Contraste em microscopia óptica - CCS-UFPB
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Processamento de tecidos duros: técnica de descalcificação Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Ação dos descalcificadores sobre os componentes do tecido. 2) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados; Técnica de descalcificação Pontos importantes 2) Ação dos descalcificadores sobre os componentes do tecido - • • distorção; maceração; vacuolização; contração; inchação. Os riscos são maiores quando o tempo de ação do descalcificador é prolongado. tamanho recomendável da peça: 2 mm x 2 cm x 2 cm. Técnica de descalcificação Pontos importantes 2) Ação dos descalcificadores sobre os componentes do tecido • Peças espessas expostas por longo tempo ao agente descalcificador: maceração periférica pode prejudicar coloração pela eosina. Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: agentes - ácido nítrico; ácido hidroclorícrido; ácido sulfúrico; ácidos orgânios: ácido acético e ácido tricloroacético (rápida descalcificação, boa preservação, mas há inchaço); Ácidos inorgânicos: maior porder de descalcificar, mas causam mais danos aos núcleos; Ácidos orgânicos: causam mais inchaço nas fibras, porém preservam melhor os núcleos. - - • • Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: descalcificador Morse Minimiza a contração celular e o inchaço das fibras - indicado para peças espessas (nenhum lado é menor que 2 mm); a) fixação em formol a 10%; b) solução: 50% de ácido fórmico a 45% + 50% de citrato de sódio a 20% (soluções ficam separados antes do uso); aplica-se solução 10x o volume do tecido, trocando a solução diriamente; Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: Morse, tempo de descalcificação Amostra tempo dente único extraído 7-14 dias dente único com osso adjacente 14-30 dias dois dentes 30-40 dias 3-6 dentes 1-2 meses mandíbula de rato 1-2 dias cabeça de rato 3-5 dias Técnica de descalcificação Pontos importantes 1)Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: descalcificador Morse d) teste químico de descalcificação: - a 5 ml do descalcificador usado, adiciona-se 1 ml de hidróxido de amônia e mistura-se; - adiciona-se 1 ml de solução saturada de oxalato de amônia; precipitado se forma se houver cálcio. Adiciona-se 1 ml de oxalato de amônia a cada 15-20 minutos até completar 4 ml. Se não houver precipitado com 4ml, deixa-se a peça no ácido por 48h até fazer outro teste. Em case de teste negativo por 3 dias, pode-se passar para desidratação. Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: descalcificador Morse Minimiza a contração e o inchaço d) lavagem em água corrente por 5 a 24 h, logo após o teste de descalcificação: remove reagentes que possam interferir com os próximos passo; e) desidratação: etapa I, álcool 30%, 50% e 70% por 24 h; etapa II, soluções 1-6 de álcool n-butílico, cada uma por 48h. Menos danoso à fixação inicial. * Tempo pode ser reduzido para peças pequenas. f) infiltração com parafina por 5-24 h. Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: Morse, soluções de álcool nbutílico Agente água dest. (ml) etanol 95% (ml) n-butílico (ml) 1 30 50 20 solução 2 3 15 50 45 35 55 4 25 74 5 100 . 6 100 Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: descalcificador ácido nítrico + formaldeído rápida descalcificação e preservação da matriz protéica indicado para peças delgadas (um lado é menor que 2 mm); a) fixação em paraformaldeído 2%/ 0,5% glutaraldeído (inativa enzimas); b) solução: ácido nítrico a 5% / formaldeído 4% (soluções ficam separados antes do uso); aplica-se solução 10x o volume do tecido por cerca de 6 h; c) teste químico de descalcificação. - Técnica de descalcificação Pontos importantes 1) Obtenção de secções finas de tecidos mineralizados: descalcificador ácido nítrico + formaldeído d) lavagem em álcool etílico 70%; e) desidratação; f) infiltração com parafina por 5-24 h.
