Vetores de Clonagem

Introdução à Biotecnologia
Prof. Dr. Marcelo Lancellotti
Biotecnologia
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Conjunto de conhecimentos/técnicas
para produção de bens com natureza
Biológica.
Biotecnologia
Técnicas / Bens
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Genética, Bioquímica, Biologia Celular,
Biologia Molecular,Genômica
Tecnologia de Processos
Nanotecnologia
Bioinformática
Robotica
HISTÓRICO
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6000 – 2000 aC – panificação e bebidas
fermentadas por egípcios,sumérios,
babilônicos e gregos
1875 dC – Louis Pasteur : queda da
Teoria da Geração Espontânea e início
dos processos de
fermentação/esterilização.
HISTÓRICO
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Processos fermentativos e produção de
antibióticos em larga escala
Áreas
Tecnologia do DNA
recombinante
Professor Doutor
Marcelo Lancellotti
Histórico
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1928 – Experimentos de transformação no
pneumococo
1953 – descoberta da estrutura do DNA
Década de 70 e 80 avanços na tecnologia do
DNA
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(Paul Berg, Stanley N. Cohen, Herbert Boyer)
Técnicas de clonagem, expressão de genes
sequenciamento genômico
Histórico
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Descoberta e utilização de exonucleases
de restrição (enzimas de restrição)
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(endonucleases do tipo II
BamHI, EcoRI, SmaI, NotI)
Descoberta e utilização das ligases

(T4 DNA ligase por exemplo)
Técnicas de Manipulação de
DNA
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Clonagem e expressão de Genes
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Vetores de clonagem e expressão
Vetores virais (cosmídios e fagos)
Vetores cromossômicos
Vetores de Clonagem
Vetores Plasmidiais
Vetores Plasmidiais
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Fragmentos de até 15000 pb
Necessidade de inserção em linhagens
bacterianas para replicação do inserto
clonado no plasmídio
Preparação de receptores competentes
pBR322
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Seleção por perda
de resistência
Insertos de maiores
tamanhos (cerca de
até 5Kb)
Réplicas de placas
(sistema de
transferência com o
veludo)
pUC18/19



Seleção por perda de
coloração das colônias
com plasmídios
contendo o inserto de
interesse
Fragmentos de até 3kb
(perda de eficiência da
ligação)
Facilidade em
sequenciar os
fragmentos clonados
Vetores de expressão


Inserção do gene de interesse sobre o
controle de um promotor forte
(expressão da proteína alvo);
Fusão do gene alvo com genes
reporters, sequências protéicas (lacZ,
gfp, his-tag)
Vetores de Expressão
Vetores de natureza viral
Cosmídios e Fagos
Vetores Virais


Insertos maiores que em plasmídios
(até 23000 pb para fagos)
Empacotamento do fago in vitro
cI
cro
cII
N
cIII
O
empacotamento
P
Fago
Q
Fago 
48,514 kb
SR
Head Tail
AWbcNu3DEFiFiiZU V G Thmlki J
Head
Tail
att int xis   
cIII N cI cro cII
Recombinação
Regulação
O P Q
SR
Replicação Lise
Cosmídios
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
Derivados principalmente do fago λ;
Clonagem de grandes fragmentos
cromossômicos ou de DNA (45000pb);
Empacotamento in vitro (região cos)
Pode ser inserido em bactérias por
transformação ou indução de ciclo lítico
(fago)
Cosmídios
Região cos : empacotamento
das pastículas virais
Ciclo Lítico necessário
Ap
Utilização em bactéria e fago
(shuttle)
Região de polylinker
ori
Genes de seleção
por resistência à antibióticos
Clonagem gênica em plantas

Plasmídios Ti de Agrobacterium
tumefasciens
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Genes de resistência à pragas
Genes codificantes para imunoglobulinas
Epítopos antigênicos de patógenos
A.tumefasciens - patogênica
Formação do Tumor em A. tumefasciens
Vetores Cromossômicos
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YAC (Yeast Artificial Chromosomes)

BAC (bacterial artificial chromosomes)
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PAC (plant artificial chromosomes)
Vetores Cromossômicos
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

Clonagem de maiores fragmentos de
DNA
Possibilidade de glicosilação após
transcrição da proteína alvo
Existência de vetores shuttle antre
bactérias (Escherichia coli)
YAC’s
YAC’s
BAC’s
pGEMT Easy Clone
Southern Blot
Southern Blot