PROTOCOLOS INICIAIS PARA - RExLab

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A BIOTECNOLOGIA E O DOSEAMENTO DE SUSPENSÕES CELULARES NA CULTURA
DE TECIDOS VEGETAIS
Gilmar Pezzopane Plá**
Elisa Sorato Cattâneo *
Débora Rodrigues*
RESUMO
Este trabalho objetivou avaliar o efeito do pH e da concentração de nutrientes no desenvolvimento e na
capacidade de produção de mentol em plantas de hortelã (Mentha sp.) cultivadas in vitro. Para tanto,
plantas mantidas in vitro, foram repicadas e inoculadas em tubos de ensaio contendo 10ml de solução
nutritiva (MS, 1962). Foram utilizadas três concentrações de nutrientes: MS completo, ½ MS e 1/3 de
MS. Os valores de pH do meio foram ajustados para 4,0; 4,5; 5,5; 6,5 e 7,0. Para a extração de mentol, foi
utilizada técnicas de microextração em fase sólida por head space (HS/SPME) e análises de
Cromatografia Gasosa (CG). As culturas foram mantidas em sala de crescimento por aproximadamente
150 dias. Após esse período, estas foram avaliadas quanto ao peso fresco, altura da planta e teor de
mentol. Os resultados obtidos demonstraram maior desenvolvimento, quanto ao peso fresco e altura, nas
plantas cultivadas em meio de cultura MS completo com pH 6,5. Em meios mais ácidos os índices de
desenvolvimento diminuíram, porém, a relação de pH e desenvolvimento das plantas não foram
significativa. Ao contrário da concentração de nutrientes que ao ser reduzido influenciou no
desenvolvimento quanto ao peso fresco e altura das plantas. As análises cromatográficas dos tratamentos
de hortelã revelaram o não aparecimento de mentol em quantidades quantificáveis em plantas cultivadas
in vitro. Porém, outros picos cromatográficos foram observados nas análises, que apenas poderiam ser
identificados através de uma espectrometria de massas.
Palavras chave: Hortelã. Desenvolvimento. Mentol. Cromatografia Gasosa.
*Acadêmicas do Curso de Agronomia- Bolsista PUIC- Universidade do Sul de Santa Catarina
** Professor - Universidade do Sul de Santa Catarina- Curso de Agronomia - E-mail:
[email protected]
1- INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de mudas de plantas, como as medicinais, que tenham capacidade de produzir
quantidades adequadas de princípios ativos para aplicação na área da fitoterapia tradicional ou na
produção de derivados como tinturas, extratos líquidos e extratos secos para utilização na produção de
medicamentos fitoterápicos pela industria farmacêutica, é um espaço científico pouco explorado. Com a
grande biodiversidade de plantas que a região sul de Santa Catarina possui existe a necessidade de
explorarmos estas potencialidades, criando bancos de mudas que possam produzir matéria prima vegetal
de qualidade aceitável no mercado nacional e internacional.
Assim, o desenvolvimento de atividades práticas e de pesquisa ao longo da disciplina de
Agrobiotecnologia, a qual tornou-se um PUIC-Disciplina em 2005/2006, passou a ser PUICContinuidade em 2006/2007 e 2007/2008, possibilitou aos acadêmicos, por exemplo, experiências que
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permitiram o entendimento sobre o isolamento e manutenção de culturas axênicas, sendo estas as
primeiras etapas na busca de alternativas para a conservação de germoplasma, e a multiplicação massal de
várias espécies vegetais de interesse econômico do homem.
Para intensificar e diversificar os trabalhos de pesquisa na área de Agrobiotecnologia, estamos
desenvolvendo estudos de doseamento de princípio ativos de determinadas plantas medicinais utilizadas
em projetos ligados a PIBIC, PUIC-individuais e PUIC continuado, e Trabalhos de Conclusão de
Cursos(TCC), onde trabalhamos com o isolamento e doseamento dos derivados do ácido rosmarinico em
plantas de melissa.
Portanto esta pesquisa teve como principal objetivo proporcionar os alunos o conhecimento das
possibilidades de utilização e manipulação de espécies vegetais, trabalhando-se a técnica do cultivo in
vitro de plantas e doseamento de suspensões celulares em plantas medicinais.
2- METODOLOGIA
Os ensaios foram realizados Laboratório de Produção Vegetal no Centro Tecnológico – CENTEC,
da Universidade do Sul de Santa Catarina – UNISUL. Foram utilizados como explantes segmentos nodais
e apicais (1cm) das plantas de hortelã (Mentha viridis) cultivadas in vitro.
# Multiplicação in vitro:
Os segmentos nodais resultantes das brotações das gemas isoladas, e contendo 2 gemas axilares,
foram subculturados no meio de cultura descrito anteriormente, acrescido de diferentes concentrações de
BAP (6-benzilaminopurina) e AIB (Ácido Indol Butírico).
# Doseamento do principio ativo
As plantas, no caso a hortelã, após o isolamento e multiplicação, com 90 dias de cultura in vitro
foram avaliadas quanto ao número de folhas e de raízes (se houver), comprimento do caule e de raízes (se
houver), medidos com um paquímetro manual. A determinação da biomassa seca foi realizada com a
pesagem das partes da planta que permaneceram em estufa por 48 horas a 70 Cº. Cada unidade
experimental foi constituída de 10 plantas e cinco repetições.
Para o doseamento do teor de certos princípios ativos foram utilizadas amostras (folhas) de
todos os tratamentos em questão no PUIC-individual e Continuado. A análise foi realizada por
cromatografia líquida de alta eficiência ou espectrofotometria UV-Vis (CLAE), no Centro Tecnológico
da UNISUL – CENTEC.
Os resultados do doseamento foram cruzados com os dados de pH e nutrientes (meios) e
condições climáticas com o objetivo de avaliar as melhores caracteristícas para o desenvolvimento das
plantas associado a performance de produção de princípios ativos.
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
## PESO FRESCO E ALTURA DAS PLANTAS
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Na observação feita, da relação entre pH com MS completo, concluiu-se que o valor 6,5 de
pH apresentou melhor desenvolvimento das plantas e por conseqüência um maior valor de peso fresco
(Tabela 1). Isto pode estar relacionado com o fato da maior disponibilidade de nutrientes para as plantas
cultivadas in vitro, em meio MS com concentrações ideais de nutrientes, ocorrerem em valores de pH
entorno de 5,8, o indicado por Murashige e Skoog (1962).
Tabela 1. Resultado da média do peso fresco (g) e tamanho (cm) das plantas de Mentha isoladas in vitro
com MS nas concentrações de nutrientes ideais (MS normal).
Valores de pH
pH 4,0
pH 4,5
pH 5,5
pH 6,5
pH 7,0
Altura da planta (cm)
24,1
22,1
28,9
30,2
27,3
Peso fresco (g)
0,194
0,278
0,281
0,483
0,251
Para altura de plantas, o melhor desempenho em meio MS completo apresentou co-relação
com os valores de peso fresco, sendo o pH de valor 6,5, novamente, o que teve maior destaque.
Os meios de cultura com MS completo e valores de pH mais ácidos demonstraram um
menor desenvolvimento das plantas. Conforme mostra a Tabela 1, o peso fresco no meio de cultura com
pH 4,0 apresentou uma média de 0,194g, enquanto a altura das plantas teve menor resultado no meio de
cultura com pH 4,5, com uma média de 22,1cm de altura.
É importante destacar que os melhores resultados no desenvolvimento das plantas, quanto
ao peso fresco e altura, em meio MS completo ocorreram entre os meios com valores de pH 5,5 e 6,5,
próximos aos 5,8 utilizados por Murashige e Skoog (1962) e entre os valores 5,0 e 6,5 indicados por
Pierik, (1987); Chagas et al. (2006a apud Ramos, 2008) como os melhores para culturas de plântulas in
vitro.
Nos meios de cultura onde se reduziu à metade a concentração de nutrientes, ½ MS,
observou-se que o pH 6,5 novamente se sobressaiu, tendo o maior índice de altura de plantas (Tabela 2).
Porém, neste meio de cultura o maior peso fresco se obteve em plantas cultivadas com pH 4,5, valor
relativamente ácido.
Tabela 2. Resultado da média do peso fresco (g) e tamanho (cm) das plantas de Mentha isoladas in vitro
com ½ MS.
Valores de pH
pH 4,0
pH 4,5
pH 5,5
pH 6,5
pH 7,0
Altura da planta (cm)
28,7
25,7
23,6
30,4
28,3
Peso fresco (g)
0,246
0,284
0,244
0,269
0,156
Vale salientar ainda, que o peso fresco com menor massa de plantas para este tratamento
com meio ½ MS, foi com pH 7,0, no entanto, este teve um dos melhores índices de altura das plantas, não
demonstrando co-relação entre os resultados.
Ao reduzir a concentração de nutrientes a 1/3 de MS, notou-se, de forma geral que os
valores de altura de planta e peso fresco diminuíram significativamente. O fator determinante destes
baixos índices provavelmente está relacionado à escassez de nutrientes no meio de cultura. Como
determina Haber et al. (2005), concentrações extremas (maior ou menor concentração) influenciam
negativamente no desenvolvimento da planta, possivelmente pela variação de pressão osmótica da
solução, que influencia na absorção de nutrientes.
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Entre os valores de pH testados no meio 1/3 MS, houve melhor desenvolvimento das
plantas, em relação à altura, nos meios de cultura com pH 5,5, demonstrando, neste caso, co-relação com
o peso fresco, com média de 0,275g, como mostra a Tabela 3. Os menores índices de altura da planta e
peso fresco observados nos meios de cultura com meio MS 1/3 foram os ajustados com pH 6,5 e 7,0.
Tabela 3. Resultado da média do peso fresco (g) e tamanho (cm) das plantas de Mentha isoladas in vitro
com 1/3 MS.
Valores de pH
pH 4,0
pH 4,5
pH 5,5
pH 6,5
pH 7,0
Altura da planta (cm)
22,9
23,7
26,3
20,5
22,7
Peso fresco (g)
0,231
0,201
0,275
0,160
0,154
Ao relacionar os três meios de cultura com concentrações de nutrientes diferentes (MS
completo, ½ MS e 1/3 MS), constatou-se que a medida que a concentração de nutrientes foi reduzida
houve um declínio no desenvolvimento das plantas de hortelã cultivadas in vitro, porém, as variações de
pH já não se mostraram tão influentes. A não influência significativa do pH no desenvolvimento das
plantas de hortelã, quanto à altura, pode ser entendido pela concentração de nutrientes encontrar-se
disponível no meio de cultura in vitro para a absorção da planta.
## EXTRAÇÃO DE MENTOL
Em todas as amostras analisadas observou-se o aparecimento de picos cromatográficos
quantificáveis, indicando a presença de compostos orgânicos na planta, porém, nenhum destes
identificado como mentol .
No meio de cultura com concentração de MS completo observou-se que o pH 4,0 obteve os
melhores picos cromatográficos (Figura 1), porém, nenhum deles correspondeu a mentol, podendo ser
estes, mentona, pulegona, cineol, mentofurano, linalol, ou tantos outros princípios encontrados na hortelã,
que apenas poderão ser
afirmados com uma análise de EM.
Figura 1: Análise cromatográfica do tratamento com meio MS completo e pH 4,0
É importante ressaltar que o valor de pH 4,0, em meio MS completo, foi o que apresentou
um dos menores valores quanto ao peso fresco e altura de plantas, da mesma forma que em pH 6,5 de
meio MS completo, observou-se o melhor desenvolvimento das plantas quanto ao peso e altura, e os
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menores picos cromatográficos (Figura 2), o que afirma a idéia de Tuomi et al. (1991 apud GARLET et
al., 2007) que a concentração de metabólicos secundários tende a ser inversa às taxas de crescimento.
Figura 2: Análise cromatográfica do tratamento com meio MS completo e pH 6,5.
No meio de cultura com redução de nutrientes, ½ MS, novamente o pH 4,0 foi o que apresentou melhores
picos cromatográficos, conforme a Figura 3, o que indica que meios de cultura em que os valores de pH
são mais ácidos, as substâncias são utilizadas para o metabolismo secundário e não no desenvolvimento
da planta (metabolismo primário), por ser estes o custo de defesa da planta em condições adversas
(TUOMI et al., 1991 apud GARLET et al., 2007).
Figura 3: Análise cromatográfica do tratamento com meio ½ MS e pH 4,0.
As demais análises cromatográficas do meio ½ MS, bem como 1/3 MS apresentaram
resultados semelhantes, porém, nenhuma das análises detectou mentol, o que mais uma vez confirma a
idéia das taxas inversa de desenvolvimento e teor de princípios ativos na planta, tendo os picos mais
baixos, nesta concentração de nutrientes em contrapartida, os melhores índices de desenvolvimento da
planta (peso fresco e altura).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Pelo trabalho pôde-se concluir que os experimentos realizados com cultura in vitro de
hortelã demonstram melhor desenvolvimento nas plantas cultivadas em meios nutritivos com
concentração completa de nutrientes (MS completo), com valores de pH ajustados entre 5,5 e 6,5. No
desenvolvimento as plantas de hortelã, quanto à altura observou-se que os valores de pH não
apresentaram influências significativas, justificando as pequenas variações ocorridas em alguns
tratamentos como fatores normais. Porém, para peso fresco das plantas de hortelã os valores de pH já se
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mostraram influentes. Quanto à concentração de nutrientes, à medida que esta é reduzida, o índice de
desenvolvimento da planta é menor, tanto para altura como para peso fresco, concluindo que o melhor
meio de cultura para o cultivo de hortelã in vitro é a concentração de meio MS completo, com pH
ajustado entre 5,5 e 6,5, próximos aos 5,8 indicados por Murashige e Skoog (1962).
No entanto, apesar de um bom desenvolvimento nenhum dos tratamentos analisados
apresentou mentol em teores quantificáveis, porém, outros compostos ativos presentes na hortelã foram
detectados em análises de cromatografia gasosa, mas não foi possível identificá-los devido à ausência de
uma espectrometria de massas.
Ao analisar os índices de desenvolvimento e os teores de princípios ativos, conclui-se o
que alguns autores defendem que as taxas de metabólicos secundários (princípio ativo) tende a ser
inversas as de crescimento da planta, já que este é seu custo de defesa. Conforme se observou, nas
análises de cromatografia gasosa, os maiores picos ocorreram nos tratamentos que apresentaram os
menores índices de desenvolvimento, enquanto picos cromatográficos menores apresentaram maior
desenvolvimento das plantas em relação ao peso fresco e altura.
6 - REFERÊNCIAS
GARLET, T. M. B.; SANTOS, O.S.; MEDEIROS, S. L. P.; GARCIA, D. C.; MANFRON, P. A.; APEL,
M. A. Produção de folhas, teor e qualidade de óleo essencial de hortelã-japonesa (Mentha arvensis L.
forma piperascens Holmes) cultivadas em hidroponia. Revista Brasileira de Plantas Medicinais.
Botucatu,
v.9,
n.4,
p.
72-79,
2007.
Disponível
em:
<http://www.ibb.unesp.br/servicos/publicacoes/rbpm/pdf_v9_n4_2007/artigo12_v9_n4.pdf>. Acesso em:
16 out. 2008.
MURASHIGE & SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabaco tissues
cultures. Physiol. Plant, 15:473-497, 1962.
NICOLOSO, Fernando T.; ERIG, Alan C.; MARTINS, Cristiane F.; RUSSOWSKI, Denise.
Micropropagação do ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais. Botucatu, v. 3, n. 2, p. 11-18, 2001.
Disponível em: < http://www.redbio.org/portal/encuentros/enc_2001/posters/01/posterpdf/01-061.pdf>.
Acesso em: 30 out. 2008.