Fundamentos de Engenharia Genética Rui Coelho

Fundamentos de Engenharia
Genética
Biologia 12º ano
Dogma Central da Biologia
Molecular
O que é Engenharia Genética?
•
É a modificação de seres vivos pela manipulação directa do
DNA, através da inserção ou delecção de fragmentos
específicos. A sua aplicação inclui a produção de vacinas,
proteínas por microorganismos, alimentos, transplantes, terapia
génica, animais transgénicos.
•
Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante
•
Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes,
recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e
transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o
processo reprodutivo
Exemplos de aplicações
Na produção de insulina humana através do uso modificado
de bactérias e na produção de novos tipos de ratos como o
OncoMouse (rato cancro) para pesquisa, através de
manipulação genética. Uma vez que uma proteína é
codificada por um segmento específico de ADN chamado
gene, versões futuras podem ser modificadas mudando o
ADN de um gene. Uma maneira de fazê-lo é isolando o
pedaço de ADN contendo o gene, cortando-o com precisão, e
reintroduzindo o gene em um segmento de ADN diferente.
A insulina facilita a entrada da
glicose nas células (onde ela será
utilizada para a produção de
energia) e o armazenamento no
fígado, na forma de glicogênio.
Retira o excesso de glicose do
sangue. Isso ocorre, logo após as
refeições, quando a taxa de
açúcar sobe no sangue. A falta ou
a baixa produção de insulina
provoca diabetes, doença
caracterizada pelo excesso de
glicose no sangue
(hiperglicemia).
História da engenharia genética
1930 - Dois pesquisadores norte-americanos demonstraram a regulação pelos genes da
produção de proteínas e enzimas e a consequente intervenção nas reacções dos
organismos dos animais. A partir destas pesquisas, teve início o progresso de
descoberta da estrutura genética humana.
1944 – Na pesquisa da cadeia molecular do ácido desoxirribonucleico (DNA), ou
(RNA), descobriu-se que este é o componente cromossômico que transmite
informações genéticas.
1953 – Conseguiu-se mapear boa parte da estrutura da molécula do DNA.
1961 – Foi descoberto que o principal responsável pela síntese
proteica é o DNA e passou então a ser o elemento central
das pesquisas de engenharia genética.
1972 – Ligaram-se duas cadeias de DNA. Uma era de
origem animal, a outra bacteriana. Esta foi a primeira
experiência bem sucedida onde foram ligadas duas
cadeias genéticas diferentes, e que é considerada por
muitos autores o início da criação sintética de produtos
de engenharia genética.
1978 - O suíço Werner Arber e os norte
americanos Daniel Nathans e Hamilton O. Smith foram
laureados
com
o
Prêmio
Nobel
de
medicina ou fisiologia por terem isolado as enzimas
de restrição que são substâncias capazes de quebrar o
DNA controladamente em pontos precisos. Juntamente
com a Ligase que consegue unir fragmentos de
ADN, as enzimas de restrição formaram a base
inicial da tecnologia do DNA recombinante.
Era da manipulação genética
Iniciou-se, então, a era da manipulação de mensagens
genéticas, expressas em fragmentos de sequências que
compõem o código genético e os nucleotídeos.
A partir deste momento a engenharia genética passou a
modificar as moléculas de DNA, utilizando enzimas
específicas. As ligases, enzimas que agem para unir a cadeia
fragmentada, começaram a ser descobertas e sintetizadas
para manipulação genética.
• Para obter um
pedaço de DNA, é
preciso “cortar” o
fragmento da
molécula e, em
seguida, colar suas
extremidades. Para
cortar os pedaços
de DNA, são
utilizadas as
enzimas de
restrição e, para se
ligar os fragmentos
de DNA, são
utilizadas as
enzimas de ligação
ou ligase.
Enzimas de Restrição
•
São endonucleases que clivam o DNA em
sequências específicas chamadas locais de restrição.
•
Quebram a ligação fosfodiéster.
•
Os locais de restrição são, geralmente, sequências
palindrómicas (mesma sequência de nucleótidos,
mas de polaridade inversa).
Enzymes for DNA manipulation – restriction
enzymes
Enzimas de Restrição
• Endonucleases específicas isoladas de procariontes.
EcoRI metilase
• Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos).
• Protegem seu próprio DNA metilando-o no local de
restrição.
• Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia
Molecular.
Classes of Restriction Enzymes
cleavage occurs 400-7000 bp
from recognition site
cleavage occurs adjacent or
Type II within recognition site
cleavage occurs 25-27 bp
Type III from recognition site
Type I
Os Vectores
São moléculas de DNA que irão propagar o
DNA clonado.
Características desejadas:
•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;
• Marca genética para selecionar a célula contendo o
vector (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);
•Locais de clonagem únicos.
Clonagem de Genes
Clonagem de um gene ou de qualquer fragmento de ADN ocorre da seguinte forma:
a) O gene é ligado a um vector, formando um DNA recombinante.
b) Esta molécula é introduzida numa célula hospedeira (bactéria) onde permanece num
estado epissomal (não integrado no genoma do hospedeiro).
c) Vector tem a capacidade de se replicar autonomamente.
d) À medida que a célula hospedeira se vai dividindo, o vector recombinante também se
divide e é transmitido às células-filhas, formando-se um clone de células iguais.
Clonagem em E. coli utilizando plasmídeo vector
Objectivos da clonagem
Tipos de vectores
• Plasmídios
• Bacteriófagos (fagos)
• Cosmídios
• Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
• Vectores especiais para plantas, células de insetos e
mamíferos
Plasmídios
•
Moléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autónoma (ORI);
•
Têm marcas de selecção para resistência a antibióticos.
Caixa de Petri com colónias bacterianas brancas - significa a presença
de DNA recombinante no plasmídio.
Bacteriófagos
•
•
Infectam células de E. coli e o DNA duplica-se na célula hospedeira.
Ex: Fago 
O Ciclo de vida de um bacteriófago
Clonagem no
Fago λ
Utilização da tecnologia do DNA recombinante
Substância obtida
pela tecnologia do rDNA
Hormona do crescimento
Factor de crescimento da pele
Interferão
Aplicação
Disfunção hipofisária
Processos de cicatrização da pele
Cancro
Factores de coagulação VII, VIII e IX
Hemofilia
Vacina para a hepatite
Hepatite B
Teste da SIDA
Superóxidodismutase
Eritropoetina
Despiste da SIDA
Evita a extensão de danos
após enfarte do miocárdio.
Anemia
Biblioteca de Genes
- O processo de multiplicação dos organismos que contêm o rDNA permite não só a
produção da substância codificada, mas também a clonagem desse gene.
- Os investigadores, conservam, cópias desses genes, conseguidas através da produção de
DNA complementar (cDNA), constituindo bibliotecas genómicas ou bibliotecas de genes.
Transcriptase reversa – na produção de cDNA (DNA complementar)
- Produz uma molécula de DNA a partir de uma molécula de mRNA
- Isolada dos retrovírus
-Aplicação: Produção de cDNA
- A comparação entre o cDNA (que não contém intrões) com o DNA
original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não
codificantes (intrões) de um determinado gene e facilita a produção de
seres eucariontes em bactérias.