação imunoquímica e citometria de fluxo, na
avaliação de cães portadores ou não de infecção por Leishmania.
A exatidão do diagnóstico citopatológico em amostras de aspirado de órgãos com agulha
fina, processadas pela técnica de cell block, vem sendo relatada em estudos realizados na
medicina humana.
A precisão do diagnóstico em tumores hepáticos chega a 100%, sendo
também alta na avaliação dos subtipos de malignidades (CEYHAN et al., 2006). Da mesma
forma, o estudo diagnóstico de aspirados pulmonares (WU et al., 2002) e de tireóide, onde a
técnica representa um avanço no diagnóstico, agora é considerado um método disponível e muito
efetivo. A citologia permite distinguir elementos de benignidade e malignidade em nódulos de
tiróides, com precisão que chega a 95% (KAMAL et al., 2003).
No presente estudo, a técnica de cell block padronizada com amostras de aspirado esplênico
processadas sem submissão a lise de hemácias e inclusão em gel de agarose a 1%, mostrou ser
um método adequado à avaliação das estruturas e celularidade presentes nos fragmentos e
material sangüíneo obtidos com a punção do baço. Foi observada na técnica de citocentrifugação
em lâmina, com o mesmo tipo de amostra, a presença de agregados celulares que correspondem
aos fragmentos esplênicos verificados no cell block. A avaliação desses fragmentos que
56
permaneceram presentes nas preparações citocentrifugadas e submetidas a imunocitoquímica,
não pode ser realizada devido a sobreposição das células, mas ficou claro que esta avaliação pode
contribuir para conclusões diagnósticas mais precisas (BARROUIN-MELO et al., 2006b).
Com o cell block, identificamos com segurança estruturas como a polpa branca, pela
presença de material denso com predominância de linfócitos em vários estágios de maturação.
Esta região está relacionada com a captura dos antígenos circulantes pelos macrófagos ou pelas
células dendríticas (AICHELE et al., 2003), ou seja, nessa área ocorre o encontro entre o antígeno
e as células apresentadoras de antígeno, com ativação linfocitária e desenvolvimento da resposta
imune específica (ATTANAVANIVH e KEARNEY, 2004). Na polpa branca também ocorrem os
processos de maturação, proliferação e diferenciação de células B, gerando linfócitos B de
memória e resposta imune secundária (CHOE, 1998; HARGREAVES, 2001), além da ativação
da resposta celular a partir da ativação dos linfócitos T, com o desenvolvimento da resposta
adaptativa.
Foi identificada também a presença de polpa vermelha, estrutura que dá continuidade à
polpa branca, constituída por um arcabouço de células e fibras reticulares contendo macrófagos,
monócitos, linfócitos, plasmócitos e elementos do sangue (eritrócitos, plaquetas e granulócitos) e
com presença de trabéculas e arteríolas peniciliares. Esta região está relacionada com as funções
de hematopoiese, armazenamento de sangue e hemocaterese, funciona como via de saída para a
maioria das células linfóides circulantes (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1990; GARTNER e
HIATT, 2002).
O material submetido à técnica de cell block nos fornece informações qualitativas mais
precisas quanto à arquitetura esplênica, visto que as amostras são mais conservadas em
comparação à técnica de imunoquímica em amostras citocentrifugadas (BARROUIN-MELO et
al., 2006b). De fato, as células não são submetidas a muitas manipulações ou processamentos
como lavagens seqüenciais que podem levar a perda celular. Da mesma forma, os reagentes
utilizados para a lise de eritrócitos, objetivando reduzir o volume da amostra e conseqüentemente
a quantidade de reagentes na imunofenotipagem, promoverão alterações morfológicas das
células, como foi constatado neste estudo nas análisea comparativas das técnicas de cell block.
57
Domenech et al. (2003) descreveram que o processamento rotineiro de tecidos para exames
histopatológicos envolve normalmente uma etapa de fixação em aldeídos, o que resulta em uma
diminuição de antigenicidade de moléculas de superfície celular. Por outro lado, os tecidos
fixados em formalina e embutidos em parafina têm vantagens sobre as secções congeladas, pois
são de manipulação mais fácil e melhor conservados quanto à arquitetura e morfologia do órgão.
As amostras avaliadas com o cell block no presente estudo de fato apresentaram uma
manipulação mais fácil, visto que, a fixação em formalina possibilita a realização de trabalho a
campo, sem a necessidade de equipamentos especiais. O material, assim, pode ser processado
alguns dias depois no laboratório, mantendo mesmo assim uma boa conservação morfológica dos
fragmentos esplênicos e células presentes na amostra.
Na busca de maximizar a representatividade da amostra de aspirado esplênico, foi avaliada
neste estudo a inclusão das amostras em gel de agarose a 1%, com o intuito de condensar mais o
material coletado através da punção.
Obteve-se, de fato, um número de secções
significativamente maior do que o obtido com a simples inclusão do material em parafina.
Entretanto, observou-se que as amostras se espalhavam no volume (comprimento) do gel (Figura
8), impossibilitando a avaliação quantitativa da amostra por secção. Para avaliar este material
seria necessário analisar um número maior de secções por amostra, consumindo assim, mais
reagentes e tempo.
Figura 8: Amostras de aspirado esplênico incluídas em gel de agarose 1%.
58
Na análise qualitativa da representatividade das 20 amostras processadas pela técnica de
cell block com inclusão direta em parafina, classificadas como boas/adequadas, 13 foram de cães
infectados e sete de sadios. E classificadas como ruins/insuficientes para análise em 11, sendo
seis de cães sadios e sete de infectados. Mesmo não havendo diferença estatística entre os grupos,
foi verificado que a aspiração esplênica de animais sadios sempre produziu amostras com menor
volume que as obtidas de cães com LV. Atribuiu-se tal constatação ao tamanho e anatomia
esperados para baços sadios, reduzido e de consistência menos friável quando comparados aos
baços de cães infectados (TRYPHONAS et al., 1977). Essa diferença, entretanto, não interferiu
nos resultados e na qualificação da técnica.
A partir da avaliação semiquantitativa das populações celulares pelo cell block com
corantes histoquímicos, realizada de forma imparcial, ou seja, sem o conhecimento prévio de
quais eram as amostras dos cães sadios ou infectados, visando não interferir tendenciosamente
nos resultados, foi observado um predomínio de plasmócitos (p < 0,0302) nas amostras dos cães
infectados, quando comparado as dos sadios. O aumento do número de plasmócitos em órgãos
linfóides é um achado comum na leishmaniose visceral (TRYPHONAS et al., 1977; VERESS et
al., 1977; VERESS et al., 1983; KEENAN et al., 1984). Martinez-Moreno (1993) descreveu um
aumento de 52% no número de plasmócitos esplênicos em cães naturalmente infectados, quando
comparados com animais não infectados.
No presente estudo, foi encontrada uma proporção menor de macrófagos nas amostras dos
cães infectados em comparação às dos animais sadios. Não houve, entretanto, diferença
estatística significativa entre os dois grupos. Tal achado mostrou-se diferente do que foi
observado com imunocitoquímica em amostras de aspirado esplênico citocentrifugadas
(BARROUIN-MELO et al., 2006b) e dos estudos que avaliaram as mudanças histopatológicas no
curso da infecção por Leishmania (NATAMI et al., 2000; MELBY et al., 2001; TAFURI et al.,
2001; KAYE et al., 2004). Tal observação pode ser explicada pelo fato dos cães infectados
apresentarem uma reposta predominatemente humoral, com menor ativação e proliferação de
macrófagos, e cosequentemente inabilidade para responder a antígenos de Leishmania
(MORENO et al., 1999; IKEDA et al., 2003).
59
Utilizando-se corantes histoquímicos, observou-se também uma maior proporção de
linfócitos (p = 0,0167) nas amostras dos cães sadios em comparação com as amostras de cães
infectados por L. chagasi, na avaliação de lâminas produzidas com o cell block no presente
estudo. Já foi demonstrado que a imunossupressão que ocorre na LVC está diretamente
relacionada a mudanças nas subpopulações de linfócitos do hospedeiro (PINELLI et al., 1994:
REIS et al., 2006). A avaliação com anticorpos monoclonais, em técnica imunohistoquímica,
permite avaliar as proporções dos diferentes tipos de linfócitos, determinando o tipo de resposta
desenvolvida, se predominantemente humoral ou celular. No presente estudo, utilizamos os
anticorpos monoclonais anti-CD3, anti-CD79α, S100, KI-67 e CD45RA em procedimentos
imunoistoquímicos em lâminas confeccionadas com as amostras de baço processadas por cell
block e verificou-se que é possível avaliar as diferentes populações celulares a partir de amostras
processadas por essa técnica.
A validação da imunohistoquímica realizada em material esplênico processado por cell
block, padronizada no presente estudo, é a etapa seguinte, já iniciada. Utilizando anticorpos
específicos para marcação de antígenos de leucócitos de cão em amostras de cell block,
demonstramos que a técnica permite a realização de imunohistoquímica. Devido à baixa
disponibilização de anticorpos monoclonais específicos para leucócitos de cão, que funcionem
em material parafinizado, foi necessário utilizar alguns anticorpos humanos como o anti-CD3,
anti-CD79α e KI67, que apresentam reação cruzada, e kits de amplificação de sinal, para
realização da técnica. Estudos realizados por Gendelman et al. (1983) e Holgate et al. (1986), já
relatavam que muitos anticorpos monoclonais anti-leucócitos só são úteis para marcar secções de
tecidos congelados, que em sua maioria apresentam baixa definição morfológica, e não reagem
prontamente com tecidos fixados com formaldeído e parafinados (GENDELMAN et al., 1983;
HOLGATE et al., 1986)
Neste estudo, foram também testados diferentes tratamentos com amostras de aspirado
esplênico para obtenção de uma suspensão celular representativa do baço, passível de marcação
por anticorpos monoclonais, para avaliação por citometria de fluxo, para análise imunofenotípica
de esplenócitos de cães.
60
Através do uso da citometria de fluxo algumas perguntas relacionadas com a resposta
imune desenvolvida na LVC, poderão ser respondidas. Tendo em vista que a citometria é uma
técnica que permite a avaliação de múltiplas propriedades físicas e biológicas de uma célula,
graças ao uso de fluorescência, torna-se possível realizar análises fenotípicas celulares
quantitativas e funcionais, utilizando para isto a identificação de antígenos de superfície e
internos com anticorpos monoclonais. Em relação à microscopia de fluorescência ou
imunohistoquímica, a citometria oferece vantagens como poder analisar grandes quantidades de
células e subconjuntos de células em poucos minutos, tem objetividade, pode analisar
multiparâmetros, possui alta reprodutibilidade e é um sistema completamente automatizado.
Como desvantagens, só permite analisar células em suspensão, os custos envolvidos com
equipamentos e reagentes são elevados e necessita de pessoal especializado para o manuseio do
citômetro.
Existem alguns estudos com cães, utilizando a citometria de fluxo para avaliação
imunofenotípica de órgãos sólidos como fígado (SAKAI et al., 2003) e baço (SANCHEZ et al.,
2004). Nesses trabalhos, foram utilizadas enzimas proteolíticas como a colagenase para
dissociação dos tecidos, e filtração para obtenção de células em suspensão. No presente estudo,
foi utilizada a colagenase dispasi para a dissociação do tecido esplênico que apresenta-se com
grumos e fragmentos no aspirado. Para filtração, foi utilizado filtro de gaze, visando reduzir ao
máximo a perda celular.
Para obtenção de células purificadas a partir de órgão sólido, além da dissociação e filtração
das amostras, a maioria dos trabalhos descreve também a utilização de Percoll (SAKAI et al.,
2003) ou Ficoll Histopaque (SANCHEZ et al., 2004) para separação dos leucócitos. No presente
trabalho, esses gradientes não foram utilizados porque, além do volume de um aspirado esplênico
ser pequeno (de 200 a 500 microlitros), os gradientes selecionam células por densidade,
excluindo a população de granulócitos juntamente com os eritrócitos. A literatura indica que para
análise de sangue periférico, utiliza-se somente a lise dos eritrócitos (REIS et al., 2005:
FALDYNA, et al., 2001) ou separação por gradiente de densidade (FALDYNA, et al., 2001). No
presente trabalho, como o objetivo foi a obtenção de um preparado celular que refletisse com a
máxima representaividade todos os leucócitos presentes da amostra, foram utilizados os
61
procedimentos de lise dos eritrócitos com tampão a base de cloreto de amônio e digestão das
fibras de colágeno com colagenase.
Verificou-se, no presente estudo, que a preparação com colagenase promove, em grau ainda
a ser determinado em trabalhos futuros, agressão às células, levando a alterações morfológicas,
conforme observadas durante as contagens de células viáveis. A avaliação com a citometria de
fluxo mostrou interferência nas marcações com anticorpos monoclonais após o tratamento com a
colagenase. Constatou-se que as amostras de sangue e de baço submetidas ao tratamento com a
colagenase a 1mg/mL apresentavam ausência ou perda de marcação dos linfócitos T quando
comparadas as amostras não tratadas, indicando ação da enzima sobre as moléculas de superfície
dos linfócitos. O problema foi solucionado com a adição de leite desnatado na solução de
colagenase. As proteínas do leite parecem ter fornecido substrato competitivo para as proteases
presentes na solução enzimática, liberando os sítios de ligação das moléculas de superfície celular
dos linfócitos T, para o anticorpo monoclonal utilizado nos ensaios de citometria. De fato, após o
tratamento enzimático com colagenase dispasi contendo leite, foi observada uma proporção
semelhante de linfócitos marcados entre as amostras tratadas e não tratadas.
Para avaliar melhor até que ponto essas alterações interferem na imunofenotipagem de
amostras de aspirado esplênico, será necessária a realização de estudos mais detalhados,
avaliando a marcação dos linfócitos após cada manipulação - lise de eritrócitos e utilização de
diferentes enzimas proteolíticas.
A eficiência de ensaios de citometria de fluxo para avaliação da resposta imune canina
ainda requer padronização. Apesar de vários estudos usarem células mononucleares semipurificadas, em geral oriundas de sangue periférico, não há uma metodologia que forneça valores
de referência para imunofenotipagem dos leucócitos (REIS et al., 2005). Além dos aspectos
técnicos, inerentes aos procedimentos de manipulação laboratorial das amostras, as diferentes
proporções de linfócitos observadas no presente estudo podem ser decorrentes de fatores como
raça, idade, gênero e estado nutricional de cada animal. Outros autores já demonstraram
diferenças atribuídas a idade e fatores como diferenças nos protocolos de imunofenotipagem,
62
qualidade e tipo de anticorpos monoclonais utilizados, métodos de manipulação das amostras e
de análise dos dados (FALDYNA et al., 2001; GREELEY et al., 2001; HEATON et al., 2002).
As técnicas de cell block e citometria de fluxo aplicadas em amostras de aspirado esplênico,
nos possibilita ampliar os conhecimentos a respeito das células de tecidos linfóides envolvidos na
resposta de resistência e susceptibilidade à infecção, e permite realizar avaliações sobre a
dinâmica da resposta imune esplênica no decorrer de ensaios experimentais com candidatos a
imunoterapia e vacina contra LVC. Bem como avaliar a evolução da doença ou da resposta ao
tratamento em um mesmo animal, visto que a técnica é realizada com amostras obtidas in vivo,
reduzindo desta forma o número de animais sacrificados para estudos sobre a doença, atendendo
aos princípios éticos dos 3Rs: Reduction (Redução), Refinement (Refinamento) e Replacement
(Substituição). Tendo em vista que a maioria dos dados caracterizando leucócitos de cão, obtidos
por meio de técnicas de imunofenotipagem, é concernente a células do sangue periférico
(WILLIAMS, 1997; BYRNE et al., 2000a, 2000b; CHABANNE et al., 2000; FALDYNA et al,
2001; GREELEY et al., 2001; OTANI et al., 2002; REIS et al., 2005), ou cortes histológicos
obtidos post-mortem (VERESS et al., 1997; SAKAI et al., 2003; STEIN et al., 2004; FALDYNA
et al., 2005). Ainda, com o desenvolvimento de técnicas e reagentes identificadores de moléculas
e componentes do sistema imune canino, serão possíveis o desenvolvimento e aprofundamento
dos estudos no campo do diagnóstico e da terapêutica, gerando conhecimentos e ferramentas
aplicáveis à medicina veterinária com implicações na medicina humana, haja vista a equivalência
das doenças.
63
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
-
A técnica de cell bloc” aplicada em amostras obtidas por punção esplênica:
•
Permite a avaliação estrutural do baço de cães sadios ou com leishmaniose visceral, p ois a
técnica permitiu a análise de uma quantidade de material esplênico significativo e bem conservado.
•
Permite a avaliação qualitativa, semi-quantitativa e fenotípica das células e sua
distribuição nos diferentes compartimentos esplênicos, pois a técnica ofereceu material
representativo das populações de leucócitos esplênicos passíveis de análises acerca da resposta imunoinflamatória órgão-específica.
•
Mostrou-se promissora como ferramenta para o diagnóstico e acompanhamento das
alterações esplênicas em cães, com uso potencial na clínica e estudos experimentais. Pois é
uma técnica realizada com o animal vivo e que pode ser repetida seqüencialmente com segurança.
As etapas realizadas para padronização da citometria de fluxo na análise celular em
amostras de aspirado esplênico:
•
Indicaram a possibilidade de identificação e a necessidade de ajustes para quantificação
da população leucocitária com AcMo. visto que o tratamento das amostras de aspirado esplênico
com a solução de colagenase dispasi contendo 10% de leite e m pó desnatado, permitiu a obtenção de
suspensões de célula única na etapa de preparação de células mononucleares, com marcação satisfatória dos
linfócitos presentes na amostra.
•
Sugerem que a molécula indentificada pelo AB6 parece não ter sido afetada pela
preparação enzimática da colagenase dispasi, tanto quanto as moléculas de CD4 e CD8.
64
9. PERSPECTIVAS
•
Utilizar a técnica de cell block em grupos de cães provenientes de uma área endêmica
para leishmaniose visceral, classificados sob os parâmetros de parasitismo positivo ou
negativo, resposta imune humoral e intensidade de sinais clínicos;
•
Avaliar se a técnica de cell block é sensível na identificação de diferenças na proporção de
sub-populações de esplenócitos in situ possivelmente associadas à qualidade da resposta
imune dos animais portadores da infecção por Leishmania e intensidade da doença
clínica.
•
Aplicar a técnica de citometria de fluxo em amostras de aspirado esplênico de um grupo
de cães com diferentes perfis clínicos, visando validar a técnica.
•
Avaliar as possíveis interferências da lise de eritrócitos e tratamentos enzimáticos na
imunofetipagem de leucócitos esplênicos de cão, utilizando a técnica de citometria de
fluxo.
65
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77
APÊNDICE 1
Manuscrito I:
Evaluation of the phenotypic variation of canine splenic leucocytes in visceral leishmaniosis
by cell block technique.
Este trabalho resultou da padronização do cell block, uma técnica que até o presente, não havia
sido aplicada em estudos na medicina veterinária, e que mostrou-se promissora para avaliação da
resposta imune celular de cães com leishmaniose e outras doenças linfoproliferativas. Sendo o
primeiro trabalho realizado com aplicação da técnica em amostras de aspirado esplênico.
78
Title: Evaluation of the phenotypic variation of canine splenic leucocytes in visceral
leishmaniosis by cell block technique.
Names of authors: SANTOS, Silvana Ornelas 2,3; AMARAL, Jamille Nonato 2; VASSALLO,
José 5; RAMOS, Eduardo 4; SANTOS, Washington Luis Conrado dos 3; BARROUIN-MELO,
Stella Maria 1,2
Addresses of affiliations:
1
Departamento de Patologia e Clínicas, Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia,
Av. Ademar de Barros 500, Salvador 40170-000, Brazil
2
Laboratório de Infectologia Veterinária, Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia,
Av. Ademar de Barros 500, Salvador 40170-000, Brazil
3
Laboratório de Patologia e Biointervensão, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo
Cruz, Rua Valdemar Falcão 121, Salvador 40295-001, Brazil
4
Laboratório Histopatologia, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz,
Rua Valdemar Falcão 121, Salvador 40295-001, Brazil
5
Deperatamento de Anatomia Patológica, Universidade Estadual de Campinas
Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Distrito de Barão Geraldo, Campinas 13083-970, Brasil
79
ABSTRACT
Structure alterations of cell population of the spleen constitute an additional cause of
immunosuppressant in infectious and hematopoietic diseases. In the present study, we present a
technique based on fine needle aspiration and cell-block for the diagnosis and follow-up of
splenic alterations in dogs. 59 dogs from an endemic area for visceral leishmaniosis (VL) were
studied. The animals underwent clinical, serological (ELISA) and parasitological examinations
for diagnosis VL. Two samples of spleen aspirates from each dog were individually added to a
biphasic culture medium, for parasite culture and to formalin for cell block preparations. The
specimens put in formalin were subjected to three different procedures: 1.Direct inclusion in
paraffin, 2. Inclusion in agarosis and later in paraffin, and 3. Erythrocytes lysis and inclusion in
paraffin. Serial cuts of 5-8 mM were stained by Hematoxilin and Eosin (HE), PAS and PASM
techniques, and analyzed by optical microscopy. The direct inclusion in paraffin presented itself
as the best technique for sample preparation for cell block. From the 31 dogs studied using this
technique, 18 were seropositive and 13 seronegative for anti-Leishmania antibodies. From the 18
positive dogs, six were culture positive for the parasite. The microscopic examination of the cell
block preparations allowed the identification of structures like red pulp, white pulp, vessels,
trabeculae and characteristic cells of the splenic tissue. There was a predominance of plasmocytes
(p < 0,0302) in the samples of infected dogs, of lymphocytes in healthy dogs, and there was a
presence of Leishmania amastigotes in four samples former identified by culture. The cell block
technique applied to fine needle spleen aspirates proved to be useful, practical and effective to
structural evaluation and of the phenotype of dogs’ spleen.
Key Words: dog, visceral leishmaniosis, spleen, cell block.
80
1. INTRODUCTION
The zoonotic visceral leishmaniosis (ZVL) is caused by parasites that belong to the complex
Leishmania donovani (L. d. infantum syn L. d. chagasi), widely distributed in Mediterranean
countries, east European countries, North of Africa and Americas (KONTOS & KOUTINAS,
1993; SHERLOCK, 1997; STRAUSS-AYALI et al., 2007). A a public healthy problem, this is
one of the most important diseases in about 80 countries of Asia, Africa and Latin America
(ASAFORD et al., 1992). Worldwide, the prevalence of visceral leishmaniosis (VL) is estimated
in 12 million new cases, with 400 000 to 2 000 000 new cases that are reported each year. (PAUL
et al., 1997). The Leishmania chagasi had been identified in humans, dogs, cats, wild dogs,
marsupials and rodents in Brazil (IKEDA-GARCIA et al., 2007). The dogs are the main
reservoirs for this parasite in endemic areas. The disease is most prevalent disease in canine
population than in human population, beside the fact that the dogs present a higher level of skin
parasitism (FEITOSA et al., 2000).
There is a increasing demand for techniques and applicable reagents, for veterinary
medicine and clinical research, to the identification and the study of cells of the immune system
of several animal species, as the necessity of advancing in the research of immunology infections
and other diseases with the immunological involvement. The dog participate in cycles of
important zoonotic infections, and, as well, is considered as a useful model for studying some of
the diseases that affect human beings. A wide variety of canine diseases have equivalent in
human beings diseases (WILLIAMS, 1997; MORENO e ALVAR, 2002; REIS et al., 2005).
The importance of defining and understanding the aspects and components of the organspecific immune response in dog’s spleen elapse from its physiological functions in immune
response, from the character of Leishmania infection in dogs, as well as studies that demonstrated
its crucial role in the evolution of the infection to a clinical disease or cure in murine models
(BLAVIER et al., 2001; NATAMI et al., 2000).
Splenic samples obtained by aspirative technique using fine needle in dogs showed to be
ideal in parasitological diagnostic methods and splenic puncture feasible in animals under
81
different clinical conditions (BARROUIN-MELO et al., 2006a). In other study developed by our
group (BARROUIN-MELO et al., 2006b), the use of fine needle spleen samples for H&E and
immunochemical analyses showed to offer representative material of splenic leucocytes for the
study of immunoinflammatory organ-specific response. The application of the method in a
comparative study between healthy and Leishmania-infected dogs revealed significant
differences among the leucocytes population, marked both with conventional stain, as with
monoclonal antibodies among distinct groups of dogs.
Our studies have showed that the puncture of the spleen in live animals can be
sequentially repeated and that the splenic material obtained through the technique presented good
representative of the leucocytes population (BARROUIN-MELO et al., 2006a; 2006b). In this
study, we describe the evaluation of canine spleen leucocytes, obtained by aspirative biopsies
with fine needle and processed through cell block technique, by inclusion of cellular fluid in
paraffin blocks. The method allowed the preparation of slides for microscopic evaluation of the
cellularity
by histochemical techniques (staining by
PAS, PASM and
HE) and
immunochemistry, with monoclonal antibodies. In the present study, we aimed to utilize the cell
block method to analyze the phenotype and the structural distribution of splenic leucocytes of
dogs from an endemic area for VL, in different clinical conditions, to evaluate the applicability of
the technique.
2. MATERIAL AND METHODS
2.1. Animals and ethics
In this study were used 59 dogs, of both sex, with variable ages and races. All the dogs
naturally infected with Leishmania examined were picked in urban and periurban areas, located
in the North Coast of the State of Bahia, Brazil along Estrada do Coco and Linha Verde, and in
the district of Jequié, where the canine visceral leishmaniasis (CVL) is endemic and human cases
are annually reported. The work has been developed in collaboration with the governmental
centers for control of zoonosis (CZCs) that applied euthanasia in serum positive dogs (Federal
Council of Veterinary Medicine of Brazil). The euthanasia was conducted with general
anesthetic, under whose effect the collection of spleen aspirated samples and peripheral blood
82
were performed. Non-infected animals, were included in this study, were picked in
Salvador/Bahia/Brazil (considered a non-endemic area). All procedures performed on animals
followed the standard set by The Ethics Committee on Animal Experiments of the Research
Centre Gonçalo Moniz, Oswaldo Cruz Foundation, Bahia/Brazil.
2.2. Clinical Evaluation of the Animals.
All dogs were examined for quantitative and qualitative clinical alterations. Skin changes
in color and mucous integrity, abnormal growth of the nails, eyelid changes, presence of
abnormal secretions, weight loss, behavior and general state alterations and the general state in
the size of lymph nodes and spleen, besides historical and clinical evidences of other infections
were thoroughly searched.
2.3. Samples
Blood samples were obtained from all the animals, using disposable syringes and needles,
of the jugular and cephalic veins, that were kept in anticoagulants tubes (EDTA), on ice, till they
were processed in laboratory for separation of serum. Spleen samples were obtained under
sedation with 0, 5 mg / kg of acepromazin, using disposable syringes and needles, according to
technique previously described by Barrouin et al. (2006a). Briefly, the dogs were put in right
lateral decubitus and sedated through intravenous injection using acepromazin. Asepsis of the
area that would be punctured was done using iodized alcohol at 2%. Splenic puncture was made
in the left flank of the animals, near the caudal border of the last ribs, using a 40 x 12 mm needle
coupled to a 20 mL syringe. The splenic aspirates were individually put in a biphasic culture for
parasitological diagnosis and in 10% of formalin to obtain the cells to perform the Cell block
technique.
83
2.4. TECHNIQUES
2.4.1. Immunodiagnosis – Indirect ELISA for anti-Leishmania antibodies.
The presence of anti-Leishmania antibodies in the sera of all dogs was investigated by a classical
indirect ELISA, using soluble L. chagasi antigens (SLA), as described by Paranhos-Silva and
collaborators (1996). The SLA consisted of the soluble fraction (the supernatant of a 10,000 g, 30
minutes centrifugation) of lysed promastigotes from a local Leishmania strain, isolated from a
sick dog, and characterized as L. chagasi by means of isoenzyme electrophoresis and comparison
with a reference strain (LTCC - Leishmania Typing Culture Collection - WDCM731). Briefly,
96-well plates (Corning-Costar Corp., New York, USA) were coated with the antigen overnight
at 4° C (incubation with 100 µl per well of 5 µg of protein per mL of 0.1M carbonate-bicarbonate
solution, pH 9.6). Non-specific antibody binding was blocked with 5% skimmed milk (w/v) in
0.15 M phosphate-buffered saline solution, pH 7.4 (PBS), containing 0.05% Tween 20 (PBS-T),
for 1 hour, at 37° C. Control and test serum samples were added at 1:400 dilution in 1% skimmed
milk in PBS-T, 100 µl/well, and incubated for 1 h at 37° C. A peroxidase-conjugated rabbit antidog IgG (Sigma Chemical Co., St Louis, USA) was added at the dilution of 1:5,000 in 1%
skimmed milk in PBS-T, 100 µL/well and incubated for 1 h at 37° C. The enzymatic reaction was
developed with o-phenilenediamine (Sigma Chemical Co., St Louis, USA) and stopped after 15
min with 25 µL/well of 4N H2SO4. Absorbance values were read at 490 nm. The cut-off value
for IgG antibodies was determined by the ROC (Receiver Operating Characteristics) curve, using
corrected absorbance values obtained with sera from 30 L. chagasi-infected dogs, positive in
serological and parasitological tests, and from 71 healthy dogs, living in non-endemic areas
(Griner et al., 1981). All determinations were carried out in triplicate and the mean values above
the cut-off for IgG were considered to be positive results.
2.4.2. Culture and microscopy for parasitological diagnosis of Leishmania.
The samples obtained by spleen aspiration (100-200 µL) were placed in culture in a
biphasic environment, containing 1.5 mL of solid mean (blood-agar) and 2mL of Schneider’s
84
mean supplemented with 20% of bovine fetal serum. The samples were kept in culture at 23ºC
and weekly examined under optical microscopy for four weeks. The positive diagnosis was given
by the finding of promastigotes forms that presented active movement.
2.4.3. Standardization of Cell block for the structural and phenotypic evaluation of the
spleen samples
The samples obtained by the spleen aspiration (100-200 µL) added in 10% of formalin and
were set for 24 h, centrifugated and the pellets were put in cassettes and included in paraffin.
Cell block with agarosis at 1%: the samples obtained by spleen aspiration (100-200 µL) were
added in formalin at 10% and were set for 24 h, centrifuged, supernatant discarded, added
agarosis at 1% and then were set in formalin at 10% for more than 48 h. The samples were placed
in cassettes and then included in paraffin.
Purification of leucocytes from the splenic aspirates for Cell block: the samples of the splenic
aspirates (100-200 µL) were individually added to 10 mL of RPMI with 200µL of heparin, in a
lid poliestilen tube kept on ice. In the laboratory, the material was centrifuged in 1800 rpm, at 4º
C, for 10 minutes. The sediments were treated with a solution that breaks the erythrocyte
(solution of 10% of ammonium chloride, diluted in H2O, pH 7,4) for 10 minutes. After a washing
state, the sediments were re-suspended in 10mL of formalin at 10% and set for 24 h. The material
was centrifuged in 3000 rpm, at 4ºC, for 5 minutes, the sediments were included in agarosis gel at
1%, placed in cassettes and then included paraffin.
Analysis of Cell block samples with different proceedings: Serial cuts of the samples of 58mM were made, the sections were stained using the Hematoxilin-Eosin (HE) techniques, Schiff
Periodic Acid (PAS) and Periodic Acid – Methenamine Silver (PASM), and individually
analyzed in opticalal microscope, by three people, without the previous knowledge of the
parasitologic and serologic results, therefore, a blind study was performed. The samples were
analyzed as: (1) Its representativeness, being classified as poor, reasonable or good, according to
85
the quantity and quality of the material obtained; (2) Identification of splenic structures as, red
pulp, white pulp and vessels, according to the presence or lack of them; (3) The cellularity as,
lymphocytes, macrophages, plasmocytes, polymorphonuclears and megakaryocytes, were
classified as absent, discrete, moderate or plenty. The reported results of the three observers were
then correlated.
2.4.4. Imunohistochemical assay to evaluate cell block samples
Used Antibodies: Rabbit - anti-human CD3 - Dako; Mouse - anti-human CD79αcy (clone
HM57) – Dako; Rabbit anti-cow S100 - Dako; Mouse - anti-human KI67 antigen (clone MIB-1) DakoCytomation; Rat - anti-canine CD45RA (clone YKIX 753.22) gently granted by Dr.
Cobbold (Cobbold and Metcalfe, 1994). As a negative control were used, rat or mouse or average
rabbit IgG, diluted in 1:500. Anti-IgG of biotinilated rat in a dilution of 1:500 (to CD45RA),
biotinilated rabbit anti-IgG in a dilution of 1:800 (to S100) and biotinilated mouse anti-IgG in a
dillution of 1:500 (to KI67), were used as secondary antibodies and conjugated peroxidase
streptavidin (Pierce) in a dilution of 1:500.
Processing of the slides: Serial cuts of 5-8 µM were put in plates covered with poly-L-lysine
(Sigma) and kept in ambient temperature to dry. Later the plates were imbibed in xilol, rehydrated in many gradients of alcohols till distilled water. Then they were submitted to an
antigen recovery treatment mediated by heat, which followed the protocol related by Shi et al.
(2001). They were placed in a plastic recipient containing a tampon of sodium citrate (pH 6, 0) or
tris-EDTA (pH 9, 0) and heated in a steam pan for 30 minutes. The material was washed twice in
PBS after cooling up for 5 minutes each. Right after it was made the blockage of the endogen
peroxidase using hydrogen peroxide and sodic azida diluted in PBS (Shi et al., 2001). Unspecific
reactions were blocked using PBS + BSA 5%. The monoclonal antibody (CD45RA in a dilution
of 1:100) and the negative control were added and incubated during the night under 4°C. Then
two 5-minute washings each were made with PBS and they were, afterwards, incubated using a
secondary antibody for 45 minutes at 37°C. Right after they were incubated with conjugated
streptavidin with peroxidase (Pierce) in a dilution of 1:500. After two washes with PBS, the
86
peroxidase activity was developed with the mixture of 0,25 µg of 3,3-diamidine-benzidine
(Sigma) and 0,05% of hydrogen peroxide diluted in PBS, incubated for two minutes. They were
washed in distilled water, antistained with hematoxilin, gradually dehydrate with alcohols and set
up with Canadian balsam (Riedel Haen AG). At last, they were observed in opticalal microscope.
The antibodies S100 and KI67, in the following dilution 1:1000 and 1:140, respectively,
were tested using a sign amplification kit, LSAB + System-HRP (Dakocytomation). And the
antibodies CD3 and CD79αcy, in the following dilution 1:400 and 1:150 respectively, were
tested with the Novolink Max Polimer Detection System kit (Novacastra), following the protocol
previously related until the antigenic recovery stage, the other steps followed the manufacture
instructions.
2.9. Statistic Study.
The statistical analysis of the data was performed using the SPSS software (STATISTICAL
PACK SOCIAL SCIENCE v. 12.0), consisting in calculations of averages and standard deviation
of the studied parameters and comparison among the average through the Mann Whitney test.
3. RESULTS
3.1. Cell block
For this step, 31 dogs were studied, being 18 seropositive and 13 seronegative by the
indirect ELISA for anti-Leishmania antibodies. Of the 18 serum positive, six presented positive
culture.
The histological analysis of samples stained with HE allowed the identification of the
splenic and blood material, since the coloration is suitable to make evident the structural
87
characteristics, once the hematoxilin stains the nucleus and the eosin stains the cytoplasm of all
cells. With the PAS staining it was possible a better visualization of the cellularity, since this
technique is mainly used to stain structures containing a high proportion of carbohydrates
macromolecules (glycogen, glycoprotein, proteoglycans) not being a good staining for
erythrocytes. Using PASM staining, that makes possible the staining of reticular fibers and basal
membrane; it was observed fragments of the splenic architecture, what confirmed that the
obtained material was representative of the spleen and not only the blood. The identified
structures were white pulp, red pulp, vessels and trabeculus (Figure 1). Characteristics cells of the
splenic
tissue
as,
lymphocytes,
macrophages,
plasmocytes,
polymorphonuclears
and
megakaryocytes, were also identified (Figure 2). The presence of amastigotes forms of the
parasite (Figure 2) was verified in four samples previously classified as positive by the culture.
A
B
C
D
Figure 1: Histology of splenic aspirate,
processed by the cell block, stained with:
HE - arteriole peniciliar (A), arteriole
common (B); PASM - reticular fibers (C);
PAS – reticular fibers and cellularity linked
to it (D).
A
C
B
D
Figure 2: Spleen cell populations through
the cell block, stained with HE - lymphocytes
and macrophages (A), plasmocytes and
polymorphonuclears (B), megakaryocytic (C)
and Leishmanias - amastigotes (D).
88
The qualitative analysis was based on the following parameters: representativeness and
identification of the splenic structures (white pulp, red pulp and vessels). According to the
representativeness parameter, 20 of the 31 slides (64,5 %) were classified as good/adequate,
being 13 of infected dogs and seven of healthy dogs; 11 slides (35, 5%) were considered
poor/insufficient for analysis. There was no significant statistical difference between the groups.
From the 20 slides classified as good, it was possible to identify white pulp in 16, red pulp in 19
and vessels in all of them (Table 1). Each block of paraffin containing the volume of one splenic
aspirate (100 to 200 µL) yielded an average of 18 sections. This relatively small number of
sections was due to the fact of the samples have been scattered in the length of the paraffin block.
Table 1. Qualitative analysis on the representativeness and structures present in the samples
drawn from spleen of dogs healthy (not infected with Leishmania) and infected by the technique
of cell block.
Representativeness
White pulp
n = 20
Present Absent
Red pulp
n = 20
Present Absent
Vessels
n = 20
Present Absent
Good
Bad
Healthy
7
6
5
2
6
1
7
0
Infected
13
5
11
2
13
0
13
0
In the semi-quantitative evaluation of the cell population it was possible to identify a
predominance of plasmocytes (p < 0, 0302) in the infected animals samples; there was a
predominance of lymphocytes (p = 0,0167) in the healthy animals samples, there was also a
predominance of macrophages in healthy dogs samples, so there was not statistically significant
difference between the two groups (Figure 3).
89
1
Plasmocytes
2
3
Macrophages
2
Macrophages
Plasmocytes
3
Lymphocytes
2
Animais sadios
Lymphocytes
Animais infectados
Figure 3: Semi-quantitative assessment of the spleen cell populations through the cell block. The
figures presented are the results of the average scores.
3.2. Cell block with agarosis at 1%
In this step, 20 dogs were analyzed, among them 16 ELISA positive and four negative. Of
the 16 seropositive dogs, six had confirmed the diagnosis of infection by parasitological
diagnosis for cultivation.
The histological analysis of the stained samples by the HE technique revealed the presence
of splenic structures and blood material. The identified structures were white pulp, red pulp and
vessels. With the inclusion of agarosis at 1% in the samples, we obtained an average of two
blocks per sample, with consequent number of sections. The samples were classified as
insufficient for the analysis, since they were scattered along the agarosis block, making it
impossible a real evaluation of the splenic structures obtained through puncture.
The staining using PAS coloration has allowed a better view of the cellularity, with the
identification
of
lymphocytes,
macrophages,
plasmocytes,
polymorphonuclears
and
90
megakaryocytes. The stain using PASM allowed the observation of structural splenic fibers. In
sections of these samples, there were not found amastigotes forms of the parasite.
3.3. Cell block with purified leucocytes from the splenic aspirate
Samples of purified leucocytes were analyzed from the splenic aspirate of eight dogs, being
three seropositive and five seronegative by ELISA test. One out the three seropositive animals
presented positive culture for the parasite.
Among the histological samples stained by the HE, PAS and PASM techniques, there were
identified splenic structures as blood material. The identified structures identified were white
pulp, red pulp and vessels. Characteristic cells of the splenic tissue as, lymphocytes,
macrophages, plasmocytes, polymorphonuclears and megakaryocytes were also identified. The
presence of the parasite was not found in the samples.
The qualitative analyses of the eight samples revealed that seven were classified as
good/adequate, being two from infected dogs and five from healthy ones and one was considered
poor/insufficient for analysis. In one of the seven samples classified as adequate, there was
identified white pulp in two of them, red pulp in all of them and vessels in six (Table 2).
Table 2. Qualitative analysis on the representativeness and structures present in the samples
drawn from spleen of dogs healthy (not infected with Leishmania) and infected by the technique
of cell block with the purification of leukocytes.
Representativeness
White pulp
n =7
Present Absent
Red pulp
n =7
Present Absent
Vessels
n =7
Present Absent
Good
Bad
Healthy
5
0
2
3
5
0
5
0
Infected
2
1
0
2
2
0
1
1
91
The lyses of the erythrocytes made possible to significantly reduce the diameter of the
section. With the inclusion of the samples in agarosis at 1%, larger blocks were obtained and
consequently there was a significant increase in the number of sections. However it was observed
that the cells had presented morphological changes due to the treatment of the lyses of the
erythrocytes, fact that could interfere in the interpretation of the immunophenotypes with
monoclonal antibodies analysis.
3.4. Immunohistochemical in cell block plates
For immunochemistry assays, cell block sections of the samples processed without the step
of erythrocyte lysis and with agarosis at 1%, were covered with the monoclonal antibodies antiCD3 (T lymphocytes marker), anti-CD79α (B lymphocytes marker), S100 (denditric cells
marker), KI-67 (cell proliferation marker) and CD45RA (activated T lymphocytes marker). It
was observed a good marking for all tested antibodies, so it was possible to conclude that the
material subjected to this technique can be used for splenocytes immunophenotyping.
4. DISCUSSION
In the present study, we evaluate the potential use of canine spleen samples obtained by
aspirative biopsy using fine needle, with the purpose of comparing immunochemical techniques
in the assessment of splenocytes by phenotypical evaluation. The well standardized technique
will contribute to increase the knowledge in the experimental area and for the diagnosis of
immunological changes during canine
visceral
leishmaniosis
(CVL),
improving the
understanding of the disease. In previous works, it was shown the applicability of such samples
for the parasitological diagnose of CVL, the safety of the spleen aspirative biopsy technique with
fine needles in dogs and its feasibility for the immunophenotypic analyses spleen samples of dogs
with different clinic profiles (BARROUIN-MELO et al., 2006a; 2006b). The present study
describes the application of these samples in the standardizing of the cell block technique with
immunochemical markers, in the evaluation of dogs carrying or not Leishmania infection.
92
The cytological analysis of the spleen, from the obtained samples by aspirative biopsy, with
chemical or immunochemical staining methods and/or by flow cytometry, has proven to be
feasible in diagnostic analysis in a variety of human pathological conditions (HAQUE et al.,
1993; ZEPPA et al., 1994, 2003; ZANDER et al., 1994; LISHNER et al., 1996; BONIFACIO et
al., 2000; KALEEM et al., 2001). In veterinary medicine, only some neoplasic conditions have
been investigated using this kind of sample (CHRISTOPHER, 2003).
The accuracy of the cytopathological diagnostic on samples of organ aspirates processed by
the cell block technique, has been reported in studies in human medicine. The accuracy of
diagnosis in liver tumours reaches 100%, being also high in the evaluation of sub-types of
malignancies (CEYHAN et al., 2006). The same is true for the diagnostic study of lung aspirates
(WU et al., 2002) and of thyroid gland, where the technique represents a diagnosis improvement,
and it is now considered an available and very effective method. The cytology distinguishes
elements of malignity and benignity in the thyroid gland nodules, with accuracy up to 95%
(KAMAL et al., 2003).
In this study, the standardized cell block technique with splenic aspirate samples included in
agarosis gel at 1%, proved to be an appropriate method of evaluation of structures and cellularity
in fragments obtained through spleen puncture. Previously, it was observed in slides processed by
cytocentrifugation with the same kind of sample, the presence of clusters that match with the
splenic fragments found in cell block. The evaluation of these fragments that remained present in
the cytocentrifugation preparations and submitted to immunocytochemistry, could not be
accomplished due to the cells overlap, but it was clear that the cell block allowed an assessment
which may contribute to much accurate diagnostic conclusions (BARROUIN-MELO et al.,
2006b).
Using the cell block, we could accurately identify structures as the white pulp, through the
presence of dense material with the predominance of lymphocytes in many stages of maturation.
This area is linked to the capture of circulating antigens, by the macrophages or dendritic cells
(AICHELE et al., 2003), even though it is related to the meeting between the antigen and the
cells of antigen presenters, with lymphocytary activation and development of the specific
93
immune response (ATTANAVANIVH e KEARNEY, 2004), maturation, proliferation and
differentiation of B cells, generating memory B lymphocytes and secondary immune response
(CHOE, 1996; HARGREAVES, 2001), and activation of cell response from the activation of T
lymphocytes, with the development of adaptive response.
It was also identified the presence of red pulp, structure that is continued with the white
pulp, identified as a framework of cells and reticular fibers containing macrophages, monocytes,
lymphocytes, plasmocytes and blood elements (erythrocytes, blood platelet and granulocytes) and
with the presence of trabeculus and penicilliary arterioles. This area is related to the
hematopoietic, blood storage and hemocatheresis; working as a way out to the majority of the
circulating lymphoid cells (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1990; GARTNER e HIATT, 2002).
The samples prepared by the cell block technique allowed precise qualitative information on
the splenic architecture. In fact, the cells are not subjected to many manipulations or procedures
like sequence washings, what may cause cell loss. Yet, the step of erythrocyte lysis, as required
for some cytological assays, in order to obtain purified leukocytes seemd to have promoted
morphological cell changes in our evaluation.
Techniques based on tissue formalin conservation and paraffin inclusion present advantages
over methods utilizing frozen sections, because they are easily manipulated and preserve better
the tissue samples, improving the morphological resolution. Nevertheless, some authors have
showed that the step of of aldehyde conservation, applied to the processing of tissue for
histological exams may result in a decrease of antigenicity (DOMENECH et al.2003). The
samples evaluated with the cell block in this study presented, in fact, an easier manipulation,
since the formalin conservation step makes it possible to field sampling, without the need of
special equipments. Also, the formalin conserved samples could be processed after a few days in
the laboratory, without lost of representativity and showed a good morphological conservation of
the splenic fragments and cells presented in the sample.
The inclusion of samples in agarosis gel at 1%, intending to promote a higher condensation
of the material was also tested in this study. By gel utilizing, a significantly higher number of
94
sections was possible than the one without it. In this step, it was observed that the samples spread
in gel volume (length), making it impossible to accomplish a real evaluation of the section. For
an appropriate evaluation of the material, it would be necessary to get a higher number of
sections per samples for analysis, what would consume more time and more reagents.
The qualitative analysis of the representativeness of the 20 processed slides by cell block
technique with the direct inclusion in paraffin classified as good/ adequate, 13 were from infected
dogs and seven from healthy ones. 11 samples were classified as poor / insufficient to the
analysis, being six from healthy dogs and seven from infected ones. Despite there was no
statistically significant difference between the two groups, it was verified that samples from
healthy dogs were usually smaller in comparison to infected animals. In fact, splenomegaly is
consistent finding in CVL, being the organ more friable, probably favoring the obtention of
bigger samples, although this aspect did not seem to have interfered with the technical quality of
the method, regarding the fact that it was developed to evaluate sick animals.
The double blind semi-quantitative evaluation of the cell population present in spleen
samples showed a predominance of plasmocytes (p < 0, 0302) in infected dogs, when compared
to the healthy ones. The raise of plasmocyte numbers in lymphoid organs is a common finding in
visceral leishmaniosis (TRYPHONAS et al., 1977; VERESS et al., 1977; VERESS et al., 1983;
KEENAN et al., 1984a). Martinez-Moreno (1993) demonstrated a raise of 52% in the number of
splenic plasmocytes in naturally infected dogs, when compared to non-infected animals. Infected
dogs had also less lymphocytes than the healthy animals (p = 0, 0167). In fact, the severity of the
pathological alterations observed in CVL is directly related with the host immunossupression,
mainly involving T lymphocytes (PINELLI et al., 1994) and the intense humoral response,
associated to an inability to respond to Leishmania antigens (MORENO et al., 1999). A reduced
proportion of macrophages in infected dogs was also observed, but there was not a statistically
significant difference between the two groups. This finding was different from what was
observed in cytocentrifuged spleen samples (BARROUIN-MELO et al., 2006b) and from the
studies that evaluate the histopathological changes in the course of Leishmania infection
(NATAMI et al., 2000; MELBY et al., 2001; TAFURI et al., 2001; KAYE et al., 2004).
95
In order to evaluate the real proportion of cell population, it would be necessary to perform
a splenocyte immunophenotyping study, using specific antibodies. In the present study, we have
utilized monoclonal antibodies to standardize an immunohistochemical assay using the cell block
samples, demonstrating that the material allows the immunohistochemical fulfillment. Due to the
low availability of specific monoclonal antibodies to canine leucocytes capable to be utilized in
paraffin-embebed tissue, it was necessary to use some antibodies developed against human
leukocyte antigens, like anti-CD3, anti-CD79α and KI67. These antibodies, which presented
cross reaction with canine antigens, were utilized with sign amplification kits and showed good
results. Studies made by Gendelman et al. (1983) and Holgate et al. (1986), already reported that
only a few monoclonal antibodies are useful markers for paraffin-embeded, since most react only
in frozen tissue sections, which, in greater number, present low morphological definition
(GENDELMAN et al., 1983; HOLGATE et al., 1986).
Since the
majority of data on the characterization of canine
leucocytes by
immunophenotyping techniques, is in peripheral blood cells (WILLIAMS, 1997; BYRNE et al.,
2000a, 2000b; CHABANNE et al., 2000; FALDYNA et al, 2001; GREELEY et al., 2001;
OTANI et al., 2002; REIS et al., 2005), or in histological cuts post-mortem (VERESS et al.,
1997; SAKAI et al., 2003; STEIN et al., 2004; FALDYNA et al., 2005), the cell block technique
applied to spleen aspirate samples, will make it possible to amplify the knowledge on the
lymphoid cell tissue involved in the resistance response and infection susceptibility. Also, it can
allow to accomplish experimental evaluations about the splenic immune response during
experimental studies with vaccine and immunotherapy candidates for CVL. It can also allow the
evaluation of disease evolution or response to treatment in a single animal, respecting that the
technique is made in vivo obtained samples, reducing, this way, the number animals that are
sacrificed in the name of science or for purposes of disease control.
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101
APÊNDICE 2
Manuscrito II:
Quadro clínico de cães infectados naturalmente por Leishmania chagasi em uma área
endêmica do estado da Bahia, Brasil.
Este trabalho foi realizado por ocasião do processo de seleção e identificação de cães sadios e
infectados em área endêmica com intuito de avaliar os diferentes quadros clínicos e
posteriormente relacionar os dados com a resposta imune de cães infectados com Leishmania
chagasi, visando uma melhor compreensão da interação entre o parasito/hospedeiro, esclarecendo
fatores de risco e possibilitando um melhor controle desta zoonose.