TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA de TABACO
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TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium 4.1.1- VETORES UTILIZADOS PARA Agrobacterium Esquema dos sistemas de vetores de Agrobacterium para transformação de plantas - a) Co-integrados - cis - b) Vetores binários - trans (Brasileiro e Dusi, 1999). seqüência de direcionamento CCCTT CACC ATG NNN ... ... NNN AAGGGT GGGAAGTG TAC NNN ... ... NNN TTCCCA G TOPO att L1 pENTR/D-TOPO® 2.6 kb Asc I Not I TOPO rrnB T2 seqüência de terminação de transcrição rrnB T1 seqüência de terminação de transcrição sítio do Primer M13 Forward attL1 (fita complementar) TOPO® sítio de reconhecimento 1 “Overhang” TOPO® sítio de reconhecimento 2 attL2 sítio do Primer M13 Reverse Gene de resistência à canamicina Origem de replicação pUC Asc I Not I TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA de TABACO 1. Purificação do vetor pENTR-D TOPO de E. coli . 2. Recombinação com o vetor Gateway pK7WG2D: • sítio de clonagem entre o promotor e terminador 35S • o gene marcador de resistência à canamicina TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA de TABACO 2. Transformação genética de Agrobacterium tumefaciens por meio de eletroporação plasmídeo Ti desarmado Região de virulência Gene de interesse Extremidades do T-DNA 3. Seleção de clones transformantes em meio seletivo Transformação de Tabaco Horsch et al., 1985 Padrão de segregação gênica Planta T2 Homozigota Análise dos Transformantes via PCR • Primers do gene nptII, de resistência à canamicina 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1kb ~700pb Análise das Plantas de Tabaco EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL “SOUTHERN BLOT” “Q-RT-PCR” ANÁLISE QUÍMICA Southern Blot http://www.dnatube.com/video/1512/Southern-blot Marcação da sonda http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=344&canal=5 Hibridização http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=345&canal=5 Southern Blot SONDA LB npt II R2 cDNA gene ugdh cDNA gene ugdh R1 RB Análise de Southern Blot Northern Blot http://www.dnatube.com/video/2 999/Nouthern-Blot Q-RT-PCR Fluorescência comparativa das reações de Q-RT-PCR a partir do cDNA das linhagens de tabaco selvagem (WT) e transgênicas, utilizando-se primers específicos para o transgene e primers específicos para um gene controle (referência) de expressão constitutiva e uniforme (ex: ubiquitina) de tabaco. Nível de Transcritos Nível comparativo de transcritos do gene endógeno das plantas de tabaco controle (WT) e do gene (endógeno+exógeno) das transgênicas (1-6), realizado a partir da reação Q-RT-PCR. Expression level relative to WT Real Time PCR Transgene Endogenous 900 850 800 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 WT 1 2 3 4 5 6 Análise Fenotípica das Plantas WT 1 2 3 4 5 6 CG Fenótipo das linhagens de tabaco transgênicas homozigotas (1-6) relativo às linhagens controles: selvagem (WT) e transgênica Gateway (CG), 6 semanas após germinação. Análises Químicas Serragem Caule Moinho Willey HPAE –PAD Cromatógrafo de Íons Extrator Soxhlet Parede Celular + Extrativos (Carboidratos) Espectrometria L-Arabinose, D-Galactose, D-Glicose, D-Xilose e D-Manose (Sigma®) (Lignina solúvel)
