DESENVOLVIMENTO DE IMPLANTES BIODEGRADÁVEIS

DESENVOLVIMENTO DE IMPLANTES BIODEGRADÁVEIS
CONTENDO ETOPOSÍDEO PARA APLICAÇÃO INTRAOCULAR
Ana G. R. Solano1,2, Silvia L. Fialho3, Armando Silva-Cunha1, Gustavo O. Fulgêncio1, Gisele
R. da Silva2, Gérson A. Pianetti1.
1
Depto. de Produtos Farmacêuticos, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil
2
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de São João Del Rei, Divinópolis (MG), Brasil
3
Divisão de desenvolvimento farmacotécnico e biotecnológico, Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte (MG),
Brasil
E-mail: [email protected]
Resumo. O tratamento quimioterápico do retinoblastoma, tumor pediátrico originário das células da retina,
objetiva a redução do volume do tumor intraocular. O etoposídeo, fármaco antitumoral inibidor da enzima
topoisomerase II, é amplamente empregado na quimioterapia sistêmica do retinoblastoma. No entanto, seu uso
clínico é limitado pela toxicidade sistêmica, reduzido tempo de meia vida e baixa penetração no olho em virtude
da existência da barreira hematorretiniana, que dificulta a entrada de substâncias da circulação sanguínea
para a retina. A incorporação de etoposídeo em implantes poliméricos intraoculares representa uma estratégia
viável para o alcance de níveis terapêuticos no interior do olho e redução dos efeitos adversos associados à
administração sistêmica. Visando o desenvolvimento de um sistema polimérico destinado à liberação controlada
e prolongada de etoposídeo no segmento posterior do olho, neste estudo foram preparados implantes
constituídos por copolímero do acido lático e glicólico (75:25) e etoposídeo, os quais foram caracterizados por
espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), uniformidade de conteúdo e perfil de
liberação in vitro. Também foram avaliadas a atividade citotóxica do fármaco liberado pelo implante contra
células HeLa e a toxicidade in vivo dos mesmos. A partir da caracterização do implante foi possível comprovar
que o etoposídeo foi homogeneamente disperso na matriz polimérica e que sua integridade química foi mantida
após a dispersão. Alem disso, foi observada liberação controlada do fármaco, a partir dos implantes
poliméricos, por período prolongado. O etoposídeo lixiviado dos implantes apresentou atividade citotóxica
semelhante a do fármaco puro. O exame clínico dos olhos dos coelhos, nos quais os implantes foram inseridos
na cavidade vítrea, evidenciou a ausência de toxicidade local. Os resultados obtidos sugerem que os implantes
constituídos por PLGA e etoposídeo representam um potencial sistema de liberação de fármacos para o
tratamento do retinoblastoma no futuro.
Palavras-chave: Implantes intraoculares, Ácido poli(D,L-lático-co-glicólico), Etoposídeo,
Retinoblastoma.
1.
INTRODUÇÃO
O retinoblastoma é um tumor maligno originário das células da retina e representa
aproximadamente 11% dos tumores malignos desenvolvidos no primeiro ano de vida [Dijk et
al., 2010]. Atualmente, seu tratamento consiste em uma combinação de quimioterapia
sistêmica (para redução do tumor) e terapia focal consolidativa (crioterapia, fotocoagulação
com laser, termoterapia, braquiterapia com placas de iodo 125 ou rutênio 106).
O tratamento quimioterápico desta doença representa um desafio, uma vez que o olho
apresenta barreiras naturais, constituídas pelo epitélio e endotélio da córnea, epitélio da retina
e endotélio vascular da retina, que dificultam a penetração dos fármacos no interior do bulbo
do olho. Assim, apenas uma pequena fração da dose do fármaco administrada por via
intravenosa atinge o tumor e o restante da dose é distribuído aos órgãos e tecidos saudáveis,
gerando efeitos indesejáveis como ototoxicidade, alopecia, mielossupressão, episódios febris,
infecções posteriores, toxicidade gastrintestinal, nefrotoxicidade e cardiomiopatia [EljarratBinstock et al., 2010].
Os implantes intraoculares representam método alternativo viável para o alcance de
níveis terapêuticos de fármacos no interior do olho. Os implantes intraoculares são vantajosos,
pois inseridos após a barreira hematorretiniana, liberam o antitumoral diretamente no local de
ação; de forma controlada e por tempo prolongado, reduzindo a possibilidade dos efeitos
indesejáveis [Choonara et al., 2010].
Os implantes intraoculares podem ser preparados a partir de polímeros
reconhecidamente biocompatíveis e biodegradáveis. Esses implantes são vantajosos por não
ser necessária a remoção cirúrgica após a liberação total do fármaco, pois o polímero será
completamente absorvido pelo organismo [Thrimawithana et al., 2011].
Considerando o exposto anteriormente, este trabalho teve por objetivo
desenvolvimento de sistemas poliméricos biodegradáveis de liberação prolongada de
etoposídeo, um fármaco citotóxico, para futura aplicação no tratamento de retinoblastoma.
2.
MATERIAIS E MÉTODOS
2.1
Materiais.
Ácido poli(D,L-lático-co-glicólico) (PLGA) na proporção de 75:25 foi adquirido na
Boehring Inselheim (Alemanha). Etoposídeo foi cedido gentilmente pela Quiral Química
(Brasil) e a substância química de referência etoposídeo foi obtida na Farmacopéia Americana
(EUA). Água ultrapura foi produzida por um sistema de purificação de água Milli-Q®
(Millipore, EUA). Acetonitrila grau HPLC foi obtido na Merck® (Brasil). Outros solventes e
reagentes utilizados foram de grau analítico.
2.2
Preparo dos implantes constituídos por PLGA e etoposídeo.
Foi preparada uma solução, em acetonitrila, de etoposídeo e PLGA na proporção 1:2.
O solvente foi eliminado em evaporador rotativo sob pressão reduzida e o filme resultante foi
modelado, a quente, para produção de implantes cilíndricos (8 mm de comprimento e 0,4 mm
de diâmetro). Também foram preparados implantes sem fármaco usando o procedimento
descrito acima [Rabin et al., 2008].
2.3
Caracterização dos implantes.
Os implantes desenvolvidos foram caracterizados por espectrofotometria na região do
infravermelho por transformação de Fourier (FTIR) e uniformidade de conteúdo.
A FTIR foi realizada em espectrofotômetro Shimadzu®, modelo Prestige 21. Foram
obtidos espectros das amostras (etoposídeo, PLGA, mistura física etoposídeo e PLGA e
implantes) utilizando a técnica de Reflexão Total Atenuada (ATR), na faixa de 4000 a 650
cm-1, a partir de 20 varreduras com resolução de 4 cm-1.
O teste de uniformidade de conteúdo foi realizado de acordo com o método descrito na
Farmacopéia Brasileira (2010). De forma resumida, dez unidades foram pesadas
individualmente e o conteúdo de fármaco determinado para cada unidade, por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE). As análises cromatográficas foram realizadas em
cromatógrafo Thermo Surveyor System (USA), provido de detector ultravioleta (DAD) a 247
nm. A coluna SB-Phenyl (250 x 4,6 mm; 5 μm) foi utilizada e mantida a 25 ºC. O volume de
injeção foi 25 μL. Utilizou-se fase móvel composta por acetonitrila e tampão acetato pH 4,56
(0,05 M), com fluxo de 1,9 mL/min. Os resultados obtidos foram expressos em porcentagem
do valor rotulado e a estimativa do desvio padrão relativo foi calculada.
2.4
Esterilização e teste de esterilidade.
Os implantes foram esterilizados por exposição à radiação ultravioleta a 254 nm por
30 minutos. O método de inoculação direta descrito na Farmacopéia Brasileira (2010) foi
utilizado para testar a esterilidade dos implantes expostos à radiação UV. Durante o
desenvolvimento do teste de esterilidade, foram avaliadas a compatibilidade físico-química
dos implantes com os meios de cultura e a atividade bacteriostática e fungistática dos mesmos
frente a alguns microrganismos para definição das condições adequadas do ensaio.
Além disso, foi traçado o espectro FTIR dos implantes submetidos à radiação UV e o
conteúdo de etoposídeo nestes implantes foi determinado por CLAE de acordo método
descrito anteriormente.
2.5
Perfil de liberação in vitro do etoposídeo a partir dos implantes de PLGA.
O perfil de liberação in vitro do fármaco foi realizado sob condições sink, em
incubadora a 37 ºC sob agitação (30 rpm). Os implantes desenvolvidos (n = 5) foram
colocados em frascos de vidro contendo 5 mL de tampão fosfato pH 7,4. Em intervalos de
tempo pré-estabelecidos, amostras do meio foram coletadas e o volume reposto com tampão
recém preparado. A quantidade de fármaco liberado foi determinada por CLAE e expressa
como porcentagem acumulada de etoposídeo no meio. A média da porcentagem de fármaco
liberado a cada tempo foi calculada e utilizada para construir a curva do perfil de liberação in
vitro.
2.6
Estabilidade do etoposídeo durante a elaboração dos implantes.
O conteúdo de etoposídeo e a identificação de produtos de degradação foram
determinados nas diferentes etapas do processo de obtenção dos implantes. As amostras
utilizadas para essas análises foram: matéria-prima etoposídeo, PLGA incorporada de
etoposídeo e implantes cilíndricos constituído por PLGA e etoposídeo. O método de CLAE
para avaliação de substâncias relacionadas descrito na Farmacopéia Japonesa [Japanese...,
2006] foi empregado para identificação de produtos de degradação do etoposídeo.
2.7
Atividade citotoxicidade dos implantes de PLGA com e sem etoposídeo.
O ensaio de citotoxicidade foi realizado com a linhagem de célula de carcinoma de
colo de útero (HeLa) cultivada em RPMI suplementado com soro bovino fetal 10%, a 37 ºC
em atmosfera umidificada de CO2 (5%) e ar (95%).
A viabilidade das células HeLa em contato com as soluções teste foi avaliada através
do ensaio colorimétrico baseado na conversão mitocondrial do sal de tetrazólio (MTT). Para
preparo das soluções teste, os implantes de PLGA com e sem etoposídeo foram incubados em
meio de cultura a 37 ºC por sete dias. Amostras deste meio de cultura foram colocadas em
contato com as células HeLa e a viabilidade celular foi determinada em 24 horas. Os
resultados foram expressos em porcentagem de viabilidade celular.
2.8
Tolerância in vivo dos implantes de PLGA com e sem etoposídeo.
O estudo in vivo foi realizado empregando-se coelhos albinos Nova Zelândia de
acordo com a resolução da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)
para o uso de animais em pesquisa. O estudo foi aprovado pela Comissão de ética no uso de
animais da Fundação Ezequiel Dias (Belo Horizonte, MG).
Os animais foram divididos em dois grupos: grupo controle que recebeu implantes de
PLGA e grupo tratado, no qual foram inseridos implantes de PLGA incorporado com
etoposídeo. Os coelhos foram anestesiados utilizando-se injeção intramuscular de Cloridrato
de Ketamina 30 mg/Kg e Xilasina 4 mg/Kg e instilação tópica de Cloridrato de Tetracaína
100 mg/mL e Cloridrato de Fenilefrina 1mg/mL. Os implantes foram inseridos na cavidade
vítrea por meio de uma esclerotomia na cavidade vítrea, utilizando um trocater transescleral
de 25G da Alcon. Não houve necessidade de sutura. A avaliação clínica dos animais foi
realizada semanalmente durante seis semanas.
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1
Caracterização dos implantes.
Os implantes poliméricos incorporados de etoposídeo apresentaram peso médio de
1,78 ± 0,06 mg, comprimento de 8,04 ± 0,17 mm, e diâmetro de 0,42 ± 0,02 mm (n=10) (Fig.
1).
Figura 1. Implante de PLGA contendo etoposídeo.
Na Figura 2 estão apresentados os espectros FTIR típicos do etoposídeo, PLGA,
mistura física de etoposídeo e PLGA, e implantes constituídos por PLGA e etoposídeo.
Absorções típicas do etoposídeo foram observadas no espectro das Figuras 2a, 2c-d, tais
como: 1760 cm-1 referente ao estiramento da carbonila do anel lactona e 1600, 1500 e 1450
cm-1 correspondente ao estiramento de C=C de grupos aromáticos. As Figuras 2b-d
apresentaram uma banda a 1100 cm-1 e outra a 1750 cm-1 devido, respectivamente, ao
estiramento da ligação C–O e do grupo carbonila de éster presentes no copolímero PLGA
[Ngian et al., 2009]. Os espectros FTIR indicaram que as absorções típicas dos grupos
funcionais do etoposídeo e PLGA foram preservadas após a mistura física destes compostos e
depois da incorporação do fármaco ao sistema polimérico, sugerindo que a integridade
química do etoposídeo foi mantida.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 2. Espectros FTIR de etoposídeo (a), PLGA (b), mistura física etoposídeo+PLGA na
proporção 1:2 (c) e implantes constituídos por etoposídeo e PLGA (1:2) (d).
Os resultados do teste de uniformidade de conteúdo comprovaram que o etoposídeo
foi homogeneamente disperso nos implantes de PLGA, uma vez que o limite de variação de
conteúdo de etoposídeo das unidades testadas (8,73%) foi inferior à especificação
farmacopéica (15%) [Farmacopéia..., 2010].
3.2
Esterilização e teste de esterilidade.
Os implantes contendo etoposídeo foram esterilizados por radiação UV e foi
verificado que a exposição à radiação não promoveu alteração na estrutura química do
etoposídeo e PLGA presentes no implante, uma vez que nenhuma alteração foi observada no
espectro FTIR dos implantes estéreis. Além disso, não foi observada diferença significativa (p
> 0,05) entre o conteúdo de etoposídeo presente nos implantes estéreis e não estéreis.
Não foi verificado crescimento microbiano em nenhum tubo contendo o implante e
meio de cultura, confirmando a esterilidade dos implantes expostos à radiação UV. O teste de
esterilidade foi realizado conforme descrito na Farmacopéia Brasileira (2010), não havendo
necessidade de alterações das condições de ensaio, uma vez que os constituintes do implante
não apresentaram incompatibilidade físico-química com os meios de cultura e nem atividade
antimicrobiana frente a alguns microrganismos padrão.
3.3
Perfil de liberação in vitro do etoposídeo a partir dos implantes de PLGA.
Liberação acumulada de etoposídeo (%)
O perfil de liberação in vitro do etoposídeo a partir dos implantes poliméricos foi
obtido na forma de porcentagem acumulada de liberação do fármaco em função do tempo em
dias (Fig. 3).
8
6
4
2
0
0
10
20
30
Tempo (dias)
Figura 3. Perfil de liberação in vitro do etoposídeo a partir dos implantes de PLGA.
Resultados apresentados como média ± desvio padrão (n=5).
No primeiro mês de incubação dos implantes poliméricos, foi verificada a liberação de
aproximadamente 5,8% do fármaco presente no sistema polimérico.
3.4
Estabilidade do etoposídeo durante a elaboração dos implantes.
Os resultados das análises cromatográficas permitem concluir que as etapas de preparo
dos implantes poliméricos não interferem na estabilidade do etoposídeo, uma vez que os
produtos de degradação não foram observados nos cromatogramas da PLGA incorporada de
etoposídeo e dos implantes cilíndricos. Além disso, não houve diferença significativa (p <
0,05) no conteúdo de etoposídeo da mistura de PLGA e etoposídeo antes e depois da etapa de
moldagem.
3.5
Atividade citotóxica dos implantes com e sem etoposídeo.
As amostras contendo implante constituído apenas por PLGA não apresentaram um
efeito citotóxico significante sobre as células HeLa, como era esperado, uma vez que o
polímero PLGA é reconhecidamente biocompatível. As amostras contendo o etoposídeo
lixiviado dos implantes poliméricos após sete dias de incubação em meio de cultura
apresentaram atividade citotóxica significante. A fim de comparar a atividade observada com
a esperada para o sistema polimérico após sete dias de incubação, baseado no perfil de
liberação in vitro do fármaco, calculou-se a concentração de etoposídeo presente no meio e
testou-se a atividade citotóxica desta solução. Não foi verificada diferença significativa
(p>0,05) entre atividade da solução de etoposídeo (14 µg/mL) recém-preparada e do fármaco
lixiviado dos implantes (Fig. 4). Este resultado comprova que o etoposídeo se mantém ativo
após o processo de preparo dos implantes e por um período de sete dias de incubação em
meio de cultura.
Viabilidade Celular (%)
100
80
Implante PLGA
Implante PLGA+Etoposídeo
Etoposídeo
60
40
20
0
Figura 4. Viabilidade de células HeLa frente a diferentes amostras: meio de cultura no qual os
implantes de PLGA e de PLGA incorporado com etoposídeo foram incubados por sete dias, e
solução de etoposídeo a 14 µg/mL. Dados apresentados como média ± DP de três
experimentos independentes.
3.6
Tolerância in vivo dos implantes de PLGA com e sem etoposídeo.
O exame clínico dos olhos dos coelhos, nos quais os implantes foram inseridos na
cavidade vítrea, evidenciou a ausência de toxicidade local. Uma semana após a cirurgia, foi
observada hiperemia conjuntival discreta no olho de dois animais que receberam o implante
polimérico incorporado de etoposídeo. Nas semanas seguintes, não foram verificadas
alterações significantes nos olhos dos animais dos grupos tratado e controle. Considerando os
resultados obtidos, pode-se considerar boa a tolerância aos sistemas poliméricos implantados.
4.
CONCLUSÃO
Os resultados demonstram que os implantes de PLGA incorporados de etoposídeo são
sistemas bem tolerados pelo organismo vivo e que promovem a liberação controlada do
fármaco. Portanto, podem ser considerados como uma alternativa promissora para o
tratamento do retinoblastoma.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Quiral Química do Brasil S.A. pela doação do fármaco
etoposídeo, e ao Centro Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e Farmacopéia
Brasileira pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
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Eljarrat-Binstock, E.; Peer, J.; Domb, A.J. (2010) “New Techniques for Drug Delivery to the Posterior Eye
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Farmacopéia Brasileira (2010), 5ª ed., Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Brasília, vol.1.
Japanese Pharmacopoeia (2006), 15th ed., Society of Japanese Pharmacopoeia, Tokyo, 653-654.
Ngian, M., Liao, S., Patil, A.J., Cheng, Z., Chan, C.K. e Ramakrishna, S. (2009) “The fabrication of nanohydroxyapatite on PLGA and PLGA/collagen nanofibrous composite scaffolds and their effects in osteoblastic
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Rabin, C., Liang, Y., Ehrlichman, R.S., Budhian, A., Metzger, K.L., Majewski-Tiedeken, C., Winey, K.I. e
Siegel, S.J. (2008) “In vitro and in vivo demonstration of risperidone implants in mice”, Schizophrenia
Research, 98, 66-78.
Thrimawithana, T.R., Young, S., Bunt, C.R., Green, C. e Alany, R.G. (2011) “Drug delivery to the posterior
segment of the eye”, Drug Discovery Today, 16, 270-277.
DEVELOPMENT OF BIODEGRADABLE IMPLANT CONTAINING
ETOPOSIDE FOR INTRAOCULAR APPLICATION
Ana G. R. Solano1,2, Silvia L. Fialho3, Armando Silva-Cunha1, Gustavo O. Fulgêncio1, Gisele
R. da Silva2, Gérson A. Pianetti1
1
Departament of Pharmaceutical Products, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte (MG), Brazil
2
Pharmacy School, Federal University of São João Del Rei, Divinópolis (MG), Brazil
3
Pharmaceutical and Biotechnological Development, Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte (MG), Brazil
E-mail: [email protected]
Abstract. The chemotherapy treatment of retinoblastoma, a pediatric tumor originating in the retinal cells,
promotes the reduction of the intraocular tumor volume. Etoposide, a antitumor drug, and topoisomerase II
inhibitor, is widely used in the systemic chemotherapy of retinoblastoma. However, the clinical use of etoposide
is limited by systemic toxicity, reduced half-life and low penetration in the eye because of the existence of bloodretinal barrier, which hinders the entry of substances from the blood circulation to the retina. The incorporation
of etoposide in the polymeric intraocular implants represents a viable strategy for reaching therapeutic levels
within the eye, and reducing the adverse effects associated with the systemic administration. Then, the objective
of this study was to development a polymer system for the controlled and prolonged release of etoposide in the
posterior segment of the eye. The implants were prepared with poly(lactide-co-glyciolide) (75:25) and etoposide,
which were characterized by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), content uniformity and in vitro
release profile. We also evaluated the cytotoxic activity of the drug released from the implant against HeLa cells
and the in vivo toxicity of the implants. The results of the implants characterization proved the etoposide was
homogeneously dispersed in the polymer matrix, and the chemical integrity of drug was maintained after the
dispersion. Furthermore, there was controlled release of drug from the polymeric implant. The etoposide
leached of the implants showed cytotoxic activity similar to the pure drug. The clinical examination of the eyes
of the rabbits in which the implants were inserted into the vitreous cavity, showed the lack of local toxicity. The
results suggest that etoposide-loaded PLGA implants represent a potential delivery system of drugs for the
treatment of retinoblastoma in the future.
Keywords: Intraocular implant, Poly(lactide-co-glyciolide), Etoposide , Retinoblastoma.