toxicidade

Testes de toxicidade para avaliação do impacto de despejos
industriais em sistemas biológicos de tratamento de esgotos:
estado da arte
Jader Vieira Leite
Engenheiro Civil pela Universidade Federal do Pará, Mestre em Engenharia Hidráulica e
Sanitária pela Escola Politécnica da Universidade de São Paulo (EPUSP), Pesquisador da
Seção de Saneamento Ambiental da Divisão de Engenharia Civil do Instituto de Pesquisas
Tecnológicas de São Paulo (IPT)
Dione Mari Morita
Engenheira Civil pela Escola de Engenharia da Universidade Makenzie, Doutora em
Engenharia Hidráulica e Sanitária pela EPUSP, professora do Departamento de Engenharia
Hidráulica e Sanitária da EPUSP, responsável pelo Laboratório de Saneamento
“Prof. Lucas Nogueira Garcez” da EPUSP.
RESUMO: A busca de formas de determinação da concentração limite de um dado composto
inibidor ao sistema de lodos ativados levou a proposição de um número considerável de testes
de toxicidade bacteriana. A escassez de bibliografia nacional sobre o assunto motivou a
realização deste trabalho, que apresenta o estado da arte sobre os testes de toxicidade para
avaliação do impacto dos poluentes presentes nos despejos líquidos industriais nos sistemas
biológicos aeróbios de tratamento de águas residuárias.
ABSTRACT: By seeking a way to determine the limit concentration of a certain inhibitory
compound to activated sludge systems, various bacterial toxicity tests have been proposed.
The lack of the Brazilian bibliography regarding this specific topic was a motivation in the
accomplishment of this research that presents the “state of art” of toxicity tests to assess the
impact caused by pollutants of industrial waste waters to aerobic biological wastewater
treatment processes.
Palavras Chave:
Testes de toxicidade, microrganismos aeróbios, respirometria, inibição.
1. INTRODUÇÃO
O lançamento de águas residuárias industriais contendo substâncias tóxicas no sistema de
tratamento de esgotos sanitários pode afetar adversamente o ambiente, provocando um
distúrbio nas funções bacterianas.
Quando a composição da água residuária é conhecida, esses efeitos deletérios podem ser
avaliados utilizando métodos de estimativa de toxicidade baseados na estrutura molecular do
composto. Porém, a complexidade das relações entre os compostos e a biota e o
desconhecimento de alguns constituintes de águas residuárias não domésticas demonstram
que os dados obtidos por métodos com base somente em análises químicas são, em muitos
casos, inadequados.
Diante disso, tornou-se necessária a avaliação da toxicidade por meio de bioensaios capazes
de representar de forma mais próxima os efeitos tóxicos dos efluentes industriais sobre os
sistemas biológicos de tratamento.
A princípio, tentou-se utilizar os mesmos métodos empregados na avaliação da toxicidade em
corpos d’água, tais como experimentos com peixes e invertebrados (Fathead minnows,
1
Daphnia similis). No entanto, os resultados não representavam o que ocorria na prática
(Schneider,1987). Esse fato é compreensível, uma vez que uma das premissas básicas do
bioensaio é que o organismo teste seja representante fiel do ecossistema estudado. Portanto, os
ensaios empregando microrganismos ou bioquímica microbiana são mais adequados para
avaliação da toxicidade nos sistemas de tratamento de esgotos.
Além disso, muitos desses testes apresentam rápida e relativa simplicidade de execução e
sensibilidade a uma grande variedade de substâncias químicas, tornando-os bastante atrativos
para o monitoramento e a operação de um sistema de tratamento biológico.
Bitton; Dutka (1989) classificaram os ensaios utilizados na avaliação da toxicidade em
estações de tratamento de águas residuárias em duas categorias, sendo estas subdivididas
segundo os fundamentos dos testes em:
 Testes bioquímicos:
 Testes enzimáticos;
 Ensaios com Adenosina Trifosfato (ATP).
 Testes bacterianos:
 Ensaios de bio-luminescência bacteriana;
 Ensaios baseados na inibição do crescimento, respiração e viabilidade das células;
 Ensaios de efeitos ecológicos.
2. TESTES BIOQUÍMICOS
2.1 Testes enzimáticos
No meio aquático, inúmeros estudos têm sido realizados para testar o efeito dos poluentes
tóxicos sobre as atividades enzimáticas. Os testes enzimáticos consistem da medida da taxa de
deplexão de um substrato ou a taxa de formação de um novo produto, utilizando para isso
técnicas de espectrofotometria, fluorometria, titulometria ou elementos marcados
radioativamente. Estes testes são muito úteis para a determinação dos mecanismos dos
inibidores sobre as diferentes vias metabólicas. Porém, sua utilização para avaliar o efeito de
águas residuárias complexas em sistemas de tratamento de esgotos torna-se restrita, uma vez
que trabalha-se com efeitos sobre reações enzimáticas específicas, tornando-se necessário um
conhecimento prévio dos substratos e enzimas envolvidas no processo biológico.
2.2 Testes com ATP
A energia liberada através do catabolismo microbiano é convertida em uma substância
química denominada Adenosina Trifosfato (ATP) (Braile; Cavalcanti,1993). Uma vez que o
ATP é rapidamente destruído após a morte celular, torna-se uma forma ideal para se distinguir
uma célula viável de uma não viável. A base do teste consiste na medida da luz emitida pela
reação da luciferina de vagalume com o ATP. Esta reação é catalizada pela luciferase e pelo
íon magnésio (Mg2+). Brezonik e Patterson, em 1972, foram os primeiros a propor o uso do
ATP para a avaliação da toxicidade no sistema de lodos ativados (Bitton; Dutka, 1989).
Anxionnaz (1981) apud Bitton; Dutka (1989) comparou o efeito de metais pesados, como o
cobre (Cu2+), o mercúrio(Hg2+), o cádmio (Cd2+), o alumínio (Al3+) e o chumbo (Pb2+) sobre a
viabilidade e níveis de ATP de culturas puras de Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e
Micrococcus sp. A relação entre a porcentagem de viabilidade e o nível de ATP não foi
evidente em todos os casos. O teste com ATP apresentou falhas na determinação de efeitos
subletais dos metais pesados.
3. TESTES BACTERIANOS
3.1 Ensaios de bio-luminescência bacteriana
2
As bactérias bio-luminescentes são, geralmente, organismos marinhos, que apresentam vida
livre ou associada com outros organismos superiores. As principais bactérias luminescentes
são Photobacterium (vibro) fisheri, P. phosphoreum e Beneckea harveyi.
Do ponto de vista da bioquímica, os sistemas bio-luminescentes são considerados uma parte
do sistema transportador de elétrons, onde a enzima luciferase catalisa a oxidação do FMNH2
(mononucleotídeo flavina reduzido) e de um aldeído, resultando na produção do FMN, ácido e
luz (Bitton; Dutka, 1989).
Em 1889, Beijerinck mostrou que algumas substâncias tóxicas reduziam a intensidade de luz
produzida por uma suspensão de bactérias luminescentes. A partir de então, vários estudos
foram realizados na tentativa de se utilizar esta característica como um indicador de
toxicidade (Bitton; Dutka, 1989). Destas tentativas, surgiu um dos testes de toxicidade mais
utilizados (Koopman et al. 1989): um ensaio baseado na inibição da bio-luminescência de
uma cultura congelada a seco de bactérias marinhas, denominadas Photobacterium
phosphoreum, comercializado pelo nome de Microtox  (Ghosh; Doctor, 1992).
Este teste é simples e reprodutível. Porém, a sua grande vantagem está no fato de que após a
exposição a uma pequena amostra, o organismo responde rapidamente a um vasto número de
substâncias. O efeito de compostos orgânicos, como o fenol, pode ser determinado em 5
minutos. A maioria dos metais bivalentes age num tempo de 15 minutos (Hiley,
Pearnside,1993).
O Microtox  tem sido largamente utilizado para a determinação da toxicidade de efluentes
industriais (refinarias, papel e celulose), água de processamento de combustíveis fósseis,
sedimentos, chorume de aterros sanitários e lixiviados de resíduos sólidos perigosos
(Munkittrick, 1991 apud Bitton,1994).
Segundo Koopman et al. (1989), o Microtox  apresenta as seguintes desvantagens:
 Como a salinidade de algumas amostras deve ser aumentada para um nível compatível
com a bactéria utilizada, pode haver a precipitação de metais pesados;
 A bio-luminescência das bactérias diminui com o tempo, requerendo um controle preciso
da duração do teste e limitando o número de amostras que podem ser processadas
simultaneamente.
Além das limitações citadas anteriormente, deve-se considerar que a cor de efluentes
industriais influencia na medida da luz emitida pelas bactérias marinhas e que a toxicidade é
uma função do tempo de exposição e da temperatura.
3.2 Ensaios baseados na inibição do crescimento, respiração e viabilidade das células
Vários ensaios bacterianos empregam a medida direta dos efeitos tóxicos sobre a taxa de
crescimento de culturas puras ou heterogêneas ou sobre características fisiológicas, como a
mobilidade e a respiração.
3.2.1 Medidas dos efeitos da toxicidade sobre a taxa de crescimento
O uso do crescimento bacteriano como um bioensaio não é um conceito novo. As mudanças
na taxa de crescimento dos microrganismos devido a adição de substâncias químicas podem
ser medidas por turbidimetria, gravimetria, espectrofotometria, potenciometria, sistemas
eletrônicos de contagem de células, métodos de contagem de colônias, método do Número
Mais Provável, etc.
A forma mais utilizada para estudar o efeito tóxico de uma substância sobre os
microrganismos é monitorando o seu crescimento em uma “placa de agar”. O inóculo diluído
é disposto em uma “placa de agar” contendo diferentes concentrações da substância tóxica. A
redução na unidade de formação de colônias (UFC) em relação a um controle, sem o poluente
tóxico, é obtida para cada concentração. A técnica de contagem é baseada no princípio de que
cada organismo viável dará origem a uma colônia (Rand; Petrocelli, 1985).
3
Estes testes também podem ser realizados utilizando sistemas em batelada. As mudanças na
taxa de crescimento são calculadas pelo coeficiente angular da tangente à curva de
crescimento logarítmico (Mayfield,1997). Um decréscimo de 50% na taxa específica de
crescimento (caracteriza o CE50 para a substância teste. A taxa de crescimento é calculada
pela equação (1):
dX / dt 
...(1)

X
onde X representa a concentração de organismos e t, o tempo de exposição destes aos
poluentes tóxicos.
Outra forma bastante utilizada para avaliar as mudanças em ( é a medida de turbidez.
Allsop et al. (1980) descreveram um teste de inibição ao crescimento bacteriano utilizando a
turbidez como indicador da população de microrganismos. Neste teste, a substância
investigada era introduzida em “erlenmeyers” de 250 mL, em várias concentrações, com uma
mistura de agentes tamponantes, nutrientes, substrato de crescimento e um inóculo
bacteriano. Eram preparados, também, controles com e sem a substância teste, com e sem o
inóculo, para a correção da turbidez da amostra, cor, ou precipitação na solução. Tal solução
era mantida em agitação, em temperatura controlada, por aproximadamente 16 horas. A
turbidez era lida em comprimento de onda de 530 nm. O grau de inibição era determinado em
relação a porcentagem da densidade ótica do controle com o inóculo, segundo a equação (2)
Densidade ótica da concentração testada x 100 = % do controle
...(2)
Densidade ótica do controle
O valor percentual era plotado em função do logaritmo da concentração da substância teste. A
concentração correspondente a 50% da absorbância em relação ao controle caracterizava a
CE50.
O método descrito por Allsop et al. (1980) apresenta a vantagem de poder utilizar inóculos
provenientes de várias fontes, como sistemas de lodos ativados, solo e culturas puras.
A maioria dos testes baseados no crescimento bacteriano utiliza culturas puras, sendo
necessário tomar algumas precauções. A pureza da cultura deve ser verificada em intervalos
freqüentes em vários meios adequados e sobre diferentes condições ambientais.
Algumas culturas mistas são muito estáveis e portanto, difíceis de serem separadas em
culturas puras. Quando esta separação for impossível, os organismos devem ser obtidos em
órgãos especializados em coleção de culturas, como por exemplo a “American Type Culture
Collection” (Mayfield,1997).
3.2.2. Medidas dos efeitos da toxicidade sobre a respiração microbiana
A respirometria é a medida da variação da concentração de oxigênio dissolvido (O.D.) ao
longo do tempo em um reator. No caso do sistema de lodos ativados, a mudança na
concentração de O.D. causa alterações em outros fatores como a respiração endógena e a
exógena (Ros, 1993).
Segundo Schneider (1987), os métodos de avaliação da inibição à respiração podem ser
classificados, segundo os meios de medição, em:
 Modificações no teste da DBO;
 Respirômetros de volume constante;
 Respirômetros eletrolíticos;
 Eletrodos de oxigênio dissolvido em recipientes fechados;
 Monitores biológicos “on-line”.
Ros (1993) classifica os métodos em função das características do respirômetro utilizado, em:
 Respirômetros fechados, subdivididos em manométricos, volumétricos ou combinados;
 Respirômetros abertos, subdivididos em descontínuos ou contínuos .
4
A medição manométrica na respirometria teve seu início ainda no século passado (1880),
quando Haldane utilizou-a para a determinação dos gases no sangue. Em 1890, Adney apud
Beach et al. (1995) desenvolveu o primeiro respirômetro com a finalidade de medir a
demanda de oxigênio em águas residuárias. Utilizou um tubo em “U” graduado e conectado a
dois recipientes, um contendo a amostra de água residuária e outro com água limpa. Este
conjunto era mantido em banho termostatizado e em agitação. O decréscimo no volume de
oxigênio era indicado pela distância que a coluna d’água percorria no interior do tubo
graduado.
O respirômetro de Warburg, criado em 1926, foi uma modificação do método desenvolvido
por Haldane. A deplexão de oxigênio dissolvido era medida por manômetros. Empregando
volume constante, foi inicialmente utilizado para determinar a Demanda Bioquímica de
Oxigênio de águas residuárias. Porém, sua finalidade principal era a avaliação da toxicidade
tanto em sistemas aeróbios como anaeróbios.
A aplicação regular da respirometria no estudo dos processos de tratamento de esgotos teve
seu início na década de 30. Desde então, grandes esforços têm sido realizados para tornar
estes métodos menos laboriosos e facilitar a interpretação dos dados obtidos. Com advento
dos eletrodos de membrana e sua posterior conjugação com registradores gráficos e com a
informática, a leitura dos dados de concentração de OD tornou-se mais prática, possibilitando
o surgimento de testes respirométricos mais precisos e rápidos.
Uma das técnicas mais utilizadas é a que emprega respirômetros abertos. Ros (1993) realizou
vários testes com respirômetros abertos descontínuos, para a avaliação da toxicidade de
substâncias e compostos químicos no sistema de lodos ativados. Na Figura 1 apresenta-se o
aparato utilizado por Ros, que consistia de um reator aberto de 1 litro, com aeração e mistura
providas, respectivamente, por bomba de aquário e agitador magnético. A concentração de
O.D. era monitorada por um medidor de oxigênio, conectado a um microcomputador com
periféricos tais como: conversor A/D, monitor e impressora.
Figura 1. Respirômetro aberto descontínuo
Fonte: Ros (1993)
A “Organization for Economic Cooperation and Development” (OECD) apresentou em seu
manual de testes de substâncias químicas (OECD, 1984), o teste OECD 209. Este método
baseia-se na diferença entre as taxas de utilização de oxigênio dos microrganismos, devido à
degradação de um substrato sintético, na ausência e na presença de diferentes concentrações
5
do poluente tóxico, empregando um respirômetro aberto com volume útil de 500 mL. O teste
tem uma duração aproximada de 3 horas.
Volskay; Grady (1988) utilizaram esse método para avaliar a toxicidade de 33 compostos da
lista do “Resource Conservation and Recovery Act” (RCRA). Eles observaram que este tipo
de procedimento não era recomendável para compostos orgânicos muito voláteis, porque com
a contínua aeração ocorria a perda destes antes mesmo de se realizar as medidas de seus
efeitos. Os autores sugeriram algumas modificações para o método OECD 209, que
consistiam, basicamente, na utilização de menores concentrações de biomassa e substrato e o
emprego de uma tampa de vedação de politetrafluoretileno (PTFE), acoplada ao frasco do
teste.
Este dispositivo era dotado de um anel móvel, permitindo a eliminação da porção de ar
aprisionada na interface com o líquido. Também contava com um orifício, que permitia o
acoplamento da sonda de OD, tornando possível a medição da taxa de utilização de oxigênio,
sem a necessidade de transferência do conteúdo do frasco para outros recipientes. Estas
alterações minimizaram significativamente as perdas por volatilização dos compostos. Porém,
a diminuição da concentração da biomassa para 75 mg/L como sugerido por Volskay; Grady
(1988), pode prejudicar a sensibilidade do teste, uma vez que o número de organismos
expostos ao poluente influencia, de forma significativa, os resultados obtidos nos testes de
toxicidade.
Posteriormente, Volskay; Grady (1990) apresentaram um respirômetro fechado confeccionado
em vidro, com volume de 250 mL. Este respirômetro tinha em sua parte superior três
singularidades, sendo uma para a injeção do substrato, outra para inserção da sonda de OD e a
terceira para a instalação do tubo de reaeração.
Barbeau et al. (1995) observaram que estas singularidades, apesar de sua vedação com fitas de
PTFE, mostravam-se como pontos críticos para a troca de gases do respirômetro com o
exterior. Estes pesquisadores sugeriram o uso de septos de borracha envoltos em fitas de
PTFE, aperfeiçoando o sistema de vedação.
A partir da década de oitenta, vários biosensores, baseados na medida contínua da taxa
específica de utilização de oxigênio (TEUO), têm sido introduzidos no mercado. Pode-se
citar, por exemplo, o “RODTOX” (Herricks et al., 1991) e o “BIOSCAN”, produzido pela
N-CON Systems Co. Inc. (Beach et al., 1995).
O RODTOX consiste, basicamente, de três partes: um reator biológico, um microprocessador
e seus acessórios e uma parte eletrônica, que serve de interface entre as duas anteriores. Este
conjunto é disposto em um gabinete que o protege das intempéries. Um esquema do
RODTOX é apresentado na Figura 2.
A unidade biológica consiste de um reator, que é preenchido com 10 litros de lodo ativado,
mantido sob aeração e agitação. A temperatura é controlada e o pH e o OD, constantemente
monitorados. Os dados respirométricos são analisados pelo microprocessador.
O método respirométrico computadorizado “BIOSCAN” (Figura 3), comercializado pela “NCON Systems”, é outro monitor de toxicidade “on-line”, utilizado para assegurar a integridade
de sistemas aeróbios de tratamento (Beach et al.,1995; Cadena et al., 1988; Magliette et al.
s.d.; Graves et al. 1991) .
O sistema é composto por um filtro biológico, com uma população microbiana similar ao do
sistema de lodos ativados da estação de tratamento de esgotos. O filtro biológico é projetado
para manter um biofilme de espessura constante. A água residuária afluente ao equipamento é
misturada com um substrato rapidamente biodegradável e é aerada até a saturação. Este
substrato garante que a biomassa tenha alimento suficiente para uma demanda de oxigênio
adequada.
6
1. Reator biológico com 10 litros de
lodo ativado
2. Aerador
3. Misturador
4. Sensor de temperatura
5. Eletrodo de OD
6. Eletrodo de pH
7. Bomba de injeção do substrato de
calibração
8. Bomba de injeção de água
residuária
9. Válvula para a saída do
sobrenadante
10. Válvula de descarga de Lodo
11. “Bypass”
12. Sistema de filtração
13. Microprocessador
Água residuária
14. Monitor e teclado
15. Impressora
Figura 2. Esquema do “RODTOX”
Fonte: Herricks e al (1991)
A razão entre as vazões de água residuária e de substrato pode ser controlada ajustando-as
separadamente. Esta mistura escoa através do filtro biológico, permitindo que a biomassa
viável utilize praticamente todo o alimento e o oxigênio disponíveis. Se a água residuária
contiver substâncias tóxicas que possam inibir ou inativar a biomassa do filtro, os
microrganismos reduzirão o consumo de oxigênio. Portanto, a concentração de OD no
efluente do filtro é um indicador da toxicidade. O OD remanescente no efluente do filtro é
monitorado por um sensor e os resultados são continuamente exibidos.
Este sistema apresenta a limitação de utilizar um crescimento bacteriano aderido à superfície,
diferenciando-se bastante da condição de crescimento em suspensão do sistema de lodos
ativados.
Embora largamente utilizada, a respirometria apresenta algumas limitações. Segundo
Patoczka et al. (1989), o consumo de oxigênio como parâmetro de toxicidade apresenta uma
séria restrição em relação aos compostos que tem seu efeito tóxico sobre a fosforilação
oxidativa. Esta classe de compostos, como por exemplo os compostos fenólicos clorados,
podem estimular o consumo de oxigênio sem aumentar o consumo de substrato.
Na tentativa de melhorar a resposta dos respirômetros, Govind et al. (1997) apresentaram um
método de quantificação automática da evolução de dióxido de carbono (CO2) durante a
análise respirométrica (Figura 4). Segundo estes autores, a ocorrência do consumo de oxigênio
pode demonstrar uma biotransformação inicial do composto, porém não pode provar que este
foi mineralizado a CO2.
Além disso, estes autores ressaltaram que a ocorrência da nitrificação podia, também, tornarse uma fonte de erro na interpretação dos dados respirométricos.
7
1
2
1.2
3
Ar
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
7
Registrador
Controle
Alarme
Sensor de OD
Válvula de calibração
Filtro Biológico
Aerador
4
5
6
Descarga
Amostra
Substrato
Figura 3. Respirômetro “on-line” N-CON BIOSCAN
Fonte: Beach et al (1995)
O sistema mostrado na Figura 4 consiste de três partes:
 um frasco padrão do respirômetro eletrônico contendo uma barra magnética para a
mistura do conteúdo; um absorvente de CO2 removível, contendo uma solução de
hidróxido de bário, que é agitada por um disco magnético com dois defletores verticais
para a total mistura da solução absorvente e para minimizar os efeitos da transferência de
massa;

e uma sonda que mede continuamente a condutividade da solução de hidróxido de bário.
Vai para o medidor de condutividade e para o
computador para análise dos dados
O2 proveniente do respirômetro
Frasco do Respirômetro
Sonda de condutividade
Agitador magnético para aumentar a taxa de
reação do CO2 na solução de Ba(OH)2
Barra magnética de agitação
Figura 4. Aparato utilizado para a medição automática e simultânea da taxa de
utilização de O2 e da evolução do CO2
Fonte: Govind et al (1997)
Os frascos servem como recipientes de reação, que são acoplados a um sistema de absorção
de CO2, um gerador de O2 e um indicador de pressão. A atividade dos microrganismos nos
reatores cria um vácuo que é registrado pelo indicador de pressão, que controla o gerador
eletrolítico de oxigênio e fornece os valores obtidos em gráficos. Com a queda de pressão no
8
interior do frasco, o nível de uma solução de ácido sulfúrico no interior do indicador de
pressão sobe, e entra em contato com um eletrodo de platina, dando início à geração de O2
pela célula eletrolítica. O oxigênio gerado alivia a pressão negativa dentro do frasco,
resultando na queda do nível de ácido sulfúrico, cessando o contato com o eletrodo,
desligando assim, a célula eletrolítica. O suprimento de oxigênio para amostra é medida em
miligramas por litro de solução no bioreator. O registrador é conectado a um computador que
salva os dados a cada 15 minutos ou qualquer outro intervalo de tempo especificado.
Apesar de suas limitações, o emprego da respirometria na operação de estações de tratamento
de águas residuárias vem crescendo acentuadamente. A “Southwest Water Pollution Control
Plant” , localizada nos Estados Unidos da América, é um grande exemplo dos benefícios da
utilização da respirometria. Os dados respirométricos auxiliaram na operação das unidades de
tratamento desta estação, possibilitando a diminuição do tempo de detenção hidráulico,
levando a eliminação de dois dos dez tanques de aeração, representando uma economia anual
nos gastos com energia de US$ 384000, contra um gasto de US$ 18000 para a aquisição do
equipamento (Arthur, 1996).
3.2. Ensaios baseados na inibição do consumo de substrato
O meio mais direto para avaliar a toxicidade ao tratamento biológico é aquele que se baseia
na inibição de sua função principal, a remoção do substrato (Schneider, 1987; Patoczka et al.,
1989).
A avaliação do efeito de um dado poluente sobre a utilização de substrato pode ser realizada
monitorando-se a remoção de substâncias específicas, como por exemplo, o nitrito
(Williamsom; Johnson, 1981) e a glicose (Larson; Schaeffer, 1982), ou por parâmetros globais
como Carbono Orgânico Total (COT) (Patoczka et al., 1989) e Demanda Química de
Oxigênio (DQO) (Botts et al., 1994).
Estes testes podem ser classificados, de acordo com o tipo de reator empregado, em:
 Testes com reatores de fluxo contínuo;
 Testes com reatores em batelada ( “batch-reactor”);
 Testes com reatores semi-contínuos (“fed-batch reactor”).
Segundo Schneider (1987), os testes com reatores de fluxo contínuo simulam melhor o
processo de lodos ativados do que os reatores em batelada, porém, apresentam a desvantagem
do longo tempo de duração.
Os testes de fluxo contínuo são realizados, normalmente, em reatores em duplicata,
alimentados com e sem a substância tóxica, sendo a taxa de utilização de substrato monitorada
para posterior comparação. Além do tempo de duração, Williamson; Johnson (1981)
destacam como desvantagens a necessidade de grande quantidade de água residuária e de
sistemas de tratamento em escala de laboratório ou piloto.
Os testes de inibição da utilização de substrato com reatores em batelada são empregados com
menor freqüência (Williamson; Johnson, 1981; Larson; Schaeffer, 1982).
Larson; Schaeffer (1982) propuseram um método para avaliar os efeitos de compostos
químicos sobre a utilização de substrato. Este método baseia-se na inibição do consumo de
glicose pelos microrganismos do lodo ativado, na presença do composto teste. Os autores
utilizaram copos Griffin como reatores em batelada contendo: inóculo microbiano proveniente
do tanque de aeração de uma estação de tratamento de esgoto; glicose marcada com carbono
quatorze ([14C] D-glicose) e a substância tóxica em diferentes concentrações. Após um tempo
de contato de 15 minutos, media-se o consumo da glicose com o auxílio de um cintilador.
O teste de inibição da glicose foi, posteriormente, modificado para a avaliação da toxicidade
de águas residuárias de diferentes categorias industriais aos microrganismos do lodo ativado
(Eckenfelder, 1992). Neste método modificado, 10 mL de água residuária industrial eram
introduzidas juntamente com 1 mL de glicose marcada, em um tubo de centrífuga. Eram
9
inseridos também 10 mL de lodo ativado. A seguir, os conteúdos dos tubos eram aerados por
60 minutos. Ao final deste tempo, adicionava-se o ácido clorídrico e media-se a concentração
de glicose no centrifugado com o cintilador. Eram, também, preparados dois controles, sendo
um do lodo, onde era substituída a água residuária por 10 mL de água desionizada, e um da
glicose, onde adicionava-se apenas água desionizada e a glicose no tubo da centrífuga, com
imediata acidulação.
A porcentagem de inibição era calculada pela equação (3):
%deinibição 
C  Cb
Co  Cb
... (3)
onde:
C - concentração final de glicose na solução [ M. L-3 ];
Cb - concentração final de glicose no controle do lodo [M.L-3 ];
Co - concentração final de glicose no controle da glicose [M.L-3 ];
Segundo Patoczka et al. (1989), os testes em batelada têm duas grandes limitações: o fato de
desprezar os efeitos da adaptação e não detectar os efeitos tóxicos crônicos.
A United States Environmental Protection Agency (USEPA) desenvolveu o teste “Refractory
Toxicity Assessment” (RTA) para a avaliação do impacto de descargas industriais lançadas
em estações de tratamento de esgotos sanitários (USEPA, 1989).
Este teste consiste do emprego de reatores em batelada para simulação das condições
operacionais do processo de lodos ativados da estação em escala real, incluindo a
concentração de sólidos em suspensão voláteis (SSV), a concentração de O.D. no tanque de
aeração e o tempo de detenção hidráulico.
Inicialmente, são realizados testes de caracterização da toxicidade do efluente primário, do
lodo e da água residuária. Ao término do teste, após um intervalo equivalente ao tempo de
detenção hidráulico do tanque de aeração, faz-se bioensaios com o sobrenadante dos reatores
para a avaliação da toxicidade crônica e aguda usando, por exemplo, Ceriodaphnia dubia e
Pimephales promelas.
Esta metodologia proposta pela USEPA, avaliava, essencialmente, os efeitos sobre o corpo
receptor. Botts et al. (1994) modificaram o teste RTA para avaliar os efeitos tóxicos sobre a
unidade de tratamento biológico. Para tanto, propuseram o monitoramento das taxas de
utilização de oxigênio, DQO, nitrogênio amoniacal, nitrito e nitrato.
O RTA modificado era conduzido em recipientes aerados de dois a quatro litros, utilizando
lodo ativado de retorno e efluente primário coletados na estação em estudo. Amostras
provenientes de poços de visita (PV) em trechos chaves da rede ou de efluentes diretamente
coletados nas indústrias eram misturados ao efluente primário, em proporção adequada para
simular a situação mais desfavorável, ou seja, a máxima vazão do trecho ou da indústria e a
mínima do efluente primário. Esta mistura mais o lodo de retorno eram dispostos no reator, de
forma a obter as mesmas características operacionais da estação, como carga orgânica e
concentração de sólidos em suspensão voláteis (SSV) no tanque de aeração.
Eram preparados dois outros reatores, sendo que um era réplica do primeiro e outro somente
com o efluente primário, funcionando como controle (Figura 5).
10
Efluente industrial +
efluente primário +
lodo ativado
Ar
Efluente primário +
lodo ativado
Efluente industrial +
lodo ativado +
efluente primário
Recipiente
de 2 a 4
litros
Agitador
magnético
Pedra
porosa
Reator 1
Reator 2
(Controle)
Reator 3
(réplica)
Figura 5. Esquema do teste Refractory Toxicity Assessment (RTA) modificado
Fonte - Botts et al. (1994)
Os resultados dos reatores de controle e de teste eram comparados para avaliar se a adição
da água residuária industrial ou amostra do PV ocasionava inibição ou toxicidade ao
sistema. A água residuária industrial ou a amostra do trecho de rede era considerada
potencialmente tóxica se o reator que a continha apresentasse maior toxicidade que o controle
(Botts et al., 1994).
Desde 1986, várias categorias industriais tiveram seus rejeitos líquidos testados pelo método
RTA, incluindo industrias farmacêuticas, galvanoplastias, de pesticidas e químicas. Este
método vem apresentando resultados satisfatórios na avaliação de descargas industriais em
sistemas públicos de esgotos com unidades de lodos ativados convencionais e processos
biológicos de remoção de nutrientes como nitrificação de único e duplo estágios (Botts et al.,
1994).
Botts et al.(1994) citaram como uma possível limitação do RTA, o custo dos bioensaios.
Outra desvantagem, se comparado com os demais testes, é o grande número de análises
laboratoriais e o tempo de duração que pode, dependendo da situação, ser bastante
prolongado.
Outra técnica para a avaliação da inibição da taxa de utilização de substrato emprega reatores
semi-contínuos ou “Fed-Batch Reactors” (FBR). As características essenciais do teste FBR
são as seguintes:
a) O substrato é continuamente introduzido em uma alta concentração e baixa vazão, de
maneira que o volume do reator não se altere significativamente durante o ensaio;
b) A taxa de alimentação deve exceder a de utilização de substrato;
c) A duração do teste deve ser suficientemente curta, tal que permita uma modelação simples
do crescimento microbiano e
d) vários lodos adaptados podem ser utilizados.
Um esquema do aparato utilizado no teste FBR é mostrado na Figura 6.
11
Misturador
Bomba Peristáltica
Retirada de Amostra
Rotâmetro
Ar
Cilindro Graduado
( Substrato )
Figura 6. Material utilizado no teste “Fed-Batch Reactor” (FBR)
Fonte: Eckenfelder; Grau (1992)
O teste FBR foi originalmente desenvolvido por Willianson; McCarty (1975), para rápida
determinação dos coeficientes cinéticos da nitrificação no sistema de lodos ativados. Neste
método, um reator de mistura completa, sem retorno de lodo e saída de efluente, era
continuamente alimentado com uma solução contendo alta concentração de (NH4)2SO4 e
uma quantidade de fósforo suficiente para o crescimento. A alimentação era introduzida no
reator com uma baixa vazão, de tal forma que a variação volumétrica do reator fosse mantida
em valores inferiores a 5% ao longo das 4 horas de teste. Willianson; McCarty (1975)
mostraram que o crescimento biológico foi inferior a 5% e que um pseudo estado de
estabilidade na oxidação do nitrogênio podia ser atingido dentro de um período de duas horas.
Os resultados obtidos por Willianson; McCarty (1975) mostraram-se bastante coerentes
quando comparados com os obtidos em reatores de fluxo contínuo. Porém, a maior
desvantagem destes em relação ao método FBR é o tempo requerido para que se atinja o
estado de estabilidade e a dificuldade e os gastos em se operar um grande número de reatores.
Porém, Watkin (1986) lembra uma desvantagem do método FBR, que Williamson, McCarty
(1975) não contemplaram em seu trabalho: o acúmulo de metabólitos ao longo do teste, que
ocorre em menor proporção em reatores de fluxo contínuo. Estes autores também
demonstraram as vantagens do FBR na determinação das constantes cinéticas quando
comparadas aos testes que empregam reatores em batelada. Para este tipo de reator, a
determinação da constante de saturação KS , quando esta é muito baixa, apresenta pouca
precisão, resultante de erros analíticos.
Em 1989, Eckenfelder propôs o uso do FBR para a avaliação da biodegradabilidade e
toxicidade de águas residuárias industriais complexas no tratamento biológico com lodos
ativados, sendo apresentado por este autor como o mais adequado para a determinação dos
coeficientes cinéticos, constante de saturação (Ks) e máxima taxa de remoção de substrato,
podendo ser usado também para a determinação da constante de inibição (Ki) da equação de
Haldane (Eckenfelder, 1989).
As respostas teóricas do “Fed-Batch Reactor” para os casos de substrato inibidor e não
inibidor são apresentadas na Figura 7. No caso específico de substrato adicionado com alta
concentração e baixa vazão, a máxima taxa de utilização de substrato não será excedida pela
taxa de alimentação e a variação volumétrica no reator será insignificante. Se a premissa
básica do FBR for mantida, isto é, as mudanças volumétricas forem desprezíveis, e se a taxa
de alimentação exceder a taxa máxima de utilização de substrato, então, a concentração de
substrato no interior do reator aumentará com o tempo. A máxima taxa específica de remoção
12
de substrato (qmáx) pode ser calculada pela diferença entre a taxa de alimentação e a de
crescimento da concentração residual do substrato dividida pela concentração da biomassa.
No caso do substrato inibidor, a utilização deste decrescerá rapidamente, resultando numa
deflexão ascendente da curva da concentração residual de substrato, como mostra a Figura 8.
Com a progressão da inibição e a ocorrência da toxicidade aguda, o gráfico da concentração
residual de substrato pelo tempo tenderá a ser paralela à taxa de alimentação. A constante de
inibição (KI) pode ser aproximada pela identificação da concentração do substrato no ponto
médio da porção curvilínea do gráfico de acumulo de substrato.
A taxa específica de utilização de oxigênio (TEUO), normalmente, decresce na presença do
inibidor. Enquanto não houver inibição, a TEUO manter-se-á constante na máxima taxa. A
inibição, no entanto, provocará um decréscimo progressivo na TEUO, como representado na
Figura 8.
450
Alimentação
Inibição
Máxima Utilização de Substrato
Crescimento ou Adaptação
Concentração do Substrato [M.L-3]
400
350
300
250
200
KI
150
100
50
0
0
2
4
Tempo
[T] 8
6
10
12
14
Taxa específica de utilização de oxigênio (T-1)
Figura 7. Resposta teórica do teste FBR
Fonte: Watkin (1986)
Sem inibição
Inibição
Tempo [T]
Figura 8. Efeito da inibição sobre a taxa específica de utilização de oxigênio
Fonte: Watkin (1986)
13
Leite (1997) propôs as seguintes modificações no método original, para minimizar os efeitos
da retirada das amostras e da temperatura, satisfazendo melhor os preceitos do FBR, de
mínimas variações volumétricas e térmicas:
a) volume útil do reator de quatro litros, o dobro do recomendado pelo método original;
b) controle da temperatura do conteúdo do reator pela sua imersão em um banho
termostatizado;
c) mistura contínua do conteúdo do reator através de agitador mecânico;
d) leitura do consumo de oxigênio realizada no interior do próprio reator;
e) determinação da DQO através da metodologia do reciclo fechado, realizada em ampolas;
f) monitoramento de microbiota ao longo do teste.
Na Figura 9, é apresentado um esquema do FBR modificado com a identificação de suas partes
constituintes.
1. Bomba peristáltica
2. Microcomputador
3. Medidor de OD
4. Impressora
5. Solução de alimentação
6. Bomba de aquário
7. Sonda de OD
8. Banho termostatizado
9. Reator cilíndrico de 4 L
10. Controle da rotação
11. Controle do aquecimento
12. Controle do resfriamento
13. Paleta do misturador
14. Mostrador da temperatura e
rotação
15. Cronômetro
Figura 9. Esquema do FBR modificado
Fonte: Leite (1997)
Utilizando este aparato, Leite (1997) avaliou a toxicidade do fenol sobre quatro diferentes
tipos de biomassa, sendo 3 originárias de estações de tratamento de esgotos sanitários da
RMSP e uma de um sistema piloto de tratamento de água residuária de coqueria. Dos
resultados obtidos, concluiu-se que as modificações propostas mostraram-se adequadas para a
avaliação da toxicidade e que os diferentes tipos de biomassa apresentaram comportamento
distintos quando expostos ao fenol. O lodo intumescido demonstrou ser mais suscetível aos
efeitos adversos do composto. A comparação dos resultados obtidos com o FBR modificado e
os dados operacionais das estações de tratamento de esgotos demonstrou a adequabilidade do
teste para auxiliar a operação das estações. Leite (1997) concluiu, ainda, que os organismos da
Classe Rotífera eram os principais indicadores da toxicidade do fenol aos sistemas de lodos
ativados estudados.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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