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DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO PARA
PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR BACTÉRIA
ISOLADA DA ÁGUA DO MAR
A. H. M. RESENDE1, I. J. B. DURVAL1, P. P. F. BRASILEIRO1, J. M. LUNA1,2, R. D. RUFINO1,2,
L. A. SARUBBO1,2
1
Universidade Católica de Pernambuco, Centro de Ciências e Tecnologia
2
Instituto Avançado de Tecnologia e Inovação (IATI)
E-mail para contato: [email protected]
RESUMO – Os biossurfactantes são uma opção de limpeza de ambientes contaminados
com petróleo e derivados. Por serem de origem microbiológica, eles têm baixa toxicidade.
Em busca desse biocomposto, o trabalho em questão observou a produção de
biossurfactante por uma bactéria isolada da água do mar variando as fontes de carbono e
nitrogênio. Após selecionar os meios que apresentaram os melhores resultados, o
biossurfactante produzido foi estudado quanto as melhores condições de cultivo, variando
tempo de crescimento e a velocidade de agitação. Os parâmetros avaliados foram a
determinação da tensão superficial em mN/m e o rendimento em g/L. Os resultados obtidos
demonstraram que o meio contendo óleo de fritura e nitrato de potássio no cultivo a 200
rpm por 72 horas foi o que apresentou os melhores resultados. Uma tensão superficial de
29,08 mN/m e um rendimento de 3,56 g/L foram observados, demonstrando que o
biossurfactante poderá ser utilizado em testes futuros de remoção de compostos oleosos.
1. INTRODUÇÃO
Grandes quantidades de óleo já foram lançados ao mar em derrames de petróleo deixando
efeitos devastadores sobre o ambiente marinho. Algumas medidas de limpeza são os surfactantes
sintéticos, dispersantes de óleo capazes de diminuir a tensão interfacial, quebrando manchas de
petróleo presentes na superfície em gotas finas e facilitando a dispersão e dissolução de componentes
hidrofóbicos na cadeia aquosa (GONG et al., 2014).
Esses produtos químicos têm custos reduzidos e alto rendimento, porém são tóxicos,
acarretando em prejuízos ao ecossistema. Desequilíbrio ambiental, criado por óleos brutos de
petróleo, hidrocarbonetos e metais tóxicos podem ser remediados pelo biossurfactante (SOBRINHO
et al., 2013), desenvolvido a partir da fermentação de micro-organismos com potencial biotecnológico
como bactérias, leveduras ou fungos filamentosos em um substrato proveniente de resíduos industriais
(SARUBBO; LUNA; CAMPOS-TAKAKI, 2006). Alguns estudos relatam o sucesso da aplicação da
biorremediação de petróleo derramado (GREENWOOD et al., 2009)
A seleção deste biodispersante para derramamento de petróleo decorre das propriedades
encontradas. O bom desempenho é influenciado por solubilidade, tensão superficial e interfacial,
relações de impactos ambientais, custo de matéria-prima, biodegradabilidade, toxicidade e
rendimento, capacitando uma substituição de surfactantes sintéticos por biológicos (MARTI et al.,
2014).
A otimização da produção de biossurfactantes é de primordial importância, considerando sua
aceitação ecológica, biodegradabilidade e aplicações extensivas (TANSEL, 2014). Isso ajudaria a
reduzir o custo de produção, de modo a aumentar a sua competitividade econômica em comparação
aos surfactantes sintéticos.
Nesse sentido, o presente estudo tem como objetivo estudar a produção de um biossurfactante
com potencial de aplicação na remediação de derivados de petróleo em água do mar.
2. METODOLOGIA
2.1. Preparação do pré-inóculo
Culturas jovens dos micro-organismos obtidos após 24 horas de cultivo em meio Ágar Nutriente
(AN) foram transferidas para frascos de Erlenmeyer contendo 50 mL de Caldo Nutritivo (CN) sendo
mantido sob agitação orbital de 150 rpm durante um período de 10-14 horas a 28°C para obtenção de
uma D.O. de 0,7 (correspondente a um inóculo de 107 U.F.C./mL) a 600 nm, analisada em
espectrofotômetro. A cultura com esta leitura foi utilizada como inóculo na concentração de 5% (v/v).
2.2. Produção do biossurfactante
As fermentações para produção do biossurfactante foram realizadas em frascos de Erlenmeyer
de 500 mL de capacidade, contendo 100 mL do meio de produção e incubados com 5 % do préinóculo. Os frascos foram mantidos sob agitação orbital de 200 rpm durante 48 horas, à temperatura
de 28°C. Após a fermentação, o líquido metabólico foi centrifugado a uma velocidade orbital de 4
000 rpm durante 30 min para determinação da tensão superficial e do isolamento do biossurfactante
(rendimento).
2.3. Influência das fontes de carbono e nitrogênio na produção
O meio mineral foi suplementado com glicose, óleo de soja e óleo residual de fritura de soja,
separadamente, na concentração de 2%. Após a seleção da fonte de carbono, esta foi utilizada com o
meio mineral que foi suplementado também com diferentes fontes de nitrogênio (cloreto de amônio,
nitrato de sódio, ureia, peptona e nitrato de potássio) foram testadas isoladamente na concentração de
0,12%. Todos os testes foram conduzidos em triplicata. O material produzido foi analisado quanto a
tensão superficial e ao rendimento de produção.
2.4. Influência do tempo de cultivo e velocidade de agitação na produção
Após a seleção do melhor meio de cultivo, a influência o tempo de fermentação (48, 72 e 96
horas) e a velocidade de agitação (150 200 e 250 rpm) na produção do biossurfactante foi avaliada.
2.5. Determinação da tensão superficial
A tensão superficial foi medida no líquido metabólico livre de células em tensiômetro
automático KSV Sigma 700 (Finland) utilizando-se o anel de NUOY. A tensão superficial foi medida
através da imersão do anel de platina no líquido metabólico e registrando-se a força requerida para
puxá-lo através da interface ar-líquido. Foram realizadas três medições e tirada a média da tensão.
2.6. Determinação do rendimento
O biossurfactante produzido foi isolado de acordo com a seguinte metodologia: adicionado HCl
até atingir pH igual a 2,0, em seguida o mesmo volume de clorofórmio/metanol (2:1) foi adicionado
ao líquido metabólico, sendo a mistura vigorosamente agitada por 15 minutos e deixada em repouso
para separação das fases. A fase orgânica foi removida e a operação repetida. O produto obtido foi
levado para uma chapa aquecedora a uma temperatura de 40°C para a evaporação do solvente
restante, sendo posteriormente pesado.
2.7. Avaliação da estabilidade do biossurfactante
Os efeitos de diferentes temperaturas (5°C, 70°C, 100°C e 120°C), de diferentes concentrações de
NaCl (2,0, 4,0, 6,0, 8,0 e 10,0 %), de diferentes pHs (2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0 e 12,0) e de diferentes
tempos de aquecimento a 90°C (10, 20, 30, 40, 50, 60 e 120 minutos) na atividade do biossurfactante
foram avaliados no líquido metabólico livre de células para determinação da tensão superficial e da
atividade de emulsificação.
2.8. Determinação da atividade de emulsificação
Para a determinação da atividade de emulsificação foi utilizada a metodologia descrita por
Cooper e Goldenberg (1987).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Influência das fontes de carbono e nitrogênio na produção do biossurfactante
Os resultados para os valores de tensão superficial observados para a produção do
biossurfactante usando 2% de diferentes substratos: óleo de soja após fritura, óleo de soja e glicose
foram de 31,39; 32,39 e 28,73 mN/m, respsctivamente. Seus rendimentos foram observados, também
com valores de 2,52; 0,17 e 0,41 g/L. A produção do biossurfactante utilizando glicose obteve melhor
resultado de tensão superficial, mas um rendimento de produção bem menor, do que o obtido para o
biopolímero produzido em meio contendo óleo residual de soja após fritura, 2,52 g/L. Dessa forma
esse foi o substrato selecionado para os estudos posteriors.
Silva et al. (2010) realizou testes com diferentes fontes de nitrogênio e percebeu que em muitos
processos fermentativos, a relação C/N é um parâmetro extremamente sensível, influenciando
consideravelmente o acúmulo de metabólitos no meio de cultivo. A literatura mostra que a relações de
C/N elevadas, ou seja, níveis reduzidos de nitrogênio no meio limitam o crescimento bacteriano,
favorecendo o metabolismo celular em direção à produção de metabólitos. Em contrapartida, um
excesso da fonte de nitrogênio direciona o substrato para a síntese de material celular, limitando
relativamente o acúmulo de produtos.
Em virtude da importância da fonte de nitrogênio para a produção de biossurfactante, após a
seleção da fonte de carbono, os experimentos foram conduzidos com o objetivo de selecionar também
a melhor fonte de nitrogênio na concentração de 0,12%, utilizando separadamente: cloreto de amônio,
nitrato de sódio, ureia, peptona e nitrato de potássio. A partir dos resultados obtidos o nitrato de
potássio foi selecionado como fonte de nitrogênio, pois o biossurfactante produzido nesse meio
apresentou um rendimento de 3,64 g/L.
3.2. Influência do tempo de cultivo e velocidade de agitação na produção do
biossurfactante
Os resultados da influência da velocidade de agitação e tempo de cultivo na tensão superficial
do biossurfactante produzido através da cepa isolada da água do mar e selecionada pelo seu potencial
tensoativo, pode ser observado na figura 1. As fontes de carbono e nitrogênio utilizadas na produção
foram o óleo residual de soja após fritura e nitrato de potássio, respectivamente.
Figura 1: Variação do tempo de cultivo e da velocidade de agitação na produção do biossurfactante
determinada pela avaliação da tensão superficial
Através desses resultados, foi possível observar que os valores da tensão superficial não
apresentaram grandes variações, estando aproximadamente entre 28 e 35 mN/m, números estes
considerados satisfatórios, de acordo com a literatura, para o biocomposto em questão. Pode-se notar,
também, que as tensões superficiais de menor valor foram observadas no tempo de cultivo de 72
horas, sendo esse o tempo mais considerado para ser selecionado entre as condições de cultivo para
produção da biomolécula.
Esses resultados são corrobados por El-Sheshtawy et al. (2015) que, variando entre 0 e 96
horas no tempo de cultivo do biossurfactante produzido pela bactéria Bacillus licheniformis, onde a
máxima produção foi alcançada em 72 horas de cultivo.
Os estudos prosseguiram para determinação da melhor condição de crescimento da bactéria e
de produção do biossurfactante, relacionando a tensão superficial em mN/m e o rendimento de
produção da biomolécula em g/L. Para isso, a figura 2 demonstra os valores obtidos na avaliação da
produção do biossurfactante pelo rendimento de produção do metabólito.
Figura 2: Avaliação da produção de biossurfactante pelo rendimento em g/L em diferentes condições
de tempo de cultivo (48, 72 e 96 horas) e velocidade de agitação (150, 200 e 250 rpm)
Com base na relação necessária para a determinação das condições de cultivo, nota-se que a
produção utilizando o tempo de 72 horas apresentou resultados satisfatórios, tanto para a tensão
superficial como para o rendimento. O melhor resultado observado foi a condição utilizando uma
agitação orbital de 200 rpm, alcançando 29,085 mN/m e 3,56 g/L, respectivamente.
Mouafi et al. (2016) em busca da produção máxima do biotensoativo também realizaram
estudos variando as condições de cultivo. Uma destas variações foi a do tempo de incubação de 3 a 7
dias (de 72 a 168 horas), onde os melhores resultados foram observados para o maior tempo de
incubação. Dessa forma, para o presente estudo, os resultados mais satisfatórios foram observados
utilizando uma velocidade de cultivo de 200rpm por um período de 72 horas.
3.3. Avaliação da estabilidade do biossurfactante
As influências na estabilidade das atividades do biossurfactante contido no líquido metabólito é
um estudo de grande relevância. Todas as variáveis estudadas englobam ambientes de natureza
específica que podem ser um desafio em sua remediação. E, para que isso aconteça, é preciso que o
tensoativo mantenha suas características surfactantes em qualquer situação. Do contrário, ele será
facilmente descartado pela indústria.
Dessa forma, nas figuras 3 e 4, foram realizados testes para avaliar a estabilidade do
biossurfactante produzido, determinada através da tensão superficial e da estabilidade da emulsão do
liquido metabólito livre de células contendo o biopolímero.
Figura 3: Influência das variações das concentrações de NaCl (A), pH (B), temperatura (C) e
tempo de exposição a 90°C (D) na tensão superficial do biossurfactante
Figura 4: Influência das variações de concentração de NaCl (A), pH (B), temperatura (C) e
tempo de exposição a 90°C (D) na atividade emulsificante do biossurfactante para o óleo de motor
A resistência do biocomposto para NaCl em diferentes concentrações ( 2-10%) foi investigada,
tanto para avaliação da tensão superficial (Figura 3), como para a atividade de emulsificação (Figura
4) A tensão superficial mostrou ser estável independente da concentração do sal, mantendo-se abaixo
de 30 mN/m em todas as variações (Figura 3A). A atividade emulsificante do biossurfactante para o
óleo de motor praticamente não mudou dentre os resultados obtidos, permanecendo com valores entre
94-98% (Figura 4A).
O tensoativo microbiológico mostrou-se bastante eficaz em sua estabilidade também nos testes
realizados para as variações de pH (2-12), apresentando uma discreta elevação nos valores da tensão
superficial apenas nos casos extremos de acidez e basicidade. E, contudo, mantendo-se abaixo de 31
mN/m de tensão superficial (Figura 3B), e valores de 88-96% na capacidade de emulsão (Figura 4B).
As relações com as variações da temperatura não foram diferentes. O líquido metabólito
contendo o biopolímero foi observado com apresentando uma tensão superficial com valores abaixo
de 31 mN/m de tensão (Figuras 3C e 3D). Tanto a elevada temperatura como o tempo de exposição a
ela, não resultaram em grandes modificações para os valores de tensão superficial observados. Assim
se sucedeu, também, com os resultados para as atividades de emulsificação para o óleo de motor
(Figuras 4C e 4D).
Deepika et al. (2016) realizaram testes e relataram uma alta estabilidade do biossurfactante
produzido, um ramnolipídeo, a partir da Pseudomonas aeruginosa em sua emulsão, com as mesmas
variações do presente estudo.
Essa alta estabilidade do biocomposto produzido no estudo em questão, se dá, muito
provavelmente, pela origem do micro-organismo utilizado em sua produção. Uma vez que a bactéria
foi isolada da água do mar, ou seja, de um ambiente com variação diária de condições, tornando-a
mais adaptada às condições de cultivo diferenciadas. O que foi observado também para o metabólito
por ela produzido.
4. CONCLUSÃO
Em virtude dos fatos observados, foi possível ressaltar que todos os testes realizados
apresentaram resultados satisfatórios em estudos de aplicação do biossurfactante em processos de
remediação em ambientes, tanto marinho quanto terrestre, impactados por derivados de petróleo.
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