Slide 1 - RExLab

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A BIOTECNOLOGIA E O DOSEAMENTO DE SUSPENSÕES
CELULARES NA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS. (PUIC )
Ciências A grárias
Gilmar Pezzopane Plá, Elisa Sorato Catâneo, Débora Rodrigues e Eulinor
Pereira da Silva ( PUIC Continuado). Curso de Agronomia – Campus Tubarão.
Introdução
Na biotecnologia, um dos ramos da biologia, a área ou a técnica de cultura de tecidos
in vitro de plantas permite a regeneração rápida em massa, a partir de explantes, de
plantas previamente selecionadas. A aplicação dessas técnicas, tais como a cultura de
tecidos vegetais in vitro para a multiplicação e produção de mudas a partir de
explantes vegetativos, representam um enorme potencial a ser explorado. Assim o
desenvolvimento de mudas de plantas, como as medicinais, que tenham capacidade
de produzir quantidades adequadas de princípios ativos para aplicação na área da
fitoterapia tradicional ou na produção de derivados como tinturas, extratos líquidos e
extratos secos para utilização na produção de medicamentos fitoterápicos pela
industria farmacêutica, é um espaço científico pouco explorado. Com a grande
biodiversidade de plantas que a região sul de Santa Catarina possui existe a
necessidade de explorarmos estas potencialidades, criando bancos de mudas que
possam produzir matéria prima vegetal de qualidade aceitável no mercado nacional e
internacional. Assim, o desenvolvimento de atividades práticas e de pesquisa ao longo
da disciplina de Agrobiotecnologia, a qual tornou-se um PUIC-Disciplina em
2005/2006, passou a ser PUIC-Continuidade em 2006/2007 e 2007/2008, possibilitou
aos acadêmicos, por exemplo, experiências que permitiram o entendimento sobre o
isolamento e manutenção de culturas axênicas, sendo estas as primeiras etapas na
busca de alternativas para a conservação de germoplasma, e a multiplicação massal
de várias espécies vegetais de interesse econômico do homem. Portanto, a
continuidade dos trabalhos desenvolvidos nos três últimos anos nesta área são muito
importantes para a consolidação da área biotecnológica, mais especificamente no
cultivo in vitro de espécies frutíferas, ornamentais e medicinais no curso de Agronomia
da UNISUL. Para intensificar e diversificar os trabalhos de pesquisa na área de
Agrobiotecnologia, estamos desenvolvendo estudos de doseamento de princípio
ativos de determinadas plantas medicinais utilizadas em projetos ligados a PIBIC,
PUIC-individuais e PUIC continuado, e Trabalhos de Conclusão de Cursos(TCC),
onde trabalhamos com o isolamento e doseamento dos derivados do ácido
rosmarinico em plantas de melissa. Portanto esta pesquisa teve como principal
objetivo proporcionar os alunos o conhecimento das possibilidades de utilização e
manipulação de espécies vegetais, trabalhando-se a técnica do cultivo in vitro de
plantas e doseamento de suspensões celulares em plantas medicinais.
Resultados
Os resultados cromatográficos foram cruzados com os valores de mentol obtidos a
partir da curva de calibração de mentol padrão, a fim de quantificar as amostras. Em
todas as amostras analisadas observou-se o aparecimento de picos cromatográficos
quantificáveis, indicando a presença de compostos orgânicos na planta, porém,
nenhum destes identificado como mentol . No meio de cultura com concentração de
MS completo observou-se que o pH 4,0 obteve os melhores picos cromatográficos
(Figura 1), porém, nenhum deles correspondeu a mentol, podendo ser estes,
mentona, pulegona, cineol, mentofurano, linalol, ou tantos outros princípios
encontrados na hortelã, que apenas poderão ser afirmados com uma análise de EM.
É importante ressaltar que o valor de pH 4,0, em meio MS completo, foi o que
apresentou um dos menores valores quanto ao peso fresco e altura de plantas, da
mesma forma que em pH 6,5 de meio MS completo, observou-se o melhor
desenvolvimento das plantas quanto ao peso e altura, e os menores picos
cromatográficos (Figura 1), o que afirma a idéia de Tuomi et al. (1991 apud GARLET
et al., 2007) que a concentração de metabólicos secundários tende a ser inversa às
taxas de crescimento. No meio de cultura com redução de nutrientes, ½ MS,
novamente o pH 4,0 foi o que apresentou melhores picos cromatográficos, conforme
a Figura 1, o que indica que meios de cultura em que os valores de pH são mais
ácidos, as substâncias são utilizadas para o metabolismo secundário e não no
desenvolvimento da planta (metabolismo primário), por ser estes o custo de defesa
da planta em condições adversas.
A
Objetivo
Proporcionar
os alunos o conhecimento das possibilidades de utilização e
manipulação de espécies vegetais, trabalhando-se a técnica do cultivo in vitro de
plantas e doseamento de suspensões celulares em plantas medicinais.
Metodologia
Os ensaios foram realizados Laboratório de Produção Vegetal no Centro Tecnológico
– CENTEC, da Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL. Foram utilizados
como explantes segmentos nodais e apicais (1cm) das plantas de hortelã (Mentha
viridis) cultivadas in vitro.
# Multiplicação in vitro:
Os segmentos nodais resultantes das brotações das gemas isoladas, e contendo 2
gemas axilares, foram subculturados no meio de cultura descrito anteriormente,
acrescido de diferentes concentrações de BAP (6-benzilaminopurina) e AIB (Ácido
Indol Butírico).
# Doseamento do principio ativo
As plantas, no caso a hortelã, após o isolamento e multiplicação, com 90 dias de
cultura in vitro foram avaliadas quanto ao número de folhas e de raízes (se houver),
comprimento do caule e de raízes (se houver), medidos com um paquímetro manual. A
determinação da biomassa seca foi realizada com a pesagem das partes da planta
que permaneceram em estufa por 48 horas a 70 Cº. Cada unidade experimental foi
constituída de 10 plantas e cinco repetições. Para os experimentos de
desenvolvimento das plantas, foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado. Os
dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de
Student-Newman-Keuls (SNK) a 5% de probabilidade. Para o doseamento do teor de
certos princípios ativos foram utilizadas amostras (folhas) de todos os tratamentos em
questão no PUIC-individual e Continuado. A análise foi realizada por cromatografia
líquida de alta eficiência ou espectrofotometria UV-Vis (CLAE), no Centro Tecnológico
da UNISUL – CENTEC. Os resultados do doseamento foram cruzados com os dados
de pH e nutrientes (meios) e condições climáticas com o objetivo de avaliar as
melhores caracteristícas para o desenvolvimento das plantas associado a performance
de produção de princípios ativos.
Obs: o
desenvolvimento metodológico da pesquisa/práticas na disciplina de
Agrobiotecnologia ocorreu a partir da sequência das aulas práticas desenvolvidas ao
longo dos semestres 2008/A e 2008/B.
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Figura 1- Análises cromatográficas dos tratamentos com meio MS completo e pH 4,0; com meio MS
completo e pH 6,5 e com meio ½ MS e pH 4,0, respectivamente.
Conclusões
- Apesar de um bom desenvolvimento das plantas cultivadas in vitro, nenhum dos
tratamentos analisados apresentou mentol em teores quantificáveis, porém, outros
compostos ativos presentes na hortelã foram detectados em análises de
cromatografia gasosa, mas não foi possível identificá-los devido à ausência de uma
espectrometria de massas.
-Ao analisar os índices de desenvolvimento e os teores de princípios ativos, concluise o que alguns autores defendem que as taxas de metabólicos secundários
(princípio ativo) tende a ser inversas as de crescimento da planta, já que este é seu
custo de defesa.
-Conforme se observou, nas análises de cromatografia gasosa, os maiores picos
ocorreram nos tratamentos que apresentaram os menores índices de
desenvolvimento, enquanto picos cromatográficos menores apresentaram maior
desenvolvimento das plantas em relação ao peso fresco e altura.
Bibliografia
GARLET, T. M. B.; SANTOS, O.S.; MEDEIROS, S. L. P.; GARCIA, D. C.; MANFRON,
P. A.; APEL, M. A. Produção de folhas, teor e qualidade de óleo essencial de hortelãjaponesa (Mentha arvensis L. forma piperascens Holmes) cultivadas em hidroponia.
Revista Brasileira de Plantas Medicinais. Botucatu, v.9, n.4, p. 72-79, 2007.
Disponível
em:
<http://www.ibb.unesp.br/servicos/publicacoes/rbpm/pdf_v9_n4_2007/artigo12_v9_n4
.pdf>. Acesso em: 16 out. 2008.
TORRES, A.C.; CALDAS,L.S.; BUSO,J.A. Cultura de Tecidos e Transformação
Genética de Plantas. Volume II.Embrapa/Brasília.517p. 1999