Proteínas recombinantes
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Mestrado em Engenharia Biomédica FML / IST Anatomia e Histologia – 2009/10 Proteínas recombinantes Aplicações em Medicina Célia Carvalho Instituto de Biologia Molecular Faculdade de Medicina de Lisboa Tecnologia de DNA recombinante Engenharia genética Tecnologia de DNA recombinante: é o conjunto de técnicas que permite a combinação de segmentos de DNA com origens diferentes de forma a originar uma nova molécula de DNA. É usada na clonagem de genes, na modificação genética de organismos e na biologia molecular de uma forma geral. Clonagem genética: obtenção de grande número de cópias de um gene. Tecnologia de DNA recombinante Clonagem genética Vector de Clonagem: Elemento genético com capacidade de replicação autónoma, usualmente um vírus ou um plasmídeo, que é usado para transportar um fragmento de DNA para uma célula hospedeira para fins de clonagem genética. Enzimas de restrição: Nucleases que clivam uma molécula de DNA em qualquer posição onde ocorra uma pequena sequência específica de nucleótidos. Tecnologia de DNA recombinante Clonagem genética Enzimas de restrição: Nucleases de restrição diferentes cortam em sequências específicas diferentes. São muito usadas em tecnologia de DNA recombinante. Exemplo de nomenclatura: EcoRI – primeira enzima (I) isolada do género Escherichia (E). Espécie coli (co), estirpe RY13 (R) Hind III – terceira enzima (III) isolada de Haemophilus influenzae, estirpe Rd. Tecnologia de DNA recombinante Clonagem genética Exercício de Aplicação Tecnologia de DNA recombinante Clonagem genética Vector de Expressão: Vector de clonagem que também dirige a expressão do gene clonado com vista à obtenção de proteína em grande quantidade. Possui um promotor específico para a expressão na célula hospedeira. Promotor: Sequência nucleotídica no DNA à qual se liga a polimerase de RNA para iniciar a transcrição. Tecnologia de DNA recombinante Clonagem genética Transcriptase reversa faz cópia do mRNA para DNA: DNA cópia ou cDNA É o cDNA que é clonado num vector com vista à expressão de proteína Produção de proteínas recombinantes Aplicações em Medicina Aplicações de proteínas recombinantes em Medicina: Doenças relacionadas com a ausência ou disfunção de uma proteína normalmente sintetizada no organismo – reposição da proteína em falta Minimização de efeitos secundários de terapias agressivas, nomeadamente o tratamento do cancro – administração de factores de crescimento Imunização na prevenção de doenças infecciosas - vacinas Produção de proteínas recombinantes Aplicações em Medicina Insulina A insulina é uma hormona produzida pelas células beta dos ilhéus de Langerhans, no pâncreas. A sua função é regular o nível de glucose no sangue Diabetes mellitus: deficiência de insulina ou da sua actividade Reposição com proteína de origem animal (vaca, porco): tem efeitos terapêuticos mas pode causar resposta imunitária ou ser portadora de contaminantes biológicos perigosos, que não são removidos pelas técnicas de purificação Produção de proteínas recombinantes Aplicações em Medicina B Leader C A Pré-pró-insulina B Pró-insulina A B Insulina A C Insulina humana: não é modificada póstraducionalmente por adição de grupos glicídicos é muito pequena: cadeia A 21 aa, cadeia B 30 aa. foi a primeira proteína recombinante a receber autorização para comercialização, em 1982, apenas 9 anos depois da primeira proteína recombinante ter sido produzida Produção de proteínas recombinantes Aplicações em Medicina Modificações da Insulina insulina aspartato: ácido aspártico 28 prolina na cadeia B. É absorvida mais rapidamente que a insulina humana regular. Apresenta uma acção mais longa e uma menor incidência de hipoglicémia. insulina glargina: asparagina 21 glicina na cadeia A e adição de dois resíduos de arginina na extremidade C da cadeia B. Ganha solubilidade em solução ácida, mas passa a formar um microprecipitado amorfo subcutâneo, do qual vai sendo libertada muito lentamente para a circulação. insulina lispro: transposição da prolina e da lisina nas posições 28 e 29 da cadeia B. Apresenta uma acção mais rápida. insulina glulisina: asparagina B3 lisina e lisina B26 ácido glutâmico. Apresenta o potencial de melhor controlo da glucose circulante a longo termo. Produção de proteínas recombinantes Sistemas de expressão Sistemas de expressão: A escolha do sistema de expressão influencia o carácter, a quantidade e o preço do produto final. A maioria dos produtos aprovados pela FDA (Food and Drug Administration) são produzidos usando sistemas procarióticos (bactérias) ou eucarióticos (leveduras ou cultura de células de mamíferos). Produção de proteínas recombinantes Sistemas de expressão vantagens bactérias E. coli níveis elevados de expressão das proteínas recombinantes, crescimento rápido da população celular num meio de cultura simples leveduras Saccharomyces cerevisae, Hansenulla polymorpha Pichia pastoris células de mamífero células de ovário de hamster chinês, CHO, cél. de rim de hamster bebé, BHK limitações acumulação intracelular de proteína produzida, a possibilidade de degradação do produto por proteases contaminantes e produção de endotoxinas Não produzem endotoxinas. São capazes de glicosilar proteínas. Níveis elevados de expressão das proteínas recombinantes. Crescimento rápido num meio de cultura simples já são capazes de glicosilar as proteínas no locais correctos, embora, com algumas diferenças no tipo de modificação glicosídica A glicosilação das proteínas não é exactamente como nos sistemas de mamíferos O custo de produção nestes sistemas é muito mais elevado devido ao seu lento crescimento e necessidade de meio nutritivo dispendioso Produção de proteínas recombinantes Sistemas de expressão vantagens animais transgénicos cabras, vacas e ovelhas produção de proteínas recombinantes no leite. Níveis de expressão altos, baixo investimento de capital, baixos custos operacionais e reprodutibilidade plantas transgénicas vantagens potenciais de economia e de alargamento de escala limitações variabilidade dos níveis de expressão e a falta de caracterização exacta das modificações pós-traducionais nestes sistemas de mamífero contaminação com fertilizantes e outros produtos químicos, doenças e pestes típicas e condições de cultivo muito variáveis Produção de proteínas recombinantes Sistemas de expressão Produção de proteínas recombinantes Aplicações em Medicina Anti-trombina A anti-trombina é uma proteína complexa com 4 grupos glicídicos N-linked e 3 ligações bissulfito. Estas características são essenciais para a sua função. Não pode ser produzida em biorreactores microbianos. As grandes quantidades necessárias são impeditivas da utilização de culturas de células de mamíferos. Vai ser produzida no leite de cabra. Aplicações médicas: resistência à heparina em pacientes sujeitos a cirurgia cardíaca prevenção de tromboses em pacientes com deficiência hereditária em AT em situações de grande risco como cirurgias ou partos Produção de animais transgénicos para produção de proteínas recombinantes Produção de proteínas recombinantes Aplicações em Medicina Grandes áreas de aplicação das proteínas recombinantes com interesse terapêutico hematologia diabetes e endocrinologia oncologia doenças infecciosas doenças lisossomais vacinas Referências Bibliográficas Gene Cloning in Medicine Echelard, Y; Ziomek, CA; Meade, HM. (2006) Production of recombinant therapeutic proteins in the milk of transgenic animals Bhopale, GM; Nanda, RK. (2005) Recombinant DNA expression products for human therapeutic use. Current Science, 89, 614 Dingermann, T. (2008) Recombinant therapeutic proteins: production platforms and challenges. Biotechnology Journal, 3, 90 Questões ou dúvidas Podem contactar-me: [email protected]
