introdução

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_________________________________________ISSN 1983-4209 – Volume ......– Número ... – 2012
Estudo da atividade citotóxica de Myracrodrun Urundeuva Fr. Allemão
Carvalho, Michelle da Silva e1*; Oliveira, Dario Alves1; Valério, Henrique Maia2
ENCAMINHADO EM 15 DE SETEMBRO DE 2012
RESUMO
Amplamente encontrada no cerrado e caatinga brasileira a aroeira preta, Myracrodrun urundeuva
Fr. Allemão é popularmente conhecida por suas propriedades medicinais como atividade
antinflamatória, cicatrizante e uso em infecções urinárias e respiratórias. Além das propriedades
farmacológicas, a aroeira preta também é conhecida pelo alto poder sensibilizante e irritante capaz
de ocasionar alergias, reações urticantes, eczemas e dermatites, frequentemente relatados por
indivíduos que manuseiam a espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito tóxico
da aroeira do sertão através do ensaio de toxicidade in vitro da atividade hemolítica do seu extrato
bruto metanólico de folhas. A aroeira-do-sertão não apresentou ação hemolítica. A ausência da
atividade hemolítica em eritrócitos sugere que a citotoxicidade do extrato em estudo não está
relacionada ao dano da membrana, podendo essa atividade estar relacionada a outro mecanismo de
ação como, por exemplo, a apoptose.
Unitermos: Aroeira, cerrado, caatinga, atividade antiinflamatória.
Study of the activity of cytotoxic Myracrodrun urundeuva Fr. Allemao.
ABSTRACT
Widely found in the Brazilian cerrado and caatinga black mastic, Myracrodrun urundeuva Fr
Allemão is popularly known for its medicinal properties like anti-inflammatory activity, and use in
healing infections and urinary tract. In addition to the pharmacological properties, the black mastic
is also known for its high power and sensitizing irritant capable of causing allergies, stinging
reactions, eczema and dermatitis, often reported by those handling the species. This study aimed to
evaluate the toxicity of mastic through the backwoods of toxicity testing in vitro hemolytic activity
of its raw methanol extract of leaves. The mastic-the-backwoods showed no hemolytic action. The
absence of hemolytic activity in erythrocytes suggests that the cytotoxicity of the extract under
study is not related to membrane damage, this activity may be related to another mechanism of
action as, for example, apoptosis.
Uniterms: Aroeira, cerrado, caatinga, antiinflammatory activity.
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Authors Affiliation: 1Bioprospecting and Genetic Resources Laboratory; Environmental Microbiology Laboratory State University of Montes Claros. *Corresponding Author. Mailing address: Laboratório de Bioprospecção e Recursos
Genéticos, Biologia/PPGCB/UNIMONTES, Campus Prof. Darcy Ribeiro, Vila Mauricéia, CEP: 39.401.089, Montes
Claros,
Cx.126,
MG,
Brazil.
E-mail:
[email protected],
[email protected],
[email protected]
Recebido em 23 de agosto de 2012
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INTRODUÇÃO
Considerado o segundo maior bioma brasileiro, o cerrado apresenta uma rica biodiversidade,
estimada em 160.000 espécies de plantas, fungos e animais (Ratter, Ribeiro & Bridgewater, 1997).
Kliplin, Machado (2005) destacam que o Cerrado possui a mais rica flora dentre as savanas do
mundo com alto nível de endemismo. Ratter e colaboradores (1997) afirmam existir neste bioma
cerca de 800 espécies arbóreas e um elevado grau de destruição. Dentre as espécies brasileiras,
destaca-se a aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All.), popularmente conhecida como aroeira
preta, aroeira do sertão.
Pertencente a família Anacardiaceae, a Myracrodruon urundeuva Fr. All. também,
denominada por Astronium urundeuva Fr. All. (Queiroz, Moraes, Nascimento, 2002), é uma espécie
tropical dióica, popularmente conhecida como aroeira-do-campo, aroeira-preta ou urundeuva, que
ocorre nas regiões Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste (Almeida, et al., 1998).
Sua utilização se aplica ao fornecimento de madeira, como planta medicinal e na indústria
de curtimento de couro (Andrade, et al., 2000). A madeira, muito utilizada na construção civil,
apresenta grande resistência mecânica e é praticamente imputrescível (Queiroz, Moraes &
Nascimento, 2002).
Seu potencial farmacológico e uso popular surgem como uma alternativa terapêutica.
Atribuído, sobretudo a folhas e cascas, as propriedades medicinais da aroeira-do-sertão se aplicam
ao tratamento das afecções urinárias, respiratórias, ação antiinflamatória e cicatrizante (Andrade, et
al., 2000). As cascas da aroeira são consideradas balsâmicas e hemostáticas e são muito utilizadas
contra as doenças das vias respiratórias e do aparelho urinário (Santos, et al. 2007). O uso medicinal
aponta indicação como antiinflamatório, antidiarréico, cicatrizante, antiulcerogênico, antihistamínico, e analgésico (Andrade, et al., 2000; Almeida, et al., 1998; Albuquerque, Rodrigues,
Viana, 2006).
Apesar das propriedades farmacológicas, a aroeira preta também é conhecida pelo alto poder
sensibilizante e irritante capaz de ocasionar alergias, reações urticantes, eczemas e dermatites,
frequentemente relatados por indivíduos que tem contado com a espécie (Diógenes, Matos, 1999).
Partículas de madeira (serragem) da aroeira, muito explorada na construção civil, pela sua
resistência mecânica, alta densidade e durabilidade (Lorenzi,1992), costumam provocar irritações
cutâneas em muitos trabalhadores (Diogenes, Matos, 1999). O potencial tóxico-irritante das plantas
da família Anacardiaceae tem sido atribuído, principalmente, à presença de derivados fenólicos
encontrados em suas espécies tais como taninos, saponinas, terpenos e alcalóides (Pell, 2004).
Tendo em vista que poucos estudos foram realizados a fim de melhor entendimento das
atividades biológicas e a capacidade de causar dermatites por contato para a espécie M. urundeuva,
este trabalho visou avaliar o efeito tóxico do extrato metanólico desta espécie através do ensaio in
vitro de atividade hemolítica de eritrócitos, Além disto, o estudo serviu para julgar a viabilidade de uso
do teste de ação hemolítica e sua aplicação para avaliação preliminar da toxicidade de plantas.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e preparo do material vegetal
As folhas de aroeira-preta foram coletadas nas proximidades da cidade de Glaucilândia,
localizada no de Norte de Minas Gerais, na primeira quinzena do mês de abril de 2008. Foram
coletadas folhas de dez árvores adultas diferentes, escolhidas aleatoriamente, distribuídas na área.
A identificação dos exemplares foi realizada por comparações morfológicas com exsicatas existentes
no Herbário Montes Claros (HMC), da Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTES). Também
foram realisadas consultas à literatura e especialistas.
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Posteriormente, procedeu-se a secagem do material vegetal conforme descreve Simões et.
al., (2004). O material vegetal foi depositado em local sombreado, à temperatura ambiente, por sete
dias. Após secagem, as folhas foram moídas em Moinho Willey (peneira 16 mm) e armazenadas em
sacos de papel a temperatura ambiente para posterior análise.
Identificação genérica saponinas
Tendo em vista que a atividade biológica mais comum atribuída ao metabólito secundário
saponina, é a capacidade de produzir hemólise, a presença deste metabólito foi pesquisada.
O teste para identificação de saponinas foi realizado através da agitação enérgica (Simões et.
al., 2004) do extrato aquoso obtido após fervura de 10 ml de água destilada e 1 g da folha
pulverizada. A formação de espuma persistente por 15 minutos foi considerada como pesquisa de
saponinas positiva (Dewick, 2002).
Obtenção do extrato seco metanólico
O extrato bruto seco foi feito conforme método de maceração descrito por Filho, Yunes
(1998). 10g das folhas pulverizadas foram maceradas, 10 dias, em 100 ml de metanol a temperatura
ambiente e submetida a agitações esporádicas. Após este período, a mistura foi filtrada e o filtrado
resultante foi levado à estufa (50°C) até a evaporação total do solvente resultando em 1,5 gramas de
extrato bruto seco (15% de rendimento).
O extrato para o teste de hemólise foi feito ressuspendendo o extrato seco em solução
isotônica de 0,9% de NaCl a fim de se obter uma concentração igual a 100 mg/ml.
Teste de Hemólise
O ensaio da atividade hemolítica do extrato metanólico seco da aroeira-preta foi feito
conforme descrito por Diniz (2006) com algumas adaptações.
Foi utilizado sangue de carneiro desfibrilado, adquirido comercialmente, Laborclin. A partir
do extrato preparado, com concentração de 100 mg/ml, foram feitas diluições sucessivas em 6 tubos
sempre utilizando solução fisiológica salina a 0,9% (NaCl 0,9%), até a proporção de 1/64. Assim
foram obtidas soluções com concentrações finais igual a 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 e 1,56 mg/ml.
Para o ensaio de hemólise foram adicionadas às diluições, 50µ de hemácias em todos os tubos
contendo o extrato com concentrações diferentes. A mistura foi deixada em repouso, à temperatura
ambiente, por 30 minutos e posteriormente centrifugado por um minuto a 3000 rpm. Como controle
positivo foi utilizada 0,5ml de água destilada e 50µl de hemácias e como controle negativo foi
utilizado apenas a solução de extrato com NaCl 0.9%. A figura 1 mostra o esquema do
procedimento realizado.
O grau de hemólise foi avaliado, qualitativamente, pela tonalidade avermelhada (hemólise) no
sobrenadante obtido após a centrifugação. Foi atribuída "cruzes", à intensidade de hemólise onde
uma cruz (+) indica ligeira hemólise, duas cruzes (++), hemólise significativa e três cruzes (+++)
indicam hemólise intensa.
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Figura 1: Teste de hemólise in vitro.
Fonte: Carvalho, Michelle da Silva e
RESULTADOS
A. Pesquisa de saponinas
A pesquisa de saponinas no extrato aquoso da aroeira-do-sertão foi positiva sendo observada a
presença de espuma persistente por mais 30 minutos. A figura 2 mostra a presença de espuma
persistente detectada no teste.
Figura 2: Presença de espuma persistente observada no teste de Pesquisa de saponinas
Fonte: Carvalho, Michelle da Silva e
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B. Teste in vitro de hemólise
O extrato de M. urundeuva não apresentou ação hemolítica visto que não foi observada
formação hemólise em nenhuma das concentrações de extrato testadas, permanecendo límpida a
solução de soro fisiológico após a centrifugação, ou seja, as hemácias permaneceram íntegras no
fundo dos tubos, com a formação de um precipitado, sem que tenha havido a lise das células. A
Tabela 1 mostra os resultados encontrados.
Tabela 1: Atividade hemolítica de concentrações decrescentes de extrato de Myracrodrun
urundeuva Fr. Allemão
Agente Hemolítico
Hemólise
Água destilada - Controle Positivo
+++
Solução fisiológica de NaCl 0,9 %
50 mg/mL
25 mg/mL
12,5 mg/mL
6,25 mg/mL
3,13 mg/mL
1,56 mg/mL
Legenda: (-) ausência de hemólise, (+) ligeira hemólise, (++), hemólise significativa,
(+++)hemólise intensa.
.
DISCUSSÃO
As plantas contêm princípios ativos responsáveis pelas propriedades terapêuticas a elas
atribuídas, mas também, por reações adversas que podem aparecer em decorrência de uso indevido
ou contado direto com a mesma.
A ação tóxica de alguns metabólitos secundários já é bem evidenciada. Dewick (2002) afirma
que os alcalóides, mesmo em pequenas quantidades, são substâncias naturalmente, tóxicas. Da
mesma forma, a habilidade dos taninos, principais constituintes químicos da aroeira-do-sertão, de
interagir com proteínas e outras macromoléculas lhe conferem atividades tóxicas e aglutinantes
(Silva, 1999; Monteiro et al., 2005).
As saponinas triterpênicas é outro grupo de compostos naturais associado a toxicidade graças
a sua capacidade de produzir hemólise. Esse efeito é resultante da sua capacidade de interagir com
os componentes da membrana celular dos eritrócitos, principalmente com as moléculas de
colesterol, induzindo uma deformação na membrana com conseqüente extravasamento do conteúdo
intracelular ((Dewick, 2002; Glauert et al., 1967; Karabaliev et al., 2003).
A atividade hemolítica das saponinas faz parte do sistema de proteção do vegetal contra
ataques de predadores (insetos, vírus, fungos e bactérias) (Bruneton, 1999). A ação antimicrobiana
atribuída a várias plantas, muitas vezes, estão relacionadas à presença de tais compostos (LacailleDubois, Wagner, 1996).
Em laboratórios, o teste de hemólise in vitro vem sendo empregado rotineiramente em estudos
de toxicidade de plantas medicinais e de interesse pecuário mostrando se positivo, sobretudo, a
espécies que apresentam saponinas em sua constituição (Pequeno, Soto-Blanco, 2006).
Embora estudos fitoquímicos demonstrem a presença na aroeira-preta de compostos tóxicos
como terpenos, alcalóides, taninos, saponinas e substâncias esteroidais (Kato, Akisue, 2002; Lima
et al., 2004; Monteiro et al., 2006; Fortes, Guedes, 2006; Mota, 2006), o ensaio de toxicidade in
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vitro desta planta não evidenciou a atividade hemolítica do seu extrato. Visto que, em nenhuma das
concentrações testadas, 50 a 1,56 mg/ml, o extrato de M. urundeuva causou dano à membrana do
eritrócito. Entretanto tal resultado, não exclui a existência de citotoxicidade uma vez que maiores
concentrações de extrato ainda não foram testadas e poucos estudos com a espécie são encontrados
na literatura.
Resultado parecido foi encontrados por Laranjeira et al. (2010). Estes autores afirmam que a
citotoxicidade do extrato Croton grewioides Baill em estudo não está relacionada ao dano da
membrana, podendo essa atividade estar relacionada a apoptose.
Tendo em vista o frequente número de casos relatados de potencial irritante da planta, é
possível afirmar que a utilização do teste de hemólise in vitro não foi útil na avaliação preliminar e
triagem de citotoxicidade de extratos de aroeira nas concentrações de 50 a 1,56 mg/ml. Portanto,
estudos futuros devem ser realizados com extratos em concentração ≥ 100 mg/ml bem como testar
diferentes metodologias.
CONCLUSÃO
O extrato metanólico da aroeira-preta não apresentou atividade hemolítica in vitro nas
concentrações de50 a 1,56 mg/ml. Desta forma, é provável que a citotoxicidade do extrato em
estudo não está relacionada ao dano da membrana.
Tendo em vista o frequente número de casos relatados de potencial irritante da planta, é
possível afirmar que a utilização do teste de hemólise in vitro não foi útil na avaliação preliminar e
triagem de citotoxicidade de extratos de aroeira nas concentrações de 50 a 1,56 mg/ml. Portanto,
estudos futuros devem ser realizados com extratos em concentração ≥ 100 mg/ml bem como testar
diferentes metodologias.
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