roteiro de aulas práticas: bacteriologia - IBB

UNESP - INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA APLICADA À ENFERMAGEM
ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS: BACTERIOLOGIA
CURSO DE ENFERMAGEM - 1º ANO
- 2015 -
2
METODOLOGIA DE ENSINO
I - INTRODUÇÃO
As aulas da Disciplina de Microbiologia serão ministradas em 3 períodos
semanais: Terças e Quartas, pela manhã. Na maioria das vezes cada aula
teórica será acompanhada (anteriormente ou posteriormente) por uma aula
correspondente prática.
II - PROGRAMA
Compreende quatro unidades a saber:
1) Bacteriologia Geral: Estudo das características gerais das
bactérias, como: estrutura, cultivo, ação dos agentes antimicrobianos, genética,
etc.
2) Bacteriologia Especial: Estudo dos principais gêneros bacterianos
de importância em patologia humana.
3) Micologia: Estudo das características gerais dos fungos e dos
principais agentes causadores de micoses humanas.
4) Virologia: Estudo das características gerais dos vírus e dos
principais agentes causadores de viroses humanas.
III - ATIVIDADES DIDÁTICAS
1. Aulas Práticas e Teóricas
As aulas práticas serão realizadas no Laboratório 1 da Central de Aulas I do
Instituto de Biociências. Os alunos serão distribuídos em grupos para realização
dos trabalhos práticos.
3
LIVRO ADOTADO - TRABULSI, L.R., Microbiologia, 4a. edição, 2005
ASSUNTOS
Morfologia e coloração das bactérias
Estrutura da célula bacteriana
Nutrição bacteriana
Meios de cultura
Crescimento bacteriano
Genética bacteriana
Controle dos Microrgansimos
Mecanismo de ação dos antimicrobianos e Mecansimos de resistência
Controle laboratorial do tratamento das infecções bacterianas (antibiograma)
Staphylococcus
Streptococcus
Neisseria
Generalidades sobre Enterobactérias
Escherichia
Shigella
Salmonella
Micobactérias
Anaeróbios
Fungos
Vírus
PÁGINAS
07- 08
08 - 19
21 - 23
23 - 28
31 - 36
37 - 49
57 - 65
79 - 89
91 - 97
175 – 187
189 – 217
219 – 227
269 – 276
277 – 309
311 – 317
319 – 328
409 – 421
377 – 387
451 – 499
509 - 564
CUIDADOS
1. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados
2. Não fume e não coma no laboratório. Evite levar à boca qualquer objeto (lápis, dedo, etc).
3. Não use frascos do laboratório para tomar água.
4. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas
sobre a mesa ou assoalho, ferimentos de qualquer espécie, aspirações da cultura na boca,
etc).
5. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.
6. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.
7. Antes de iniciar suas atividades e depois de terminá-las, limpe com desinfetante, o seu local
de trabalho.
NOTA: É OBRIGATÓRIO O USO DE AVENTAL DURANTE OS
TRABALHOS PRÁTICOS.
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BACTERIOLOGIA GERAL
TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS
Os materiais que comumente são utilizados em Microbiologia podem ser enumerados
em:
1. Alça e Fio de Platina
2. Meios de Cultura (Sólidos e Líquidos)
3. Placas de Petri e Tubos de Ensaio
4. Pipeta Pasteur
5. Microscópio
6. Lâminas de Vidro
7. Estufa e Banho-maria
8. Autoclave e Forno Pasteur
Dentre os cuidados que são necessários para que o material não seja contaminado,
salientamos as seguintes regras:
1. Alça e fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de
semeadura. Isto será conseguido, aquecendo-se os mesmos e logo após, a parte inferior do
cabo deverá ser passada na chama de Bico de Bunsen, 2 a 4 vezes. A posição ideal para a
flambagem da alça é um ângulo de 45º em relação à mesa de trabalho. Outro cuidado
indispensável é o de promover o esfriamento da alça antes de ser colhido o material. Para
tanto a alça quente deverá ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio.
2. Relativamente às semeaduras procedidas em tubos de ensaio, exige-se flambar a
boca dos mesmos após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. O tampão de
algodão deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão direita e nunca deve ser deixado
sobre a mesa do laboratório.
3. As pipetas que utilizaremos serão previamente esterilizadas e embrulhadas em papel.
Para sua utilização e ao mesmo tempo evitar que se contaminem, deve-se torcer o papel na
região central da pipeta, retirar primeiramente a parte superior do papel e depois a inferior
(ponta da pipeta). A pipeta utilizada deverá ser colocada dentro de um recipiente de vidro,
contendo solução de desinfetante.
4. As placas de Petri deverão ser manuseadas com cuidado e não deverão ficar
abertas, isto é, expostas ao ambiente. Com esta medida e mais a exigência de abrí-las
próximo ao Bico de Bunsen, o tempo suficiente para a semeadura, colheita do material ou
simplesmente inspeção, será evitada a contaminação através de germes do ar. Uma vez
semeadas, devem ser incubadas em estufas, com tampa voltada para baixo.
5. Tendo em vista os exercícios de bacterioscopia, as lâminas contendo esfregaços de
material fixado e corado sempre serão observadas através do uso da objetiva de imersão; a
lâmina, após detalhada observação, deverá ser colocada em recipiente próprio colocado no
laboratório. O microscópio uma vez utilizado, deverá ser limpo e imediatamente procedido o
seu acondicionamento.
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Nº 1
MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DAS BACTÉRIAS
1.MORFOLOGIA
1.1.As bactérias de um modo geral, apresentam-se sob a forma de:
a) Cocos (esferas)
b) Bastonetes retos (bacilos)
c) Bastonetes encurvados (espirilos)
As formas básicas acima mencionadas estão sujeitas a variações(formas plemórficas
e formas de involução).
1.2.Agrupamentos
Segundo o(s) plano(s) de divisão celular as bactérias podem agrupar-se:
a) diplococo
b) estafilococo
c) estreptococo, estreptobacilo
2. MÉTODOS DE COLORAÇÃO
1.1. Método de Gram
Este método de coloração diferencial permite a separação das bactérias em dois
grandes grupos:
GRAM-positivas: São aquelas que não se deixam descorar quando submetidas à ação
de solventes orgânicos (álcool, éter, etc) e permanecem com a cor do cristal violeta.
GRAM-POSITIVA = COR AZUL
GRAM-negativas: São, portanto, aquelas que se deixam descorar pelo solvente
orgânico tomando a cor do corante de contraste (safranina ou fucsina).
GRAM-NEGATIVA = COR VERMELHA
2.1.Método de coloração de Ziehl-Neelsen
Constitui um método específico para a coloração das Micobactérias (Ex.bacilo de
Hansen e bacilo da tuberculose). Tais bactérias se caracterizam por resistirem à ação do
álcool-ácido permanecendo, portanto, com a cor do primeiro corante (fucsina-fenicada).
B.A.A.R. = COR VERMELHA
EXERCÍCIOS
A) COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE GRAM.
MATERIAL NECESSÁRIO
- Culturas A, B, C, D;
- Bateria de Gram: violeta genciana, lugol, álcool e fucsina;
6
- Lâminas bem limpas;
- Alça de platina;
- Solução fisiológica.
TÉCNICA
1.Com auxílio da alça de platina, fazer esfregaços bem finos sobre a lâmina de microscopia.
Esperar secar.
2.Fixar os esfregaços passando a lâmina três vezes sobre a chama do Bico de Bunsen.
3.Deixar a lâmina esfriar e cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1
minuto.
4.Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto.
5.Escorrer o lugol e decorar os esfregaços pelo álcool. Para isso deixe o álcool cair gota a gota
sobre a lâmina, man tendo-a inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados
quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos.
6.Lavar a lâmina em água corrente.
7.Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto.
8.Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro.
9.Examinar ao microscópio com a objetiva de imersão.
10.Desenhar nos espaços abaixo as bactérias observadas.
Lâmina A
Lâmina C
Lâmina B
Lâmina D
7
B) Coloração de Bactérias pelo Método de Ziehl-Neelsen
MATERIAL NECESSÁRIO
- Lâmina de microscopia contendo esfregaço de escarro;
- Bateria de Ziehl-Neelsen: fucsina fenicada, álcool-ácido e azul de metileno.
TÉCNICA
1.Cobrir a lâmina com fucsina fenicada. Com auxílio de Bico
de
Bunsen
aquecer
a
preparação até a emissão de vapores. Manter o aquecimento durante 3 a 5 minutos. NÃO
DEIXAR A FUCSINA FERVER OU SECAR
2.Escorrer a fucsina e descorar completamente pelo álcool-ácido.
3.Lavar em água corrente.
4.Cobrir o esfregaço com a solução de azul de metileno. Esperar de 30 segundos a 1 minuto.
5.Lavar em água corrente. Secar com papel de filtro.
6.Examinar ao microscópio com a objetiva de imersão.
7.Desenhar no espaço abaixo as bactérias observadas:
Nº 2
ESTRUTURA DA CÉLULA BACTERIANA
A célula bacteriana apresenta as seguintes estruturas:
1. Estruturas externas
a) Flagelos
d) Parede celular
b) Fímbrias
e) Membrana citoplasmática
c) Cápsula
2. Estruturas internas
a) Esporo
d) Ribossomas
b) Citoplasma
e) Núcleo
c) Mesossomas
f) Grânulos citoplasmáticos
EXERCÍCIOS
A) Coloração da cápsula - Método de Hiss
- Esfregaço a partir de cultura de Klebsiella sp
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão
- Desenhar a estrutura visualizada:
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B) Coloração da parede celular - Metodo de G.Moreno.
- Esfregaço a partir de cultura de Bacillus sp
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão
- Desenhar a estrutura visualizada:
C) Coloração de esporos - Método de Wirtz
- Esfregaço a partir de cultura de Bacillus sp
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão
- Desenhar a estrutura visualizada:
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Nº 3
MEIOS DE CULTURA - CULTIVO BACTERIANO
A) Meios de cultura
Para o cultivo e identificação das bactérias usamos soluções e substâncias nutritivas,
denominadas Meios de Cultura. Estes meios, quanto às substâncias nutritivas, podem ser:
I) Quanto às Substâncias Nutritivas
1) Meios sintéticos: Quando as soluções de substâncias são quimicamente definidas.
2) Meios simples: Quando constituídos somente de substâncias essenciais para o
crescimento de algumas bactérias.
3) Meios complexos: Quando se adicionam ao meio simples,substâncias orgânicas
complexas.
II) Quanto ao Estado Físico
1) Meios líquidos: Também denominados caldos.
2) Meios sólidos: Quando se adiciona ao caldo 1,5 a 2% de ágar.
3) Meios semi-sólidos: Quando se adiciona ágar ao caldo, na concentração igual ou
menor que 0,5%.
III) Quanto à força seletiva e diferencial
1) Meios enriquecidos: meios básicos adicionados de certas substâncias como sangue,
soro, extrato de levedura, etc. Estes meios servem para o cultivo de bacterias que necessitam
de substratos complexos. Ex: ágar-sangue, ágar-chocolate, ágar-soro, etc.
2) Meios seletivos: são meios de cultura adicionados com algumas substâncias que
impedem o crescimento de certas bactérias e possibilitam o crescimento de outras. Ex:
MacConkey, tetrationato, verde brilhante, etc.
3) Meios diferenciais: são aqueles que contém substâncias que, quando utilizadas,
indicam certas características bioquímicas das bactérias.
Exemplos:
A) O sangue quando adicionado ao meio de cultura, indica se uma bactéria é hemolítica
ou não. Nesse caso, o meio além de enriquecido é também diferencial. Ex: ágar-sangue.
B) A lactose, quando adicionada juntamente com um indicador dará reação no meio de
cultura, permitindo distinguir as bactérias que fermentam esse açúcar das que não o
fermentam. Ex: MacConkey.
4) Meios de enriquecimento: Quando favorecem o crescimento de
determinadas
bactérias. Ex: Tetrationato e Selenito permitem maior crescimento do Gênero Salmonella.
5) Além desses, existem outros meios de cultura, como por exemplo meios para
conservação de bactérias, meios para a contagem do número de bactérias, etc.
B) Condições físicas de cultivo:
Além de fornecer os nutrientes necessários, para cultivarmos e identificarmos uma
bactéria, outros fatores deverão ser observados, tais como:
1) pH do meio de cultura: deve ser geralmente em torno de 7.
2) Temperatura de crescimento: geralmente a 370C
Quando as bactérias crescem em temperaturas baixas (10 a 20ºC), são denominadas
de psicrófilas.
10
Quando as bactérias crescem em temperaturas médias (20 a 40ºC), são denominadas
mesófilas.
Quando as bacterias crescem em temperaturas mais altas (50 a 60ºC), são
denominadas termófilas.
3) Teor de oxigênio
A) Bactérias aeróbias: são aquelas que só crescem na presença de oxigênio.
B) Bactérias anaeróbias estritas: crescem somente na ausência de oxigênio.
C) Bactérias anaeróbias facultativas: crescem tanto na presença como na ausência de
oxigênio.
D) Bactérias microaerófilas: crescem somente em baixo teor de oxigênio.
EXERCÍCIOS
A) Necessidades nutricionais de algumas bactérias:
Material necessário
-Cultura A;
-Cultura B;
-Cultura C;
-Caldo sintético (sulfato de amônia, cloreto de sódio,
destilada);
-Caldo comum;
-Caldo glicosado (caldo comum mais glicose);
-Alça de Platina;
glicose, fosfato de potássio e água
Técnica
1)
2)
3)
4)
Semear cada um dos 3 germes nos diferentes meios de cultura.
Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte.
Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).
Registrar os resultados no quadro seguinte:
MEIOS CALDO SINTÉTICO
BACTÉRIAS
A
B
C
CALDO COMUM
CALDO GLICOSADO
B) Relação das bactérias com oxigênio
Material necessário
-Meio de tiogel;
-Cultura A;
-Cultura D;
-Agulha de platina;
Técnica
Com a agulha de platina semear cada uma das culturas em um tubo de tiogel. Colocar
todos os tubos na estufa. No dia seguinte, examinar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a
localização do crescimento. Observar também o tubo de tiogel já semeado com a cultura F.
Registrar os resultados.
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Local do Crescimento (Meio de Tiogel)
CULTURAS
SUPERFÍCIE
MEIO
DO TODA
EXTENSÃO BASE DO MEIO
DO MEIO
A
D
F
Nº 4
CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS
I - Ação dos agentes físicos sobre as bactérias
O calor e várias formas de radiação, bem como outros processos físicos, são frequentemente
utilizados com a finalidade de destruir bactérias e outros microrganismos. Verificaremos a ação
do calor úmido sobre duas bactérias, uma esporulada e outra não esporulada.
EXERCÍCIOS
A) Ação da temperatura, em função do tempo, sobre culturas bacterianas
Material
- Cultura A
- Cultura E
- Placa de Petri contendo ágar nutriente
- Banho-Maria a 60º C
- Alça de Platina
Técnica
1. Divida as placas de ágar nutriente em 4 quadrantes, anotando diferentes períodos de tempo
em cada um: 0’, 5’, 10’ e 15’.
2. Coletar com a alça de platina, um pouco da cultura A e inocular a suspensão no quadrante
correspondente ao tempo 0’. Repetir o procedimento com a cultura E na placa
correspondente.
3. Coloque os tubos com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 5', 10' e 15', retire
amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes das placas de Petri (proceda
exatamente como no item 2).
4. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.
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5. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do tempo de
aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de
crescimento). Discuta as diferenças de crescimento.
Tempo de aquecimento
0'
5'
10'
15'
Cultura A
Cultura E
II - Ação dos agentes químicos sobre as bactérias
A ação dos agentes químicos sobre as bactérias é muito importante, do ponto de vista prático e
todos devem se familiarizar com estas substâncias, suas ações e limitações. Verificaremos a
ação do fenol e do álcool iodado sobre algumas bactérias.
EXERCÍCIOS
C) Ação do fenol a 0,8% de acordo com o tempo.
Material
- Tubo contendo solução aquosa a 0,8% de fenol (10 ml)
- Cultura A em caldo
- Placa de Petri contendo ágar nutriente
- Alça de platina
- Pipeta de 1 ml esterilizada
Técnica
1. Adicione, com a pipeta, 1 ml da cultura A aos 10 ml da solução de fenol e misture bem.
2. Imediatamente e após 5', 10' e 15', retire com a alça de platina, amostra da mistura (fenol
mais cultura A) e inocule nos respectivos quadrantes da placa de Petri (0', 5', 10' e 15').
3. Deixe a placa na estufa, a 37oC, até o dia seguinte.
4. Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++) em cada um
dos quadrantes da placa, em função do tempo de tratamento da cultura com o fenol.
Tempo de tratamento com o fenol
0’
5’
10’
15’
D) Ação do álcool iodado a 0,1% sobre as bactérias da pele
Material
- Placa de Petri contendo ágar nutriente
- Zaragatoas estéreis
- Álcool iodado 0,1%
- Solução salina estéril
Técnica
1. Divida a placa de ágar nutriente em duas partes.
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2. Umedeça uma zaragatoa em solução salina e esfregue-a vigorosamente no dorso de uma
das mãos, numa extensão de aproximadamente 4 cm2. Inocule, a seguir, numa das
metades da placa de ágar nutriente.
3. Umedeça uma outra zaragatoa com álcool iodado e esfregue-a no dorso da outra mão, em
área semelhante.
4. Espere 5 minutos para que haja ação do antisséptico e secagem da superfície. Passe
então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida com salina, tomando cuidado para
não atingir a área não tratada. Inocule a outra metade da placa de ágar.
5. Deixe a placa na estufa, a 37o C, até o dia seguinte.
6. Leia os resultados, anotando a variação quantitativa de crescimento (+ a ++++), em função
da presença do álcool iodado.
Tratamento
Sem álcool iodado
Com álcool iodado
Nº 5
TRANSFERÊNCIA DE RESISTÊNCIA A DROGAS
A resistência, de muitos germes, às drogas antimicrobianas depende, geralmente, da
presença de partículas de DNA no citoplasma da célula. Estas partículas podem ser
transferidas de célula para célula, algumas por conjugação e outras por transdução. Este
fenômeno será demonstrado "in vitro".
EXERCÍCIOS
Material necessário
-Placa de MacConkey sem antibiótico;
-Placa de MacConkey com antibiótico Canamicina (K20), na concentração de 20 g/ml;
-Cultura em caldo da bactéria A (não fermentadora da lactose) (Salmonella sp);
-Cultura em caldo da bacteria B (fermentadora da lactose) (E.coli K12);
-Tubo de ensaio contendo mistura das culturas A e B (0,1 ml da cultura A e 0,1 ml da cultura B
foram transferidas
para 5,0 ml de caldo nutriente e, em seguida, esta mistura foi colocada
na estufa, 37ºC por 18 horas);
-Alça de platina;
Técnica
1. Semear com a alça de platina a cultura A numa das metades de uma placa de MacConkey
contendo Canamicina. Fazer o mesmo com a cultura B na outra metade. Incubar a 37ºC até o
dia seguinte.
2. Semear, a cultura A numa das metades da placa de MacConkey sem Canamicina. Fazer o
mesmo com a cultura B na outra metade.Incubar a 37ºC até o dia seguinte.
3. Após 24 horas de inoculação examinar as placas e verificar o crescimento das culturas A e
B.
4. Registrar os resultados no quadro abaixo, identificando as culturas resistentes e sensíveis.
5. Tomar uma alçada da mistura das culturas A e B e semear na superfície da placa de
MacConkey contendo Canamicina.
6.Examinar as placas no dia seguinte e anotar os resultados no quadro abaixo:
RESULTADOS
PRESENÇA DE CRESCIMENTO
CULTURA
MC COM CANAMICINA
MC SEM CANAMICINA
A (Salmonella sp)
B ( E. coli K 12)
Bactéria resistente = presença de crescimento.
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Bactéria sensível
= ausência de crescimento.
Nº 6
DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS
Após o isolamento de uma bactéria de um processo infeccioso, é desejável em alguns
casos, conhecer a sua sensibilidade ou resistência a vários antibióticos e quimioterápicos. Isto
se consegue com o emprego de vários métodos, sendo que o método do disco de papel de
filtro impregnado com solução da droga (Método de Bauer e Kirby) é o mais amplamente
utilizado.
EXERCÍCIO
Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby
Material
- Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos contendo
drogas distintas
- Régua
- Tabela de referência
1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento.
2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no quadro abaixo.
Droga
Concentração
(ug/ml)
Diâmetro do halo de
inibição do crescimento
1
2
3
4
5
* S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário
Interpretação*
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BACTERIOLOGIA ESPECIAL
Nº 1
GÊNERO Staphylococcus
EXERCÍCIOS
A) Examinar placas de Ágar-sangue semeadas com S.aureus e S.epidermidis. Descrever as
características das colônias e verificar hemólise.
CULTURAS
S. aureus
S. epidermidis
CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
HEMÓLISE
B) Observar, pelo método de Gram, esfregaços das culturas de S.aureus e S.epidermidis.
Examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Desenhar o observado.
S.aureus
S.epidermidis
C) Prova de Catalase
Colocar sobre a cultura de S.aureus (em caldo) algumas gotas de água oxigenada. Repartir a
experiência com a cultura de S.epidermidis.
Leitura positiva = desprendimento de bolhas
Anotar o resultado no quadro abaixo:
CULTURA
RESULTADO
S.aureus
S. epidermidis
D) Prova da Coagulase
Misturar 0,5 ml da cultura de S.aureus em 0,25 ml de plasma citratado a 1%, de coelho.
Incubar a 37ºC e observar durante quatro horas. Repetir a experiência com a cultura de
S.epidermidis.
Leitura positiva = coagulação do plasma
Anotar o resultado no quadro abaixo.
CULTURA
S.aureus
S. epidermidis
RESULTADO
16
Nº 2
GÊNERO Streptococcus
EXERCÍCIOS
A) Examinar placas de Ágar-sangue semeadas com Streptococcus Beta Hemolítico,
Streptococcus Grupo viridans e Streptococcus pneumoniae. Descrever as características das
colônias e verificar hemólise.
CULTURAS
CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
HEMÓLISE
Streptococcus pyogenes
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
B) Observar pelo método de Gram, esfregaços das culturas de Streptococcus agalactiae e
Streptococcus pneumoniae. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão. Desenhar o
observado.
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
C) Prova da Catalase
Colocar sobre a cultura de Streptococcus agalactiae e Streptococcus pneumoniae (em caldo)
algumas gotas de água oxigenada.
Anotar o resultado no quadro abaixo:
CULTURAS
RESULTADOS
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
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D) Prova da Bile-Solubilidade
Adicionar 0,1 ml de uma solução a 10% de desoxicolato de sódio a 1,0 ml da cultura de
Streptococcus do grupo viridans.
Incubar a 37ºC e examinar após 15 minutos. Repetir a experiência com a cultura de
S.pneumoniae.
Leitura positiva = a suspensão torna-se clara
Anotar o resultado no quadro abaixo:
CULTURAS
RESULTADOS
Streptococcus pneumoniae
Nº 3
GÊNERO Neisseria
EXERCÍCIOS
A) Examinar placa de Ágar-Sangue semeada com Neisseria spp. Descrever as características
das colônias e verificar hemólise.
CULTURAS
Neisseria
CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
HEMÓLISE
B) Observar pelo método de Gram, esfregaços da cultura de Neisseria spp. Examinar ao
microscópio com objetiva de imersão.
Desenhar o observado.
Neisseria spp.
Nº 4
GÊNERO Pseudomonas
EXERCÍCIOS
A) Examinar placa de Ágar-Sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.
Descrever as características das colônias e verificar hemólise.
CULTURAS
CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
Pseudomonas aeruginosa
HEMÓLISE
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B) Observar pelo método de Gram, esfregaços de cultura de Pseudomonas aeruginosa.
Examinar ao microscópio com objetiva de imersão.Desenhar o observado.
P. aeruginosa
C) Examinar meio de ágar simples semeado com P. aeruginosa e observar a presença de
pigmento.
Nº 5
ENTEROBACTÉRIAS
MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA O ENRIQUECIMENTO E ISOLAMENTO DAS
ENTEROBACTÉRIAS
I) Meio de Enriquecimento
Meio de Tetrationato: Impediente para coliformes, permitindo o crescimento praticamente
irrestrito de Salmonella.
II) Meios Utilizados no Isolamento de Enterobactérias
Esses meios de cultura foram idealizados para o isolamento de enterobactérias patogênicas
das fezes e visam sempre os mesmos objetivos: eliminar a flora indesejável e facilitar a
diferenciação dos não patogênicos, são portanto, meios seletivos e diferenciais. Os meios mais
usados são MacConkey, SS, Verde Brilhante.
1) Ágar MacConkey: Impediente para bactérias Gram-positivas, permitindo o crescimento das
Enterobactérias. Aquelas que fermentam a lactose crescem em colônias vermelhas e aquelas
que não a fermentam, em colônias claras (indicador: vermelho neutro).
2) Ágar SS: (Shigella-Salmonella): Impediente para bactérias Gram positivas, permitindo o
crescimento de Shigella e Salmonella. As bactérias fermentadoras de lactose crescem em
colônias vermelhas e as não fermentadoras em colônias incolores (indicador: vermelho
neutro).
3) Ágar Hektoen: Impediente para bactérias Gram positivas, enterobactérias da microbiota
intestinal normal, possibilitando o crescimento de Shigella e Salmonella (exceto Salmonella
typhi, que cresce com menor intensidade). As bactérias fermentadoras de lactose formam
colônias de cor amarela ou alaranjada enquanto que as não fermentadoras apresentam
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colônias incolores.
EXERCÍCIOS
A) Examinar e interpretar placas de MC, SS e HE, semeadas com E.coli e Salmonella sp
MEIOS
CULTURAS
Escherichia coli
Salmonella spp.
MC
SS
Hektoen
B) Observar, pelo método de Gram, esfregaços das culturas de E.coli e Salmonella sp.
Examinar ao microscópio com objetiva de imersão.
Desenhar o observado.
E.coli
Salmonella spp.
C) Examinar meio de Tríplice Açúcar com ferro(TSI) semeado com E.coli e Salmonella spp.
Anotar os resultados no quadro abaixo:
Tríplice Açúcar
Base do Meio
Superfície do Meio
H2S
Gás
E.coli
Salmonella spp.
D) Identificação bioquímica
A partir do TSI, inocular as culturas E. coli e Salmonella sp em séries bioquímicas
(meios de EPM, MILi e citrato de Simmons) .
Incubar a 37o C, 24 horas.
Fazer a leitura e anotar os resultados no quadro abaixo:
Provas Bioquímicas
E.coli
Indol
Vermelho de Metila
Voges-Proskauer
Citrato de Simmons
Uréia
Fenilalanina
Movimento
Salmonella sp
20
Glicose
Lactose
E) Realizar aglutinação em lâmina com a cultura de E.coli, semeada em ágar inclinado,
utizando o soro anti-E.coli 0 55. Repetir a experiência com a cultura de Salmonella sp utilizando
o soro anti-Salmonella.
Anotar os resultados no quadro abaixo:
CULTURA
ANTI-E.coli O55
E. coli
Salmonella
ANTI-Salmonella