Para bactérias

MICROBIOLOGIA MÉDICA E IMUNOLOGIA I
BACTERIOLOGIA GERAL
NUTRIÇÃO E CULTURA DE BACTÉRIAS
 Para cultivar bactérias em laboratório é necessário conhecer as suas
preferências nutricionais.
 É necessário conhecer também as suas exigências ambientais.
NUTRIENTES
 Fonte de energia.
 Elementos plásticos:
 Carbono (C);
 Azoto (N);
 Fósforo (P);
 Enxofre (S);
 Minerais.
Os principais elementos, suas fontes e funções nas células bacterianas
Elemento
peso
seco
(%)
Fonte
Compostos orgânicos ou
CO2
H2O, compostos
orgânicos, CO2, and O2
NH3, NO3, compostos
orgânicos, N2
H2O, compostos
orgânicos, H2
Fosfatos inorgânicos
(PO4)
SO4, H2S, So, compostos
de enxofre orgânico
Carbono
50
Oxigénio
20
Azoto
14
Hidrogénio
8
Fósforo
3
Enxofre
1
Potássio
1
Sais de potássio
Magnésio
0.5
Sais de magnésio
Calcio
0.5
Sais de cálcio
Ferro
0.2
Sais de ferro
Função
Principal constituinte do material celular
Constituinte do protoplasma e água celular; O2 é
aceitador de electróes na respiração aeróbica
Constituinte de aminoácidos, ácidos nucleicos
nucleótidos e coenzimas
Principal constituinte de compostos orgânicos e água
celular
Constituinte de ácidos nucleicos, nucleótidos,
fosfolípidos, LPS, acidos teicóicos
Constituinte da cisteina, metionina, glutatião, vários
coenzimas
Principal catião celular inorgânico e cofactor para certos
enzimas
Catião celular inorgânico, cofactor par certas reacções
enzimáticas
Catião inorgânico celular, cofactor para certos enzimas e
um componente dos endósporos
Componente dos citocromos e certas ferro-proteinas
nonhemínicas e um cofactor para algumas reacções
enzimáticas
TIPOS TRÓFICOS DE BACTÉRIAS
Fototróficas
Utilizam a luz como fonte de energia.
 Fotolitotróficas – utilizam substâncias inorgânicas como fonte de
electrões e protões:
 Sulfobactérias (Chromatium) utilizam SH2, produzindo.enxofre.
 Cianobactérias (Anabaena) utilizam H2O, produzindo O2.
 Fotoorganotróficas – utilizam substâncias orgânicas como fonte de
electrões e protões:
 Rhodopseudomonas.
Quimiotróficas
Oxidam substâncias químicas para derivar energia e electrões e protões.
 Quimiolitotróficas:
 Bactérias nitrificantes (Nitrobacter e Nitrosomonas) oxidam o N
a nitrito (NO2) e a nitrato (NO3).
 Bactérias sulfooxidantes (Thiobacillus thiooxidans) oxidam o S a
ácido sulfúrico (H2SO4).
 Quimioorganotróficas:
 Bactérias saprófitas – Escherichia coli, Lactobacillus plantarum.
Paratróficas
 Parasitas intracelulares obrigatórios – parasitas energéticos.
 Riquétsias e Clamídias.
Outro modelo de classificação para os principais tipos tróficos procariotas
Tipo nutricional
Fonte de energia
Fonte de
carbono
Exemplos
Fotoautotróficos
Luz
CO2
Cianobactérias,
algumas bactérias
púrpuras e verdes
Luz
Compostos
orgânicos
Algumas bactérias
púrpuras e verdes
Fotoheterotróficas
Quimioautotróficos ou
litotróficos
(Litoautotróficos)
Compostos
inorgânicos, Ex: H2, CO2
NH3, NO2, H2S
Algumas Eubacteria e
muitas Archaea
Quimioheterotróficos ou
Heterotróficos
Compostos
orgânicos
A maior parte das
Euacteria, algumas
Archaea
Compostos
orgânicos
FONTES DE CARBONO
 Autotróficas
Utilizam substâncias inorgânicas como fonte de carbono.
 Obrigatórios - não crescem na presença de matéria orgânica
(Nitrobacter, Nitrosomonas).
 Facultativos – também utilizam matéria orgânica como fonte de
carbono (Hydrogenomonas).
 Heterotróficas – Utilizam substâncias orgânicas como
fonte de carbono.
 Prototróficas – como fonte de carbono exigem, nos meios onde
crescem, substâncias orgânicas tão simples como glucose (meio
mínimo) (Escherichia coli).
 Auxotróficos – para crescer, nos meios de cultura, necessitam de
substâncias orgânicas mais complexas – aminoácidos, vitaminas,
etc., (bactérias patogénicas, bactérias lácticas).
Vitaminas importantes na nutrição de algumas bactérias
Vitamina
Ácido paminobenzóico
(PABA)
Forma Coenzima
Ácido fólico
Á. Tetrahidrofólico
Biotina
Biotina
Ácido lipóico
Lipoamida
Ácido
mercaptoetanosulfónico
Coenzima M
Produção de CH4 pelas bactérias metanogénicas
NAD (nicotinamida adenina
dinucleótido) e NADP
Coenzima A e a Proteína acil
transportadora (ACP)
Transportador de electrões nas reacções de
deshidrogenação
Oxidação de ceto ácidos e transportador de grupos
acil no metabolismo
Transaminação, desaminação, descarboxilação e
racemização de aminoácidos
Ácido nicotínico
Ácido pantoténico
Piridoxina (B6)
Riboflavina (B2)
Tiamina (B1)
Vitamina B12
Vitamina K
-
Fosphato de piridoxal
FMN (flavina mononucleótido)
and FAD (flavina adenina
dinucleótido)
Tiamina pirofosfato (TPP)
Cobalamina acoplada a adenina
nucleósido
Quinonas e naftoquinonas
Função
Precursor na biosíntese de ácido folico
Transferência de unidades monocarbonadas e
necessário à síntese de bases tiamina e purina,
serine, metionina and á. pantoténico
Reacções biosintéticas que requerem fixatção de
CO2
Transferência de grupos acil na oxidação de ceto
ácidos
Reacções de óxido-redução
Descarboxilação de ceto ácidos e transaminações
Transferência de grupos metilados
Processos de transporte electrónico
FONTES DE AZOTO (N)
 A amónia (NH4+) é a fonte de N preferencial para a maioria das
bactérias.
 Algumas bactérias utilizam nitratos (NO3-) como fonte de N.
 Diazotróficos – fixam o N2 atmosférico (Clostridium pasteurianum,
Cyanobacter).
FÓSFORO (P )
 Existe em pequenas quantidades em todos os ecossistemas. Nos
depósitos naturais encontra-se imobilizado numa forma não disponível
(não solúvel).
 É importante para a estruturação dos ácidos nucleicos, fosfolípidos e
ácidos teicóicos das bactérias Grampositivas.
ENXOFRE (S)
 Necessário para a biossíntese de aminoácidos sulfurados (cisteína,
cistina, metionina).
 Estruturação das proteínas.
 Nas arquibactérias, necessário para a estruturação da membrana
citoplasmática.
MINERAIS
 Importantes na manutenção da osmolalidade do meio.
 Controlo do pH.
 Estruturação de enzimas - enzimas conjugados (o átomo do mineral faz
parte da própria molécula do enzima).
 Cofactores enzimáticos (para que os enzimas funcionem, é necessário
que o mineral exista em determinadas concentrações no meio).
 Macroelementos (concentrações da ordem de g/l)
K+, Na+, Mg2+, Mn2+ e Fe2+
 Oligoelementos (concentrações da ordem de ppm)
Zn2+, Mo2+, Co2+ e Cu2+
 Factores de crescimento
 Alguns microrganismos são incapazes de sintetizar algumas
macromoléculas
 exigem a sua incorporação no meio onde crescem
 3 classes principais
 aminoácidos
 purinas e pirimidinas
 vitaminas
- Enterococcus faecalis necessita de 8 vitaminas
para crescimento;
- Haemophilus influenzae exige hemina no meio de
cultura;
- Lactobacillus e Streptococcus são utilizados em
ensaios microbiológicos para dosear vitaminas e
aminoácidos.
ABSORÇÃO DE NUTRIENTES
 Os microrganismos, em condições naturais, vivem em habitats pobres
em nutrientes
 têm
que
absorver
nutrientes
contra
concentração
 Transporte facilitado
 Permeases
 Glicerol é transportado por difusão facilitada
gradiente
de
 Transporte activo
 transporte contra gradiente de concentração
 consumo de energia
 Transportadores
ABC
(ATP-binding
cassette
transporters)
Bactérias
Arqueobactérias
Eucariotas
 No exterior da membrana existe uma proteina ligante do
soluto
 No interior, um domínio de ligação nucleotídica
E. coli transporta vários glúcidos (arabinose, maltose,
galactose, ribose) e aminoácidos (á. glutâmico, histidina,
leucina) com este sistema
 Transporte activo usando gradientes de protões e Na+
 Simport – absorção de lactose com entrada de protões
A lactose-permease de Escherichia coli transporta
lactose para o interior da célula com a entrada de
protões
 Antiport – entrada de protões e excreção de sódio
O gradiente de sódio gerado dirige a absorção de
glúcidos e aminoácidos
As proteinas transportadoras de E. coli transportam melibiose e
á. glutâmico com a entrada de sódio
 Translocação de grupo
A molécula é transportada para o interior da célula sendo alterada
quimicamente
 Sistema Fosfotransferase (PTS)
 envolve a molécula de fosfoenolpiruvato (PEP)
transporte de glúcidos
PEP + glúcido (ext.) → piruvato + glucidofosfato (int.)
Sistema bem distribuido nos procariotas com a
excepção dos aeróbios estrictos
Sistema bem estudado em E. coli e Salmonella
typhimurium
 Absorção de ferro
 Quase todos os microrganismos requerem ferro (Fe) para a
produção de citocromos
 A absorção do Fe é dificil devido à extrema insolubilidade
do ião férrico (Fe3+)
 Muitas bactérias ultrapassaram esta limitação com a
produção de sideróforos
Moléculas de baixo peso molecular capazes de
complexarem Fe3+ e fornecê-lo à célula
Normalmente ou são hidroxamatos ou fenolatoscatecolatos
Enterobactina é um catecolato produzido por E. coli
 Os microrganismos produzem sideróforos quando a
concentração de Fe no meio é muito baixa
Quando o complexo sideróforo-Fe atinge a superfície
celular, liga-se com a proteina receptora-sideróforo
Então o ião Fe ou é libertado e entra para a célula
directamente ou o complexo sistema de transporte é
transportado
para
transportador-ABC
o
interior
da
cálula
pelo
MEIOS DE CULTURA
Para bactérias
 Quimicamente definidos – sintéticos.
 Quimicamente não definidos – Meios complexos.
Peptonas, extracto de carne, extracto de levedura.
Agar-agar – gelificante dos meios.
Meio mínimo para o crescimento de Bacillus megaterium. Um exemplo de um
meio quimicamente definido para o crescimento de uma bactéria heterotrófica
Componente Quantidade Função do componente
sacarose
10.0 g
fonte de C e energia
K2HPO4
2.5 g
Tampão pH ; fonte de P e K
KH2PO4
2.5 g
Tampão pH ; Fonte de P e K
(NH4)2HPO4 1.0 g
Tampão pH; fonte de N e P
MgSO4 7H2O 0.20 g
Fonte de S e Mg++
FeSO4 7H2O 0.01 g
Fonte de Fe++
MnSO4 7H2O 0.007 g
Fonte de Mn++
water
985 ml
pH 7.0
Meio complexo para crescimento da bactérias fastidiosas
Componente
Quantidade
Extracto de carne
1.5 g
Extracto de
levedura
Peptona
Glucose
Agar
Água
pH 6.6
3.0 g
6.0 g
1.0 g
15.0 g
1000 ml
Função do componente
Fonte de vitaminas e outros factores de
crescimento
Fonte de vitaminas e outros factores de
crescimento
Fonte de aminoácidos, N, S, e P
Fonte de C e energia
Agente solidificante inerte
Tipos de Meios
 Meios Gerais:
Caldo nutritivo, agar nutritivo.
 Meios enriquecidos:
Sangue, soro, colesterol. etc (agar sangue).
 Meios Selectivos:
Substâncias inibidoras – cristal violeta e sais biliares (agar
MacConkey).
Escherichia coli, (à direita) que fermenta a lactose, e Citrobactor freundii,
(à esquerda), que não fermenta.
 Meios diferenciais ou indicadores:
Contêm substâncias que sofrem alteração visível por acção dos
microorganismos (agar MacConkey).
 Meios para testes microbiológicos:
Antibiogramas (Müller Hinton), quantificação de vitaminas.
Meios para riquétsias e clamídias
Cultura de tecidos – são células animais desenvolvidas em meios
laboratoriais.
 Linhas celulares primárias obtidas de explantes – amostras de tecidos ou
células recolhidas de órgãos de animais.
 Linhas celulares contínuas – células transformadas adaptadas às condições in vitro
(diferentes das originais , mas sem perder a afinidade para os virus). Ex: Células
HeLa (neoplasia cervical de Helen Lane – 1951).
CONDIÇÕES
AMBIENTAIS
PARA
BACTERIANO
 Oxigénio (O2)
 Temperatura
 pH
 Concentração de solutos (osmolalidade)
 Potencial óxido-redutor (O/R)
Oxigénio (O2)
 Bactérias aeróbias estrictas ou obrigatórias
Acetobacter.
 Bactérias anaeróbias estrictas ou obrigatórias
Clostridium; Bacteroides.
 Bactérias facultativas
Escherichia coli.
 Bactérias microaerófilas
Brucella; Campylobacter.
O
CRESCIMENTO
Efeito do oxigénio nas bactérias aeróbicas, anaeróbicas, e facultativas
Ambiente
Grupo
Aeróbico
Anaeróbico
Sem
Aeróbio estricto
Crescimento
crescimento
Crescimento se o
Sem
Microaerófilo
nível não for muito
crescimento
elevado
Anaeróbio obrigatório Sem crescimento
crescimento
Anaeróbio facultativo
Crescimento
(Aeróbio facultativo)
Anaeróbio
aerotolerante
Crescimento
Efeito do O2
Requerido (utilizado para a
respiração aeróbica)
Requerido mas em níveis
abaixo de 0.2 atm
Tóxico
Não requerido para o
Crescimento crescimento mas utilizado
quando disponível
Não requerido e não
Crescimento
utilizado
Acção da superoxido-dismutase, catalase e peroxidase – estes enzimas destoxificam
os radicais de oxigénio inevitavelmente gerados pelos sistemas vivos na presença de
O2 e a sua distribuição determina a sua capacidade para crescerem na presença de
O2 .
Distribuição da superoxidismutase, catalase e peroxidase nos procariotas com diferentes
tolerâncias ao O2.
Grupo
Aeróbios estrictos e a maior parte anaeróbios
facultativos (e.g. Enterobactérias)
A maior parte dos anaeróbios aerotolerantes (e.g.
Streptococci, Lactobacilli)
Anaeróbios estrictos(e.g. Clostridia,
Metanogenes, Bacteroides)
Superóxido
Catalase Peroxidase
dismutase
+
+
-
+
-
+
-
-
-
Temperatura
 Bactérias psicrófilas ou criófilas:
crescem a temperaturas compreendidas entre 00 C – 200 C.
 Bactérias mesófilas:
crescem a temperaturas compreendidas entre 150 C – 450 C.
 Bactérias termófilas:
crescem a temperaturas compreendidas entre 450 C – 800 C.
 Bactérias termófilas extremas (Pyrodictium):
crescem a temperaturas compreendidas entre 950 C – 1030 C.
Temperatura de crescimento (graus C)
Bactéria
Minima
Óptima
Listeria monocytogenes
1
30-37
Vibrio marinus
4
15
Pseudomonas maltophilia
4
35
Thiobacillus novellus
5
25-30
Staphylococcus aureus
10
30-37
Escherichia coli
10
37
Clostridium kluyveri
19
35
Streptococcus pyogenes
20
37
Streptococcus pneumoniae
25
37
Bacillus flavothermus
30
60
Thermus aquaticus
40
70-72
Methanococcus jannaschii
60
85
Sulfolobus acidocaldarius
70
75-85
Pyrobacterium brockii
80
102-105
Máxima
45
30
41
42
45
45
37
40
42
72
79
90
90
115
Temperaturas óptimas de crescimento para vários procariotas
Géneros e espécies
Vibrio cholerae
Photobacterium
phosphoreum
Rhizobium leguminosarum
Streptomyces griseus
Rhodobacter sphaeroides
Pseudomonas fluorescens
Erwinia amylovora
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus pyogenes
Treponema pallidum
Thermoplasma acidophilum
Thermus aquaticus
Bacillus caldolyticus
Pyrococcus furiosus
Óptimo de crescimento(graus
C)
18-37
20
20
25
25-30
25-30
27-30
30-37
37
37
37
37
37
59
70
72
100
pH
 A maioria das bactérias proliferam nos meios de cultura a valores de pH
compreendidos entre 6 e 9.
 Bactérias acidófilas – só crescem em meios ácidos (pH  5)
Lactobacillus sp.
Concentração de solutos
 Bactérias halófilas:
concentração de NaCl nos meios  2% (Halococcus spp. e
Halobacterium spp. – cresce em concentrações  20%; produzem o
“vermelho do bacalhau”).
 Bactérias não halófilas:
concentração de NaCl  2%.
 Bactérias osmófilas
Não prescindem da presença de NaCl
 Desequilíbrios osmóticos
- Plasmoptise – rebentamento celular (meio hipotónico).
- Plasmólise – encolhimento do protoplasma celular (meio hipertónico).
(plasmoptise)
 Solutos e Actividade da Água
A quantidade de água disponível para os microrganismos pode ser reduzida
por interacção com solutos.
A actividade da água (Aw) traduz a água disponível para o
desenvolvimento microbiano.
É a relação existente entre a pressão do vapor da solução onde se
encontram os microrganismos (Psol) e a pressão do vapor da água pura
(Págua) à mesma temperatura:
Aw= Psol/Págua
Potencial óxido-redutor (E/0)
 É o grau de oxigenação ou redução do meio.
 A capacidade do meio dar (como dador) ou receber (receptor) O2.
 expressa-se em milivolts (mV):
+ 800 mV (potencial do O2) até - 450 mV (potencial do H2)
 Quanto mais electropositivo for o E/0, maior será o poder oxidante do
sistema.
 Quanto mais electronegativo for o E/0 maior será o poder redutor.
Potencial redox de alguns pares de oxido-redução:
+800
H2O/1/2O2
Fe3+/Fe2+
+600
NO3-/NO2+400
Cit.c(red.)/cit.c (ox)
+200
0
Lactato/piruvato
-200
NAD(P)H/NAD(P)H+
-400
Ferredoxina(red)/Ferredoxina (ox)
1/2H2/H+
-600