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Fundação Oswaldo Cruz
PAPEL DA APOPTOSE NA
LEISHMANIOSE HUMANA.
INTERAÇÃO MOLECULAR COM O
HIV
Dra. Maria Lourdes Farre Vallve
LIMI-CPqGM-FIOCRUZ
LEISHMANIOSE
 Doença infecto-parasitária causada por um protozoário da família
Trypanosomatidae, gênero Leishmania
2 milhões de casos novos a cada ano - entre as seis endemias mais
importantes do mundo (OMS).
 Importante problema de saúde pública no Brasil e 88 outros países do
mundo
Apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas:
Cura espontânea da lesão cutânea
Forma cutânea localizada
Forma cutâneo-mucosa
Forma Visceral
Depende da espécie
de Leishmania
envolvida
X
características genéticas
e da resposta imunológica
do hospedeiro
CO-INFECÇÃO HIV-LEISHMANIA
 Afeta 34 paises
 3a co-infecção associada
ao HIV
 Principalmente associada
a leishmaniose visceral
 A co-infecção piora o estado clínico do paciente, sendo que o HIV aumenta o
risco de apresentar leishmaniose e a Leishmania acelera o processo da AIDS.
 Aumenta a mortalidade em comparação com os indivíduos unicamente
infectados por HIV.
 A co-infecção dificulta o diagnóstico sorológico.
 a
co-infecção afeta as áreas endêmicas de leishmaniose na Bahia?
 A infecção pelo HIV está internalizando para as áreas rurais no Brasil
APOPTOSE: Morte celular programada
Inicia-se: Receptores de morte
Executa-se: caspases
Regula: prot. família Bcl-2
APOPTOSE E LEISHMANIOSE
No modelo murino, a expressão de Fas/FasL demostrou-se crucial na resistência à
infecção pela L. major (Conceição-Silva et al., 1998; Huang et al., 1998).
Em humanos (pouca informação):
Leishmaniose visceral: Fas e FasL elevados no plasma e retornam a valores
normais pós-cura (Eidsmo et al., 2002).
Leishmaniose cutânea: a via Fas-FasL é necessária para resolução da lesão (Sami
et al., 2001).
Infecção in vitro: a L. donovani regula a apoptose do neutrófilo e macrófago para
assegurar a sua sobrevida (Aga et al, 2002; Moore et al, 1994).
HIPÓTESES
A apoptose é um processo celular importante no estabelecimento e
resolução da leishmaniose humana.
Nas áreas endêmicas de leishmaniose na Bahia existem casos de coinfecção HIV/Leishmania.
OBJETIVO GERAL
Estudar o papel da apoptose na leishmaniose humana, incluindo os
casos de leishmaniose que apresentem co-infecção com HIV.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Estudar a regulação molecular da apoptose ex vivo e in vitro em células
mononucleares de pacientes com leishmaniose tegumentar americana.
2. Estudar a incidência da co-infecção HIV/Leishmania e a possível alteração
destas vias moleculares pela coexistência dos dois agentes infecciosos em
indivíduos co-infectados.
3. Correlacionar os dados moleculares obtidos com os dados clínicos.
METODOLOGIA
Dados
clínicos
Banco de dados
Parafina: H/E diagnostico
IHQ
Biopsia
Paciente LTA
Coleta
sangue
RNA
2a coorte
1a coorte
PBMC
Plasma
ELISA: Fas
FasL
Sorologia: HIV
Leishmania
Citometria de
fluxo
Analise
Bayesiano
proteína
DNA
Polimorfismo
gene FAS
CBA: Caspase-3
Bcl-2
PARP
Paciente
leish. visceral
Dados
clínicos
Banco de dados
Plasma
ELISA: Fas
FasL
Coleta
sangue
Controle
sadio
DNA
Coleta
sangue
RNA
2a coorte
1a coorte
Plasma
ELISA: Fas
FasL
PBMC
Citometria de
fluxo
proteína
DNA
Polimorfismo
gene FAS
CBA: Caspase-3
Bcl-2
PARP
RESULTADOS
CONSTRUÇÃO DE BANCOS DE DADOS E AMOSTRAS
1.Construção de um banco de dados e amostras de
leishmaniose tegumentar americana (LTA).
181 pacientes
Dados demográficos e clínicos.
Plasma, DNA, RNA, proteína e biopsia de lesão
2. Construção de um banco de dados e DNA de
leishmaniose visceral (colaboração UFMa).
1000 crianças (com manifestação clínica, DTH+ e controles sadios)
Dados demográficos e clínicos.
Plasma e DNA
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A
APOPTOSE NA LTA: receptor de morte celular FAS
Análise da expressão ex-vivo do receptor Fas na superficie celular em pacientes com LTA
*
***
***
% CD95
100
75
Controls
LCL patients
50
25
0
Neutrophils Monocytes Lymphocytes
Aumento significante de neutrófilos, monócitos e linfócitos Fas positivos nos pacientes de
LTA a respeito dos controles normais.
Correlação entre a expressão de Fas e as células mieloides somente nos controles normais
(p=0.0029, r=0.83) mais não nos pacientes com LTA.
RELEVÂNCIA
CLÍNICA ??
CORRELAÇÃO EXPRESSÃO DE FAS COM DADOS
CLÍNICOS
B
A
150
100
healing time (days)
healing time (days)
p=0.048 r=-0.58
**
200
200
50
150
100
50
0
Fas"high" Fas"low"
0
0
25
50
75
100
% CD95+ lymphocytes
A expressão de Fas na superfície dos
linfócitos correlaciona-se negativamente
com o tempo de cura.
Patient
group
healing time
≤60 days
healing time
>60 days2
Fas “high” 1
5
1
Fas “low” 1
1
7
RR=6.67 (95% IC 1.03-43.19) p=0.026 (Fisher’s test)
Risco relativo seis vezes maior de
aumento do tempo de cura nos
pacientes que expressam menos
FAS.
Não observamos associação com a resposta imune humoral (anti-leishmania IgG) ou
celular (DTH)
2a coorte (n=X) confirma-se os resultados da primeira coorte.
Aplicação do análise de redes bayesiana (análise de associação multifatorial - dados laboratoriais
e clínicos): Expressão de Fas associa-se com o número de ciclos de tratamento requeridos.
Treatment
cycles
CD95
Expressão de Fas na
superficie dos linfocitos
MARCADOR DE RESPOSTA
TERAPÊUTICA
Existem fatores
genéticos
associados??
PAPEL DO POLIMORFISMO -670 DO GENE FAS NA LTA.
Polimorfismo funcional na região promotora do gene FAS situado na seqüência de ativação por
interferon-gama (GAS, STAT1 binding site).
AA funcional
Análise por RFLP: substituição CCAGAAACCAGGAA
GA heterozigotos
GG não funcional
RESULTADOS:
2
1
AA
GA
GG
Genotypes
Associação
com a severidade  o genotipo AA (funcional) esta
associado com um tempo de cura menor e menor requerimento
de ciclos de tratamento com antimonial pentavalente.
G
G
G
G
G
A
50
0
0
A
100
G
A
0
*
A
1
*
*
150
A
*
3
Healing time (Day)
**
A
DTH
2
Treatment SbV
Não observamos diferenças nas freqüências dos genotipos entre os pacientes de LTA e os
controles normais  não contrubui com a susceptibilidade.
Análise Bayesiana confirma a associação entre o genótipo de
FAS, os ciclos de tratamento e o tempo de cura
Healing time
Treatment
cycles
Fas
genotype
O polimorfismo –670 do gene FAS esta associado com a severidade da doença  candidato
a marcador farmacogenêtico para a resposta a antimoniales na LTA.
A evolução clínica da LTA é um processo multifatorial com interações complexas entre sexo,
idade, fatores genéticos e resposta imune.
ANÁLISE DA REGULAÇÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS COM A
APOPTOSE NA LTA: caspase-3, Bcl-2 e PARP
CONTROLES vs. LTA
**
10000
8000
Controles sadios
6000
Pacientes LTA
**
U/ml
4000
2000
Extrato protéico de PBMC
1000
(2a coorte) - Técnica CBA
Caspase-3  ativação
500
PARP  clivagem
Bcl-2  expressão
l-2
bc
l-2
bc
P
P
A
R
P
A
R
P
-3
se
ca
sp
a
ca
sp
a
se
-3
0
 Diminuição significativa da expressão de Bcl-2 (proteína anti-apoptotica) nos pacientes com LTA em
comparação com os controles sadios.
 Diminuição da ativação da caspase-3 (efetora da apoptose) nos pacientes com LTA, mas sem diferenças
no clivagem de PARP (substrato da caspase-3)  dúvida: marcador de apoptose ou ativação celular ???
Proximo passo: estudo da regulação destas proteínas nas populações celulares isoladas.
RESULTADOS V
Sorologia HIV pacientes área endêmica de Jiquiriçá
 124 pacientes testados
 2 pacientes positivos e 2 no cut off (duplicados). Para descartar falsos
positivos (pois a presença de Leishmania pode interferir no teste)  Detecção do RNA do
vírus.
Projeto aprovado e financiado na Chamada para pesquisas clínicas e clínico-epidemiológicas em
DST/HIV/Aids. Convocatória n 1/2005 – Ministério da Saúde – UNESCO
Relação Parasita-Hospedeiro na co-infecção HIV x Leishmania sp e sua
evolução para a Leishmaniose Tegumentar.
Avaliação da co-infecção HIV-Leishmania numa população de 4000 indivíduos
das áreas endêmicas de Jiquiriçá (Fazenda Bom Jesus) e Jequié (Florestal) Ba.
TRABALHOS EM ANDAMENTO
 Análise dos níveis de Fas e Fas L solúveis por ELISA
 Análise do polimorfismo -670 do gene Fas na coorte de leishmaniose visceral
 Estudos in vitro da regulação das vias de apoptose na infecção in vitro de
macrófagos humanos.
PERSPECTIVAS
 Análise de Fas e Fas L na lesão (IHQ da biopsia)
 Estudo da inicidência da co-infecção HIV/Leishmania nas áreas endêmicas de
Jiquiricá e Jequié (projeto aprovado e financiado).
 Estudos ex vivo e in vitro da interação HIV/Leishmania.
Publicacões e apresentacões a congressos
Lymphocyte Fas (CD95) expression can predict therapeutic response in human cutaneous
leishmaniasis.
Lourdes Farré, Gilvanéia Silva Santos, George Soares, Jackson M Costa, Aldina Barral,
Manoel Barral-Netto & Johan Van Weyenbergh
Submetido no Cell Death and
Differentiation.
Apresentações em congressos:
Immunogenetic and pharmacogenetic analysis of FAS (TNFRf6) -670 promoter polymorphism in cutaneous
leishmaniasis. Santos, G.S. ; Farre, L ; Deforche, k. ; Soares, G ; Barral-Neto, M ; Van Weyenbergh J . XXX
meting of the Brazilian Society of immunology, 2005, São Paulo.
Efeito diferencial de IFN-beta e L.amazonensis em macrófagos e células NK. Bafica AM, Farre L, Van Weyenberg
J. Jornada de iniciação científica do nordeste-2004, Recife. Comunicação oral.
Efeito diferencial de IFN-beta e l. amazonensis em macrofagos e celulas NK humanas XXIII Seminário Estudantil
de Pesquisa. Bafica AM, Farre L, Van Weyenberg J. UFBA, 2004,Salvador.
Fas expression in PBMC of patients with localized cutaneous leishmaniasis - correlation with clinical data. Silva G,
Farre L, Soares G, Barral A, Barral-Netto M, Van Weyenbergh J. Meeting of the Brazilian Society of
Immunology. 5-8 outubro 2003. Mangaratiba (RJ).
Orientações concluídas:
Estudo do polimorfismo –670 e da expressão do gene Fas na leishmaniose
cutânea: possível associação com dados clínicos.
Tese de mestrado (co-orientação). Curso de Pós-graduação em Patologia UFBAFIOCRUZ 2004 Aluna: Gilvanéia Silva Santos.
Especialização: Adriana Santos Almeida, Aline Clara da Silva.
Iniciação cientifica: Bruna
Orientações em andamento:
Doutorado: Gilvanéia Silva Santos (Co-orientação)
Mestrado: Aline Clara da Silva
EQUIPE
Adriana Santos Almeida
Gilvaneia Silva Santos
George Mariani Soares
COLABORADORES
Dra. Isolda Casanova
Dr. Ramon Mangues
Aline Clara da Silva
Hospital de Sant Pau
Barcelona - Espanha
Dra. Maria Lourdes Farre Vallve
Kul Deforche
Dr. Johan Van Weyenbergh
Dra. Anemie Vandamme
Dr. Jackson Costa Mauricio
Univestidade Católica de
Lovaina – Bélgica
Dra. Aldina Barral
Dr. Manoel Barral-Netto
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz
FIOCRUZ - Bahia