3-Métodos para a Caracterização de ácidos Nucleicos

Técnicas de Biologia Molecular em
microbiologia Clínica
Prof.Doutor José Cabeda
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Espectrofotometria
 Lei

de Bert-Lambert
C=eA
 max
 L=1
cm
 A(suporte)
 A(solvente)
Espectrofotometria

Lei de Bert-Lambert

C=eA
 max
 L=1
cm
 A(suporte)
 A(solvente)
Espectofotometria
Espectrofotometria

Lei de Bert-Lambert

C=eA
 max
 L=1
cm
 A(suporte)
 A(solvente)
 A(contaminantes)
Quantificação de DNA
max=260 nm
 max(proteínas) =280 nm
 ref =320 nm
 Concentração = f(OD260). Se L=1cm:






dsDNA 1OD=50µg/ml
ssDNA 1OD=40µg/ml
ssRNA 1OD=40µg/ml
Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)
  ( 260) 

Pureza  f 
  ( 280) 
(se puro deve situar-se entre 1.75 e 2)
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Fazer um gel de
agarose
Electroforese
ELECTROFORESE
 V=IR
 P=I2R

A resistência é inversamente proporcional á secção e á
força iónica da solução
TIPOS DE GEIS

Agarose (TAE e TBE)






Seakam
Nusieve
Nusieve 3:1
outras (LMP, HGT, etc)
formamida como desnaturante
Acrilamida


Acrilamida/bisacrilamida /TEMED
/peróxido de amónio
SDS como desnaturante


Horizontais
Verticais
Limitações da Electroforese
Eficaz de 100bp até no máximo 50kb
 Deixa de fora muitos fragmentos
 Deixa de fora os cromossomas
 Não permite separar simultâneamente os
fragmentos pequenos e grandes
 Ineficaz para caracterizar genotipos
complexos de organismos

Electroforese Convencional
Matriz semisólida
 Campo eléctrico
 uniforme
 Estático
 Moleculas migram
 Segundo uma única dimensão
 Uniformemente ao longo da electroforese

Solução: PFGE


Campo eléctrico variável
 Direcção variavel
 Duração variável
 Intensidade variável
As moléculas respondem ao campo elétrico:
 Reorientando-se (a maior parte do tempo)
 Reorientação dependente do ângulo dos
campos elétricos anternantes
 Migrando no gel (no tempo que sobra)
Electroforese em Campo Pulsado
(PFGE)







Field-inversion G.E.
Transverse-Alternating Field G.E.
Rotating Gel Electrophoresis
Contour-Clamped Homogeneous
Electric Field
Orthogonal-FieldAlternation G.E.
Programable Autonomouslycontroled Electrodes
Pulsed Homogeneous Orthogonal
Field Gel Electrophoresis
Field inversion gel electrophoresis
(FIGE)



Ângulo de 180º
Pulsos Forward/reverse
 Tempo F/R=3:1
 Se pulsos aumentam com a
corrida, melhora a resolução
(swich time ramping)
Resolução aceitável até 800 kb
Traverse-alternating field gel
electrophoresis (TAFE)





Gel vertical
Campos eléctricos fora do plano do
gel
DNA zigzagueia no gel
Ângulo dos campos difere ao longo
do gel
 Aumenta a resolução pois
 DNA maiores menor ângulo
de reorientação
 DNA menores maior ângulo
de reorientação
Separações até 1,600 kb
Rotating Gel Electrophoresis (RGE)





Gel roda com campo desligado
Campo eléctrico uniforme
Fácil de fazer protocolos com
 Ramping voltage
 Ramping time pulse
 Ângulo variável
Tempo para a mudança do ângulo é
o mais longo
Separações de 50 kb a 6000 kb
Contour Clamped Homogeneous
Electric Fields (CHEF)




Solução mais sofisticada
Campo elétrico uniforme
 resistores aplicados a
todos os 24 eléctrodos
 Todas as “lanes” são
perfeitamente paralelas
Ângulo de reorientação de
120º
Separações até 7,000 kb
Aspectos Criticos em PFGE


Pulse Time e rapidez de mudança
 Suficientemente longo para
haver corrida
 Suficientemente curto para
haver principalmente
reorganização
Forma do campo eléctrico
 Número e configuração dos
eléctrodos
 Ângulo dos campos
 Sempre >100º
 Óptimo entre 120º e 150º
 Nunca ≤90º
 Ângulos variáveis tornam
as bandas mais finas



Voltagem
 6-10V/cm (DNA< 1 Mb)
 <2 V cm (3-6 Mb)
 1.5 V/cm (>12 Mb)
 Menor V => aumento tempo
Temperatura
 Arrefecimento e recirculação
do tampão é mandatório
 Ar condicionado eficiente e
24h/dia – 7dias/semana
 14ºC – 22ºC
Escolha da enzima de restrição
 Deve originar:
 Grandes fragmentos
 Poucos fragmentos
Utilização do PFGE





Genotipagem bacteriana
 Discriminação de surtos de infecção nosocomial
 Estudos epidemiológicos da mobilidade de estirpes
bacterianas patogénicas
Mapas genéticos de mais de 180 bactérias
Mapa do genoma humano
Isolamento e caraterização de cromossomas
 Construção de bibliotecas
 Construção de YAC
Produção de Ratinhos transgénicos
Exemplo de PFGE
Electroforese Capilar
Electroforese em capilares de pequeno
diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro
interno)
 Utiliza campos eléctricos muito elevados
(20-30 kV), já que os capilares dissipam o
calor com muita eficiência
 Separações muito boas, num período de
tempo inferior.

Electroforese Capilar (II)





Elevada voltagem
 Grande velocidade
 Produção de calor
Janela de detecção
Capilar fino
 Eficiente gestão do calor
Matriz de separação
Tampão condutor
Electroforese Capilar (III)
Fluxo Electroendosmótico (FEO)
Superfície do capilar C/ grupos negativos
Junto à superficie grupos positivos:
migram para o polo negativo
arrastam consigo o tampão/solvente




Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO
Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO
Moléculas negativas são mais lentas que o FEO
todas as moléculas migram para o pólo negativo
 velocidade depende da carga e do peso molecular
Electroforese Capilar (IV)


Detecção por fluorescência
 Moléculas marcadas
 Fluorocromos c/ afinidade
 Sinal quantitativo
 Grande sensibilidade
Sinal em função do tempo
 Imagem de gel simulada
 Grande resolução
Electroforese Capilar (V)
Videos:
1-Load Matrix
2-Load Samples/markers
3-Run
DNA Demo
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição




REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
Brometo de etidio e análogos
Radioactividade
 32P e 33P
 35S
 125I
 14C
 3H
 Tempos de exposição
 Cassetes com e sem ecran repetidor
 Necessidade de secagem dos geis
Nitrato de prata
Marcação de sondas

Radio-isótopos
32
 P
 33P
 35S
 3H
 14C
 125I
Marcação de sondas
Digoxigenina
 Biotina


detecção directa da cadeia dupla
Enzimas para a marcação de
sondas
Polimerases
 Actividade exonucleolitica
 Temp. optima
 estabilidade térmica
 TdT

Tipos de sondas
Oligonucleótidos
 inserts de plasmideos
 prod. de PCR

Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Fotografia
FOTOGRAFIA
Abertura do diafragma
 Tempo de exposição
 Focagem e profundidade de foco
 Filtros necessários
 Tipos de fotos Polaroid
 Sistemas alternativos

Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Aquisição computorizada de
imagens de geis
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Integração de histogramas
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Reacção de restrição
SISTEMAS R-M

Protecção contra DNA estranho

TIPO I: pouco frequentes (1%)
TIPO II: (93% das enzimas)

reconhecem sequencias simétricas cortando
entre as sequencias
 As endonucleases requerem Mg2+ e as
metiltransferases requerem sadenosylmetionina
 endonucleases compostas por um homodimero
 metiltransferases compostas por monomero

SISTEMAS R-M

TIPO IIs:
como as Iis, mas com sequencias de
reconhecimento assimétricas e interrompidas
 local de corte a até 20 nucleótidos da sequência
reconhecida
 Metilação efectuada po 2 metilases (uma para
cada cadeia, podendo ser metiladas bases
diferentes em cada cadeia)



TIPO III: pouco frequentes (<1%)
TIPO IV: as restantes
MONTAR UMA
REACÇÃO DE RESTRIÇÃO




Instabilidade térmica
Concentração de glicerol
Tampão de reacção
Actividade enzimática:
 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora
 conformação e pureza do DNA
 utilizar 2-3 x mais enzima
 volume total > 50µl
 Homogeneizar por pipetagem
 Verificar a temperatur de reacção