Patricia Carvalho Gindri

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UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO
RIO GRANDE DO SUL
DEPARTAMENTO DE ESTUDOS AGRÁRIOS
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
GRADUAÇÃO
Patrícia Carvalho Gindri
Ijuí, RS, Brasil
2016
1
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
Patrícia Carvalho Gindri
Relatório do Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária,
Área de Clínica e Reprodução de Grandes Animais, apresentado ao
Curso de Medicina Veterinária, da Universidade Regional do Noroeste
do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ, RS), como
requisito parcial para obtenção do grau de
Médica Veterinária.
Orientadora: Profª Med. Vet. MSc. Luciane Ribeiro Viana Martins
Supervisora: Med. Vet. Dra. Ligia Margareth Cantarelli Pegoraro
Ijuí, RS, Brasil
2016
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Universidade Regional do Noroeste do Estado do
Rio Grande do Sul
Departamento de Estudos Agrários
Curso de Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova o
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
elaborado por
Patrícia Carvalho Gindri
como requisito parcial para obtenção do grau de
Médica Veterinária
COMISSÃO EXAMINADORA:
____________________________________________________
Luciane Ribeiro Viana Martins, MSc. (UNIJUÍ)
(Orientadora)
____________________________________________________
Roberta Carneiro da Fontoura Pereira, Dra. (UNIJUÍ)
(Banca)
Ijuí, 02 de julho de 2016.
3
AGRADECIMENTOS
Ao criador por me dar a capacidade de aprender e evoluir a cada dia.
A meu pai, Amir, que me fez criar gosto pela lida da pecuária desde pequena,
e que mesmo com dificuldades não mediu esforços para que chegasse até aqui.
A minha mãe, Tânia, e minha irmã Érica, que nas horas de desespero não me
deixaram desistir nunca, e que sempre estiveram do meu lado e me deram forças
pra alcançar meus objetivos.
Quero agradecer também aos meus familiares que mesmo distantes, sempre
estiveram torcendo por mim.
Devo a minha gratidão também aos meus amigos, os distantes e os que
encontrei nesta longa caminhada da graduação e morada de Ijuí.
Agradeço de coração a professora Denize Fraga que me fez criar gosto na
pesquisa e sempre acreditou na minha capacidade, e não me fez por vez desistir, ao
pessoal do Grupo de Pesquisa Saúde Animal, que me proporcionaram ao longo
desta caminhada, muitas trocas de conhecimentos, e alegrias.
Ao Irder que me proporcionou a estrutura para as aulas práticas, as quais
foram fundamentais durante a minha escolha de gosto para a formação acadêmica.
Aos professores da UNIJUI pelos conhecimentos, e ensinamentos durante a
vida acadêmica. Em especial a professora Luciane Viana que me orientou durante o
estágio, sempre com muita paciência e alegria.
A Embrapa Clima Temperado e toda a equipe do laboratório de reprodução
que me auxiliaram, e me mantiveram calma nas horas de ansiedade, e torceram
para que eu chegasse até aqui.
A Dra. Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro pela compreensão, oportunidades
e conhecimentos transmitidos durante o estágio, que de forma alegre e constante
me despertou a curiosidade pelo diferencial.
As mestrandas do Laboratório, Bruna Mion e Letícia Collares, pelo
conhecimento e experiências trocadas, e pela amizade que levarei para sempre.
Por fim, serei eternamente grata de alguma forma por aqueles que
contribuíram para realização deste sonho e que torceram por esta realização.
Muito Obrigado!
4
“Sei que meus ensinamentos não se encerram por
aqui, a única coisa que realmente sei é que ainda
tenho muito que aprender”.
Autor Desconhecido
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RESUMO
Relatório do Estágio Curricular Supervisionado
Curso de Medicina Veterinária
Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul
RELATÓRIO DO ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM
MEDICINA VETERINÁRIA – ÁREA DE CLÍNICA E
REPRODUÇÃO DE GRANDES ANIMAIS
AUTORA: PATRÍCIA CARVALHO GINDRI
ORIENTADORA: LUCIANE RIBEIRO VIANA MARTINS
Data e Local da Defesa: Ijuí, 02 de julho de 2016.
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado na
área de Reprodução de Grandes Animais, no Laboratório de Reprodução da
Embrapa Clima Temperado, que está localizado na cidade de Pelotas – Rio Grande
do Sul, durante o período de 01 de março a 05 de abril de 2016, contabilizando um
total de 150 horas. O estágio ocorreu sob supervisão interna da Dra. e Pesquisadora
da Embrapa Clima Temperado Ligia Margareth Cantarelli Pegoraro e com orientação
da professora Mestre em Medicina Veterinária Luciane Ribeiro Viana Martins. A
realização do estágio teve como principal objetivo aplicar os conhecimentos teóricos
obtidos durante a graduação, permitindo uma visão mais ampla sobre a prática
envolvendo a reprodução animal e biotécnicas como a Produção in vitro de
embriões. As atividades que foram desenvolvidas durante o estágio serão
apresentadas em forma de tabelas onde estão especificadas de acordo com as
atividades laboratoriais e complementares, bem como as práticas envolvendo a
Reprodução Animal. No decorrer do relatório será descrita a técnica de Produção in
vitro de embriões (PIV) que foi selecionada para a discussão e revisão bibliográfica.
O estágio curricular obrigatório supervisionado me proporcionou o contato
profissional, a troca de conhecimentos entre acadêmicos, mestrandos e supervisor,
bem como a vivência da realidade encontrada na reprodução animal, e o
conhecimento de novas biotecnologias e a troca de experiências.
Palavras-chaves: Reprodução Animal. Produção in vitro. Bovino. Ovino.
6
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
– Estação Experimental Terras Baixas, Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul........................................
– Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul........................................
– Punção folicular realizada durante o Estágio de Reprodução
Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil...............................................................................................
– Seleção dos oócitos realizada durante o Estágio no Laboratório
de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio
Grande do Sul.................................................................................
– Lavagem dos oócitos em gotas de meio de maturação, realizada
durante o Estágio no Laboratório de Reprodução Animal,
Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul..............
– Estufa de cultivo de embriões do Laboratório de Reprodução
Animal, Embrapa Clima Temperatura, Pelotas, Rio Grande do
Sul, Brasil........................................................................................
– Avaliação da concentração espermática por câmara de
Neubauer no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa
Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul..............................
– Transferência de prováveis zigotos para a placa Nunc®,
realizado no laboratório de Reprodução da Embrapa, Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul........................................
– Avaliação da clivagem de embrião bovino, realizada no
Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil.................................................
– Avaliação de embriões bovinos produzidos no Laboratório de
Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio
Grande do Sul.................................................................................
11
11
17
18
18
19
21
21
22
23
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
–
Tabela 2
–
Tabela 3
–
Atividades laboratoriais desenvolvidas durante o Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na
Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil,
no período de 01 de março a 05 de abril de 2016.......................... 12
Atividades Clínicas Reprodutivas desenvolvidas a campo
durante o Estágio Curricular Supervisionado em Medicina
Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado, Pelotas,
Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de
abril de 2016................................................................................... 13
Atividades complementares desenvolvidas durante o Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na
Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil,
no período de 01 de março a 05 de abril de 2016.......................... 13
8
LISTA DE ANEXOS
Anexo A
–
Anexo B
Anexo C
–
–
Certificado do Curso de Ultrassonografia em bovinos realizado
durante período de Estágio Supervisionado em Medicina
Veterinária...................................................................................... 34
Atestado de conclusão de estágio.................................................. 35
Fontes de aquisição........................................................................ 36
9
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 10
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ...................................................... 12
3 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES ............................................ 15
4 CONCLUSÃO .................................................................................... 30
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 31
6 ANEXOS ............................................................................................ 33
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1 INTRODUÇÃO
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado no
período de 01 de março á 01 de abril de 2016, totalizando uma carga horária de 150
horas. Foi realizado em Pelotas, na Embrapa Clima Temperado na área de
Reprodução e Clínica Animal, tendo como supervisora a pesquisadora da Embrapa,
Dra. Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro, e como orientadora a professora da Unijuí,
Msc. Luciane Ribeiro Viana Martins.
A Embrapa Clima Temperado (Figura 1) está localizada na BR 392, km 78,
em Pelotas, Rio Grande do Sul. O Laboratório de Reprodução Animal (Figura 2) está
localizado na subunidade da Embrapa Estação Experimental Terras Baixas (ETB),
no município de Capão do Leão/RS. O setor de reprodução animal da ETB
desenvolve experimentos na área de biotecnologia da reprodução e é constituído de
um Laboratório e da área de campo. O Laboratório de Reprodução é dividido em
recepção (escritório), sala de procedimentos laboratoriais, e sala de cultivo. A área
de campo é constituída pela Unidade de Melhoramento Genético (UMG), onde estão
alocados carneiros e ovelhas, e pela unidade de manejo Reprodutivo, onde
permanecem as vacas, para a realização dos experimentos in vivo.
As principais atividades desenvolvidas no Laboratório são pesquisas
relacionadas á produção in vitro de embriões, criopreservação de gametas e
fisiologia reprodutiva. A equipe de trabalho de funcionários é constituída por um
laboratorista com formação em Técnico em Química, duas estudantes de pósgraduação (mestrado), com formação em Medicina Veterinária, um estudante de
pós-graduação (doutorado), com formação em Zootecnia e uma estudante da
graduação, do curso de Biotecnologia.
O estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária proporcionou
aprimorar meus conhecimentos na área de Reprodução Animal, bem como estudar,
e conhecer novas áreas dentro da Reprodução e o domínio da própria postura
profissional.
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Figura 1 – Estação Experimental Terras Baixas, Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, Rio Grande do Sul
Figura 2 – Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
12
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Durante o estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária, dentre
as atividades desenvolvidas foram acompanhadas a produção in vitro de embriões
bovinos e ovinos, que envolve todo o processo de maturação in vitro, bem como a
fertilização in vitro, cultivo in vitro, e desenvolvimento embrionário. As atividades
realizadas nas etapas de produção in vitro de embriões e a manutenção do
laboratório, tais como a limpeza e esterilização de materiais na técnica de PIV estão
descritos na tabela 1.
Tabela 1 – Atividades laboratoriais desenvolvidas durante o Estágio Curricular
Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016
Atividades Desenvolvidas
Atividades complementares de laboratório
Preparação de solução salina para
transporte de ovários de bovinos e ovinos
Preparação de meio de maturação bovino
Maturação in vitro de oócitos bovino
Preparação de meio de fecundação bovino
Fecundação in vitro de oócitos bovino
Preparação de meio de cultivo bovino
Cultivo in vitro de bovinos
Avaliação de Clivagem embrião bovino
Avaliação de desenvolvimento embrionário
bovino
Feeding
Congelamento de embriões bovinos
Aspiração folicular in vitro de ovinos
Maturação in vitro de oócitos de ovinos
Fecundação in vitro de oócitos ovinos
Avaliação de clivagem embrião ovino
Avaliação do desenvolvimento embrionário
Ovino
Total
Número de Rotinas
25
7
%
32,46
9,09
1
5
1
5
1
5
5
5
1,29
6,49
1,29
6,49
1,29
6,49
6,49
6,49
7
5
1
1
1
1
1
9,09
6,29
1,29
1,29
1,29
1,29
1,29
77
100
As atividades desenvolvidas na área clínica com enfoque em manejos
reprodutivos serão descritos na tabela 2.
13
Tabela 2 – Atividades Clínicas Reprodutivas desenvolvidas a campo durante o
Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa
Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a
05 de abril de 2016
Atividades/campo
Diagnóstico de gestação em bovinos
Coleta de sêmen ovino
Hidrometra
Diagnóstico de gestação em ovinos
Protocolo de sincronização em ovinos
Coleta de sangue ovino
Observação de cio ovino
Inseminação em ovino
Avaliação de escore de condição corporal em bovinos
Monitoramento de monta natural em ovinos
Total
Número
91
4
2
24
19
16
20
1
25
15
217
%
41,93
1,84
1
11,05
8,75
7,37
9,21
0,46
11,52
6,91
100
As atividades complementares que envolvem as reuniões, dias de campo, e
cursos serão descritos na tabela 3.
Tabela 3 – Atividades complementares desenvolvidas durante o Estágio Curricular
Supervisionado em Medicina Veterinária, realizado na Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 01 de março a 05 de abril de 2016
Atividades complementares
Curso de Ultrassonografia
Participação como ouvinte em defesa de mestrado
Participação em reunião de projetos em andamento
Participação em reunião dos estagiários
Dia de campo
Total
Número
1
1
3
1
3
9
%
11,11
11,11
33,33
11,11
33,33
100
Durante a presença no laboratório de reprodução Animal/Embrapa foi
acompanhado o desenvolvimento de um projeto de pesquisa intitulado “Efeito da
suplementação com diferentes soros no meio de maturação in vitro sobre a taxa de
clivagem e desenvolvimento embrionário inicial”, este experimento faz parte de um
projeto de mestrado da aluna Leticia Franco Collares, do curso de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária da UFPel.
A limpeza e esterilização de materiais no laboratório seguiam as normas
básicas de seguranças sendo que a limpeza dos materiais deveria ser procedida de
acordo com sua categoria. O material utilizado na produção de embriões deveria ser
14
cuidadosamente limpo para evitar contaminações por microrganismos e a presença
de material tóxico, que poderiam prejudicar no desenvolvimento embrionário.
Para a permanência no laboratório era preconizado o uso de avental,
sandálias crocs e as mãos deveriam ser lavadas com sabonete desinfetante. Na sala
de cultivo dos embriões usava-se um avental especifico para a área de cultivo, touca
e máscara cirúrgica e para trabalhar no fluxo laminar era recomendado o uso de
solução antisséptica nas mãos. O material usado na produção in vitro dos embriões
era esterilizado e preparado anteriormente juntamente com a limpeza das bancadas
da sala de cultivo com álcool 70%. A limpeza do chão da sala de cultivo era
realizada com desinfetante LETAH MAX® a cada sete dias.
15
3 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES
Patrícia Carvalho Gindri; Luciane Ribeiro Viana Martins
Introdução
O avanço da agricultura, a valorização da terra, o aumento no valor pago pela
produção de grãos e a redução de áreas para outras atividades tem levado a uma
crescente exigência de eficiência econômica na pecuária brasileira (GUIMARÃES
JUNIOR et al., 2008). Uma ferramenta pra incrementar eficiência é a utilização de
biotécnicas reprodutivas como a inseminação artificial, criopreservação de embriões,
superovulação e transferência de embriões, bem como a recuperação de oócitos e a
fecundação in vitro, técnicas que também promovem o desenvolvimento científico,
tornando o Brasil uma referência na produção in vitro de embriões (VIEIRA, 2012). A
produção in vitro (PIV) está sendo gradualmente integrada nos programas de
melhoramento genético, como uma ferramenta complementar á inseminação artificial
e a transferência de embriões (RUMPF, 2007).
Com o desenvolvimento da PIV, ocorreu um grande avanço na otimização e
multiplicação de fêmeas não só para a produção, mas também para a conservação e
regeneração de espécies em perigo de extinção (RUMPF, 2007). A produção in vitro
de embriões é uma biotecnologia utilizada como alternativa para acelerar a produção
de animais geneticamente superiores. Além disso, a técnica em bovinos é utilizada
para evitar o descarte de fêmeas de alto valor genético portadoras de alterações
adquiridas, ou alterações que impeçam que a reprodução ocorra de forma natural
(GONÇALVES et al., 2008). Segundo Palhano (2008), a PIV permite a produção de
uma gestação semana/vaca, podendo aumentar rapidamente o intervalo entre
gerações e aumentando a intensidade de seleção destes animais. A PIV envolve
três etapas que são desenvolvidas em laboratório; a maturação oocitária, a
fecundação dos oócitos, e o cultivo embrionário até os estágios de mórula e
blastocisto,
que
poderão
ser
transferidos
para
receptoras,
previamente
sincronizadas, ou criopreservadas (VARAGO et al., 2008).
O aprimoramento dos sistemas envolvidos no processo da PIV na espécie
bovina, a partir de oócitos recuperados de ovários oriundos de abatedouros tem sido
fundamental para o estudo e a compreensão de vários fenômenos e mecanismos
16
biológicos, desde a maturação dos oócitos, fecundação, até o início do
desenvolvimento embrionário (HOSHI, 2003). No entanto apesar de muitas
pesquisas e estudos, os resultados da técnica ainda são bastante variáveis de um
laboratório para outro e até dentro do mesmo laboratório (GARCIA et al., 2004).
Na produção animal, particularmente nos bovinos, a utilização da PIV ainda é
limitada em função da inconsistência dos resultados referentes ás taxas de
qualidade de mórulas e blastocistos, da infraestrutura necessária e do tempo
consumido para executar a rotina da produção de embriões, que vai desde a punção
in vivo até o desenvolvimento in vitro de embriões (GONÇALVES et al., 2008).
O objetivo deste trabalho é relatar as atividades desenvolvidas durante o
estágio curricular supervisionado, realizado no laboratório de Reprodução Animal da
Embrapa Clima Temperado, no município de Pelotas/RS, no período de 01 de março
a 05 de abril de 2016 totalizando 150 horas.
Metodologia
Etapas da Produção in vitro de embriões:
Durante a realização do estágio foi possível o acompanhamento das etapas
referentes á produção in vitro de embriões: recepção dos ovários, aspiração folicular,
maturação oocitária, fecundação in vitro (FIV), cultivo in vitro (CIV) e avaliação
embrionária. As etapas serão descritas a seguir.
Aspiração folicular:
Os ovários para a aspiração folicular eram provenientes de abatedouros
locais, transportados ao Laboratório de Reprodução/Embrapa em garrafas térmicas
com solução salina 0,9% de NaCl, suplementada com o antibiótico gentamicina e
aquecida a 30-35°C. No laboratório, os ovários eram lavados novamente com
solução salina 0,9% de NaCl, suplementada com gentamicina e aquecida a 30-35° e
posteriormente contabilizados para controle interno.
A aspiração dos ovários (Figura 3) era realizada com uma bomba de vácuo
digital com uma pressão de 10-12 mmHg, e uma agulha de 19G acoplada. A bomba
era ligada uma hora antes do início da aspiração, para que houvesse estabilização
da temperatura (30-35°C) no interior da máquina e nos tubos Falcon® de 15 mL,
onde era depositado o conteúdo aspirado. Durante a realização da aspiração
folicular, deve-se ter o cuidado de introduzir a agulha através do parênquima
17
ovariano, evitando puncionar diretamente o folículo para que não haja rompimento e
extravasamento do liquido folicular e perda do oócito, outro cuidado que se deve ter
é não aspirar folículos dominantes, no laboratório era recomendado não aspirar os
folículos maiores que 8 mm, pois estes se encontram em processo de maturação o
que é indesejável na PIV. A aspiração era realizada na sala de procedimentos
laboratoriais.
Figura 3 – Punção folicular realizada durante o Estágio de Reprodução Animal,
Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Seleção oocitária:
Após a aspiração estes recipientes Falcon® permaneciam em repouso por
aproximadamente 10 min para ocorrer a sedimentação celular formando um pellet,
que é constituído por oócitos, células de descamação e células da parede de
folículo. O pellet era retirado com auxílio de uma pipeta de Pasteur e colocado em
uma placa de Petri com liquido folicular, para realização da seleção oocitária. A
seleção dos oócitos (Figura 4) era realizada na sala de cultivo embrionário com o
auxílio de um esteromicroscópio. A classificação dos oócitos era realizada de acordo
com a qualidade do citoplasma e o número de camadas do cumulus-oophorus.
18
Figura 4 – Seleção dos oócitos realizada durante o Estágio no Laboratório de
Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
Após a seleção, os oócitos eram lavados em gotas de líquido folicular para
retirada de restos celulares e células de descamação. Finalmente, os oócitos eram
lavados em meio de maturação (Figura 5) e transferidos para as placas Nunc® de 4
poços contendo 400 µL de meio de maturação.
Figura 5 – Lavagem dos oócitos em gotas de meio de maturação, realizada durante
o Estágio no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, Rio Grande do Sul
19
Maturação in vitro (MIV):
Na etapa de maturação era necessário que os meios fossem preparados com
antecedência de no mínimo 2 horas, para que o meio estabilizasse a temperatura e
o pH. O base utilizado no meio de maturação era o TCM-199®, com acréscimo de
hormônios como o folículo estimulante (FSH), e hormônio luteinizante (LH),
amicacina, penicilina e piruvato. Durante a realização do estágio eram testados
diferentes tipos de soros no meio de maturação: o soro de ovelha em cio (controle),
soro de vaca no pós-parto recente e soro de vacas no final da lactação. Os meios
eram colocados em diferentes poços da placa Nunc® e aproximadamente 45 oócitos
eram depositados de forma aleatória em cada poço de tratamento. Os oócitos
permaneciam no meio de maturação por um período de 22 a 24 horas, no interior de
uma estufa (Figura 6) de atmosfera controlada, com 5% de gás carbônico e 20% de
oxigênio, e temperatura de 39°C.
Figura 6 – Estufa de cultivo de embriões do Laboratório de Reprodução Animal,
Embrapa Clima Temperatura, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Fecundação in vitro (FIV):
Os oócitos eram retirados do meio de maturação e passados para a placa
Nunc® contendo 400 µL de meio FIV (Fert-TALP®), com adição de BSA (albumina
sérica bovina), penicilina, hipotaurina e a epinefrina (PHE), piruvato e heparina para
capacitação espermática. A transferência dos oócitos para a placa deveria ser o
mais breve possível, evitando assim mudanças no pH do meio e variações de
20
temperatura. No laboratório, a incubação dos oócitos com os espermatozoides era
realizada durante 18 – 20 horas a 39°C, sob atmosfera de 5% de gás carbônico e
20% de oxigênio.
Separação e capacitação espermática:
O laboratório utilizava amostras de sêmen comercializado congelado para a
fertilização dos oócitos. A palheta do sêmen desejado era descongelada em banhomaria a 35°C por 30 segundos. Após o processo de descongelamento, o sêmen era
colocado em um tubo eppendorf de 2mL e uma alíquota era retirada para avaliação
da motilidade (quantificada em porcentagem) e vigor (escala de 0 a 5). Essa
avaliação era realizada em microscópio óptico e a amostra era depositada em
lâmina e lamínula pré-aquecidas.
O método de eleição utilizado para a separação espermática era o Percoll®,
utilizando duas concentrações do gradiente (45% e 90%). Em um eppendorf de 2 mL
eram depositados 400 µL de Percoll® 90% e sobre ele eram depositados 400 µL de
Percoll® 45%. Estes frascos devem ser preparados duas horas antes da realização
da FIV, para a estabilização dos gradientes.
O sêmen já descongelado era depositado na porção superior aos dois
gradientes e colocado na centrifuga (5min x 700 giros). Após a centrifugação era
realizada a remoção do sobrenadante e retirado o pellet. O pellet era depositado em
meio SPERM-TALP®, para promover a capacitação espermática e novamente
centrifugado (5min x 700 giros). Após a segunda centrifugação, novamente retiravase o sobrenadante e avaliava-se a motilidade, vigor e concentração espermática do
pellet. A concentração espermática é realizada com auxílio de uma câmara de
Neubauer (Figura 7) e fornece a contagem de espermatozoides que entrarão no
cálculo da dose inseminante. Esse cálculo também deve considerar a motilidade
final da amostra e o volume da gota de meio FIV onde os oócitos estarão
depositados. Como descrito a seguir:
Ci x Vi = Cf x Vf sendo que:
Ci = Concentração encontrada na câmara de Neubauer;
Vi = Dose inseminante;
Cf = 1 x 106 SPTZ/ml
Vf = Volume da gota fecundação;
Dose inseminante = Volume da gota µL
N. encontrado C.N.
21
Figura 7 – Avaliação da concentração espermática por câmara de Neubauer no
Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio
Grande do Sul
Cultivo in vitro (CIV):
O CIV corresponde à etapa de desenvolvimento do oócito fertilizado até o
estágio
de
blastocisto.
Após
18-20
horas
de
co-cultivo
dos
oócitos
e
espermatozóides, os prováveis zigotos eram retirados do meio de FIV e submetidos
a repetidas pipetagens com posterior lavagem em gotas contendo meio de CIV, para
retirada das células do cumulus-oophorus (desnudamento) e dos espermatozóides
ainda aderidos à zona pelúcida. Após as lavagens, as estruturas eram transferidas
para as placas Nunc® (Figura 8), contendo 400 µL de meio SOFaa® com acréscimo
de proteína soro de ovelha em cio (controle) e piruvato, coberto com óleo mineral. A
troca de meios (feeding) era realizada no dia da avaliação da clivagem (Dia 2), e no
dia da avaliação das mórulas (Dia 5).
Figura 8 – Transferência de prováveis zigotos para a placa Nunc®, realizado no
laboratório de Reprodução da Embrapa, Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do
Sul
22
Avaliação da Clivagem:
A avaliação da clivagem (Figura 9) era efetuada 48 horas após a inseminação
(Dia-2). Esta avaliação deve ser realizada em menor tempo possível para evitar
alterações da temperatura e pH, com consequente dano ao desenvolvimento
embrionário. No laboratório, o critério para avaliação da clivagem era a visualização
de estruturas com 2 a 8 células.
Figura 9 – Avaliação da clivagem de embrião bovino, realizada no Laboratório
de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil
Avaliação do desenvolvimento embrionário:
No laboratório de Reprodução, a avaliação embrionária era realizada
mediante a observação do desenvolvimento das estruturas (Dia-7). Após a
avaliação, os embriões eram congelados em Trizol® para avaliação da expressão
gênica, conforme metodologia estabelecida pelo experimento da suplementação de
diferentes soros.
Os embriões podem ser avaliados de acordo com as seguintes classificações
(Figura 10):
Mo- (Mórula); Mc- (Mórula Compacta); Bi (Blastocisto Inicial); Bl (Blastocisto);
Bx (Blastocisto Exapandido), Bn (Blastocisto em Eclosão); Be (Blastocisto Eclodido).
23
Figura 10 – Avaliação de embriões bovinos produzidos no Laboratório de
Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul
Resultados e discussões
A PIV de embriões envolve as etapas de coleta, maturação in vitro (MIV) e
fecundação in vitro de oócitos (FIV), bem como cultivo ou co-cultivo de zigotos e
estruturas embrionárias (GONÇALVES et al., 2008).
Os oócitos utilizados para a PIV podem ser obtidos de ovários coletados em
matadouros ou, in vivo, por punção folicular guiada por ultrassonografia (PALHANO,
2008). O laboratório de Reprodução da Embrapa tem como finalidade a pesquisa e
utiliza ovários provenientes de abatedouros, e os protocolos de transporte e lavagem
seguem o padrão utilizado por Gonçalves et al. (2008), diferindo apenas no
antibiótico utilizado onde o autor usou penicilina ao invés de gentamicina. Segundo
Palma (2008) é recomendável que se adicione antibióticos na solução salina na
limpeza dos ovários ao chegarem no laboratório para melhorar as condições de
higiene e diminuir o índice de contaminação.
A técnica de aspiração dos ovários, foi realizada com uma bomba vácuo
digital pressão de 10-12 mmHg e uma agulha acoplada de 19G, da mesma forma
proposta por Palma (2008) que também comenta que este procedimento pode ser
efetuado sem dano aos oócitos se realizado com seringas estéreis. É de grande
importância avaliar o tamanho dos folículos que não devem ultrapassar de 8 mm
nem serem menores que 2 mm, importância que também foi observada por Alves et
24
al. (2001). Gonçalves et al. (2008) ressalta que folículos menores que 2 mm não
estão aptos a reiniciar o processo da meiose e já folículos maiores que 8 mm
poderão encontrar-se em processo de atresia ou maturação, sendo assim ambos
tornam-se inviáveis para a realização das técnicas de PIV.
O procedimento de sedimentação e retirada do pellet que é formado por
oócitos, células de descamação e parede folicular e a sua transferência para placas
de Petri onde ocorre a seleção dos melhores oócitos, também é utilizado por Palma
(2008), que relata que oócitos do fundo do tubo com líquido folicular devem ser
retirados com uma pipeta Pasteur estéril e depositados em uma placa de Petri, para
assim serem realizadas a lavagem e a seleção. A seleção dos oócitos é realizada
pela análise do aspecto do citoplasma e o revestimento da camada do cumulusoophorus; o ideal é que os oócitos contenham várias camadas de células do
cumulus-oophorus, pois aqueles que contêm mais que três camadas são
considerados de melhor qualidade (GONÇALVES et al., 2008). No laboratório de
reprodução/Embrapa a seleção dos oócitos se baseava na avaliação do cumulusoophorus e na qualidade do citoplasma.
Os oócitos aspirados no interior dos folículos ovarianos não se encontram
ainda
capazes
de
serem
fecundados,
sendo
necessária
uma
série
de
transformações moleculares do núcleo e do citoplasma que consistem na maturação
oocitária (GARCIA et al., 2004; GONÇALVES et al., 2008). Após estas mudanças
estruturais e bioquímicas o oócito já se encontra capacitado à fecundação e ao seu
posterior desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et al., 2008).
Em condições in vivo, o processo de maturação tem início, com o pico pré
ovulatório de LH durante o estro, e in vitro, com a simples retirada do oócito do
folículo (MONTAGNER et al., 2000; GONÇALVES et al., 2008).
Para que todos os eventos da maturação oocitária ocorram in vitro, é
necessário que os meios utilizados durante este período mimetizem as condições
encontradas durante o processo de maturação in vivo (SANGILD et al., 2000). O
conjunto de meios de maturação utilizado foi o sugerido por Rodrigues e Garcia
(2000), onde diferentes formulações foram testadas durante a MIV em bovinos, a
grande maioria dos laboratórios tem optado pelo meio TCM-199®, suplementado
com soros bovinos, e hormônios como FSH, e LH. Para Gonçalves et al. (2008),
ainda há controvérsia sobre a necessidade de suplementação como uso do
hormônio FSH e LH mas a maioria dos resultados já estudados demonstraram um
25
aumento na capacidade de fecundação e desenvolvimento embrionário, já a adição
dos soros tem sido sugerido para alcançar a perfeita expansão do cumulus-oócito.
Porém componentes destas formulações poderão afetar a maturação destes oócitos.
Após os oócitos serem lavados nos meios e colocados em placas Nunc® de
MIV, permaneciam durante um período de 22 a 24 horas, no interior de uma estufa
de atmosfera controlada, com temperatura de 39°C, 5% de gás carbônico e 20% de
oxigênio, conforme recomenda Palhano (2008). Os oócitos imaturos se encontram
parados no estágio de prófase I, e completam a maturação quando ocorre a
passagem da Prófase I para Metáfise II entre 20 e 24 horas após o início do cultivo,
e com a extrusão do primeiro corpúsculo polar, estando aptos para a próxima fase
chamada de fecundação in vitro (GARCIA et al., 2004). Para Palhano (2008), cerca
de 80 a 90% dos oócitos completam a maturação nuclear in vitro.
A próxima etapa da PIV consiste na FIV que resume os eventos iniciados pela
penetração do espermatozoide através das camadas celulares e acelulares que
rodeiam o oócito (PALMA, 2008). Segundo Loiola et al. (2014), a fecundação in vitro
é caracterizada pela fusão do espermatozoide com o oócito, seguida de exocitose
dos grânulos corticais e a retomada da meiose com a extrusão do segundo
corpúsculo polar e a formação do pró-núcleo feminino.
Os meios utilizados para a FIV seguiam um protocolo adaptado ao usado por
Palhano (2008), onde preconiza o emprego de meio base de fecundação FertTALP® com adição de BSA (albumina sérica bovina), acrescido de substâncias
como a penicilina, hipotaurina, e a epinefrina (PHE), com o intuito de aumentar a
fertilidade espermática facilitando sua penetração no oócito. Além destes
componentes no laboratório de Reprodução/Embrapa utiliza-se a heparina e o
piruvato. Segundo Gonçalves et al. (2008) a heparina tem sido utilizada para
capacitar
espermatozoides
bovinos,
pois
atua
desencadeando
mudanças
bioquímicas na sua membrana. Conforme Palhano (2008), no processo in vivo, o
espermatozoide quando ejaculado não se encontra apto para realizar a fertilização,
algumas glicosaminoglicanas presentes no trato genital feminino são responsáveis
pela indução e a capacitação espermática, processo este realizado pela heparina
quando in vitro.
Antes de co-cultivar os oócitos e os espermatozoides em meio de fertilização,
o sêmen do touro deve ser preparado por técnicas que permitem a separação dos
espermatozoides vivos dos demais componentes do sêmen e seus crioprotetores
26
(GONÇALVES et al., 2008). Para o processo de FIV são utilizados espermatozoides
de palhetas de sêmen congelado, e a separação em gradiente de Percoll® tem sido
o método mais comum para a obtenção da fração e seleção espermática viva após o
descongelamento (GALLI e LAZZARI, 1996). Para Palma (2008), o gradiente de
Percoll® corresponde a maior parte dos quesitos de uma técnica eficaz para a
seleção espermática e, também resulta em frações límpidas, com espermatozoides
de alta motilidade, não causando lesões na cromatina e proporcionando uma alta
taxa de recuperação de gametas, mesmo quando amostras com baixa concentração
são usadas. No laboratório o sêmen utilizado era congelado, e o método aplicado
era gradiente de Percoll® que consiste nas diferenças de densidades e a separação
é realizada pela centrifugação do sêmen conforme citam Palhano (2008) e Palma
(2008). Após o processo de seleção no gradiente de Percoll®, o sêmen passava
pelo processo de capacitação espermática. Para Varago et al. (2008), a capacitação
ocorre pela remoção dos fatores descapacitantes presentes no plasma seminal,
como proteínas e outras substâncias que recobrem a membrana do espermatozoide.
O meio mais utilizado para a capacitação, e que também foi utilizado no laboratório é
o Sperm-TALP®, o mesmo citado Gonçalves et al. (2008).
Após a seleção e a capacitação espermática, avaliava-se a motilidade, vigor e
concentração espermática. Segundo Garcia et al. (2004), a concentração usada
para a fertilização in vitro é de 2 x 106 espermatozoides/mL, calculada de acordo
com a motilidade e a concentração da fração viva de espermatozoides obtida após a
capacitação espermática, este cálculo evita que ocorra a polispermia. O período de
incubação dos oócitos com os espermatozoides varia entre 6 e 20 horas. Para
Golçalvez et al. (2008), o co-cultivo (espermatozoides e oócitos) é realizado por um
período que, dependendo do laboratório, pode variar de 6 a 9 ou 18 a 22h, a uma
temperatura de 39°C, e uma atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade saturada. O
tempo de permanência dos oócitos com os espermatozoides era de 18-20 horas no
laboratório de Reprodução/Embrapa.
A próxima etapa é o cultivo in vitro. Segundo Garcia et al. (2004), é durante
este período de desenvolvimento que ocorrem os eventos como ativação do genoma
embrionário (transição materno-zigótica), divisão celular (clivagem), compactação
dos blastômeros no estádio de mórula, início da diferenciação embrionária (células
do trofoblasto que darão origem a placenta e anexos fetais) e a formação da
blastocele. A metodologia empregada foi mesma usada por Palhano (2008), Palma
27
(2008) e Gonçalves et al. (2008), onde os meios necessários para o
desenvolvimento embrionário devem ser simples, suportar a nutrição celular e o
desenvolvimento durante a fase pré-implantação embrionária, sendo baseado nos
fluidos do útero e do oviduto durante o início da gestação. Basicamente o meio base
que tem apresentado melhor resultados é o SOFaa®, acrescido de uma fonte de
energia como o piruvato, e também por uma fonte de proteína (PALMA, 2008).
Gonçalves et al. (2008) sugere que o meio seja renovado (feeding) de forma total ou
parcial, em um intervalo de um ou dois dias, para o controle da osmolaridade e do
pH do meio. O feeding era realizado na avaliação da clivagem (Dia 2), e na
avaliação das mórulas (Dia 5).
Antes mesmo de os prováveis zigotos serem transferidos para a placa de
cultivo, estes devem ser separados das células do cumulus-oophorus por repetidas
pipetagens e lavados com meio cultivo, a fim de evitar a transferência de qualquer
célula do cumulus-oophorus para o meio de desenvolvimento embrionário (SIRARD
e COENEN, 2006). Assim como o utilizado no laboratório, evitando a competição de
nutrientes com os possíveis zigotos.
Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos da PIV, a proporção de
embriões que atingem o estágio de blastocisto é raramente superior a 40% (NEVES
et al., 2010), a taxa de produção de embriões obtida no laboratório de reprodução da
Embrapa gerava em torno de 30%.
Após 48 horas da inseminação, era realizada a avaliação da clivagem (Dia 2),
que consistia na observação das estruturas embrionárias com 2 ou 8 células.
Golçalves et al. (2008), cita que neste período os embriões já se encontram com
duas, quatro e oito células, denominados de blastômeros.
O desenvolvimento embrionário in vitro, consiste na visualização da
compactação dos blastômeros e o início da formação da blastocele, esta avaliação
final pode ser realizada no 7° dia, e após os embriões poderão ser transferidos a
fresco para as vacas receptoras previamente sincronizadas ou criopreservados
(THOMPSON, 2000).
Os embriões também eram avaliados no dia 7 de acordo com as seguintes
classificações, sugeridas pela sociedade internacional de tecnologia de embriões
(IETS) segundo STRINGFELLOW e SEIDEL (1998).
28
Mo - Mórula: Blastômeros ainda evidentes, porém ainda não é possível
determinar número exato. Massa de células ocupa maior parte do espaço dentro da
zona pelúcida. Visível entre os dias 5,5 e 6,0 do cultivo embrionário.
MC - Mórula Compacta: Compactação torna a massa de células coesa,
dificultando a individualização dos blastômeros, causando retração do embrião á
zona pelúcida. Formação de junções de adesão e de oclusão entre as células,
preparando o embrião para a formação da blastocele. Visível entre o dia 6,0 a 6,5 do
cultivo embrionário.
Bi - Blastocisto Inicial: Blastômeros criam gradiente osmótico que atrai água
para o espaço intracelular iniciando a formação de uma cavidade denominada
blastocele. Formam-se duas populações celulares distintas: o trofoblasto que reveste
a blastocele, e a massa celular interna lateral a blastocele. Visível entre os dias 6,5 a
7,0 do cultivo embrionário.
Bl
-
Blastocisto:
Blastocele
aumenta
de
tamanho,
tornando-se
proporcionalmente maior que a massa celular interna e ocupando gradualmente todo
o espaço perivitelínico. Trofoblasto sofre diferenciações morfológicas e funcionais
associadas à captação de nutrientes enquanto as células da massa celular interna
mantém a sua potencialidade. Visível entre os dias 7,0 e 7,5 do cultivo embrionário.
Bx - Blastocisto Expandido: Expansão da blastocele causa aumento de
tamanho do embrião e progressiva redução na espessura da zona pelúcida. Maior
desenvolvimento do trofoblasto, a massa celular interna é visível dependendo da
posição do embrião. O rompimento da zona pelúcida caracteriza eclosão. Visível
entre os dias 7,0 e 7,5 do cultivo embrionário.
Bn - Blastocisto em Eclosão: o embrião está começando o processo de saída
da zona pelúcida. Visível entre os dias 7,0 e 7,5 do cultivo embrionário.
Be - Blastocisto Eclodido: o embrião está totalmente livre da membrana
pelúcida, sendo ainda nítido a presença da blastocele. Visível entre os dias 7,0 e 7,5
do cultivo embrionário.
Segundo Gonçalves et al. (2008), os índices de blastocisto expandido e
eclodido é o principal fator para determinar a eficácia do sistema de maturação do
oócito, bem como a fecundação e o desenvolvimento embrionário.
Após este período os embriões podem então serem criopreservados ou
transferidos para doadoras previamente sincronizadas. No laboratório de reprodução
29
da Embrapa os embriões estavam sendo produzidos e criopreservados para uma
futura avaliação gênica, dando continuidade ao projeto de pesquisa.
Conclusão
Os avanços alcançados nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos estão
permitindo um grande avanço nos melhoramentos genéticos de bovinos. Portanto, a
busca pelo conhecimento continua e o aperfeiçoamento de cada umas das três
técnicas na produção in vitro de embriões, para que cada vez mais se busque novos
métodos para melhorar a eficiência e o melhoramento dos embriões.
30
4 CONCLUSÃO
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária proporcionoume um grande aprendizado complementar para a formação acadêmica. O período
de estágio na Embrapa Clima Temperado e a busca sempre pelo diferencial me
possibilitaram a obtenção de novos conhecimentos e aperfeiçoamentos frente aos
avanços alcançados com o uso de biotécnicas reprodutivas.
O estágio é extremamente importante, pois possibilita colocar em prática a
teoria vivenciada durante a vida acadêmica, estimulando o raciocínio lógico a frente
de novos desafios. Com conhecimento acadêmico concluo que a formação
profissional é um momento único e que permite a aquisição de experiências e
ligação com diversas pessoas, novos lugares e oportunidades.
31
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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33
ANEXOS
34
Anexo A – Certificado do Curso de Ultrassonografia em bovinos realizado
durante período de Estágio Supervisionado em Medicina Veterinária
35
Anexo B – Atestado de conclusão de estágio
36
Anexo C – Fontes de aquisição
1. Letah Max®. Indeba- Mercoclean Ltda, Tupã – SP.
2. Tubo Falcon®. Ciencor, São Paulo – SP.
3. Placas Nunc®. Ciencor, São Paulo – SP.
4. TCM-199®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.
5. Fert-TALP®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.
6. Percoll®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.
7. SPERM-TALP®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.
8. SOFaa®. Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.
9. Trizol®. Gibco- Life Technologies do Brasil Ltda, São Paulo – SP.