aula pratica 2 2017 faciplac reformulada

UNIÃO EDUCACIONAL DO PLANALTO CENTRAL
FACULDADES INTEGRADAS DA UNIÃO EDUCACIONAL DO PLANALTO CENTRAL
Aprovadas pela Portaria SESu/MEC Nº 368/2008 de 19/05/2008 (DOU 20/05/2008)
Profa. Dra. Lízia Lenza Campos
Aula Prática 2
Preparações Microscópicas a Fresco e Fixada
I. INTRODUÇÃO
Preparações microscópicas compreendem técnicas
onde espécimes microbianos são colocados sobre
lâminas, possibilitando a observação ao
microscópio. Duas técnicas gerais permitem a
obtenção de material adequado para o exame
microscópico. Uma é a suspensão de
microrganismos em meio líquido onde podem ser
examinados vivos, com o auxílio ou não de
corantes vitais; na outra as células microbianas
são fixadas pelo calor e corados com corantes
químicos específicos. A visualização microscópica
a fresco dos micro-organismos é difícil devido ao
seu reduzido tamanho e índice de refração que se
aproxima ao da água o que os torna praticamente
incolores quando suspensos em meio aquoso.
Apesar da dificuldade de visualização, as
preparações microscópicas a fresco são úteis para
observar viabilidade e atividades celulares como
motilidade e fissão binária, e também observar o
tamanho e a forma natural das células
microbianas, pois as preparações fixadas que
utilizam o calor e a exposição a substâncias
químicas durante a coloração provocam distorções
na morfologia das células. Nesta prática serão
preparadas lâminas a fresco de amostras, contendo
grupos distintos de micro-organismos, tais como
bactérias, algas, protozoários e leveduras. Onde,
poderemos observar a grande diversidade das
células microbianas no tamanho e na forma, bem
como verificar a ocorrência ou não de motilidade.
Nas preparações fixadas, o método de GRAM é
o mais utilizado. A coloração de Gram é a
técnica de coloração diferencial mais importante
e utilizada em bacteriologia. As bactérias coradas
por esta técnica pertencem a duas categorias
distintas: Gram-positivas e Gram-negativas. A
diferença básica entre os dois grupos é resultado
da estrutura de suas paredes celulares.
OBJETIVOS:
 Preparar lâminas a fresco para observação microscópica de algumas amostras de bactérias, leveduras,
protozoários
 Familiarizar os alunos com a técnica de coloração diferencial usando como exemplo a coloração
proposta por Christian Gram;
 Focalizar as preparações;
 Utilizar óleo de imersão;
 Esquematizar as morfologias celulares observadas.
I.
MATERIAIS:
- Microscópios binoculares; Bateria de corantes para coloração de GRAM: Lugol; Cristal
violeta; etanol; fucsina; picetas com água; óleo de imersão; bico de bunsen; Alça de platina;
Descarte de lâminas; material isolado pelos estudantes na aula anterior.
Suspensão de bactérias: E. coli e S.aureus.
Leveduras de fermento de pão em suspensão aquosa, amostras de água estagnada (pode pegar
do curral).
-
Solução de azul de metileno
lâminas, lamínulas e pipetas Pasteur.
II. A - PROCEDIMENTO PARA COLORAÇAO A FRESCO
1. Colocar sobre a lâmina limpa uma gota do material a examinar. Ao observar leveduras colocar antes, sobre a
lâmina, uma gota de azul de metileno (corante vital) e depois uma gota da suspensão de leveduras para
evitar a contaminação do corante com o micro-organismo!
2. Encostando um dos bordos da lamínula na gota
de ar entre a lâmina e lamínula.
deixe-a descer suavemente para evitar a formação de bolhas
3. Focalize conforme procedimento descrito no item
microscópio ótico.
abaixo : Observação de micro-organismos ao
4. Procure campos onde os organismos exibem motilidade, utilizando os parafusos do “charriot”.
5. Observe as diferenças entre os microrganismos focalizados e desenhe-os, considerando tamanho, forma e
coloração.
6. Após a observação descarte a lâmina e lamínula nas bandejas com detergente e desinfetante colocadas na
bancada lateral .
7. Terminada a observação, desligue a luz; gire o revólver para encaixar a objetiva de menor aumento, passando
pela objetiva de 10x; abaixe a platina e retire a lâmina.
Observação de microrganismos ao microscópio ótico
1. Destrave o microscópio, movimentando a TRAVA;
2. Gire o REVÓLVER, encaixando a OBJETIVA de menor aumento (4x);
3. Coloque a lâmina sobre a PLATINA e prenda-a com a presilha (certifique-se de que a lâmina esteja bem
encaixada);
4. Acenda a luz do microscópio;
5. Regule a quantidade de luz com o DIAFRAGMA e abaixando o CONDENSADOR. (Para organismos mais
transparentes diminua a luminosidade regulando a abertura do diafragma e abaixando o condensador);
6. Levante a platina, movimentando o MACROMÉTRICO e o MICROMÉTRICO até o seu ponto máximo;
7. Olhando pela ocular e utilizando o parafuso macrométrico, abaixe lentamente a platina até que o material a
ser observado
possa ser visualizado. Corrigir a
focalização, utilizando somente o parafuso
MICROMÉTRICO;
8. Encaixe a objetiva de 10x e faça o ajuste da focalização com o micrométrico;
9. Observe o material, selecione uma determinada área, e encaixe a objetiva de 40x.
10. Trave o microscópio e ajuste a focalização sempre com o parafuso micrométrico.
ATENÇÃO: Não levante a platina do microscópio (movimentando o macrométrico para frente) com a
objetiva de maior aumento encaixada!!
II.
B- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PARA GRAM:
a) Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada retirar uma gota de suspensão bacteriana;
b) Preparar um esfregaço homogêneo e delgado sobre uma lâmina;
c) Esperar secar e fixar com o calor passando a lâmina, com o lado do esfregaço virado para cima, três
vezes sobre a chama da lamparina;
d) Cobrir
o
esfregaço
com
corante
cristal
e) violeta por 1 minuto;
f) Escorrer o corante e cobrir com solução fixadora lugol por 1 minuto;
g) Escorrer o lugol e lavar com água destilada;
h) Lavar rapidamente com o agente diferenciador etanol (10-15 segundos) e em seguida com água
destilada
i) Cobrir o esfregaço com solulção corante fucsina de Ziehl 1:10 ou safranina por 30 segundos;
j) Lavar com água destilada e secar suavemente com papel higiênico;
k) Observar ao microscópio com aumento de 10, 40 e 100X. Não esquecer de aplicar o óleo de
imersão quando for usar a lente de 100X.
III.
EXERCÍCIOS
a) Qual o princípio da técnica de coloração de gram? Qual o objetivo desta técnica.
b) Qual o motivo para que as bactérias gram negativas tornem-se vermelhas e as gram positivas
tornem-se roxas?
c) Desenhe a morfologia das bactérias visualizadas especificando a cor assumida por elas.
d) Compare as paredes celulares das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
e) Por que algumas células de levedura se colorem de azul e outras permanecem incolores quando
utilizamos o corante vital azul de metileno?
f) Quais são as vantagens e desvantagens da observação de lâminas em preparações a fresco?
IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. NEDER, R.N. Microbiologia: manual de laboratório. São Paulo. Nobel. 1992. 138p.
2. PELCZAR, M., REID, R., CHAN, E.C.S. Microbiologia. São Paulo. Mc Graw-Hill do Brasil, 1980,
v.1. 566p.
V. RESULTADOS
Nome:.....................................................................Nº Matrícula......................Turma.............
Preparações à fresco: Desenhe os campos observados fazendo distinção entre as diversas amostras de
microrganismo, com relação à forma, tamanho, e motilidade.
Leveduras
Água de alface
(bactérias)
Identificação da célula
Aumento
Água de alface
(protozoário)
Exibe Motilidade?
GRAM
VIII. Normas de Segurança
 Use calçados fechados, não use saias ou bermudas. Pessoas que tenham cabelos
longos devem mante-los presos enquanto estiverem no laboratório.
 Usar jaleco de manga longa, luvas e óculo de proteção;
 Não fume, coma ou beba nos laboratório;
 Não retorne reagentes aos frascos originais, mesmo que não tenham sido usados. Evite
circular com eles pelo laboratório
 Não use nenhum equipamento em que não tenha sido treinado ou autorizado a utilizar.
 Caminhe com atenção e nunca corra no laboratório;
 Não leve a mão à boca ou aos olhos quando estiver manuseando produtos químicos;
 Objetos pessoais como bolsas, blusas, e outros, não devem ser guardados em cima das
bancadas;
 Brincadeiras são absolutamente proibidas nos laboratórios;
 As substâncias inflamáveis devem ser manipuladas em locais distantes de fontes de
aquecimentos;
 Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite aquecimento prolongado
ou que desenvolva grande quantidade de energia.
 Siga corretamente o roteiro de aula e não improvise, pois improvisações podem causar
acidentes, use sempre materiais e equipamentos adequados.
 Em caso de acidentes, mantenha a calma e chame o professor ou técnico responsável;
 Não há palavras e nem frases que possam nos manter seguros, há somente
ações.