Setor 23 - Imunologia Molecular e Imunodiagnóstico

Setor 23 - Imunologia Molecular e Imunodiagnóstico
23.001
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO GENE DA QUIMIOCINA SDF1-3’A EM
PACIENTES COM LEISHMANIOSE E INDIVÍDUOS INFECTADOS PELO HIV.
Oliveira, K. B. de *; André, N. D. *; Miranda, H. C.; Oliveira, C. E. C.; Amarante, M. K.;
Cavassin, G. G. O.; Muxel, S. M.; Reiche, E. V.; Watanabe, M. A. E.; Ciências Patológicas,
UEL; Patologia - CCB, UEL.
Objetivo: Fator derivado do estroma da medula óssea (SDF-1) é uma quimiocina
o qual se liga ao receptor de quimiocina denominado CXCR4, conhecido como coreceptor para o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) do tipo
linfotrópico. Tem sido descrito um polimorfismo no segmento evolucionário
conservado da região 3’ não codificadora (3’UTR) do gene estrutural (SDF-3’A).
Neste trabalho avaliamos o polimorfismo para a variante 3’A de 181 indivíduos.
Métodos e Resultados: A análise seqüencial do SDF1 (GenBank accession
number L36033) revela a transição G→A para posição 801 na região 3’ UTR
consistindo de um polimorfismo designado como SDF1-3’UTR-801 G→A e
abreviado como SDF1-3’A. Pelo fato desta variante eliminar um sítio de restrição,
o estudo genotípico pode ser realizado pela análise do polimorfismo envolvendo o
comprimento dos fragmentos após a digestão enzimática do produto do PCR com
a enzima Msp I (PCR-restriction fragment length polymorphism-RFLP). Amostras
de soro foram avaliadas por imunofluorescência indireta para leishmaniose e
MicroElisa para HIV. O genótipo 3’A/3’A foi encontrado em 4% (2/51) indivíduos
com leishmaniose, 5% (3/60) doadores normais e foi ausente em indivíduos HIV
positivos. O genótipo wt/3’A foi encontrado em 49% (25/51) com leishmania,
30% (18/60) dos doadores normais e 34% (24/70) indivíduos infectados pelo
HIV.
Conclusões: É conhecido que na população normal o genótipo wt/wt é
encontrado com maior freqüência (60-70%). Neste trabalho, o genótipo wt/3’A foi
significantemente mais freqüente nos indivíduos com leishmaniose. Nossos dados
sugerem que o genótipo 3’A pode estar relacionado com a susceptibilidade da
leishmaniose.
Apoio Financeiro: CPG, UEL
23.002
AVALIAÇÃO DE DESEMPENHO DA PESQUISA DE ANTICORPOS IGG ANTIPROMASTIGOTAS VIVAS DE LEISHMANIA (V.) BRAZILIENSIS, POR
CITOMETRIA DE FLUXO, NA IDENTIFICAÇÃO DE CASOS ATIVOS DE
LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA). Rocha, R. D. R. **; Martins
Filho, O. A.; Gontijo, C. M. F.; Elói-Santos, S. M.; Carvalho, A. T. de **; Corrêa-Oliveira, R.;
Marques, M. J.; Mayrink, W.; CPqRR - MG, FIOCRUZ; Doença de Chagas, FIOCRUZ;
Parasitologia, FIOCRUZ; Imunologia, UFJF; Parasitologia - ICB, UFMG.
Objetivo: Desenvolvemos um método de detecção de anticorpos IgG antipromastigotas vivas (AAPV-IgG) de Leishmania (V.) braziliensis por citometria de
fluxo. Com o objetivo de avaliar a aplicabilidade do método na identificação de
casos ativos de LTA, foram estudados soros de 145 indivíduos de área endêmica,
com ausência/presença de lesão (L-, n=67; L+, n=78). As amostras foram
avaliadas pela AAPV-IgG e RIFI.
Métodos e Resultados: Os resultados da AAPV-IgG foram expressos sob a
forma de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) estabelecendo
diferentes pontos de corte para avaliação do desempenho do teste. Este foi
avaliado através de índices percentuais, incluindo sensibilidade, especificidade,
valores preditivos, acurácia, índice J de Youden e curva ROC, e em chance, a
razão de verossimilhança (RV). Resultados: Três pontos de corte foram
selecionados, PPFP de 20%, 50%, 60%. O limiar de PPFP < 20% mostrou-se de
grande valor diagnóstico, uma vez que exclui a possibilidade diagnóstica de LTA
(RV=0,07). O ponto de corte de 50% distinguiu 92% (72/78) dos pacientes L+
como positivos e 81% (54/67) dos indivíduos L- como negativos. Observou-se um
ganho real da AAPV-IgG em relação à RIFI, incluindo sensibilidade (4%),
especificidade (24%), valor preditivo positivo (15%) e negativo (9%),
probabilidade de doença pós-teste negativo (9%), acurácia (13%) e índice de J
Youden (24%). A curva ROC reforçou o melhor desempenho da AAPV-IgG, e
indicou o estabelecimento de um ponto de corte de 60%. Valores de PPFP >60%,
mesmo não apresentando um RV de caráter conclusivo (RV=7,98) pode contribuir
para o esclarecimento diagnóstico. Os RVs para a RIFI foram desprovidos de valor
diagnóstico.
Conclusões: A citometria de fluxo apresenta-se como um novo instrumento para
o diagnóstico sorológico da LTA.
Apoio Financeiro: FIOCRUZ
23.003
EFEITO DO MACERATO AQUOSO DA Dieffenbachia seguine S. e da
Euphobia tirucalli L. SOBRE OS LINFÓCITOS HUMANOS, MARCADOS COM
TIMIDINA TRICIADA, IN VITRO. Golzio, S. S. *; Oliveira, W. A. de *; Morais Filho, E. S. *;
Fournié, J. J.; Santos, C. F.; CHU Pupan, ISERM; Biologia, UFPB; Biologia Molecular,
UFPB.
Objetivo: Objetivou-se o trabalho no estudo de respostas de linfócitos humanos, in vitro,
na presença de extratos aquosos, separadamente, de plantas que popularmente são ditas
tóxicas: Dieffenbechia seguina S. e a Euphobia tirucalli L. A resposta imunitária passa por
diversos processos de reconhecimento/apresentação o que se da por moléculas presentes
no meio, acarretando assim modificações moforlógicas e na proliferação celular. Os
resultados mostram confiabilidade estatística sobre culturas de linfócitos em presença de
moléculas biotavas dessas plantas e de timidina triciada, na quantidade de radioativo
incorporado na cultura linfocitária.
Métodos e Resultados: Coleta e secagem das plantas Extração pelo método
clorofórmio/metanol/água e utilização da fase aquosa Concentração dos extratos
através de rota-evaporador Análise cromatográfica das frações Separação dos
linfócitos do sangue humano, através de gradiente de Ficol Cultivo de linfócitos
em presença de extrato na diluição de 1:800 O controle positivo utilizado para as
experiências em quatruplicatas, foi de 10 l de extrato de Micobacterium
tuberculosis, diliuido de 1:1000 Marcagem radioativa com timidina triciada
Contagem radioativa (cpm)
Média de Leitura
D. seguine
E. tirucalli
348
34,5
Média do controle negativo 7,3
(meio de cultura celular)
7,3
Média do controle positivo 266,6
(M. tuberculosis)
266,6
Controle negativo p < 0,05 (n=4)
Controle positivo p > 0,05 (n=4)
Método ANOVA (p<0,05)
Conclusões: Os resultados sugerem que o extrato aquoso da D. seguine possui efeito altamente
indutor e significativo na resposta linfocitária na diluição de 1:800, enquanto que o extrato aquoso da
E. tirucalli possui efeito indutor, porém menor que da anterior, visto na contagem em cpm de timidina
incorporada.
Apoio Financeiro: CNPq, INSERM, PIBIC, UFPB
23.004
ANÁLISE DA EXPRESSÃO QUANTITATIVA DE CD38 NA LEUCEMIA
LINFOCÍTICA CRÔNICA Fernandes, M. **; Rubens, C. V. **; Cavalcante, A. M. M. P.;
Poppe, S.; Buccheri, V.; Lab. Citometria de Fluxo, Fund. Maria Cecília Souto Vidigal.
Objetivo: Recentemente, foi demostrado que a proporção de células CD38
positivas está associada com o estádio clínico e prognóstico em pacientes com
Leucemia Linfocítica Crônica de células B (LLC). O objetivo do presente estudo foi
quantificar a expressão de CD38 nas células CD5 /CD19 de casos de LLC e
avaliar se o nº de moléculas por célula (mol/cel) apresenta variação segundo o
estadiamento da doença.
Métodos e Resultados: Foram avaliados 91 pacientes com LLC. Em todos foi
realizada análise morfológica e imunofenotípica ao diagnóstico. Os pacientes
foram classificados em estádio A, B e C de acordo com o sistema de estadiamento
clínico de Binet. A expressão de CD38 foi avaliada por citometria de fluxo
utilizando-se tripla marcação com diferentes fluorocromos. Expressão de CD38 
30% foi considerada positiva. A média da intensidade de fluorescência (MIF)
emitida pelas células CD38 foi convertida em nº de mol/cel utilizando-se o
reagente Quantum Simply Cellular Microbeads. Trinta pacientes foram
classificados como LLC estádio clínico A, 19 como B e 42 como C. Positividade
para CD38 foi evidenciada em 44% dos casos de LLC. Porém, quando a expressão
de CD38 foi avaliada de acordo com o estádio clínico, a grande maioria (93%) dos
pacientes com estádio A foram CD38 negativos, comparado a 38% daqueles com
estádio B ou C (p < 0,0001). No tocante ao nº de mol/cel, não se encontrou
diferença estatisticamente significante entre os dois grupos de pacientes: estádio
A – média=9130 (d.p.=7705), mediana=7075; estádios B+C – média=7666
(d.p.=7453), mediana=5523 (p=0,39).
Conclusões: Esses resultados corroboram com os dados da literatura onde a expressão
de CD38 está correlacionada com o estádio clínico nas LLC, entretanto o nº de mol/cel
mostrou ser independente da proporção de células CD38 positivas. Futuros estudos com
maior número de pacientes devem ser realizados para comprovar esse dado e também a
análise da expressão de CD38 deverá ser avaliada durante o curso da doença para verificar
se ocorrem alterações nessa expressão.
23.005
POLIMORFISMO DOS ALELOS HLA-A, B E DRB1 NA POPULAÇÃO DO
ESTADO DO MATO GROSSO DO SUL Sell, A. M.; Sossai, C. R. *; Orita, L. *; Tsuneto,
L. T. **; Borelli, S. D.; Moliterno, R. A.; Visentainer, J. E. L. **; Dalalio, M. M. de O.; Melo, F. C.;
Braga, M. A.; Análises Clínicas, FUEM; Análises, UEM; Análises Clínicas, UEM; DAC Imunogenetica, UEM; Odontologia, UEM.
Objetivo: O sistema HLA é altamente polimórfico, característica essencial à
função imunológica. Os alelos HLA variam com o grupo populacional e étnico. O
conhecimento da distribuição dos alelos e haplótipos possibilita a caracterização
de populações, a identificação de sua origem e o grau de miscigenação, além de
fornecer uma estratégia mais eficiente na pesquisa de compatibilidade em
transplantes. Neste trabalho, a distribuição dos alelos HLA- A, B e DRB1 em
indivíduos caucasóides e mulatos do estado do Mato Grosso do Sul foi
determinada.
Métodos e Resultados: 75 indivíduos caucasóides e 48 mulatos saudáveis e não
relacionados foram tipificados por PCR-SSP (micro SSP DNA, One Lambda, Inc.
Canoga Park, CA). As freqüências alélicas, gênicas e haplotípicas foram calculadas
por metodologia padrão. Os alelos mais freqüentes em caucasóides foram HLAA*02 (33,3%), A*01 (25,3%), A*03 (25,3%), A*24 (21,3%); B*44 (24%), B*35
(22,6%), B*15 (18,6%), DRB1*13 (29,3%), DRB1*04 (28%), DRB1*07 (25,3%)
e os haplótipos foram HLA-A*02/B*44 (5,1%), A*11/B*51 (3,9%), A*01/B*08
(3,2%), A*03/B*35 (3,1%), B*14/DRB1*01 (3,7%), B*35/DRB1*8 (3,6%) e
B*49/DRB1*13 (3,6%). Em mulatos, os alelos e haplótipos mais freqüentes
foram HLA-A*02 (50%), A*68 (22,9%), A*01 (18,8%), A*29 (18,8%); B*44
(22,9%), B*51 (22,9%), B*35 (18,7%), B*15 (16,7%), DRB1*11 (31,5%),
DRB1*13 (29,2%), DRB1*07 (22,9%); HLA-A*02/B*44 (6%), A*02/B*51 (6%),
A*29/B*44 (4,9%), A*01/B*35 (3,8%), B*51/DRB1*13 (6,7%), B*35/DRB1*08
(6,1%), B*15/DRB1*11 (5,9%) e B*44/DRB1*7 (4,5%).
Conclusões: Neste estudo, o perfil de distribuição das moléculas HLA em
população e etnia específicas foi traçado e os alelos e haplótipos predominantes
foram determinados. Os resultados obtidos auxiliarão no entendimento da origem
e do grau de miscigenação desta população, além de auxiliarem nas tipificações
HLA envolvendo transplantes. PIBIC/CNPq/UEM.
23.006
PERFIL DE RNAM DE RECEPTORES DE QUIMIOCINAS DE CÉLULAS
MONONUCLEARES
DO
SANGUE
PERIFÉRICO
DE
INDUVÍDUOS
INFECTADOS COM HTLV-I. Marciano, A. P. V. *; Melo, G. E. B. A. de; Melo, G. E. B. A.
de **; Martins-Filho, O. A.; Carneiro-Proietti, A. B. F.; Catalan-Soares, B.; Ribas, J. g.;
Barbosa-Stancioli, E. F.; -, Faculdade Federal Odontol. Diamantina; Doença de
Chagas, FIOCRUZ; Análises Clínicas, HEMOMINAS; Microbiologia - ICB, UFMG.
Objetivo: A síndrome do complexo neurológico associado ao HTLV-I (HAM/TSP) é
caracterizada por lesões no sistema nervoso central (SNC). Estudos prévios
demonstraram que células T CD4+, alvo primário da infecção pelo HTLV-I,
proliferam espontaneamente e expressam várias citocinas e moléculas de adesão
que contribuem para sua migração direcionada para o SNC. A replicação viral no
SNC favorece a ativação e a migração de outros tipos celulares como LT CD8+ e
monócitos para o SNC. Alguns estudos recentes têm chamado a atenção para a
importância das quimiocinas e dos receptores de quimiocinas no recrutamento de
linfócitos T CD4+ e CD8+, bem como monócitos do sangue periférico para o
Sistema Nervoso Central de pacientes com HAM/TSP.
Métodos e Resultados: Nesse estudo, analisamos o perfil de RNAm para
receptores de quimiocinas (CCR5, CXCR3, CCR8 e CXCR4) em células
mononucleares do sangue periférico de 21 indivíduos infectados com HTLV-I
incluindo Assintomáticos-(AS=7), Oligoassintomático-(OL=7) e com HAM/TSP(HT=7) através de RT-PCR e Dot-Blotting. Amostras de 5 doadores saudáveis
foram incluídas como grupo controle (NI). Nossos dados demonstraram um
aumento na expressão de CCR5 e CCR8 no grupo HT quando comparado com NI
e AS. O grupo AS apresentou uma diminuição na expressão CXCR3 e CXCR4 em
comparação com NI e HT.
Conclusões: Esses dados preliminares demonstram em conjunto a existência de
uma maior expressão de receptores de quimiocinas em PBMC do grupo HT,
importante para o favorecimento da ativação e migração celular para o SNC e
uma expressão deficiente desses receptores no grupo AS que poderia contribuir
com a manutenção da forma clínica assintomática.
Apoio Financeiro: FIOCRUZ, CNPq
23.007
ESTABELECIMENTO DE UM ENSAIO SOROLÓGICO POR CITOMETRIA DE
FLUXO PARA DETECÇÃO DE IGG SÉRICA ANTI-HTLV-I APLICÁVEL NO
PROGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HTLV-I. Souza, J. G. *; Melo, G. E. B. A. de;
Bicalho, P. M. F. *; Nédir, B. H. *; Ferreira, A. G. P.; Carneiro-Proietti, A. B. F.; CatalanSoares, B. C.; Ribas, J. G. R.; Barbosa-Stancioli, E. F.; Martins-Filho, O. A.; Elói-Santos, S.
M.; -, Faculdade Federal Odontol. Diamantina; Doença de Chagas, FIOCRUZ;
Núcleo de Pesquisas Biológicas, HEMOMINAS; Microbiologia - ICB, UFMG.
Objetivo: A análise sorológica em pacientes infectados pelo HTLV-I, através de técnicas
sorológicas convencionais tem sugerido a presença de uma resposta hiperimune em indivíduos
portadores de HAM/TSP. Embora os ensaios imunoenzimáticos sejam ideais para a rotina sorológica,
apresentam limitações para aplicação em testes semi-quantitativos, considerando as variabilidades
inerentes ao processo de revelação. Nesse estudo propusemos avaliar a aplicabilidade da citometria de
fluxo na detecção de anticorpos IgG anti-HTLV-I, visando identificar diferenças quantitativas
aplicáveis como indicadores prognósticos da evolução clinica da infecção.
Métodos e Resultados: Amostras de soro de 45 pacientes infectados pelo HTLV-I,
apresentando diferentes manifestações clínicas, incluindo 14 assintomáticos (AS), 10
oligossintomáticos (OL) e 21 HAM/TSP (HT) foram testadas. Onze indivíduos não-infectados foram
incluídos como grupo controle (NI). Os resultados foram expressos para cada diluição do soro como
percentual de partículas fluorescentes positivas (PPFP). O estabelecimento de PPFP=50% como limiar
entre amostras de alta e baixa reatividade permitiu identificar, na diluição 1:2048, uma reatividade
diferencial com 90% dos indivíduos HT apresentando alta reatividade, enquanto apenas 30% dos
indivíduos AL e OL e nenhum indivíduo NI apresentaram alta reatividade.
Conclusões: Nossos resultados sugerem que a análise de anticorpos anti-HTLV-I
por citometria de fluxo apresenta-se como uma alternativa promissora no campo
da imunologia clínica, aplicável como ferramenta para prognóstico em estudos de
acompanhamento.
Apoio Financeiro: CNPq, FIOCRUZ
23.008
IDENTIFICAÇÃO DE GENES REGULADOS PELO ÁCIDO OLÉICO EM
CÉLULAS JURKAT Lima, T. M. de **; Henrique Bengtson, M.; de Oliveira Rodrigues, L. **;
Verlengia, R. *; Pompéia, C. **; Curi, R.; Biofísica e Fisiologia - ICB1, USP; Fisiologia e
Biofísica ICB1, USP; Instituto de Química, USP; Instituto Química, USP.
Objetivo: Neste estudo avaliamos o efeito do ácido oléico sobre a expressão de
RNAm de células Jurkat (linfócito humano T) utilizando a técnica de hibridização
subtrativa.
Métodos e Resultados: As células (2x105 células/ml) foram cultivadas em meio
RPMI 1640 acrescido de 10% de soro fetal bovino. Acrescentou-se o ácido oléico
na concentração de 50 uM e incubou-se as células por 24 horas. Esta
concentração de ácido oléico é próxima à encontrada em condições fisiológicas e
não é tóxica para esta linhagem celular. O RNA mensageiro das células tratadas e
controle (etanol) foi extraído e utilizado como amostra para a síntese de cDNA.
Em seguida realizou-se a hibridização subtrativa conforme descrito por Rebrikov
et al. (Nucl. Ac. Res. 28:90-3, 2000). Através desta técnica isolou-se o cDNA de
genes que tiveram sua expressão aumentada ou diminuída pelo tratamento com
o ácido oléico. Os genes que tiveram a alteração na expressão confirmada por
northern blot foram seqüenciados. Estes são: gp96 (antígeno de rejeição a
tumor), fator de elongação traducional alfa1, hsp 60, ATP sintase e PACE 4.
Conclusões: Os efeitos benéficos das dietas ricas em ácido oléico estão
relacionados a alterações da expressão de diferentes genes em linfócitos. A
maioria dos genes que teve sua expressão modificada está relacionada com a
manutenção da homeostasia celular, indicando papel citoprotetor deste ácido
graxo.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES, PRONEX
23.009
VALOR PREDITIVO DO ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO (PSA) COMO
BIO-MARCADOR DE EXPOSIÇÃO AO SÊMEN HUMANO Oliveira, L. C.; Galvão, L.;
Diaz, J.; Castilho, R. F.; Patologia Clínica - FCM, UNICAMP.
Objetivo: Os objetivos do presente estudo foram: (i) validar a determinação do
antígeno prostático específico (PSA) em eluatos preparados de swabs vaginais
realizados antes e após relação sexual; (ii) verificar a possível interferência do
congelamento e descongelamento dos eluatos na determinação de PSA; (iii)
estudar a possível interferência dos materiais utilizados nos condons e swabs na
determinação de PSA; (iv) ser um estudo piloto para comparar a eficácia dos
condons masculino e feminino na prevenção a exposição ao sêmen durante o uso
típico.
Métodos e Resultados: A determinação de PSA foi realizada por um
imunoensaio enzimático de quimioluminescência em sistema automatizado
Immulites resultados validaram a determinação de PSA em eluatos obtidos de
swabs vaginais. Não foi observada interferência de: congelamento e
descongelamento dos eluatos, contaminação com Escherichia coli ou de materiais
utilizados nos condons e swabs. Detectou-se PSA predominantemente em swabs
vaginais realizados após relação sexual sem uso de condom ("17 resultados
positivos" em "18 amostras") e predominantemente não foi detectado PSA em
swabs realizados após relação sexual com o uso de condons masculinos
("nenhum resultado positivo" em "8 amostras") ou femininos ("2 resultados
positivos" em "10 amostras").
Conclusões: Conclui-se que a determinação de PSA em eluatos obtidos de swabs
vaginais realizados após relação sexual é um eficiente método para se avaliar a
exposição ao sêmen humano.
23.010
STUDY OF STABILITY OF CELL WALL ANTIGENS OF PARACOCCIDIOIDES
BRASILIENSIS. Fragata da Silva, D. **; Mendes de Assis, C.; Mara Zamboni, I.; Elpídio de
Oliveira, L. **; Ribeiro Kloth, V. **; Vicentini, A. P.; Imunologia, INST.ADOLFO LUTZ;
Programa Pós - Graduação, INST.ADOLFO LUTZ; Micologia, INST.MEDICINA
TROPICAL.
Objetivo: Evaluate the stability of the Soluble Component Cell Wall Outer Surface
of P. brasiliensis (SCCWOS of Pb)
Métodos e Resultados: Antigens were obtained from the isolate Pb 113
cultivated at 360 C Fava-Netto agar for 5, 10, 15, and 20 days. Antigenic lots
were kept at 4° C for 15 years. Their antigenic stability was evaluated by
immunodiffusion assay against 60 sera of patients with PCM (43 with chronic form
and 17 with severe form) as well as pool of sera of patients with histoplasmosis
and aspergillosis and H. capsulatum, A. fumigatus, Pb, and anti-gp43 rabitt
antisera. By ID we observe high reactivity of SCCWOS obtained on different days
against sera of PCM and hyperimmune serum anti-Pb and gp43. No crossreactivity was seen when the SCCWOS were assayed against heterologous sera
and antisera. SDS-PAGE analysis showed high complexity of protein fractions of
cell wall antigens, with proteins of molecular weight ranging from 20 to 100 kDa.
Using immunoblotting, we confirmed the specificity and sensitivity of the
SCCWOS against a pool of sera of chronic and severe PCM forms; we also
observed that SCCWOS obtained on the 5th and 10th days showed high reactivity
of the 25, 43, 60, 70, 85, and 100 kDa antigenic fractions. It is important to
report that the 43 and 70 kDa protein fractions are secreted constitutively up to
the 20th day culture.
Conclusões: We have concluded that the SCCWOS are stable and show wellpreserved antigenic determinants, which are confirmed by the high reactivity
against sera of different clinical forms of PCM, antisera anti-Pb and anti-gp43 of
Pb. Some serum were also evaluated employing metabolic antigens obtained form
isolate Pb113 cultivated in NGTA and Negroni modificated mediums, kept at 4 0C
for 15 years, showing by ID high specificity against all samples specimens
analyzed. Apoio Financeiro: Instituto Adolfo Lutz/Coordenação dos Institutos de
Pesquisa/Secretaria de Estado da Saúde (CTC#107/97 e CTC #13/2002)
23.011
IDENTIFICAÇÃO DA PROTEÍNA SUPRESSORA DE ASCARIS SUUM POR
ANTICORPOS MONOCLONAIS Oshiro, T. M. **; Rafael, A. **; Enobe, C. S. **;
Fernandes, I.; Macedo-Soares, M. F. de; Imunopatologia, BUTANTAN; Imunopatologia,
INSTITUTO BUTANTAN.
Objetivo: Extrato bruto de vermes adultos de Ascaris suum (ASC) possuem
componentes de alto peso molecular que apresentam atividade inibitória sobre o
sistema imune. Este trabalho tem por objetivo produzir e caracterizar anticorpos
monoclonais contra esta proteína imunossupressora.
Métodos e Resultados: Pelo processo de fusão celular entre células
mielomatosas (SP2/0) e linfócitos provenientes de camundongos BALB/c
imunizados com ASC obteve-se três clones de hibridoma produtores de anticorpos
contra proteínas do extrato de A. suum. Os anticorpos foram denominados MAIP1 (IgM), MAIP-2 (IgA) e MAIP-3 (IgG1). A especificidade destes clones frente às
proteínas de ASC foi determinada por ELISA e “Immunoblotting” sendo
constatado que os anticorpos monoclonais reconhecem diferentes epítopos de
proteínas de ASC. Também foi demonstrado que as proteínas reconhecidas pelos
monoclonais são capazes de suprimir intensamente a resposta imune humoral.
Dentre os monoclonais obtidos, MAIP-1 mostrou-se capaz de neutralizar a
imunosupressão induzida por ASC, ao contrário de MAIP-2 e MAIP-3.
Conclusões: Por processo de fusão celular obteve-se os anticorpos MAIP-1,
MAIP-2 e MAIP-3 que são específicos para diferentes epitopos de proteínas de
ASC. Por sua vez, as proteínas reconhecidas pelos monoclonais são capazes de
suprimir a resposta imune humoral.
Apoio Financeiro: FAPESP
23.012
ANÁLISE SOROLÓGICA EM PACIENTES CHAGÁSICOS APÓS TRATAMENTO
ETIOLÓGICO ESPECÍFICO. Barbosa Wendling, A. P. *; Nascimento, B.; Lopes, E.;
Machado de Assis, G. *; de Lana, M.; Dias, J. C.; Maria Eloi Santos, S.; Martins Filho, O. A.;
CPqRR - MG, FIOCRUZ; Doença de Chagas, FIOCRUZ; Análises Clínicas, UFOP.
Objetivo: Avaliar a reatividade sorológica de indivíduos chagásicos após
tratamento durante a fase crônica da infecção, empregando diferentes
metodologias, visando avaliar o desempenho desses testes na identificação de
cura pós-terapêutica.
Métodos e Resultados: Foram utilizadas amostras de 60 pacientes chagásicos
crônicos, provenientes de Berilo/MG, previamente submetidos a tratamento
etiológico específico. A reatividade sorológica foi avaliada comparativamente
através de RIFI, ELISA convencional-EIE, ELISA recombinante-EIEr (BioManguinhos), PAGIA (DiaMed) e por Citometria de Fluxo para detecção de
anticorpos anti-epimastigotas fixadas (FC-AFEA).Empregando, o critério que
preconiza a positividade de dois testes convencionais de fundamentos diferentes
para o diagnóstico sorológico da Doença de Chagas, aqui empregados a RIFI e
EIE, observamos que 87%(52/60) dos indivíduos permaneceram sorologicamente
positivos, enquanto 8%(5/60) e 5%(3/60) dos indivíduos apresentaram sorologia
indeterminada ou negativa, respectivamente. A análise comparativa entre os
métodos mostrou de forma interessante que 25%(13/52) dos indivíduos com
sorologia positiva, apresentaram resultados negativos no EIEr. Ainda, 100%(5/5)
dos indivíduos com sorologia indeterminada apresentaram resultados negativos
em todas as outras metodologias empregadas.
Conclusões: Nossos dados mostram reatividade sorológica pós tratamento concordante
com dados da literatura, evidenciando cura pós terapêutica em 5% dos indivíduos e a
existência de um grupo de 30% que apresenta dissociação entre a sorologia convencional e
métodos alternativos. Nesse contexto, a utilização da EIEr apresentou desempenho
semelhante à pesquisa de anticorpos anti tripomastigotas vivos empregada em estudos
anteriores, sugerindo cura pós terapêutica em 35% dos indivíduos tratados na fase crônica
da doença de Chagas. Estudos futuros para avaliação da reatividade anti tripomastigotas
vivos estão ora em andamento.
Apoio Financeiro: PIBIC | iniciação científica
23.013
IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS LEUCOCITÁRIOS HUMANOS (HLA) EM
PACIENTES COM NEUROCISTICERCOSE Bueno, E. C.; Vaz, A. J.; Farmácia,
UNIVALI; Análises Clínicas e Toxicológicas, USP.
Objetivo: A neurocisticercose é a presença da forma larvária da Taenia solium no
sistema nervoso central. As interações parasita-hospedeiro são de natureza
complexa em função dos antígenos parasitários, uma vez que estes parasitas
podem apresentar diferentes estágios de evolução, e em função das variações
genéticas individuais interferindo na resposta do hospedeiro. O objetivo do
trabalho foi identificar os antígenos leucocitários humanos (HLA) de classe I em
pacientes com neurocisticercose e correlacionar a presença destas antígenos à
susceptibilidade à doença.
Métodos e Resultados: Foram analisadas 39 amostras de sangue heparinizado
obtidas de pacientes com neurocisticercose. As células mononucleares foram
separadas por separação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. A tipagem
de HLA de classe I nas células isoladas foi realizada pela metodologia de
microlinfocitotoxicidade em placas Terasaki. Foram identificados, em ordem
decrescente de freqüência, os seguintes antígenos: HLA-A2 (20 pacientes, 51%)
e HLA-A30 (8 pacientes, 20%), HLA-B12 e HLA-B35 (9 pacientes, 23%) e HLA-B7
e HLA-B17 (5 pacientes, 13%), HLA-Bw4 (23 pacientes, 59%) e HLA-Bw6 (22
pacientes, 56%), HLA-Cw4 (16 pacientes, 41%) e HLA-Cw2 e HLA-Cw3 (6
pacientes, 15%).
Conclusões: A identificação de HLA-A2 e HLA-A30, HLA-B12 e HLA-B35 como de
maior freqüência sugere tendência à susceptibilidade à doença nos indivíduos
portadores. Entretanto, para evidenciar este achado e seqüência do estudo, são
necessárias: a análise de maior casuística, a identificação de HLA de classe II e
também a comparação com os dados da população brasileira.
Apoio Financeiro: FAPESP, PICDT
23.014
POSSIVEL ENVOLVIMENTO DA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA DA HSP65 DE
M. LEPRAE NA AUTO-IMUNIDADE E PROCESSOS INFLAMATÓRIOS Blini
Marengo, E. **; Portaro, F. C. V. **; Fernandes, B. L.; Carvalho Pimenta, D.; Camargo, A. C.
M. de; Bioquímica e Biofísica, BUTANTAN; Farmacologia, BUTANTAN; Bioquímica,
INSTITUTO BUTANTAN; Bioquímica, UNIFESP; Microbiologia - ICB II, USP.
Objetivo: As heat shock proteins (hsps) desempenham funções primordiais,
translocando proteínas e polipeptídeos recém-sintetizados, conferindo-lhes
estruturas terciárias corretas. As hsp65 são altamente conservadas entre as
espécies, desde procariotos a eucariotos, e freqüentes contatos com
microorganismos podem levar a uma resposta auto-imune em humanos,
resultando em artrite-reumatóide, ateroesclerose, etc.
Métodos e Resultados: Nosso trabalho enfoca as hsp65 micobacterianas que
apresentam 90% de similaridade entre suas seqüências de aminoacidos e são
consideradas os antígenos dominantes em diversos processos autoimunes e/ou
inflamatórios. Devido ao seu alto poder imunogênio, as hsp65 vem sendo
utilizadas como adjuvantes no desenvolvimento de vacinas contra a tuberculose e
artrite-reumatóide. Na tentativa de esclarecer o poder protetor conferido pela
hsp65 de Mycobacterium leprae contra a tuberculose, descobrimos que esta
proteína apresenta atividade proteolítica. A partir de estudos de homologia com a
HslVU de E. coli e mutagênese sítio-dirigida, definimos que a tríade T375-K409S502 governa a atividade enzimática da hsp65 de M. leprae (Biochemistry
41(23):7400-6, 2002), sugerindo tratar-se de uma treonina-protease. Ainda,
observamos que a hsp65 de M. leprae cpn2 também apresenta atividade ATPásica
(Km= 95μM e kcat = 2.6 min-1) e que a ligação com ATP, não somente a sua
hidrólise, é necessária para oligomerização e atividade proteolítica desta enzima.
Conclusões: Esse trabalho co-relaciona as seqüências de aminoácidos,
focalizando epítopos MHC classe I, e as atividades adjuvantes e catalíticas dessas
hsp65.
Apoio Financeiro: CNPq
23.015
RECEPTORES DE NUCELOTÍDEOS DO TIPO P2Z/P2X7 EM CÉLULAS DE
MEDULA ÓSSEA MURINA. Pecora, I. L.; Lamoglia de Souza, A. **; Antonio da Silva
Souza, H.; Gomes, A. P. da S. *; Coutinho-Silva, R.; Cury El Cheikh, M.; Persechini, P. M.;
Histologia e Embriologia - BL F, UFRJ; IBCCF - Bl - G, UFRJ; Imunobiofísica, UFRJ;
Imunobiofísica - IBCCF, UFRJ; Imunologia, UFRJ; Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, UFRJ; Física e Biofísica - IB, UNESP - Botucatu.
Objetivo: Objetivo: Estudar a expressão do receptor P2Z/P2X7 e sua relação com
a permeabilização induzida por ATP em células do sistema imune, a partir de sua
origem, na medula óssea (MO).
Métodos e Resultados: Métodos e Resultados: Células de MO murina foram
obtidas dos fêmures de machos adultos jovens, em meio RPMI gelado e mantidas
no gelo até o início do experimento. Utilizamos citometria de fluxo para realização
simultânea de fenotipagem e ensaio padrão de permeabilização induzida por ATP
extracelular (5-10 mM, 10 min; marcação de DNA com YOPRO, TOPRO-3 ou
etídeo). 100% das células de MO são P2X7+, mas apenas 10-15% apresentaram
permeabilização induzida por ATP. Estas células tipicamente apresentaram as
seguintes características fenotípicas: Mac-1+ (50%), C-kit+ (11-17%) e B220+(<
10%).
Conclusões: Conclusão: Embora a grande maioria das células de medula óssea murina
expressem a molécula P2X7, usualmente associada ao fenômeno da permeabilização
induzida por ATP extracelular, apenas 10-15% delas são efetivamente permeabilizadas por
esse nucleotídeo, o que indica um desacoplamento entre expressão e funcionalidade do
receptor. Os dados sugerem ainda que precursores mielóides e linfoides ainda não
identificados, além de monócitos, podem apresentar o fenômeno da permeabilização
associado ao receptor P2Z/P2X7.
Apoio Financeiro: FAPERJ, PRONEX, CNPq, FUJB, UFRJ
23.016
PRODUÇÃO
DE
ANTI-SOROS
ESPECÍFICOS
A
FITOVÍRUS
POR
*
IMUNIZAÇÃO ORAL DE CAMUNDONGOS. Beserra Júnior, J. E. A. ; Florindo, M. I.;
Lima, M. S.; Bioquímica e Biologia Molecular, UFC.
Objetivo: Produzir anti-soros específicos aos vírus que infectam vegetal CPSMV,
PLYV e PRSV-P através da administração pela via oral de camundongos Swiss de
extratos foliares infectados.
Métodos e Resultados: Métodos: Extratos de folhas de Vigna unguiculata
infectadas com CPSMV e extratos de folhas de Carica papaya infectadas com PLYV
ou PRSV-P foram administradas pela via oral a grupos de 8 camundongos Swiss
durante 10 dias consecutivos. Reforços foram dados 21 e 35 dias após o início da
imunização. Utilizou-se como controle, extratos foliares de plantas nãoinfectadas. Os anti-soros foram obtidos aos 7, 14, 21, 35 e 42 dias após o
primeiro dia de imunização. Resultados: O PRSV-P não foi capaz de induzir
síntese de anticorpos específicos. Entretanto, CPSMV e PLYV induziram a síntese
de anticorpos séricos específicos, evidenciada através de testes de imunodifusão
dupla e quantificada por ELISA indireto:
Extrato c/ CPSMV
Extrato c/ PLYV
Extrato c/ PRSV-P
7 dias
0.298 ± 0.047
0.113 ± 0.055
0.094 ± 0.019
28 dias
0.752 ± 0.106
0.404 ± 0.088
0.112 ± 0.061
Conclusões: O uso da via oral para síntese de anticorpos específicos aos vírus CPSMV e PLYV
mostra-se uma técnica simples, rápida e barata para obtenção de anti-soros específicos a fitovírus.
Apoio Financeiro: CNPq
23.017
RESPOSTA DE LINFÓCITOS HUMANOS NA PRESENÇA DE EXTRATOS DE
CAESALPINIA PULCHERRIMA E DE COCOS NUCIFERA MARCADOS COM
TIMIDINA TRICIADA SEPARADAMENTE, IN VITRO. Oliveira, W. A. de *; Golzio,
S. S. *; Morais Filho, E. S. *; Fournié, J. J.; Santos, C. F.; CHU Pupan, ISERM; Biologia,
UFPB; Biologia Molecular, UFPB.
Objetivo: Nosso objetivo foi avaliar respostas de linfócitos na presença de
extratos de plantas. A função essencial do sistema imunológico é a defesa contra
infecção, através da resposta natural e adaptativa. Na adaptativa observam-se
três características importantes: memória, especificidade e reconhecimento
daquilo que é próprio e não próprio. Através da incorporação de timidina triciada
é possível avaliar a proliferação celular, proveniente da ativação linfocitária, assim
por esse método é possível observar efeitos de extratos naturais de plantas sobre
linfócitos humanos, essa pode ser observada através de microscópio de fase
invertida. A formação de blastos quando comparado ao controle negativo ou
positivo possível pode nos indicar o processo de resposta celular.
Métodos e Resultados: Coleta e identificação das plantas Separação das fases lipídica
e aquosa dos extratos Separação dos linfócitos do sangue humano Cultivo de linfócitos em
presença do extrato Observação da formação de blastos e proliferação celular através de
microscópio de fase invertida Marcagem radioativa com timidina triciada Incubação por 20
horas Contagem radioativa (cpm) Da marcagem com timidina triciada Caesalpinia
pulcherrima
Tempo
Média
Variância Desvio Padrão
16
2
1,41
Diluição controle (+)
260,5
612,5
24,75
1:1000 amostra
207,5
112,5
10,61
20h
controle (-)
Controle negativo p < 0,05 e Controle positivo p > 0,05 ANOVA (p > 0,05). Cocos nucifera
Tempo
Média
Variância Desvio Padrão
16
2
1,41
Diluição controle (+)
260,5
612,5
24,75
amostra
1:1000 aquosa
28,5
40,5
6,36
23
2
1,41
20h
controle (-)
amostra
lípidica
Controle negativo p < 0,05 e Controle positivo p > 0,05 ANOVA (P > 0,05). Controle positivo
(Micobacterium Tuberculosis na diluição 1:1000) e controle negativo (meio de cultura)
para ambas experiências. Da formação de Blastos Caesalpinia pulcherrima
Diluições
extratos
dos 1:250
1:1000
1:4000
T3
+
+
+
T5
+
+
+
Tabela1: Resposta dos linfócitos em presença do extrato de Caesalpinia pulcherrima, 3 º dia
(T3), 5º dia (T5) de incubação. Formação de blastos (+), não formação de blastos (-). Cocos
nucifera
Diluição
extratos
dos 1:250
1:1000
1:4000
Fl
Fa
Fl
Fa
Fl
Fa
T3
+
-
+
-
-
-
T5
+
-
+
-
-
-
Tabela2: Fase lipídica (Fl) e aquosa (Fa) no 3 º dia (T3), 5º dia (T5) de cultura. Formação de
blastos (+), não formação de blastos (-).
Conclusões: Da marcagem com timidina triciada. Na concentração estudada
(1:1000), o extrato da Caesalpinia pulcherrima (fase única) apresentou efeito
indutor de proliferação celular, apresentando significância quando comparado com
os controles negativo e positivo. Já em extrato de Cocos nucifera (concentração
1:1000), apenas a fase aquosa foi significativa quando comparada com o controle
negativo, não apresentando significância quando comparada com o controle
positivo. Com a fase lipídica na mesma diluição, os dados estatísticos não
mostraram significância em ralação a nenhum dos dois controles. Da formação de
blastos. Em presença do extrato aquoso de C. pulcherrima, depois do 3º e 5º dias
observou-se formação de blastos devido à ativação linfocitária, nas diluições do
extrato 1:250, 1:1000, 1:4000. Já com o extrato lipídico do C. nucifera apenas
nas diluições 1:250, 1:1000 observa-se atividade linfocitária com a formação de
blastos. O extrato aquoso dessa planta não induziu nenhuma atividade nos
linfócitos nas concentrações estudadas. As observações dos resultados também
foram após 3º e 5º dias do cultivo celular. Os resultados sugerem que algum tipo
de substância presente nos extratos induziu a resposta linfocitária.
Apoio Financeiro: CNPq, INSERM, PIBIC, UFPB