Mayanny Carla de Carvalho Lima - evz - ppgca

i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E LARVAL DE
Colossoma macropomum, Piaractus brachypomus E DO
HÍBRIDO TAMBATINGA
Mayanny Carla de Carvalho Lima
Orientador: Prof. Dr. Emmanuel Arnhold
GOIÂNIA
2014
ii
iii
MAYANNY CARLA DE CARVALHO LIMA
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E LARVAL DE
Colossoma macropomum, Piaractus brachypomus E DO
HÍBRIDO TAMBATINGA
Dissertação apresentada para obtenção do
grau de Mestre em Ciência Animal junto à
Escola
de
Veterinária
e
Zootecnia
da
Universidade Federal de Goiás.
Área de Concentração:
Produção Animal
Orientador:
Prof. Dr. Emmanuel Arnhold – U.F.G.
Comitê de orientação:
Profa. Dra. Maria Lúcia Gambarini Meirinhos
– U.F.G.
Profa. Dra. Fernanda Gomes de Paula
– U.F.G.
GOIÂNIA
2014
iv
v
vi
Dedico este trabalho a Deus, aos meus pais
João Batista e Divina Celma, ao meu esposo
Cassio Roberto e a minha amiga Dayane Lenz.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus e a Nossa Senhora Aparecida, por me
abençoar todos os dias e por estar sempre ao meu lado, iluminando meu
caminho, me tornando capaz.
Ao professor Dr. Emmanuel Arnhold por todo apoio, orientação, paciência e
compreensão.
Ao setor de piscicultura da Escola de Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás. À professora Dra. Fernanda Gomes pelos
ensinamentos, paciência e apoio.
À professora Dra. Maria Lúcia Gambarini pela dedicação, paciência,
ensinamentos e acima de tudo compreensão, os quais foram essenciais para meu
aprendizado.
Ao meu esposo Cassio Roberto, pelo companheirismo, compreensão e
apoio sempre.
À Dayane Lenz pela amizade, pelos ensinamentos, pela convivência,
paciência, pela ajuda sempre.
Aos meus pais João Batista e Divina Celma pelo incentivo na busca da
sabedoria.
À Juliana Macedo, Alex Pereira, Rafael Ferro, Diogo Ferro pelo incentivo,
amizade e companheirismo.
Aos parceiros de todas as horas, André Luiz, Alexandre Akio, Anderson
Pires, Fabricio Sado, Thainan Menezes, Luís Antônio, Ludiero, Rafael, pelo
companheirismo, amizade, e ajuda na execução do experimento.
À Piscicultura Buritizal, especialmente ao Sr. Ebraim Arantes que
gentilmente abriu as portas de sua piscicultura para realização deste trabalho.
Ao Valdir, Abadia e Valdir Junior pela ajuda durante a fase experimental.
Ao Marcelo, pela sua amizade, atenção e ajuda, sempre.
Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
Muito Obrigada!
viii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... xi
LISTA DE QUADROS .......................................................................................... xiii
RESUMO.............................................................................................................. xiv
ABSTRACT ........................................................................................................... xv
1INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 3
2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 3
2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 3
3 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 4
3.1 Espécies estudadas ......................................................................................... 4
3.1.1 Tambaqui ...................................................................................................... 4
3.1.2 Pirapitinga ..................................................................................................... 5
3.2 Hibridação ........................................................................................................ 6
3.2.1 Tambatinga ................................................................................................... 7
3.3 Desenvolvimento embrionário em peixes ......................................................... 8
3.4 Desenvolvimento larval em peixes ................................................................... 9
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 11
4.1 Local ............................................................................................................... 11
4.2 Seleção de reprodutores e indução hormonal ................................................ 11
4.3 Fertilização dos gametas ................................................................................ 12
4.4 Coleta dos embriões e larvas ......................................................................... 13
4.5 Análise sob estereomicroscopia ..................................................................... 14
4.3 Delineamento experimental ............................................................................ 15
5 RESULTADOS .................................................................................................. 16
5.1 Embriogênese ................................................................................................ 16
5.1.1 Estágio de zigoto ......................................................................................... 16
5.1.2 Estágio de clivagem .................................................................................... 18
5.1.3 Estágio de mórula........................................................................................ 20
5.1.4 Estágio de blástula ...................................................................................... 21
5.1.5 Estágio de gástrula ...................................................................................... 22
ix
5.1.6 Estágio de organogênese............................................................................ 24
5.1.7 Eclosão........................................................................................................ 27
5. 2 Desenvolvimento larval ................................................................................. 27
6 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 37
7 CONCLUSÃO .................................................................................................... 42
8 REFERÊNCIAS ................................................................................................. 43
x
LISTA DE ABREVIATURAS
MAF -
Minutos após a fertilização
AF
Após fertilização
-
HAE -
Horas após a eclosão
HG
-
Horas- grau
g
-
Gramas
ml
-
Mililitros
kg
-
Quilogramas
h
-
Hora
min
Minutos
m
-
Metro
cm
-
Centímetros
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Crescimento do espaço perivitelino observado em
diferentes momentos após a fertilização (AF) nos ovos de
(Colossoma macropomum)....................................................
17
Início da formação dos polos animal e vegetal, aos 12
minutos após a fertilização..................................................
17
Clivagem
dos
ovos
de
tambaqui
(Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
♂Piaractus brachypomus)......................................................
19
Clivagem
dos
ovos
de
tambaqui
(Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂ P.
brachypomus).........................................................................
20
Fase de mórula nos ovos de tambaqui (Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
♂Piaractus brachypomus)......................................................
21
Fase de blástula nos ovos de tambaqui (Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
♂Piaractus brachypomus)......................................................
22
Figura 7
Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma
macropomum),pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
♂Piaractus brachypomus)....................................................... 23
Figura 8
Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
♂Piaractus brachypomus)....................................................... 24
Figura 9
Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
♂Piaractus brachypomus)....................................................... 25
Figura 10
Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
♂Piaractus brachypomus)....................................................... 26
xii
Figura 11
Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀Colossoma macropomum X
27
♂Piaractus brachypomus)..................................................
Figura 12
Larva de tambaqui (Colossoma macropomum) logo após a
eclosão...................................................................................
28
Larva de pirapitinga (Piaractus brachypomus) logo após a
eclosão...................................................................................
28
Larva do híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂ P.
brachypomus) logo após a eclosão........................................
29
Desenvolvimento
larval
do
tambaqui
(Colossoma
macropomum)........................................................................
30
Desenvolvimento
larval
da
pirapitinga
(Piaractus
brachypomus).......................................................................
31
Desenvolvimento
larval
do
híbrido
tambatinga
(♀.C.macropomum X ♂.P. brachypomus)............................
32
Desenvolvimento
larval
do
tambaqui
(Colossoma
macropomum)........................................................................
34
Desenvolvimento
larval
da
pirapitinga
(Piaractus
brachypomus).......................................................................
35
Desenvolvimento
larval
do
híbrido
tambatinga
(♀.C.macropomum X ♂.P. brachypomus)............................
36
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
xiii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Esquema dos cruzamentos realizados..........................................
13
xiv
RESUMO
O conhecimento do desenvolvimento embrionário e larval dos peixes é essencial
para o entendimento da biologia das espécies, desenvolvimento da cadeia
produtiva e estudos de melhoramento genético e de tecnologia da reprodução de
peixes. Assim, objetivou-se descrever o desenvolvimento embrionário e larval do
tambaqui (Colossoma macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do
seu híbrido tambatinga (♀C. macropomum x ♂ P. brachypomus). O experimento
foi realizado na Piscicultura Buritizal, localizada no município de Palmeiras de
Goiás. Foram utilizados três fêmeas tambaqui, três fêmeas pirapitinga, cinco
machos tambaqui e cinco machos pirapitinga em idade reprodutiva. A reprodução
foi realizada através de indução hormonal. Os ovos foram incubados em
incubadoras verticais, com capacidade para 200L d’água. As amostragens
ocorreram em tempos pré-determinados, desde o momento da extrusão dos
ovócitos até 84 horas após a fertilização. As amostras foram fixadas em solução
formol salina tamponada a 10% imediatamente após a coleta e analisadas em
estereomicróscopio. As fêmeas de tambaqui e pirapitinga produziram ovócitos
esféricos, não adesivos e translúcidos. Durante o período de desenvolvimento
embrionário foram observadas as fases de zigoto, clivagem, mórula, blástula,
gástrula, organogênese e eclosão. O polo vegetativo permaneceu indivisível
durante todo o desenvolvimento embrionário, caracterizando o tipo de
segmentação meroblástica discoidal, típica de ovos com grandes quantidades de
vitelo. Os ovos de tambaqui e pirapitinga eclodiram 15 horas ou 422 horas-grau
após a fertilização, já os ovos do híbrido tambatinga eclodiram 14 horas ou 394
horas-grau após a fertilização, à temperatura média de 28,13±0,06ºC. As
espécies parentais e o híbrido em estudo apresentaram desenvolvimento
embrionário e larval característico dos peixes com ovos telolécitos, na qual a larva
recém eclodida, ainda não apresenta todos os sistemas orgânicos completamente
formados, limitada a poucos órgãos, e ainda dependente do vitelo para sua
nutrição. Não foi observado nenhuma diferença morfológica no desenvolvimento
embrionário e larval do híbrido tambatinga em relação as espécies parentais.
Palavras-chave: embriologia, larvicultura, tambaqui, pirapitinga, hibridação.
xv
ABSTRACT
Knowing fish embryonic and larval development is essential to understand species
biology, supply chain development and studies of breeding and reproduction of
fish technology. This study aimed was to describe Tambaqui (Colossoma
macropomum), pirapitinga (Piaractus brachypomus) and its hybrid tambatinga
(♀C. Macropomum x ♂ P. brachypomus). embryonic and larval development. The
experiment was conducted in Buritizal Fish Farm, located in Palmeiras de Goiás
district. It was used three Tambaqui females, three pirapitinga females, five males
tambaqui and five pirapitinga in reproductive age. Reproduction was performed by
hormonal induction. Eggs were incubated in vertical incubators of 200L water
capacity. Sampling took place at pre-determined time from the moment of
extrusion of oocytes to 84 hours after fertilization. Samples were fixed in formalin
buffered saline to 10% immediately after collection, and examined under a
stereomicroscope. Tambaqui and pirapitinga females produced spherical, nonadhesive, translucent oocytes. During embryonic development stage of the zygote,
cleavage, morula, blastula, gastrula, organogenesis and hatching were observed.
The vegetative pole remained undivided throughout embryonic development,
characterizing segmentation type meroblastic discoidal, typical egg yolk with large
amounts. Pirapitinga and tambaqui eggs hatched 15 hours or 422 hours-degree
after fertilization, tambatinga hybrid eggs hatched 14 hours or 394 hours-degree
after fertilization, at an average temperature of 28.13 ± 0,06ºC. Parental species
and hybrid under study showed characteristic embryonic and larval of telolecithal
fish with eggs, wherein the newly hatched larvae, has not yet fully formed, all
organic systems, limited to a few organs, and depending on the yolk for
nourishment . No morphological difference in embryonic and larval development of
hybrid
tambatinga
regarding
parental
species
was
observed.
Keywords: embryology, hatchery, tambaqui, pirapitinga, hybridization.
1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, vários aspectos relacionados à reprodução induzida,
nutrição e técnicas de criação de espécies de peixes nativos, vêm sendo
estudados com frequência. Entretanto, o desenvolvimento embrionário e a
produção de larvas não receberam a atenção necessária, e frente à enorme
diversidade de espécies de peixes encontradas no Brasil, o conhecimento
dessas fases ainda é escasso.
O conhecimento e identificação de cada estágio ontogênico é de
extrema importância, principalmente nos peixes de piracema, pelas mudanças
dos fatores ambientais aos que estão expostos na sua rotina migratória, e a
alta mortalidade nas primeiras fases do desenvolvimento embrionário e larval
(MACIEL, 2006).
No Brasil, o tambaqui (Colossoma macropomum) e a pirapitinga
(Piaractus brachypomus) são espécies nativas migradoras de grande
importância econômica e ecológica. Apesar dos avanços tecnológicos para
produção de peixes neotropicais no país, ainda são necessárias informações
sobre características biológicas destas espécies com potencial para a
piscicultura nas diferentes fases do desenvolvimento inicial (GODINHO, 2007).
Porém, observa-se que pisciculturas de diversas regiões brasileiras tem
realizado cruzamentos entre estas espécies, fazendo com que o cultivo de
peixes híbridos cresça cada vez mais no país (PORTO-FORESTI et al. 2011;
HASHIMOTO et al. 2012).
Entre os peixes híbridos, destaca-se o tambatinga produzido a partir do
cruzamento da fêmea de tambaqui (Colossoma macropomum) com o macho
de pirapitinga (Piaractus brachypomus), o qual apresenta superioridade em
relação as suas espécies parentais quanto ao crescimento e produtividade
(HASHIMOTO et al., 2012; DIAS et al. 2012).
No entanto, verifica-se poucos relatos quanto aos aspectos básicos do
período embrionário dos peixes híbridos. É necessário caracterizar o
desenvolvimento embrionário dos peixes híbridos e das suas espécies
parentais, uma vez que o conhecimento da embriogênese dos peixes, constitui
ferramenta útil na localização de áreas de desova e no estudo do crescimento
2
da espécie em ambiente natural (REYNALTE-TATAJE et al., 2001). Além de
permitir a identificação temporal da morfologia no processo de formação de um
novo organismo, o qual ajuda no manejo da incubação e da produção de larvas
(VALBUENA et al., 2012).
3
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
- Realizar uma comparação morfo-temporal das diferentes fases do
desenvolvimento embrionário e larval das espécies parentais tambaqui e
pirapitinga, e do seu híbrido tambatinga.
2.2 Objetivos específicos
- Descrever e comparar o formato e a coloração dos ovócitos;
- Descrever e comparar as possíveis alterações morfológicas advindas do
processo de hibridação nas fases de zigoto, clivagem, mórula, blástula,
gástrula, organogênese e eclosão;
- Comparar o tempo de eclosão dos ovos;
- Descrever e comparar a coloração das larvas ao eclodir;
- Descrever e comparar o tempo de formação dos principais órgãos observados
na fase larval.
4
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Espécies estudadas
O tambaqui (Colossoma macropomum) e a pirapitinga (Piaractus
brachyopomus) pertencem a ordem Characiformes, família Characidae e
subfamília Serrasalminae (VÁSQUEZ-TORRES, 2005; GRAÇA & PAVANELLI,
2007).
Segundo NELSON (2006) a ordem Characiformes é um dos maiores
grupos de peixes água doce, compreendendo 18 famílias, com cerca de 1.674
espécies válidas em 270 gêneros. Possuem ampla distribuição em águas
continentais do sul dos Estados Unidos, México, América Central e do Sul e
África.
3.1.1 Tambaqui
O tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) é nativo dos rios
Amazonas, Orinoco e afluentes, amplamente distribuído na parte tropical da
América do Sul e na Amazônia Central (DIAZ & LOPEZ, 1995; ARAÚJO-LIMA
& GOMES, 2005). É a espécie nativa mais cultivada no Brasil com produção de
54.313,1 toneladas em 2010 e crescimento de 39% de 2008 a 2010 (MPA,
2012). Possui grande porte, e na natureza pode atingir 1,0 m de comprimento e
peso médio de 30 kg. É considerado o segundo maior peixe de escamas da
bacia Amazônica (KUBTZA, 2004; ARAUJO-LIMA & GOMES, 2005).
A popularidade dessa espécie se deve à facilidade de produção de
alevinos, resistência ao manuseio, a temperaturas elevadas, enfermidades e a
baixos níveis de oxigênio dissolvido, além de apresentar rápido crescimento
(ARAÚJO-LIMA & GOMES, 2005).
O habitat do tambaqui é caracterizado por águas ricas em nutrientes, com
temperaturas médias entre 25 e 34ºC e abundância de áreas alagáveis
(ARAÚJO-LIMA & GOMES, 2005).
5
Reprodutivamente o tambaqui é um peixe de piracema com fecundação
externa e desova total. O periodo de desova é sincronizado com o periodo
chuvoso, normalmente de outubro a fevereiro na sua região de origem, época
em que realiza grandes migrações (VIEIRA et al., 1999). Apresenta alta
fecundidade e não possui cuidado parental, atinge a maturidade sexual entre o
terceiro e o quarto ano de vida, é mais tardio em regiões onde a temperatura
média anual é mais baixa (GRAÇA & PAVANELLI, 2007).
Como ocorre com a maioria das espécies migradoras, em cativeiro o
tambaqui é induzido com utilização de hormônios (ARAÚJO-LIMA & GOMES,
2005). Em laboratório a desova ocorre entre 200 a 300 horas-grau após a
indução hormonal e os ovos devem ser incubados com taxa de estocagem de 1
a 2 g/L ou 3.000 ovos/L. A temperatura deve estar entre 22oC a 28oC, e o
tempo de incubação varia de 18 a 22 horas (ANDRADE & YASUI, 2003).
3.1.2 Pirapitinga
A pirapitinga Piaractus brachypomus (CUVIER, 1818), é uma espécie
natural
dos
rios
Solimões,
Amazonas,
Orinoco
e
seus
afluentes
(WOYNAROVICH, 1988), pode atingir 80 cm de comprimento e 20 kg de peso.
De hábito alimentar onívoro, a pirapitinga se alimenta de frutas, folhas,
sementes e microcrustáceos (VÁSQUEZ-TORRES, 2005).
A pirapitinga é a única espécie do gênero Piaractus encontrada na Bacia
Amazônica (SOBRINHO et al., 1984). Segundo KUBITZA (2004), é
considerado o terceiro maior peixe de escamas da Amazônia, perdendo
apenas para o pirarucu e o tambaqui.
Possui um crescimento rápido, rusticidade, resistente a elevadas
temperaturas, ao manejo, às enfermidades e a baixos níveis de oxigênio
dissolvido (VÁSQUEZ-TORRES, 2005). Em 2010, a produção nacional da
pirapitinga atingiu 783,6 toneladas (MPA, 2012).
As fêmeas de Pirapitinga alcançam sua maturidade sexual aos três anos,
enquanto que nos machos ocorre ao final de dois anos. São espécies de
fecundação externa que liberam seus gametas no meio ambiente (ALMEIDA,
6
1997). Nas condições naturais estes peixes realizam piracema, migrando rio
acima no período entre junho e julho até outubro, quando os ovários das
fêmeas ainda não estão desenvolvidos. Já em cativeiro é necessária indução
hormonal e fertilização artificial, pois não conseguem desovar naturalmente. A
desova ocorre no período de outubro a fevereiro quando as condições
ambientais se tornam ideais, com temperatura média da água de 27°C, após as
primeiras chuvas (VELÁSQUEZ-MEDINA, 2008).
Em condições normais, a uma temperatura de 26ºC, o desenvolvimento
embrionário da pirapitinga pode variar entre 16 e 18 horas, porém, em
temperaturas maiores, de até 29-30ºC, o tempo de eclosão pode diminuir para
13 a 14 horas (NAKATANI et al., 2010).
3.2 Hibridação
O fenômeno da hibridação tem como objetivo aproveitar o possível vigor
híbrido ou heterose (SENHORINI et al., 1988), alcançado por meio do
cruzamento de grupos ou indivíduos geneticamente diferenciados. A hibridação
pode envolver tanto cruzamentos entre linhagens diferentes dentro de uma
mesma espécie, quanto entre indivíduos de espécies diferentes (BARTLEY et
al., 2001).
A heterose é utilizada para descrever a manifestação da superioridade de
um caráter quantitativo em combinações híbridas, é a expressão genética dos
efeitos da hibridação (BASTOS et al., 2003), manifesta-se quando a
característica avaliada no híbrido é maior (heterose positiva), ou menor
(heterose negativa) do que a média dos genitores. Assim do ponto de vista
comercial, considera-se como heterose aquela resultante de um híbrido cuja
média é superior à média do genitor de melhor desempenho (SENHORINI et
al., 1988).
A aplicação da técnica de hibridação nas grandes pisciculturas visa
produzir animais que possam obter melhor desempenho que as espécies
parentais (QUAGGIO et al., 2009), como o aumento da taxa de crescimento,
maior qualidade da carne, resistência a doenças e capacidade de tolerar
7
variações
ambientais,
além
do
aperfeiçoamento
de
diversas
outras
características (BARTLEY et al., 2001), de maneira que o sistema se torne
mais competitivo e o produto final tenha maior aceitação por parte dos
consumidores (BOTERO et al., 2004).
No entanto, há necessidade de mais estudos sobre a biologia reprodutiva
dos peixes híbridos, bem como do impacto ambiental que podem vir a causar,
antes da exploração em larga escala destes animais. Ademais, o sucesso da
criação de peixes depende basicamente do conhecimento da biologia da
espécie e, em especial, do processo reprodutivo (ROMAGOSA et al., 2000).
3.2.1 Tambatinga
O tambatinga é um peixe híbrido resultante do cruzamento de fêmea
tambaqui (Colossoma macropomum) com o macho de pirapitinga (Piaractus
brachypomum). Apresenta coloração clara, com a ponta das nadadeiras caudal
e anal avermelhadas, coloração herdada da pirapitinga. Tem hábito alimentar
onívoro, especialmente frugívoro-herbívoro e pode alcançar até 80 cm de
comprimento e pesar mais de 15 kg de peso corporal (CRUZ et al. 2006).
O tambatinga é superior em crescimento e produtividade (HASHIMOTO et
al., 2012) e apresenta melhor conversão alimentar quando comparado com as
suas espécies parentais (PAULA et al., 2009a e 2009b).
A produção nacional do híbrido tambatinga em 2010 foi de 4.915,6
toneladas (MPA, 2012).
Possui filamentos branquiais mais desenvolvidos que a pirapitinga,
possibilitando assim, maior eficiência no processo de filtragem do plâncton
existente no meio durante sua alimentação (FLORES et al., 1992).
Dessa forma, esse peixe híbrido apresenta características de ambas as
espécies parentais, com a vantagem de maior resistência às doenças adquirida
da pirapitinga e o crescimento do tambaqui (HASHIMOTO et al., 2012), sendo
cultivado principalmente nos estado do Amapá, Pará, Tocantins, Piauí, Mato
Grosso e Mato Grosso do Sul (IBAMA, 2007).
8
3.3 Desenvolvimento embrionário em peixes
O desenvolvimento embrionário em peixes compreende eventos
morfogenéticos que ocorrem desde a fertilização até a eclosão do ovo
(KIMMEL et al., 1995). Após os eventos desencadeados pela fertilização, o ovo
passa por alterações que incluem os estágios de zigoto, clivagem, mórula,
blástula, gástrula, organogênese e eclosão (FAUSTINO et al., 2007).
A duração da embriogênese varia entre as espécies, depende do
tamanho dos ovos, das características reprodutivas das mesmas (NAKATANI
et al., 2001), e da temperatura da água (KUBTIZA, 2004). Ela é expressa em
horas-grau (HG) obtida pela soma das temperaturas da água, a cada hora,
durante o evento. Em geral, a embriogênese dos peixes de piracema é mais
curta, observa-se a eclosão dos ovos antes de completar 500 HG, já a de
peixes sedentários situa-se entre 1000 HG (SATO et al., 2003).
O processo de desenvolvimento embrionário tem início após a
fecundação do ovócito pelo espermatozóide, via micrópila (FAUSTINO et al.,
2010). Em contato com a água o óvulo hidrata e sua micrópila fecha
gradativamente (ANDRADE & YASUI, 2003). O período de hidratação pode
variar entre as espécies devido ao tamanho do ovo: menos de um minuto para
o pacu (Piaractus mesopotamicus) (RIBEIRO et al., 1995), 20 minutos para o
tambaqui (Colossoma macropomum) (ALBUQUERQUE et al., 1994) e 30
minutos para a piracanjuba (Brycon orignyanus) (LANDINEZ et al., 2004).
Assim, no caso do pacu, em aproximadamente um minuto já é inviável a
fecundação, porque os espermatozóides ativados inicialmente pelo contato
com a água têm tempo de vida e motilidade aproximadamente igual ao período
em que a micrópila dos óvulos permanece aberta (ANDRADE & YASUI, 2003).
Após a fertilização, tem-se o início do estágio de zigoto. Nesta fase o
ovo absorve água e ocorre a formação do espaço perivitelino, com a separação
do córion da membrana vitelina, segregação dos polos animal e vegetativo e
clivagem do blastodisco (LANGELAND & KIMMEL, 1997; NAKATANI et al
2001).
A fase de clivagem compreende seis divisões mitóticas sucessivas do
blastodisco até atingir os 64 blastômeros passando pelos estágios de duas,
9
quatro, oito, 16, 32 e 64 células, dando origem a mórula. O tipo de divisão é
meroblástica, e só acontece no polo animal sem comprometer o polo vegetal,
que permanece indivisível durante todo o desenvolvimento embrionário que
forma, posteriormente, o saco vitelínico (KIMMEL et al., 1995) do qual o
embrião irá nutrir-se durante a embriogênese, e que é também utilizado para
nutrir a larva por algum tempo após a eclosão (NAKATANI et al., 2001).
O período de blástula começa a partir de 128 células, e se estende até o
início dos movimentos de epibolia (KIMMEL et al. 1995).
Na gastrulação ocorre os movimentos de involução, convergência e
extensão que darão origem às camadas germinativas primárias e ao eixo
embrionário. A involução marca o início da fase de gástrula quando o embrião
atinge 50% de epibolia e surge o anel germinativo no bordo do blastoderma. Na
convergência se dá uma acumulação de células ao longo do anel germinativo.
Já o movimento morfogenético de extensão faz referência ao alongamento do
eixo embrionário (KIMMEL et al., 1995). No final da gastrulação, quando a
epibolia está próxima de seu término, ocorre o acúmulo de células que darão
origem a notocorda. Essa fase é caracterizada pelo fechamento do blastóporo
(GANECO, 2003; SAMPAIO, 2006).
A fase de organogênese é caracterizada pelo surgimento dos primeiros
somitos e do saco vitelino. O embrião continua se desenvolvendo e nesta fase
são visíveis a cauda livre, aumento da região da cabeça, vesícula ótica, tubo
neural na região cefálica, notocorda, deslocamento da cauda, alongamento do
embrião a partir do eixo cefálico caudal e os primeiros movimentos musculares
do mesmo (SAMPAIO, 2006; NEUMANN, 2011).
A eclosão ocorre após movimentos da cauda, que resulta no rompimento
do córion (GANECO, 2003).
3.4 Desenvolvimento larval em peixes
O período de desenvolvimento larval inicia-se após a eclosão e termina
com a reabsorção do vitelo e início da alimentação exógena (HELFMAN et al.,
2000).
10
A maioria das larvas de peixes de água doce eclodem com boca e
mandíbulas ainda não formadas, olhos despigmentados e saco vitelínico
grande (NAKATANI et al., 2001). Antes da abertura da boca, as larvas nutremse do vitelo, que é reabsorvido constantemente através de endocitose via
camada sincicial vitelínica (SHAHSAVARANI et al., 2002). Nesse período,
poucos melanóforos são visualizados e a larva é muito transparente
(NAKATANI et al., 2001).
Durante o desenvolvimento larval vários eventos devem ser observados,
destacando-se a pigmentação dos olhos, abertura bucal e do sistema digestivo
(lúmen intestinal), inflação da bexiga natatória, flexão da notocorda,
desenvolvimento das nadadeiras, início do consumo de alimentos exógenos,
entre outras. A abordagem desses aspectos é crucial no estudo da ontogenia
de espécies nativas, sejam estes migradores ou não (GODINHO, 2007;
SANTOS & GODINHO, 2002).
11
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local
O experimento foi realizado na Piscicultura Buritizal, empreendimento
destinado à produção de alevinos de peixes nativos, localizado no município de
Palmeiras de Goiás/GO, em novembro de 2013.
4.2 Seleção de reprodutores e indução hormonal
Para a realização do experimento foram selecionadas três fêmeas de
tambaqui e três fêmeas de pirapitinga, sexualmente maduras, escolhidas
subjetivamente pela aparência da papila urogenital, do abdômen e canulação
intra-ovariana dos ovócitos. Após a seleção, as fêmeas foram identificadas por
fio de cobre revestido de pvc colorido na nadadeira dorsal, pesadas e
encaminhadas ao laboratório de reprodução, onde foram acondicionadas em
caixas d’água de volume de 1000 L com fluxo de água contínuo e submetidas à
indução hormonal com extrato bruto de hipófise de carpa na quantidade de 5,5
mg/kg de peso vivo, diluído em solução salina de NaCl 0,9% aplicado via
intraperitonial, em duas doses de 0,5 mg/kg e 5,0 mg/kg respectivamente com
intervalo de 12 horas entre doses. Após a aplicação da segunda dose de
hormônio foi realizada a contagem de 260 horas-grau para a extrusão dos
ovócitos de tambaqui e 275 horas-grau para a extrusão dos ovócitos de
pirapitinga por pressão abdominal no sentido céfalo-caudal em meio e
recipiente seco, sem presença de água, urina ou sangue.
Também foram selecionados dez exemplares machos, cinco da espécie
tambaqui e cinco da espécie pirapitinga, sexualmente maduros, que liberaram
sêmen com leve pressão abdominal sem indução hormonal. Após a seleção, os
indivíduos foram identificados por fio de cobre revestido de pvc colorido na
nadadeira dorsal, pesados e encaminhados ao laboratório de reprodução de
peixes, onde foram acondicionados em caixas d’água de volume de 1000 L
com fluxo de água contínuo e submetidos à indução hormonal com extrato
12
bruto de hipófise de carpa, na quantidade de 2,0 mg/kg de peso vivo, diluído
em solução salina de NaCl 0,9%, na quantidade de 0,5 mL/kg de peso vivo e
aplicado via intraperitonial. Decorridas 12 horas da indução hormonal os
indivíduos foram envoltos em toalha úmida e submetidos à extrusão dos
gametas por pressão abdominal no sentido céfalo-caudal, realizada em meio
seco, sem presença de água, urina ou sangue. O sêmen foi coletado em
seringas graduadas de 10,0 mL previamente identificadas com o nome da cor
de identificação de cada reprodutor.
Para cada amostra foi realizado o teste de contaminação, que consistiu
em avaliar a motilidade espermática com o auxílio de microscópio óptico com
aumento de 400X, em que foram rejeitadas as amostras que apresentarem
mais de 1,0% de motilidade no campo óptico sem a ativação com água.
Atestada a viabilidade das amostras, o sêmen foi acondicionado em caixa
térmica com gelo, na temperatura de aproximadamente 5,0ºC.
4.3 Fertilização dos gametas
Para a realização da fertilização foram coletadas duas alíquotas de 200 g
dos ovócitos de cada fêmea de tambaqui e uma alíquota de 200 g de cada
fêmea de pirapitinga, totalizando nove alíquotas. O sêmen dos reprodutores de
cada espécie foi misturado em alíquotas de igual proporção formando dois
“pools” de sêmen, um de tambaqui e outro de pirapitinga.
Para os ovócitos de cada fêmea de tambaqui ocorreu a fertilização com o
“pool’’ de sêmen de tambaqui e de pirapitinga, já os ovócitos das fêmeas de
pirapitinga foram fertilizados apenas com pool de sêmen de pirapitinga (Quadro
1).
Os gametas foram misturados em meio seco e em seguida ativados com
água da incubadora onde se seguiu a incubação, eclosão dos ovos e
larvicultura. Cada repetição foi realizada em incubadora individual de 200 L de
capacidade e fluxo de água vertical e contínuo na densidade de 1,0 g de
ovos/L.
As incubadoras foram previamente identificadas com o número do
tratamento e repetição correspondente, e o fluxo de água foi previamente
13
ajustado em 2 L/min. Além disso, todas as incubadoras compartilhavam a
mesma fonte de água, para não haver diferenciação dos parâmetros físicos e
químicos da água de incubação dos ovos e larvicultura. Durante todo o período
experimental a temperatura da água foi aferida a cada hora com termômetro
digital.
Quadro 1 – Esquema dos cruzamentos realizados.
Cruzamentos
♀ C. macropomum
♀ P. brachypomus
♀ C. macropomum
X
X
X
♂ C. macropomum =
♂ P. brachypomus =
♂ P. brachypomus =
C. macropomum
P. brachypomus
Híbrido tambatinga
4.4 Coleta dos embriões e larvas
Os intervalos de coleta foram estabelecidos em função do tempo após a
fertilização. Devido ao fato do padrão de crescimento em peixes mudar
rapidamente no início do ciclo de vida, este foi mensurado em curtos intervalos
de tempo.
O tempo após fertilização foi iniciado no momento da ativação dos
gametas e cronometrado para cada repetição em cronômetro digital, que
registrou o tempo durante todo o período do experimento.
A primeira coleta realizada foi de uma amostra de ovócitos de cada fêmea
após a extrusão. Em seguida, os ovócitos foram coletados 15 segundos após a
fertilização, um minuto após a fertilização e dois minutos após a fertilização.
Após completados dois minutos de fertilização as coletas se tornaram
mais espaçadas, ocorrendo a cada dois minutos até completar 22 minutos após
a fertilização. Daí em diante, foram coletadas mais 14 amostras com intervalos
regulares de cinco minutos, completando 78 minutos após a fertilização e uma
coleta aos 90 minutos após a fertilização.
14
A partir dos 90 minutos após a fertilização as coletas ocorreram a cada 15
minutos até completar duas horas após a fertilização, quando passaram a ser
realizadas em intervalos de 30 minutos, até atingir nove horas após a
fertilização.
Após nove horas da fertilização dos ovócitos, as coletas passaram a ser
realizadas com intervalos de uma hora até que os embriões completassem 24
horas após a fertilização. A partir desse momento, as coletas ocorreram com
intervalos de quatro horas até atingir 84 horas após a fertilização.
Para a metodologia de coleta realizada foram obtidas 76 amostras de
cada repetição, totalizando 684 coletas durante todo experimento.
As amostras foram fixadas em solução formol salina tamponada a 10%
imediatamente após a coleta. O formol tamponado foi preparado com 270 mL
de formol, e 730 mL de tampão fosfato (5,2g de fosfato de sódio monobásico,
23g de fosfato de sódio dibásico e 1000 mL de água destilada).
4.5 Análise sob estereomicroscopia
Após a fixação na solução formol salina tamponada, as amostras foram
encaminhadas para o Laboratório de Reprodução Animal, da Universidade
Federal de Goiás, e analisadas em estereomicroscópio Coleman. As imagens
foram registradas pelo sistema de captura, Câmera CMOS digital colorida, 5
megapixels TUCSEN USB 2.0
Para visualização dos ovócitos, ovos, embriões e larvas, foi necessária
adequação do “zoom” do estereomicroscópio em certos tempos de coleta.
Assim para análise de todas as repetições foi utilizado o “zoom’’ de 40X até a
coleta de número 30 (01h45min após a fertilização), a partir da coleta de
número 31 (02:00h após a fertilização) passou a ser utilizado o aumento de
34X. Já na coleta de número 54 (17:00h após a fertilização) foi utilizado
aumento 28X, e a partir da coleta número 60 (24:00h após a fertilização)
“zoom” de 22X.
Alterações que ocorreram desde a fertilização dos ovócitos, até 84:00h
após a fertilização e puderam ser vistas no estereomicroscópio foram descritas.
15
Neste estudo, foi utilizada a classificação de FAUSTINO et al. (2010), ou
seja, a expressão “ovócito” refere-se ao gameta feminino, antes da fertilização.
O termo “ovo” referiu-se aos estágios compreendidos entre a fertilização até o
final da fase de gastrulação, quando então ocorre a formação do eixo
embrionário passando a ser denominado "embrião". A denominação “larva” foi
utilizada desde o momento da eclosão até a absorção total do vitelo.
4.3 Delineamento experimental
Foi realizada uma análise descritiva, comparando todos os estágios de
desenvolvimento embrionário do tambaqui, pirapitinga e do seu hibrido
tambatinga.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, sendo
tomado como tratamento as duas espécies puras e o híbrido (T1 = tambaqui;
T2 = pirapitinga e T3 = híbrido tambatinga). Cada fêmea utilizada nos
cruzamentos foi considerada uma repetição
Como unidade experimental foram utilizadas nove incubadoras verticais
de 200L, devidamente instaladas no laboratório de reprodução, com renovação
de água continua, registros e tubulações que permitiram controlar a vazão de
abastecimento.
16
5 RESULTADOS
5.1 Embriogênese
As fêmeas de tambaqui e pirapitinga produziram ovócitos esféricos, não
adesivos e translúcidos, porém com coloração distinta. Os ovócitos de
tambaqui apresentaram coloração amarelada, e os de pirapitinga verdeazulada.
Os ovos das espécies estudadas foram classificados como telolécitos,
uma vez que exibiram grande quantidade de vitelo concentrado no polo
vegetativo enquanto o citoplasma e organelas foram distribuídos ao longo do
polo animal.
Durante o desenvolvimento embrionário foram observadas sete fases
comuns as espécies puras e ao híbrido, sendo elas: zigoto, clivagem, mórula,
blástula, gástrula, organogênese e eclosão, cada uma com suas características
que poderam ser vistas no estereomicroscópio descritas a seguir.
5.1.1 Estágio de zigoto
Com 15 segundos após a fertilização (AF) foi observado o início da
expansão do córion e a formação do espaço perivitelino nos ovos de tambaqui,
pirapitinga e do híbrido tambatinga. O espaço perivitelino, apresentou
crescimento com o decorrer do tempo e do desenvolvimento embrionário,
estando presente até a formação do embrião (Figura 1).
17
A
B
C
D
E
F
FIGURA 1 – Crescimento do espaço perivitelino observado em diferentes momentos
após a fertilização (AF) nos ovos de (Colossoma macropomum). A - 15
segundos AF; B - 1 MAF (minuto após fertilização); C - 10 MAF; D - 18
MAF; E - 26 MAF; F - 34 MAF. Destaca-se o aumento do espaço
perivitelino no decorrer do tempo (↔).
Aos 12 minutos após a fertilização (MAF) já era visível o início da
formação dos polos animal e vegetal, nos ovos de tambaqui, pirapitinga e do
híbrido tambatinga (Figura 2).
A
B
B
C
FIGURA 2 – Início da formação dos polos animal e vegetal, aos 12 minutos após a
fertilização. A - ovo de tambaqui (Colossoma macropomum); B - ovo de
pirapitinga (Piaractus brachypomus); C - ovo do híbrido tambatinga
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus).
O polo animal foi formado pelo citoplasma ativo e um núcleo que se
acumulou, originando uma protuberância em forma de disco, o blastodisco
unicelular (zigoto ou célula-ovo). Já o polo vegetal foi composto por vesículas
globosas de vitelo. Este estágio teve duração de 25 minutos nos ovos de
tambaqui pirapitinga e o híbrido tambatinga
18
5.1.2 Estágio de clivagem
As primeiras divisões celulares foram observadas simultaneamente nos
ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, tendo início aos 26
MAF.
Os ovos das espécies estudadas apresentaram clivagem meroblástica
discoidal ou parcial, em que foi observado o seguinte padrão de divisão celular:
A primeira clivagem foi orientada verticalmente. O sulco de clivagem
surgiu no polo animal e avançou rapidamente em direção ao polo vegetal,
passou no disco de citoplasma, e originou dois blastômeros visíveis aos 30
MAF nos ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga (Figuras 3A, 3B
e 3C respectivamente).
A segunda clivagem orientou-se também verticalmente e em ângulo reto
ao plano da primeira clivagem, gerou quatro blastômeros dispostos em duas
fileiras, aos 34 MAF nos ovos de tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 3D
e 3F), e aos 38 MAF nos ovos de pirapitinga (Figura 3E).
A terceira clivagem permaneceu vertical, todavia mostrou dois sulcos
paralelos ao plano da primeira clivagem, originando oito blastômeros, dispostos
em duas fileiras de quatro blastômeros, 42 MAF para tambaqui (Figura 3G), 50
MAF para a pirapitinga (Figura 3H) e do híbrido tambatinga aos 46 MAF (Figura
3I).
A quarta clivagem foi vertical e paralela à segunda, ocorreu também em
dois sulcos. Esta clivagem gerou 16 blastômeros dispostos em quatro fileiras
de quatro células, 54 MAF para o tambaqui e o híbrido tambatinga (Figuras 3J
e 3L) e pirapitinga aos 62 MAF (Figura 3K).
19
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
FIGURA 3 – Clivagem dos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
A
B
pirapitinga (Piaractus
brachypomus) e doCseu híbrido tambatinga
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, D, G, J –
Ovos de tambaqui com dois, quatro, oito e 16 blastômeros,
respectivamente; B, E, H, K - Ovos de pirapitinga com dois, quatro,
oito e 16 blastômeros, respectivamente; C, F, I, L - Ovos de
tambatinga com dois, quatro, oito e 16 blastômeros, respectivamente.
D
A quinta clivagem permaneceu
vertical segmentando
as quatro fileiras
E
F
de células, portanto mais quatro sulcos se formaram, produzindo 32
blastômeros dispostos em oito fileiras de quatro células a 62 MAF nos ovos
tambaqui e tambatinga (Figuras 4A e 4C), e pirapitinga aos 74 MAF (Figura
4B).
I
H
G
20
A sexta clivagem orientou-se na horizontal, dando origem a duas
camadas de células, totalizando 64 blastômeros a 78 MAF nos ovos de
tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 4D e 4F), e na pirapitinga aos 90
L
J (Figura 4E). A medida Kque as segmentação ocorreram,
MAF
os blastômeros
diminuíram gradativamente de tamanho.
Durante a fase de clivagem o polo vegetativo permaneceu indivisível. As
divisões mitóticas ocorreram somente no polo animal.
A
B
C
D
E
F
FIGURA 4 – Clivagem dos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum), pirapitinga
(Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga (♀C.
macropomum X ♂P. brachypomus). A, D - Ovos de tambaqui com 32 e
64 blastômeros, respectivamente; B, E - Ovos de pirapitinga com 32 e 64
blastômeros, respectivamente; C, F - Ovos de tambatinga com 32 e 64
blastômeros, respectivamente.
5.1.3 Estágio de mórula
A fase de mórula foi caracterizada inicialmente pela presença de 64
blastômeros
e
em
seguida
por
128
blastômeros,
notando-se
um
desalinhamento dos mesmos. Várias camadas foram observadas, formou-se
um maciço celular com arranjo semelhante à uma amora.
Este estágio de desenvolvimento pode ser observado a partir de 78 MAF
nos ovos de tambaqui e tambatinga (Figuras 5A e 5C), e nos ovos de
pirapitinga aos 90 MAF (Figura 5B).
21
B
A
C
FIGURA 5 – Fase de mórula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A – ovos de
tambaqui; B – ovos de pirapitinga; C – ovos do híbrido tambatinga.
5.1.4 Estágio de blástula
Esta fase se estendeu desde o momento em que o polo animal
apresentou-se abaulado, com mais de 128 blastômeros, até o início da
movimentação celular.
Este formato abaulado foi resultante da primeira clivagem no sentido
horizontal (sexta clivagem), que dividiu o embrião em duas camadas de células
e formou uma cavidade entre elas, a blastocele.
O início da fase de blástula foi observado aos 105 MAF nos ovos de
tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 6A e 6C), e às 02:00h AF para a
pirapitinga (Figura 6B).
O término desta fase ocorreu às 03h30min AF nos ovos de tambaqui e
tambatinga (Figuras 6D e 6F), e 04:00h AF para a pirapitinga (Figura 6C),
quando aproximadamente 30% do vitelo foi recoberto pelo movimento de
epibolia (Figura 6).
22
A
B
C
D
E
F
FIGURA 6 – Fase de blástula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A - Início da
fase de blástula nos ovos de tambaqui; B – início da fase de blástula nos
ovos de pirapitinga; C - Início da fase de blástula nos ovos tambatinga;
D - Final da fase de blástula nos ovos de tambaqui; E- Final da fase de
blástula nos ovos de pirapitinga; F – Final da fase de blástula nos ovos
de tambatinga.
5.1.5 Estágio de gástrula
Na fase de gástrula, pôde-se visualizar o movimento de epibolia das
células blastodérmicas, que realizaram um movimento de divergência partindo
do polo animal em direção ao polo vegetal envolvendo totalmente o ovo.
O início dessa fase foi observado às 04:00h AF nos ovos de tambaqui e
tambatinga (Figuras 7A e 7C), e às 04h30min AF para a pirapitinga (Figura 7B),
quando visualizou-se 50% de epibolia. Às 05:00h AF, cerca de 70% de epibolia
foi observado para as espécies parentais e seu híbrido em estudo (Figuras 7D,
7E e 7F).
Às 05h:30min AF foi observada 90% de epibolia e formação do
blastóporo nos ovos de tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 7G e 7I), e
às 06:00h AF nos ovos de pirapitinga (Figura 7H).
23
A
B
C
D
E
F
G
H
I
FIGURA 7 – Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, D, G – 50,
70 e 90% de epibolia nos ovos de tambaqui, respectivamente ; B,
E, H – 50, 70, 90% de epibolia nos ovos de pirapitinga,
respectivamente; C, F, I – 50, 70 e 90% de epibolia nos ovos de
tambatinga, respectivamente.
Com 06:00h AF observou-se 95% de epibolia para o tambaqui e o
híbrido tambatinga (Figuras 8A e 8C), e 06h30min AF para a pirapitinga (Figura
8B).
No término da gastrulação, 100% de epibolia, ocorreu o fechamento do
blastóporo com 06h30min para o tambaqui e tambatinga (Figuras 8D e 8F), e
07:00h para a pirapitinga (Figura 8E).
24
A
B
C
D
E
F
FIGURA 8 – Fase de gástrula nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A - 95% de
epibolia nos ovos de tambaqui; B – 95% de epibolia nos ovos de
pirapitinga; C – 95% de epibolia nos ovos de tambatinga; D –
fechamento do blastóporo nos ovos de tambaqui; E – fechamento do
blastóporo nos ovos de pirapitinga; F - fechamento do blastóporo nos
ovos de tambatinga.
5.1.6 Estágio de organogênese
A fase de organogênese iniciou logo após o fechamento do blastóporo, e
foi caracterizada pela formação de órgãos rudimentares, do saco vitelino e dos
somitos.
O início da formação do eixo embrionário, a diferenciação das regiões
cefálica e caudal, e o surgimento dos primeiros somitos (tecidos mesodermais)
que se alongaram em ambos os lados da notocorda, foram observados às
07:00h AF para tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 9A e 9C), e
07h30min para a pirapitinga (Figura 9B).
A vesícula óptica evidenciou-se as 08:00h AF para tambaqui e
tambatinga (Figuras 9D e 9F) e às 08h30min AF nos embriões de pirapitinga,
ocorrendo simultaneamente o aumento no número de somitos (Figura 9E).
25
A
B
C
D
E
F
op
so
op
op
FIGURA 9 – Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
G
H brachypomus) e do Iseu híbrido tambatinga
pirapitinga (Piaractus
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, B, C - Início
da formação dos somitos, do eixo embrionário e diferenciação das
regiões cefálica e caudal, nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do
híbrido tambatinga, respectivamente. D, E, F - A vesícula óptica e somitos
evidentes nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga,
respectivamente. Legenda: op - vesícula óptica; so – somitos.
Com 09:00h AF foi observada a vesícula de Kupffer nos embriões de
tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 10A e 10C), e as 10:00h AF nos
embriões de pirapitinga (Figura 10B).
Com 10:00h AF foi constatado o início do desprendimento da cauda do
saco vitelino nos embriões de tambaqui e do híbrido tambatinga (Figuras 10D e
10F) e às 11:00h AF nos de pirapitinga (Figura 10E).
Nesse estágio foram observados movimentos de contração muscular,
que se tornaram mais intensos a medida que a cauda soltava-se do saco
vitelínico, o qual apresentou-se alongado, acompanhando o formato larval.
26
B
A
C
vk
vk
vk
D
E
F
FIGURA 10 – Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
pirapitinga (Piaractus
brachypomus) e doI seu híbrido tambatinga
G
H
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus) A, B, C - Vesícula
de Kupffer visível nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido
tambatinga, respectivamente. D, F, G - Início do desprendimento da
cauda dos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga,
respectivamente. Legenda: vk – vesícula de Kupffer.
A formação da nadadeira embrionária teve início às 11:00h AF nos
embriões
de tambaqui (Figura
J
K 11A), e as 12:00hL AF nos embriões de
pirapitinga e do híbrido tambatinga (Figuras 11B e 11C). Neste momento a
vesícula ótica e tubo neural, estavam bastante visíveis nos embriões
estudados.
Às 13:00h AF os embriões das espécies parentais e do híbrido em
estudo, apresentaram-se totalmente alongados e cauda completamente solta.
27
A
ot
D
B
E
ot
C
ot
F
FIGURA 11 – Fase de organogênese nos ovos de tambaqui (Colossoma macropomum),
pirapitinga (Piaractus brachypomus) e do seu híbrido tambatinga
(♀Colossoma macropomum X ♂Piaractus brachypomus). A, B, C - Início
da formação da nadadeira embrionária, visualização da vesícula ótica e
tubo neural nos embriões de tambaqui, pirapitinga e do híbrido
tambatinga, respectivamente. D, E, F – embriões de tambaqui, pirapitinga
e do híbrido tambatinga, respectivamente, totalmente alongados e cauda
completamente solta. Legenda: ot - vesícula ótica.
5.1.7 Eclosão
A eclosão dos ovos de tambaqui e pirapitinga ocorreu as 15 horas após a
fertilização ou 422 horas-grau, já os ovos do híbrido tambatinga eclodiram com
14 horas após a fertilização ou 394 horas-grau. Nesta fase, as larvas
realizaram movimentos fortes, essenciais para o rompimento do córion.
5. 2 Desenvolvimento larval
No momento da eclosão, as larvas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido
tambatinga apresentaram-se esbranquiçadas, eram desprovidas de pigmentos,
acuidade visual (olhos ainda despigmentados), e capacidade natatória,
havendo somente uma nadadeira embrionária recobrindo toda a região caudal.
28
A cabeça encontrava-se em posição ventral, aderida à região anterior do saco
vitelino, que apresentou-se alongado, e o tubo digestório rudimentar sem
aberturas oral e anal (Figuras 12,13, 14).
Foram constatados os esboços do coração, vesícula ótica, formação do
cristalino e cálice óptico, notocorda e somitos.
FIGURA 12 – Larva de tambaqui (Colossoma macropomum) logo após a eclosão.
FIGURA 13 – Larva de pirapitinga (Piaractus brachypomus) logo após a eclosão.
29
FIGURA 14 – Larva do híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂P. brachypomus)
logo após a eclosão.
O processo de pigmentação dos olhos foi observado 17:00 h após a
eclosão (AE) das larvas de tambaqui (Figura 15 A), as 09:00h AE nas larvas de
pirapitinga (Figura 16A) e as 10:00h AE nas larvas do híbrido tambatinga
(Figura
17A).
O
olho
apresentou-se
levemente
pigmentado
e
predominantemente esférico.
O inicio da diferenciação da boca foi evidenciada as 25:00h AE nas larvas
de tambaqui (Figura 15B), 15:00h AE nas larvas de pirapitinga (Figura 16C) e
as 14:00h AE para o híbrido tambatinga (Figura 17B). Pode-se observar que a
boca é ampla em relação ao tamanho do olho e da cabeça.
No decorrer do desenvolvimento larval, alguns pigmentos puntiformes
foram observados ao longo do intestino na região ventral. O início da
pigmentação do corpo das larvas de pirapitinga foi observado 21:00h AE
(Figura 16B), as 30:00h AE nas larvas do híbrido tambatinga (Figura 17C), e as
57:00h AE nas larvas de tambaqui (Figura 15F).
As 45:00h AE os arcos branquiais se tornaram evidentes nas larvas de
tambaqui (Figura 15C), as 37:00h AE nas larvas de pirapitinga (Figura 16D) e
as 38:00h AE nas larvas do híbrido tambatinga (Figura 17D).
Com 45:00h AE a bexiga natatória das larvas de tambaqui (Figura 15D)
começou a inflar. Nas larvas de pirapitinga a bexiga natatória foi visualizada as
41:00 h AE (Figura 16F), e no híbrido tambatinga as 46:00h AE (Figura 17E).
30
As 49:00h AE já era visível as nadadeiras peitorais nas larvas de
tambaqui (Figura 15E), as 50:00h AE no híbrido tambatinga (Figura 17F), e as
41:00 h AF nas larvas de pirapitinga (Figura 16E).
A
B
C
D
ab
bn
E
F
np
FIGURA 15 – Desenvolvimento larval do tambaqui (Colossoma macropomum). A –
início do processo de pigmentação dos olhos; B – início diferenciação da
boca; C – início da formação dos arcos branquiais; D – bexiga natatória
começa a inflar; E - nadadeira peitoral evidente; F – início da
pigmentação do corpo. Legenda: bn - bexiga natatória; ab- arcos
branquiais; np - nadadeira peitoral.
31
A
B
C
D
E
F
FIGURA 16 – Desenvolvimento larval da pirapitinga (Piaractus brachypomus). A – início
da pigmentação dos olhos; B – início da pigmentação do corpo; C- início
da diferenciação da boca; D – desenvolvimento dos arcos branquiais;
E – nadadeira peitoral evidente; F – bexiga natatória começa a inflar.
32
A
B
C
D
E
F
FIGURA 17 – Desenvolvimento larval do híbrido tambatinga (♀.C. macropomum X ♂.P.
brachypomus). A – início pigmentação do olho; B – início da diferenciação
da boca; C - início da pigmentação pelo corpo; D – início do
desenvolvimento dos arcos branquiais; E – bexiga natatória começa a
inflar; F - nadadeira peitoral começa a se desenvolver.
33
As nadadeiras peitorais tornaram-se mais evidentes as 57:00h AE nas
larvas de tambaqui (Figura 18A) e pirapitinga (Figura 19A), e as 58:00h AE nas
larvas do híbrido tambatinga (Figura 20A). Nesse momento também observouse a placa olfatória na cabeça das larvas.
A nadadeira embrionária observada nas larvas logo após a eclosão
transformou-se ao longo da embriogênese, originando a nadadeira caudal.
Assim, com 61:00h AE foi possível a visualização bem nítida da nadadeira
caudal nas larvas de tambaqui e pirapitinga (Figuras 18B e 19B), e as 62:00h
AE (Figura 20B) nas larvas do híbrido tambatinga.
Com 65:00h AE pode-se observar o coração bastante desenvolvido,
bexiga natatória mais inflada e arcos branquiais maiores nas larvas de
tambaqui e pirapitinga (Figuras 18C, 19C), e as 66:00h AE nas larvas do
híbrido tambatinga (Figura 20C).
As 69:00h AE pode-se observar olhos bastante pigmentados, boca
aberta, saco vitelino bastante reduzido, intestino e canal anal diferenciados,
nas larvas de tambaqui, pirapitinga (Figuras 18D, 19D), e as 70:00h AE nas
larvas do híbrido tambatinga (Figura 20D). O intestino apresentou-se longo,
com sua parte terminal ultrapassando a metade do corpo.
Durante o período larval observado, não foi verificada a formação do
estômago nas larvas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga.
34
AA
BB
C
D
co
FIGURA 18 - Desenvolvimento larval do tambaqui (Colossoma macropomum). A –
nadadeiras peitorais e placa olfatória; B - nadadeira caudal se
desenvolvendo; C - coração bastante visível, arcos branquiais maiores,
bexiga natatória mais inflada; D - olhos bastante pigmentados, boca
formada e aberta intestino e canal anal diferenciados, saco vitelino
reduzido. Legenda: co – coração.
35
A
C
B
D
FIGURA 19 – Desenvolvimento larval da pirapitinga (Piaractus brachypomus). A nadadeiras peitorais e placa olfatória; B –nadadeira caudal se
desenvolvendo; C - coração bastante visível, arcos branquiais maiores,
bexiga natatória mais inflada; D - olhos bastante pigmentados, boca
formada e aberta intestino e canal anal diferenciados, saco vitelino
reduzido.
36
A
C
B
D
FIGURA 20 – Desenvolvimento larval do híbrido tambatinga (♀C. macropomum X ♂P.
brachypomus). A - nadadeiras peitorais e placa olfatória; B –
nadadeira caudal se desenvolvendo; C - coração bastante visível, arcos
branquiais maiores, bexiga natatória mais inflada; D - olhos bastante
pigmentados, boca formada e aberta, intestino e canal anal
diferenciados, saco vitelino reduzido.
37
6 DISCUSSÃO
A temperatura média da água durante o desenvolvimento embrionário e
larval do tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga foi de 28,13±0,06ºC.
Segundo KIMMEL et al. (1995) essa temperatura é considerada ótima para o
desenvolvimento de peixes tropicais.
Os ovócitos de tambaqui e pirapitinga apresentaram-se, pequenos,
esféricos, não adesivos e translúcidos. Os ovócitos pequenos são típicos de
espécies migradoras, com desova total, de fecundação externa e sem cuidado
parental (VAZZOLER, 1996), e quando hidratados, aumentam muito seu
diâmetro (SATO et al., 2000), dando início ao processo de expansão do córion
e a formação do espaço perivitelino.
O espaço perivitelino existente nos ovos de peixes protege o embrião
contra as injurias do meio ambiente, delimitando o espaço para seu
desenvolvimento (RIBEIRO et al., 1995). Os ovos de tambaqui, pirapitinga e do
híbrido tambatinga apresentaram amplo espaço perivitelino, que também foi
observado em outras espécies de peixes teleósteos (RIBEIRO et al., 1995;
SHARDO 1995; ROMAGOSA et al., 2001; FAUSTINO et al., 2007).
Os ovos das espécies parentais e do híbrido estudados podem ser
classificados como telolécitos, pois apresentaram grande quantidade de vitelo
concentrado no polo vegetativo, e o citoplasma e suas organelas localizadas no
polo animal. Essas características obtidas são semelhantes às observadas por
BOTERO et al. (2004) nos ovos do híbrido tambatinga, OLAERTE et al (2010)
nos ovos de pirapitinga, e LEITE et al.(2013) em ovos de tambaqui.
A clivagem dos ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga, foi
do tipo meroblástica ou parcial, ou seja, o polo vegetativo permaneceu
indivisível durante todo o desenvolvimento embrionário. Tal clivagem é típica
dos ovos de peixes e foram similares aos descritos em outros teleósteos
(RIBEIRO et al., 1995; GANECO, 2003, NINHAUS-SILVEIRA et al., 2006;
FAUSTINO et al., 2007; MARQUES et al., 2008;).
As clivagens iniciam do centro para as bordas do blastodisco
(SHARDO,1995). Até a fase de 32 blastômeros (quinta clivagem), as
segmentações ocorrem em um único sentido (vertical), e o embrião é composto
38
por uma camada simples de células, conhecida como blastoderme (SALMITOVANDERLEY & SANTANA, 2010).
Durante o estágio de clivagem as divisões mitóticas ocorrem para que a
relação existente entre o núcleo e citoplasma no polo animal atinja um novo
equilíbrio, ou seja, o enorme volume do citoplasma zigótico é dividido cada vez
mais em células menores, enquanto o volume citoplasmático não aumenta
(GILBERT, 2003). Este fato também foi observado por RIBEIRO et al. (1995) e
LEITE et al. (2013) em ovos de tambaqui, e BOTERO et al. (2004) estudaram o
híbrido tambatinga.
O abaulamento observado nos ovos de tambaqui, pirapitinga e do híbrido
tambatinga é característico da fase de blástula. Segundo SALMITOVANDERLEY & SANTANA (2010) esse abaulamento é resultante da primeira
clivagem no sentido horizontal (sexta clivagem), dividindo o embrião em duas
camadas de células com uma cavidade entre elas chamada de blastocele.
No final da fase de blástula e início da gástrula evidenciou-se movimento
de epibolia. Este movimento foi acompanhado do surgimento de um anel
germinativo na borda marginal da blastoderme, e consequente formação do
escudo embrionário. O mesmo foi observado por (KIMMEL et al., 1995)
estudando o zebrafish (Brachidanio rerio).
Na fase de gástrula a medida que as divisões mitóticas prosseguiram, o
polo animal tornou-se cada vez mais abaulado devido ao acumulo de células
no polo animal que iniciaram um movimento em direção ao polo vegetal,
recobrindo gradativamente a região vitelínica. Este movimento, é conhecido
como epibolia, é característico da fase de gástrula, pois durante a epibolia
ocorrem também movimentos de involução das células do polo animal para
dentro da blastocele, através do blastóporo, para a formação de tecidos
embrionários (GARCIA E FERNANDEZ, 2006).
Os principais eventos observados durante a fase de organogênese foi a
formação da notocorda e tubo neural, formação dos somitos e da vesícula de
kuppfer. A notocorda é um órgão provisório que possui função de formação do
tubo neural e posterior sistema nervoso central (GILBERT, 2003), já os somitos
entram em miogênese para posterior formação dos músculos, desenvolvidos
em blocos celulares (BUZZOLO, et al., 2011).
39
O processo de formação do tubo neural, rudimento do sistema nervoso
central, é chamado neurulação e o tubo neural se origina de um sólido cordão
de células da placa neural formando uma estrutura com aspecto de cordão que
migra dentro do embrião fechando-se para formar o tubo. Assim, a porção mais
anterior do tubo sofre mudanças drásticas, expandindo-se em três vesículas
primárias, cérebro anterior (prosencéfalo), cérebro médio (mesencéfalo) e
cérebro posterior (rombencéfalo) (GILBERT, 2003).
A vesícula de Kupffer também foi observada por KIMMEL et al. (1995)
estudando Danio rerio (zebrafish), FAUSTINO et al. (2007) nos embriões de
híbridos
de
pintado
(Pseudoplatystoma
corruscans)
e
cachara
(Pseudoplatystoma fasciatum) e por NEUMANN (2008) em matrinxã (B.
amazonicus). KIMMEL et al. (1995) relataram que esta vesícula apresenta-se
como uma depressão no broto da cauda, sendo uma estrutura transitória
encontrada apenas em embriões de teleósteos. Recentemente, estudos
mostraram que esta vesícula, possui fluido e cílios, os quais proporcionam um
fluxo direcional sempre da direita para a esquerda, imprescindível para a
assimetria dos órgãos durante o desenvolvimento (ESSNER et al. 2005).
A eclosão dos ovos ocorrem após contrações musculares vigorosas da
cauda e do corpo das larvas (NAKATANI et al., 2001), sendo o córion
amolecido como resultado da ação de enzimas (BLAXTER, 1988). A eclosão
dos ovos de tambaqui e pirapitinga ocorreu as 15 horas após a fertilização ou
422 horas-grau, já os ovos do híbrido tambatinga eclodiram com 14 horas após
a fertilização ou 394 horas-grau.
LEITE et al. (2013) observaram eclosão das larvas de tambaqui 13:00h
após a fertilização, o equivalente a 357 horas-grau, com temperatura da água
de 27,5°C.
BOTERO et al. (2004) descreveram o desenvolvimento embrionário do
híbrido tambatinga, e encontraram um tempo de eclosão das larvas de 19
horas, à temperatura de 27ºC na incubadora.
OLAERTE et al (2010) observaram eclosão dos ovos de pirapitinga
14:00h após a fertilização, a temperatura de 26.9 ± 0.4oC.
Segundo KUBTIZA (2004) esta variação no período embrionário deve-se
ao fato do desenvolvimento dos teleósteos ser muito sensível às mudanças
ambientais, principalmente temperatura. Assim, o período de desenvolvimento
40
é geralmente menor em temperaturas elevadas do que em temperaturas mais
baixas.
Os estágios observados durante o desenvolvimento embrionário das
espécies e seu híbrido descritos neste trabalho (zigoto, clivagem, mórula,
blástula, gástrula, organogênese e eclosão), foi semelhante à relatada para o
tambaqui (ALBUQUERQUE et al.,1994; LEITE, 2011), pirapitinga (OLAERTE et
al. 2010), para o híbrido tambatinga (BOTERO et al. 2004), e para outras
espécies
da
família
Characidae
(ANDRADE-TALMELLI
et
al.,
2001;
REYNALTE-TATAJE et al., 2004).
Logo após a eclosão as larvas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido
tambatinga apresentaram-se esbranquiçadas, com poucos órgãos formados,
quase sem pigmentos pelo corpo e ainda dependente do vitelo para sua
nutrição. Porém, de acordo com NAKATANI et al. (2001) no primeiro estágio de
desenvolvimento após a eclosão (larval vitelino) várias espécies de peixes
apresentam-se pouco desenvolvidas. Em Characiformes a maioria das larvas
de peixes recém-eclodida não possui boca aberta, intestino, ânus, brânquias,
bexiga natatória, nadadeiras pares, pigmentação e acuidade visual
Segundo BLAXTER (1998) e FUIMAN (2002) o desenvolvimento corporal
das larvas nesse estágio está intimamente relacionado com a estratégia
reprodutiva da espécie. Ou seja, espécies com ovócitos pequenos, geralmente
apresentam curtos períodos de incubação e consequentemente pouco
desenvolvimento corporal.
No decorrer do desenvolvimento larval, alguns pigmentos puntiformes
foram observados ao longo do intestino na região ventral das larvas de
tambaqui, pirapitinga e do híbrido tambatinga. O mesmo foi relatado por
OLIVEIRA et al. (2008) em larvas de piraputanga (Brycon hilarii), sendo
característico, nos indivíduos mais desenvolvidos a presença destes pigmentos
puntiformes enfileirados desde a região terminal do intestino até o pedúnculo
caudal. No entanto as larvas de tambaqui demoraram mais para iniciarem a
pigmentação corporal, sendo a mesma observada somente as 57:00h AE, já
nas larvas de pirapitinga foi observado as 21:00h AE, e as 30:00h AE nas
larvas do híbrido tambatinga.
A abertura da boca e do intestino, e a pigmentação dos olhos observadas
no final do estágio larval vitelínico, são eventos que ocorrem quase que
41
simultaneamente. Segundo OLIVEIRA et al. (2012), a pigmentação dos olhos e
abertura da boca e do intestino estão relacionadas com o início da alimentação
exógena da larva.
42
7 CONCLUSÃO
Não foi observado nenhuma diferença morfológica no desenvolvimento
embrionário e larval do híbrido tambatinga em relação as espécies parentais,
que pudesse ser visualizada em estereomicróscopio.
Apesar dos ovos estarem mantidos em água da mesma temperatura e
fonte de origem, foi observada eclosão em tempos diferentes. Os ovos do
híbrido tambatinga eclodiram com 394 horas-grau, ou 14:00 horas após a
fertilização, e os ovos de tambaqui e pirapitinga eclodiram com 422 horas-grau
ou 15:00 horas após a fertilização.
As larvas recém eclodidas de tambaqui, pirapitinga e do híbrido
tambatinga não apresentaram todos os sistemas orgânicos completamente
formados, limitada a poucos órgãos, e ainda dependente do vitelo para sua
nutrição.
43
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