métodos de extracção e identificação de lípidos
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FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE COIMBRA No âmbito de: BIOQUÍMICA I (1º ano) MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS SEMINÁRIO ORIENTADO 3 – SO3 Turma 2 MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS SUMÁRIO 1. Noção básica de propriedades dos lípidos, remetendo para aquelas com interesse no uso de métodos de extracção e identificação 2. Comunicação de diferentes métodos de extracção de lípidos em amostras biológicas 3. Comunicação de diferentes métodos de análise de lípidos que possibilitem a sua identificação 4. Comunicação de exemplos do estudo dos lípidos no diagnóstico médico MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS São, LÍPIDOS maioritariamente: − Ésteres de ácidos gordos Propriedades − Amidas de ácidos gordos Moléculas orgânicas com: ‒ Baixa solubilidade em água e outros solventes polares ‒ Alta solubilidade em solventes apolares Por serem insolúveis em solventes polares, os lípidos são fundamentais para estabelecer uma interface entre o meio intracelular e o extracelular, francamente hidrófilos. MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS LÍPIDOS RESERVA MEMBRANARES (LÍPIDOS APOLARES) (POLARES) FOSFOLÍPIDOS GLICEROFOSFOLÍPIDOS Ácido gordo Esfingosina Ácido gordo Ácido gordo Glicerol Glicerol Ácido gordo Ácido gordo PO4 ESFINGOLÍPIDOS Álcool Ácido gordo PO4 Álcool ESTERÓIS GLICOLÍPIDOS EX : COLESTEROL ESFINGOLÍPIDOS Esfingosina TRIGLICERÍDEOS Ácido gordo Mono- ou oligossacarídeo MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS MÉTODOS DE EXTRACÇÃO Método de Folch Cromatografia ‒ Cromatografia em camada fina (TLC) MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS MÉTODO DE FOLCH Realiza-se uma homogeneização do tecido com clorofórmio e metanol na proporção de 2:1. Adiciona-se água ou um sal apropriado à solução. A mistura resultante fica dividida em duas fases. Na fase inferior encontram-se os lípidos puros. Durante o processo de lavagem, vai ser perdida alguma percentagem de material lipídico. MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS CROMATOGRAFIA Baseia-se na interacção de uma amostra com uma fase estacionária e uma fase móvel. A fase estacionária (matriz) permanece imóvel durante a separação, enquanto a fase móvel, que constitui o eluente, permite a separação dos componentes da amostra consoante a sua afinidade. Os vários componentes da amostra interagem, essencialmente, por: - Afinidade de carga; - Polaridade. MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS ERA UMA VEZ… A M A M A M M M A A M M A A M A A MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS ERA UMA VEZ… M M M A A AAA A A A A M M M M M MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA As substâncias da mistura são transportadas a certas distâncias e, desta forma, separadas. Permite identificar substâncias desconhecidas através da comparação com padrões (caso eles existam) e isolar os diferentes componentes de uma mistura. Fase estacionária – camada fina de ácido de silício (por exemplo) sobre suporte de vidro, adsorvente muito polar Migração de um solvente (a) e de um componente da amostra (b). e, como tal, os fosfolípidos (por exemplo) possuem grande afinidade para ele. Fase móvel – solvente (clorofórmio+metanol+água) com afinidade para os fosfolípidos MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS MÉTODOS DE ANÁLISE Teste de Iodo Teste de Liebermann-Burchard Espectrometria de massa Teste enzimático ‒ Identificação da esfingomielina MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS TESTE DO IODO Identifica a presença de ácidos gordos insaturados através de uma reacção de halogenação. Se houver dupla ligação, o iodo será consumido e a coloração característica (azul) da solução de iodo diminuirá de intensidade. Pode-se quantificar os ácidos gordos insaturados através de uma titulação com uma solução de iodo. MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS TESTE DE LIEBERMANN-BURCHARD Identificar e quantificar o "colesterol total" (colesterol + ésteres do colesterol). Tem como fundamento a reacção do colesterol e dos seus ésteres com anidrido acético e ácido sulfúrico concentrado, da qual resulta a formação de um complexo corado de azul esverdeado, cuja intensidade da cor é directamente proporcional à concentração de colesterol. L-B reagent H2SO4/HOAc HO HOO2S Cholesterol Cholestahexaene sulfonic acid max = 620 nm MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS ESPECTROMETRIA DE MASSA Um composto é ionizado (uma molécula de carga nula é bombardeada por electrões). Os iões são separados atendendo à base da razão da massa pela carga. Identifica entidades massa/carga (que correspondem a compostos) devidamente separadas umas das outras e expressa esses achados de maneira gráfica (espectro). Muitas vezes acoplada à cromatografia. MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS TESTE ENZIMÁTICO Através de reacções enzimáticas específicas com a amostra anteriormente isolada, obtêm-se produtos que emitem, por exemplo, fluorescência. IDENTIFICAÇÃO DA ESFINGOMIELINA Importante componente lipídico da membrana celular. É baseado na actividade enzimática da esfingomielinase. Esfingomielinase bacteriana é primeiramente usada para hidrolisar a esfingomielina. Ocorrem, posteriormente, uma série de reacções enzimáticas que resultam na formação de um produto altamente fluorescente, a resorufina. MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS EXEMPLOS DO ESTUDO DE LÍPIDOS NO DIAGNÓSTICO MÉDICO Doença de Niemann-Pick Hipercolesterolemia MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS NIEMANN-PICK Doença sem tratamento (segundo um trabalho de licenciatura de uma aluna de bioquímica tutorado pelo Prof. Doutor Hassan Bousbaa). As formas tipo A e B da doença de Niemann-Pick são causadas pela deficiente actividade da esfingomielinase. Os pacientes desta doença possuem valores de esfingomielina 4 a 15 vezes mais elevados que um indivíduo normal, dependendo do tecido em análise. Leva à hipertrofia do baço e do fígado e a lesões nervosas graves (Tipo A) DIAGNÓSTICO Realizado a partir da análise dos níveis de esfingomielina em amostras de tecidos (biopsia ao baço ou fígado). MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS HIPERCOLESTEROLEMIA Patologia que se caracteriza pelos níveis elevados de colesterol no sangue É um dos factores envolvidos no desenvolvimento da arterosclerose, devido à acumulação de colesterol na corrente sanguínea Tem como causa maior a prática de hábitos alimentares inadequados DIAGNÓSTICO Realizado a partir da análise dos níveis de colesterol no sangue. MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS HIPERCOLESTEROLEMIA Tratamento Uma alimentação saudável, com baixo teor em gorduras saturadas. Estatinas ( inibidor da enzima que catalisa a reacção de formação do colesterol) Acetyl-CoA 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA HMG-CoA reductase Squalene Cholesterol + Lecithin LCAT Mevalonate Cholesterol ester “Statin” drugs inhibit this enzyme MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS BIBLIOGRAFIA Propriedades e classes de lípidos ‒ STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L.; BERG, Jeremy M. – Bioquímica – 5ª ed.; Rio Janeiro:Guanabara Koogan , 2004 ; pág. 333-344, 754-755 Métodos de extracção ‒ ‒ ‒ ‒ Métodos de análise ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ http://www.cyberlipid.org/extract/extr0001.htm http://www.lipidlibrary.co.uk/topics/extract/index.htm http://jacintocastanho.planetaclix.pt/cromatografia.htm http://www.infopedia.pt/$cromatografia http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm http://www.apmaldi.com/Applications/Spectra/Lipids_Spectrum2.jpg http://www.dbm.ufpb.br/DBM_bioquimica_monitoria.htm http://www.dq.fct.unl.pt/cadeiras/bio-A/main/aula09_08_09(lipidos).pdf http://www.dqb.fc.ul.pt/docentes/fduarte/espectrometria_de_massa_de_elect.htm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12069422?dopt=Abstract Exemplos do estudo de lípidos no diagnóstico médico ‒ ‒ ‒ http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm http://www.ess.ips.pt/escola/Bioquimica/8CLE/GRUPO9/9.8.pdf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12069422?dopt=Abstract
