produção in vitro de embriões bovinos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
CAMPUS JATAÍ
TCCG – GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Markis Suel Moraes Borges
Orientador: Prof. M.Sc. Marco Antônio de Oliveira Viu
JATAÍ
2008
ii
MARKIS SUEL MORAES BORGES
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS
Trabalho de Conclusão de Curso de
Graduação apresentado para a obtenção
do título de Médico Veterinário junto à
Universidade Federal de Goiás, Campus
Jataí.
Área de Concentração:
Reprodução Animal
JATAÍ
2008
iii
MARKIS SUEL MORAES BORGES
Trabalho de conclusão de Curso de graduação defendido e aprovado em 16 de
dezembro de 2008, pela seguinte Banca Examinadora:
Prof. M.Sc. Marco Antônio de Oliveira Viu
Presidente da banca
Prof. M.Sc. Henrique Trevizoli Ferraz
Membro da banca
M.Sc. Dyomar Toledo Lopes
Membro da banca
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a DEUS pelo Dom da Vida e a Sabedoria que
me destes, e pelas forças para enfrentar as dificuldades de cada dia.
Aos meus pais Marzy Borges e Ilceni Moraes, por quem sou
eternamente grato por tudo que fizeram e que fariam se fosse preciso.
Simplesmente não existem palavras para expor tal sentimento.
Aos meus irmãos, Renata e Mário, que sempre estiveram presentes em
todos os momentos e, de uma maneira ou de outra, me apoiaram em todas as
minhas escolhas.
Aos meus familiares que estiveram presentes em bons momentos pelos
quais passei, principalmente minhas avós Adelina (Mocica) e Maria. A todos os
meus tios e primos, Carlos (Tucano), Rodrigo, Fernando, Kleber, Nelimar, Nélio
(Milico), Cesa (in memmorian), minha prima Stephania, Luana, minha querida
sobrinha (Giovanna). Ao meu cunhado Roberto e àqueles que não citei aqui, pois
foram eles que me influenciaram diretamente na escolha da minha profissão.
Aos meus amigos da República Pinga Porca (Peroba, Irapuã, Biba,
Trocin, Tropeço) e da República Overgole (Espiga-Companheiro), Apolo (Zezin),
Taberai, Vespa, Sapin, Digão, Coro e o Porquim, onde passei a maior parte das
minhas folgas, tomando tereré e jogando conversa fora, mas sem beber é claro.
Aos professores que tiveram uma enorme paciência para nos lhe
ensinar durante a minha formação.
Aos meus amigos de sala de aula, com os quais tenho certeza que
posso contar com eles sempre que necessário.
Aos pesquisadores da Embrapa – Cenargen, pelos conhecimentos
passados e, principalmente, ao pesquisador Dr. Roberto Sartori, por me
supervisionar no estágio curricular.
Aos funcionários da fazenda Sucupira, Dona Lia Nita, Teco, Milton,
Expedito, Tim, Zidane, Japão, Weber, Pele, Rambinho, Zezão e Chicão, Urias e
Dona Zerfa, pessoas de coração enorme, pelos momentos de alegria e
aprendizado que tive.
v
Aos mestrados e estagiários da fazenda que me agüentaram no
alojamento com minhas brincadeiras e também por compartilhar seus
conhecimentos.
vi
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO...............................................................................
1
2
DESCRIÇÃO DO CAMPO DE ESTÁGIO......................................
3
3
ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.................................................
5
3. 1
Aspiração folicular intravaginal......................................................
5
3. 2
Obtenção de ovários de abatedouros............................................
6
3. 3
Maturação in vitro (MIV).................................................................
7
3. 4
Fecundação in vitro (FIV)..............................................................
8
3. 5
Cultivo in vitro de embriões...........................................................
10
4
REVISÃ0 DE LITERATURA..........................................................
11
4.1
Produção in vitro de embriões bovinos..........................................
11
4. 1. 1
Etapas da produção in vitro de embriões......................................
12
4. 1. 2
Obtenção de oócitos imaturos para PIV........................................
12
4. 1. 3
Maturação in vitro de oócitos.........................................................
15
4. 1. 4
Fecundação in vitro.......................................................................
21
4. 1. 4. 1
Gradiente de percoll......................................................................
23
4. 1. 5
Cultivo in vitro de embriões...........................................................
24
5
DISCUSSÃO..................................................................................
28
6
CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................
32
REFERÊNCIAS.............................................................................
33
ANEXOS........................................................................................
40
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Vista aérea do prédio da administração e da PIV - Fazenda
Sucupira............................................................................................
Figura 2
4
Aspiração do líquido folicular de ovário bovino oriundo de
abatedouro......................................................................................
6
Figura 3
Tubo cônico contendo líquido folicular aspirado.............................
6
Figura 4
Placa de petri com gotas de meio MIV cobertas com óleo mineral
7
Figura 5
Estufas de Maturação de oócitos e Cultivo embrionário.................
8
Figura 6
Fecundação in vitro de oócitos bovinos..........................................
9
Figura 7
Embriões bovinos produzidos a partir de oócitos maturados,
fecundados e cultivados in vitro........................................................
Figura 8
Figura 9
10
Oócitos de bovinos imaturos, logo após a aspiração dos folículos
ovarianos, apresentando células do cumulus compactas.................
14
Estrutura de um folículo ovariano na espécie bovina......................
15
Figura 10 Ovócitos de bovinos maturos, após 22 horas de maturação in
vitro, apresentando expansão das células do cumulus..................
17
Figura 11 Distribuição dos segmentos do sêmen nas diferentes camadas
de Percoll® após centrifugação........................................................
23
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BBGA
Banco Brasileiro de Germoplasma Animal
BSA
Albumina sérica bovina
CAP
Meio de capacitação
CENARGEN Centro Nacional de Recursos Genéticos
CES
Campo Experimental Sucupira
CT
Centro de treinamento
CCO
Complexo cumulus oophurus
FEC
Meio de fecundação
FISH
Hibridação in situ por fluorescência
FSH
Hormônio folículo estimulante
G
Gauge
IA
Inseminação artificial
IETS
Sociedade Internacional de transferência de embriões
LAV
Meio de lavagem
LH
Hormônio Luteinizante
MIV
Maturação in vitro
OPU
Ovum Pick-up
PBS
Solução fosfato salina tamponada
PHE
Penicilina, hipotaurina e epinefrina
PIV
Produção in vitro de Embriões
SOF
Fluido sintético de oviduto
SFB
Soro fetal bovino
TCM 199
Meio base para cultivo de tecido
VIP
Peptídeo intestinal vasoativo
ZP
Zona pelúcida
ix
ANEXOS
Anexo 1 Meio para maturação de oócitos......................................................... 41
Anexo 2 Gradientes de Percoll.......................................................................... 43
Anexo 3 Meios de capacitação e fecundação................................................... 44
Anexo 4 Meios de Cultivo.................................................................................. 46
1 INTRODUÇÃO
A IA em bovinos foi o primeiro passo para acelerar a transferência de
características desejáveis, permitindo a disseminação de genes de machos
considerados superiores e a melhoria do nível zootécnico dos rebanhos. Um touro
em regime de coleta pode produzir milhares de bezerros durante sua vida
produtiva, enquanto, no mesmo período, uma fêmea não é capaz de produzir
mais do que de oito a dez bezerros. Assim sendo, o possível ganho genético
obtido pela linhagem materna era extremamente limitado. Com o desenvolvimento
de técnicas de reprodução assistida em animais ocorreu um grande avanço na
otimização e multiplicação de fêmeas de interesse não só para a produção
animal, mas também para a conservação e regeneração de espécies animais em
perigo de extinção (DODE & RUMPF, 2002).
A TE proporciona um melhor aproveitamento de matrizes de elevado
mérito genético, podendo aumentar, em média, dez vezes o número de crias por
ano. Com o advento da PIV, esse potencial de multiplicação se torna ainda maior.
A aspiração de oócitos imaturos diretamente dos folículos ovarianos, associada à
maturação, fecundação, e cultivo in vitro destes embriões, permite que sejam
produzidas, em média, 36 crias por ano oriundas de uma única fêmea. Além
disso, somente com o estabelecimento da PIV é que técnicas como a clonagem
por transferência nuclear, a injeção intracitoplasmática de espermatozóides e a
transgenia podem ser aprimoradas e utilizadas (RUMPF et al., 2000).
Embriões produzidos in vitro são aqueles produzidos pela manipulação
de gametas fora do organismo materno. Essa técnica, inicialmente, se resumia à
FIV. Entretanto, após o nascimento do primeiro bezerro, em 1981, foram obtidos
avanços consideráveis (BRACKETT et al., 1982). Atualmente, essa tecnologia se
refere à combinação de vários processos interdependentes, que vão desde a
obtenção dos oócitos imaturos à transferência dos embriões para as fêmeas
receptoras, que levarão a gestação a termo. Essa biotécnica surge como uma
nova opção para a multiplicação animal, não só pelo seu potencial, mas também
porque abre a possibilidade de utilizar em animais jovens, gestantes ou lactantes
e com problemas de infertilidade adquiridos. Sendo que a utilização de bezerras
como doadoras de oócitos em programas de TE oferece um potencial
2
considerável para acelerar o ganho genético pela de redução do intervalo entre
gerações (TANEJA et al., 2000).
Hoje a PIV pode ser considerada uma técnica estabilizada. Estima-se
que mais de 200.000 bezerros tenham nascido a partir dessa técnica, quando
associada à aspiração folicular. Números como 50 bezerros a partir de uma única
doadora são obtidos, relativamente, sem extremas dificuldades (RUMPF, 2007).
Em muitos países a PIV somente é utilizada como última opção para a
obtenção de embriões, quando a recuperação pela lavagem uterina é inviável. No
Brasil, no entanto, a PIV é muitas vezes a primeira opção para a multiplicação de
animais de interesse zootécnico e/ou comercial, e isto certamente tem relação
com predomínio da raça Nelore no plantel nacional (SENEDA et al., 2006), uma
vez que esses animais geralmente possuem maior número de folículos recrutados
por onda. Diante disso é possível observar a importância da técnica na
reprodução do rebanho nacional, principalmente no gado de elite.
3
2 DESCRIÇÃO DO CAMPO DE ESTÁGIO
O
Estágio Supervisionado
Obrigatório do
Curso
de
Medicina
Veterinária da Universidade Federal de Goiás – UFG – foi realizado na EMBRAPA
– CENARGEN (Centro Nacional de Recursos Genéticos), no período de 03 de
junho a 15 de agosto de 2008, perfazendo um total de 480 horas. No decorrer
desse tempo foi possível acompanhar alguns experimentos e inteirar-se da rotina
do CES.
O CES localiza-se entre o Riacho Fundo I e o Recanto das Emas,
dentro do Distrito Federal. A fazenda possui uma área de aproximadamente 1.180
hectares e é constituída de dois laboratórios (Laboratório do Macho e da Fêmea)
onde são desenvolvidos experimentos na área de biotecnologia ligados à
reprodução animal, tais como: produção in vitro de embriões, coleta e
congelamento de sêmen, transferência de embriões, dentre outros.
Em parceria nos estudos, a Embrapa – Cenargen, situada no final da
W3 norte (Plano Piloto – DF), desenvolve outras áreas de pesquisa relacionadas
também à biotecnologia animal, como por exemplo: clonagem animal, biologia
molecular, etc.
O BBGA é uma linha de pesquisa que tem como principal objetivo
preservar raças brasileiras de animais que estão ameaçadas de extinção. Na
espécie bovina encontram-se nessa situação as raças Junqueira, Crioula
Lageana, Curraleira e Pantaneira. Já as raças Piau-Açu, Casco-de-Mula, Tatuí,
Rabo-de-Peixe, Monteiro e Caruncho são exemplares da espécie suína. Os
caprinos das raças Canindé, Mochotó, Repartida, Cabra Azul e Nambi completam
a lista de animais que compõe o BBGA. A biotecnologia neste caso é usada como
uma ferramenta de preservação, ao contrário das outras linhas de pesquisas que,
visam principalmente, o melhoramento genético animal.
O meu estágio curricular obrigatório era supervisionado pelo Dr.
Roberto Sartori Filho pesquisador da EMBRAPA, na área de biotecnologia animal.
Os pesquisadores da Embrapa utilizam as dependências da Fazenda
Sucupira para ministrar aulas práticas, realizar cursos e para desenvolver projetos
de pesquisa através de seus orientados de mestrado e doutorado.
4
FIGURA 1 – Vista aérea do prédio da administração e da PIV - Fazenda
Sucupira/EMBRAPA - CENARGEN
5
3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
O CES possui uma rotina semanal (geralmente de segunda à sextafeira), com carga horária de oito horas por dia. Durante o estágio foram
desenvolvidas diversas atividades no Laboratório do Macho, conhecido também
como CT, e no Laboratório da Fêmea, além do acompanhamento do manejo da
fazenda. Dentre as atividades desenvolvidas no laboratório do macho foram
acompanhadas coleta e congelamento de sêmen bovino, coleta de sêmen em
ovinos,exame/avaliação andrológico em bovinos e ovinos e coleta de embriões.
No laboratório da fêmea pôde-se acompanhar coleta de embriões em bovinos,
inovulação de embriões em vacas, busca e classificação de embriões bovinos,
diagnóstico de gestação por palpação retal e ultra-sonografia, treinamento em
vacas e éguas, coleta de ovários em abatedouros, produção in vitro de embriões,
protocolos de superovulação, sincronização do ciclo estral e avaliação da
dinâmica folicular em vacas e éguas, lavagem e esterilização de materiais.
Dentre as atividades acompanhadas destacaram-se a produção PIV e
TE em bovinos. Durante o estágio foram utilizados oócitos provenientes de
abatedouros, além de algumas vacas pertencentes ao BBGA adaptadas às
condições ambientais e de manejo.
3. 1 Aspiração folicular intravaginal
Antes do início do procedimento de punção, as vacas recebiam três mL
de lidocaína a 2% (Anestésico Pearson®), via epidural, no espaço sacrococcígeo.
O aparelho de aspiração folicular consistiu de um ultra-som portátil (SSD-500,
Aloka Co., Tókio) com uma probe setorial convexa de 5,0 MHz, acoplada em um
suporte vaginal, equipado com uma guia de aspiração. Os complexos cumulus
oophurus (CCO) eram aspirados de todos os folículos visualizados, com auxílio
de uma agulha de aspiração (18 gauge) conectada à uma bomba de vácuo de
fluxo contínuo (3v 001 - WTA®) acoplada a um tubo cônico de 50 mL estéril,
ligado no sistema de vácuo com pressão regulada em < 40 mmHg. A linha de
aspiração era constantemente lavada com o meio de lavagem (LAV) composto de
100 µL de heparina – (Liquemine®), 500 µL de soro fetal bovino (SFB - Nutricell®)
e q.s.p. 50 mL de solução fosfatada tamponada - PBS (Nutricell®) durante toda a
6
aspiração. O conteúdo dos tubos plásticos de 50 mL era passado em filtro
específico (MILLIPORE®). Os CCO`s eram rastreados com auxílio de um
estereomicroscópio e transferidos para uma placa com a solução LAV. Apenas os
CCOs de qualidade I e II foram selecionados seguindo a metodologia proposta
por (GONÇALVES et al., 2002), que utiliza uma escala de I a IV, considerando as
características do cumulus e do citoplasma do oócito.
3. 2 Obtenção de ovários de abatedouros
Os ovários provenientes de abatedouros foram transportados em
soluções de PBS aquecidos a 30-35oC e imediatamente enviados ao Laboratório
de Reprodução Animal do CES, em tempo não superior a duas horas após o
abate. No laboratório, os ovários eram mantidos em banho-maria a 35oC. Os
folículos eram então aspirados com uma agulha acoplada em uma seringa de 20
mL (Figura 2), colocados posteriormente em tubos cônicos de 15 mL (Figura 3).
FIGURA 2 - Aspiração do líquido folicular de ovário bovino oriundo de abatedouro
FIGURA 3 - Tubo cônico contendo líquido folicular aspirado
7
3. 3 Maturação in vitro (MIV)
Os meios utilizados no Laboratório de Reprodução Animal no CES, da
maturação ao cultivo, eram fornecidos pela Nutricell® - Nutrientes Celulares Ltda,
e também formulados pelo próprio Laboratório de Reprodução Animal do
CENARGEN.
O meio de maturação (MIV) utilizado era o meio de cultura de tecidos
TCM 199 (Anexo 1), com sais de Earle suplementado com 10% de SFB, LH, FSH,
L-Glutamina, penicilina e estreptomicina. Os oócitos eram selecionados e
separados em grupos de, no máximo, 35 oócitos por gota, lavados duas vezes no
meio MIV e em seguida colocados para maturarem em outras placas de petri,
sendo posteriormente transferidos para gotas de 150 µL do mesmo meio, coberto
com óleo mineral (AMRESCO®) (Figura 4) previamente estabilizado por duas
horas em incubadora a 39oC e 5% de CO2. (Figura 5).
A maturação se realizava dentro de estufa incubadora com atmosfera
de 5% de CO2 em ar, com uma temperatura de 39oC, durante 24 horas. Após
esse período os oócitos que maturaram eram identificados visualmente pela
expansão das células do cumulus.
FIGURA 4 - Placa de petri com gotas de meio MIV cobertas com óleo mineral Fonte:
SPEGIORIN (2006)
8
FIGURA 5 - Estufas de maturação de oócitos e Cultivo embrionário
3. 4 Fecundação in vitro (FIV)
O laboratório de reprodução animal do CES preconizava o método de
gradiente de percoll para FIV descrito abaixo com seu respectivo protocolo.
Adicionavam-se 300 µL de meio Sp-TALP 10x definido como Percoll
90% (Anexo 2) em ependorfe de 5,0 mL. A seguir o gradiente de percoll é obtido
pela colocação de 1,0 mL de Percoll 90% na parte inferior de um tubo de
centrífuga de 15 mL, logo acima colocava-se o mesmo volume de SP-TALP 1x,
obtendo o Percoll a 45%. O sêmen era depositado sobre o percoll 45%. O
gradiente constituiu de 1,0 mL de percoll 90% sob um mL de percoll 45% (ambos
diluídos em meio de capacitação).
O sêmen era descongelado em banho-maria a 37oC por 30 segundos.
Logo após uma alíquota do sêmen era retirada para avaliação de motilidade
progressiva (quantificada em porcentagem) e vigor (escala de 0 a 5) sendo, após
isso, cuidadosamente depositado no gradiente previamente estabilizado por duas
horas à 39oC e 5% de CO2. O gradiente era então centrifugado a 700 Gauge (G)
por 20 minutos a de 30oC. O “pellet” resultante foi retirado e lavado no meio de
capacitação (CAP). Para essa finalidade o meio mais utilizado é o Fert-TALP
contendo heparina (Anexo 3), sendo novamente centrifugado por mais cinco
minutos a 700G. O sobrenadante era retirado e o novo “pellet” era ressuspendido
9
com meio de fecundação previamente estabilizado. Uma amostra do meio
contendo o sêmen era separada para nova avaliação de motilidade progressiva e
vigor. A concentração espermática era feita com o auxílio de uma câmara de
Newbauer (BOECO®), onde 5,0 µL do meio de fecundação contendo sêmen eram
diluídos em 95 µL de água destilada, formando uma diluição de 1:20.
O FEC era preparado no mesmo dia da FIV, sendo acrescidos de 40
µL de PHE (Penicilamina, Hipotaurina e Epinefrina) e 20 µL heparina para cada
900 µL de meio FEC.
O número de ovócitos por gota de FEC permanecia o mesmo do meio
MIV. Para a fertilização in vitro o sêmen era diluído, com o meio FIV, até alcançar
a concentração de um milhão de espermatozóide vivos/mL. Os oócitos maturados
eram lavados duas vezes no meio de fecundação com auxílio de uma micropipeta
de 20 µL, antes de serem transferidos para a placa de fecundação previamente
estabilizada por duas horas (Figura 6). O volume da gota era de 150 µL sob óleo
mineral. A FIV ocorria dentro da estufa incubadora de 5% de CO2 em ar
atmosférico a 39oC por 24 horas, sendo considerado o dia da fecundação como o
dia zero (D-0).
FIGURA 6 - Fecundação in vitro de oócitos bovinos(adaptado de: DODE & RUMPF,
2002)
10
3. 5 Cultivo in vitro de embriões
Para o cultivo in vitro o meio utilizado foi o SOF, suplementado com
aminoácidos essenciais (glicina, alanina e prolina) e não essenciais (glutamina),
tri-citrato de sódio, myoinositol e 10% de soro fetal bovino (SFB).
Após o período de fecundação, os prováveis zigotos eram lavados três
vezes com meio SOF (Anexo 4) e em seguida eram transferidos para a placa de
cultivo previamente estabilizada por duas horas a 39oC e 5% CO2.
A clivagem iniciava-se com uma série de divisões mitóticas, por meio
das quais o zigoto, que possui uma célula com grande volume, se dividia em
numerosas células nucleadas de menor tamanho, chamadas blastômeros, até a
formação do blastocisto. Os prováveis zigotos permaneciam em cultivo por sete
dias.
A avaliação da clivagem era realizada 48 horas após a inseminação.
Nesse período, encontra-se embriões com duas, quatro e oito células. As
estruturas eram movimentadas com micropipeta fina. Para melhor visualização
retiravam-se as estruturas não clivadas da gota. Os aglomerados de células do
cumulus aderidos à placa eram removidos utilizando o “vortex”. Entre o dia 7 (D-7)
e dia 10 (D-10) para acompanhar o número de mórulas, blastocistos, blastocistos
expandidos e blastocisto eclodido (Figura 7). O índice de blastocisto expandido e
eclodido era indicativo fundamental para determinar a eficácia do sistema de
maturação do oócito, fecundação e desenvolvimento embrionário.
FIGURA 7 - Embriões bovinos produzidos a partir de ovócitos maturados, fecundados e
cultivados in vitro (adaptado de: DODE & MATTOS, 2002)
11
4 REVISÃO DE LITERATURA
4. 1 Produção in vitro de embriões bovinos
O interesse crescente da PIV ocorre, devido a possibilidade de
aumentar rapidamente a produção de uma fêmea, visto que os números de
produtos obtidos supera o de TE. O aprimoramento das condições de cultivo in
vitro bem como das técnicas de recuperação de oócitos in vivo tornaram-se
viáveis à aplicação da PIV em escala comercial desde a década de 90 (RUMPF et
al., 2000).
Atualmente muitos países utilizam a técnica comercialmente. No
entanto é no Brasil que se verifica um número surpreendente de embriões
gerados a partir deste método. Dentre os principais aspectos relacionados a esta
expressiva disseminação da técnica no país, pode-se apontar o domínio da PIV
por laboratórios privados e a crescente valorização da raça Nelore (SENEDA &
BLASCHI, 2004).
A PIV tem sido utilizada, alternativamente, para acelerar a produção de
animais geneticamente superiores, uma vez que permite diminuir o intervalo entre
gerações e impedir, através da aspiração folicular guiada por ultra-som (AFGUS),
o descarte precoce de fêmeas geneticamente privilegiadas que não respondem à
superovulação ou que sejam portadoras de infertilidade adquirida (GONÇALVES
et al, 2002).
No entanto, apesar de muitas pesquisas e estudos, os resultados da
técnica ainda não são muito variáveis de um laboratório para outro, até mesmo
dentro de um mesmo laboratório (GARCIA et al., 2004). A relativa baixa eficiência
da técnica e também a menor qualidade dos embriões produzidos in vitro.
Quando comparados com os produzidos in vivo, são outros fatores limitantes
desta, uma vez que aproximadamente 30% dos oócitos colocados para maturar
se desenvolvem até o estádio de blastocisto (MINGOTI, 2005) e, geralmente,
menos de 50% dos embriões transferidos geram prenhez, isto quando não foram
anteriormente criopreservados, pois nestes casos os resultados são bem
inferiores (DODE et al., 2000).
12
Diante destes aspectos, para obtenção de melhores resultados, muitos
estudos avaliando individualmente cada uma das etapas envolvidas no processo
de PIV tem sido realizados a fim de ajustar, da melhor maneira possível, todas as
suas variáveis envolvidas (MINGOTI, 2005).
Apesar dos avanços obtidos, a PIV ainda apresenta algumas limitações
tais como: os baixos índices de blastocisto, dificuldade na criopreservação dos
embriões, menor viabilidade dos oócitos obtidos de bezerras em relação aos de
vacas e novilhas, e o custo do embrião que é mais alto do que um embrião de TE.
Além disso, bezerros com maior peso ao nascer, período de gestação mais longo,
aumento na incidência de abortos, aumento da mortalidade perinatal e aumento
de anormalidades congênitas tem sido associados a prenhezes produzidas por
transferência de embriões produzidos in vitro (RUMPF, 2007).
4. 1. 1 Etapas da produção in vitro de embriões
A primeira etapa da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos
consiste na obtenção dos oócitos, seja a partir de ovários de animais vivos
(através da aspiração folicular transvaginal) ou através de ovários de animais
abatidos ou ovariectomizados. Em seguida a técnica é desenvolvida em três
etapas, todas interligadas e realizadas em laboratório: a maturação in vitro, a
fertilização in vitro e o cultivo de zigotos in vitro. Esta última etapa é estendida até
os estádios de mórula e blastocisto (geralmente alcançado no sétimo dia pósFIV), quando então os embriões disponíveis poderão ser transferidos ou
criopreservados para estoque (DODE & RUMPF, 2002). A seguir será discutido
todo o processo de produção in vitro de embriões bovinos.
4. 1. 2 Obtenção de oócitos imaturos para PIV
A produção in vitro de embriões bovinos obteve avanços consideráveis
nos últimos anos e está sendo rapidamente incorporada aos meios de produção,
juntamente com a aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-sonografia
Ovum pick up (OPU), favorecendo os programas de melhoramento genético
(ALVES et al., 2001). No entanto, a taxa de desenvolvimento embrionário
13
permanece baixa, em média 20% a 30% dos oócitos maturados chegam até o
estádio de blastocisto (DAYAN et al., 2000).
Devido à dinâmica folicular em novilhas e vacas zebuínas e européias
ser caracterizada pela presença de duas ou três ondas desenvolvimento folicular
(GINTHER et al., 1989; FIGUEIREDO et al., 1997; CASTILHO et al., 2000), é
possível realizar a recuperação de oócitos por via transvaginal durante todo o
ciclo estral, mesmo repetidamente (KRUIP et al., 1994).
Na OPU a obtenção de oócitos é feita pela punção folicular com uma
agulha acoplada a uma sonda transvaginal, de forma que os folículos a serem
puncionados são visualizados na tela do ultra-som. Um sistema de bomba à
vácuo conectado à agulha permite a recuperação dos oócitos e do líquido folicular
para dentro de um tubo coletor. Os oócitos são transportados até o laboratório,
onde se inicia o processo de produção in vitro de embriões. A média de oócitos
viáveis obtidos por coleta in vivo é em torno de oito, entretanto essa média
depende da estratégia adotada. Assim, é possível puncionar os folículos de uma
doadora duas vezes por semana, uma vez por semana ou uma vez a cada duas
semanas, sendo que, nas duas últimas alternativas, é possível dobrar os
resultados mediante a estimulação hormonal (GOODHAND et al., 1999).
Independente da estratégia, o resultado final esperado é de, pelo menos, uma
gestação por semana por doadora (BOUSQUET et al., 2000).
Ovários de abatedouro são a principal fonte de oócitos para serem
utilizados na pesquisa, e são geralmente provenientes de animais sem valor
econômico. A aspiração de oócitos a partir desses ovários, da mesma forma que
no método in vivo, é realizada com uma agulha acoplada a uma bomba a vácuo,
com a qual se aspiram todos os folículos presentes na superfície dos ovários com
diâmetro variando entre 2,0 a 6,0 mm. A média de oócitos recuperados por ovário
está entre seis e dez, sendo que a quantidade e a qualidade dos oócitos obtidos é
influenciada pela época do ano, estado fisiológico do animal e tamanho do folículo
aspirado (DODE & RODOVALHO, 2001). Convém ressaltar, entretanto, que
quando se trabalha com ovários isolados de vacas de elevado mérito genético,
além da punção dos folículos visíveis, pode ser feita a dissecação desses ovários,
maximizando o seu aproveitamento (GONÇALVES et al., 2002).
14
Os ovários que são obtidos de animais de abatedouro normalmente
são transportados até o laboratório dentro de caixas de isopor ou em garrafas
térmicas contendo solução salina a 0,9% de NaCl aquecida a 30-35oC
(GONÇALVES et al., 2002).
Assim como a temperatura de transporte, o tempo decorrido entre a
obtenção dos ovários e o início da colheita também é muito importante. Segundo
GONÇALVES et al. (2002), o tempo entre a obtenção dos ovários e o início da
colheita de até três horas parece não afetar a viabilidade dos oócitos.
A OPU, em geral, não promove danos ao sistema reprodutor feminino,
embora em alguns casos já tenha sido relatada a predominância de tecido
conjuntivo no parênquima ovariano de vacas doadoras que estavam sendo
submetidas a sessões de aspiração quinzenais (RODRIGUES & GARCIA, 2002).
Após
a
recuperação
dos
oócitos,
com
o
auxílio
de
um
estereomicroscópio, faz-se a seleção, levando em consideração o número de
camadas de células do cumulus (Figura 8) e o aspecto do citoplasma do oócito
(GONÇALVES et al., 2002).
FIGURA 8 – Oócitos de bovinos imaturos, logo após a aspiração dos folículos ovarianos,
apresentando células do cumulus compactas (DODE, 2002)
Segundo GONÇALVES et al. (2002), a classificação dos oócitos pode
ser realizada com a escala de um a quatro, sendo, Qualidade 1: Cumulus
compacto, presente, contendo mais de três camadas de células, ooplasma com
granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de
coloração marrom. Qualidade 2: Cumulus compacto, parcialmente presente em
volta do oócito ou rodeando completamente o oócito, com menos de três
15
camadas celulares, ooplasma com granulações distribuídas heterogeneamente,
podendo estar mais concentradas no centro e mais claras na periferia ou
condensadas em um só local aparentando uma mancha escura. O ooplasma
preenche o espaço do interior da zona pelúcida. Qualidade 3: Cumulus presente,
mas expandido, ooplasma contraído com espaço entre a membrana celular e a
zona pelúcida, preenchendo irregularmente o espaço perivitelínico, degenerando,
vacuolizando ou fragmentando. Qualidade 4: oócito desnudo (sem cumulus).
4. 1. 3 Maturação in vitro de oócitos
Os oócitos, assim que retirados dos folículos ovarianos, não se
encontram ainda aptos para sofrerem fecundação normal e desenvolvimento
embrionário inicial, sendo necessário passarem por uma série de modificações
estruturais e bioquímicas no núcleo (maturação nuclear) e citoplasma (maturação
citoplástica) para adquirirem tais capacidades, que em seu conjunto são
denominadas de maturação oocitária (GONÇALVES et al., 2002).
Os oócitos encontram-se no interior de folículos ovarianos conforme a
(Figura 9) e são formados em ovários de fêmeas mamíferas durante a vida fetal.
A população destes folículos ovarianos é muito vasta em todos os mamíferos e foi
estimada em 130.000 para bovinos de raça européia e 70.500 para zebuínos.
FIGURA 9 - Estrutura de um folículo ovariano na espécie bovina
16
Durante a ovogênese os oócitos de mamíferos permanecem retidos no
estádio de diplóteno da prófase da primeira divisão meiótica, desde a vida fetal
até pouco antes da ovulação. A retomada da meiose pode ser mediada por um
estímulo hormonal in vivo que tem início após o pico pré-ovulatório de LH durante
o estro. Porém, a simples retirada do oócito do contato com as células foliculares
já é suficiente para que haja um reinício do processo de maturação nuclear.
Portanto, quando os oócitos são aspirados dos folículos ovarianos (normalmente
entre 2,0 e 6,0 mm de diâmetro) para serem utilizados na PIV, eles ainda são
imaturos e necessitam sofrer o processo de MIV. Essa é realizada cultivando os
oócitos, logo após a aspiração do folículo, em meio de maturação, com
temperatura e atmosfera apropriada, por um período de 22 a 24 horas (DODE &
RUMPF, 2002).
A maturação envolve mudanças nucleares e citoplasmáticas que
devem ocorrer simultaneamente e que conferem aos oócitos a capacidade de
serem fecundados, descondensarem a cabeça do espermatozóide, formar os prónúcleos e terem desenvolvimento embrionário normal (DODE et al., 2000).
Os
eventos
nucleares
envolvem
reorganização
da
rede
de
microtúbulos, rompimento do envoltório nuclear, condensação dos cromossomos
e progressão para metáfase I, anáfase I, telófase I, expulsão do primeiro
corpúsculo polar e retenção no estádio de metáfase II (CHA & CHIAN, 1998).
No que se refere ao citoplasma, ocorre reprogramação na síntese
protéica, mudança na atividade da proteína quinase ativada por mitógenos
(MAPK) e do fator promotor da maturação (MPF), bem como no desenvolvimento
dos mecanismos de liberação de Ca++, e aquisição da capacidade de
descondensar a cabeça do espermatozóide (SALAMONE et al., 2001). Ainda
durante esse período, ocorrem mudanças na organização citoplasmática, tais
como um contínuo desenvolvimento dos estoques de lipídios, redução do
aparelho de Golgi, aparecimento de vários ribossomos adjacentes aos
cromossomos, rearranjo das mitocôndrias e alinhamento dos grânulos corticais
próximos à membrana plasmática (DIELEMAN et al., 2002). O aumento no
estoque de lipídios pode estar associado à formação de um pool de energia
essencial para o oócito suportar o desenvolvimento após a fecundação.
17
Outro evento que ocorre na maturação é a expansão das células do
cumulus
que
circundam
os
oócitos.
Essas
são
células
da
granulosa
especializadas, que estão metabolicamente associadas entre si e com o oócito.
Projeções celulares das células do cumulus atravessam a zona pelúcida e
formam pequenas junções com o oócito (gap). Essas junções são a única entrada
de substâncias ou estímulos no plasma. No oócito imaturo (Figura 8) elas estão
muito compactadas e, durante a maturação, iniciam a secreção de ácido
hialurônico, que se deposita entre elas separando-as e causando a expansão
dessas células (Figura 10).
Figura 10 – Ovócitos de bovinos maturos, após 22 horas de maturação in vitro,
apresentando expansão das células do cumulus (adaptado de: DODE et
al., 2002)
A ligação metabólica vai diminuindo gradativamente à medida que a
expansão aumenta (WARSSAMAN & ALBERTINI, 1994), sugerindo que a
presença dessas células seriam essenciais no período inicial da maturação
(DODE et al., 2000).
A maturação representa o estádio final da preparação do oócito para a
fecundação, portanto as mudanças estruturais e bioquímicas que ocorrem durante
esse período são necessárias para que esse processo seja completo. Entretanto,
para que isso ocorra, o oócito precisa ter competência meiótica, que é adquirida
progressivamente durante a fase final do crescimento oocitário. Essa competência
se refere à capacidade do oócito de completar a divisão meiótica, descondensar a
cabeça do espermatozóide, formar os pró-núcleos e suportar o desenvolvimento
embrionário
subsequente
(WARSSAMAN
&
ALBERTINI,
1994).
Oócitos
18
competentes necessitam ter estocado fatores importantes, na forma de proteínas
ou mRNA estável, que deverão ser utilizados durante a maturação, fecundação e
início do desenvolvimento embrionário (CHA & CHIAN, 1998).
Tendo em vista que os oócitos maturados in vitro, quando comparados
aos in vivo, apresentam menores taxas de blastocisto após a fecundação e o
cultivo in vitro (TAKAGI et al., 2001), pode-se supor que a maturação ainda
continua sendo um problema na PIV. Sendo que, vários fatores podem afetar o
sucesso da maturação oocitária, entre eles podemos citar a morfologia do
complexo cumulus oócitos (CCOs), as condições de maturação e a competência
do oócito (GONÇALVES et al., 2002).
A morfologia dos CCOs tem sido correlacionada com as taxas de
blastocistos, a redistribuição das mitocôndrias e o conteúdo de ATP dos oócitos,
os quais diferem entre os considerados morfologicamente bons e ruins. Nos
oócitos imaturos morfologicamente superiores, as mitocôndrias aparecem
distribuídas de forma uniforme na periferia do citoplasma. Após a maturação,
aparecem como grupos maiores localizados não só na periferia, mas também na
porção mais central do citoplasma, o que não ocorre nos oócitos considerados
inferiores (STOJKOVIC et al., 2001). Da mesma forma, o conteúdo de ATP em
oócitos imaturos é maior nos morfologicamente superiores, havendo uma
correlação positiva entre a concentração de ATP do oócito e o número total de
células dos embriões produzidos. Esses fatores, entre outros, podem ser
responsáveis pela diferença na capacidade de desenvolvimento desses oócitos
(DODE & ADONA, 2001).
Além das características morfológicas, as condições de cultivo afetam
drasticamente a maturação. A presença de hormônios, substâncias antioxidantes,
fatores de crescimento, temperatura e atmosfera gasosa, são alguns fatores que
têm sido relatados como responsáveis por muitos dos problemas que ocorrem
durante a maturação (CHA & CHIAN, 1998).
Em bovinos, o crescimento do oócito está completo quando os folículos
atingem em torno de 2,0 mm de diâmetro e, nesse estádio, alguns oócitos já
estão competentes para se desenvolver in vitro. No entanto, no processo de MIV,
os oócitos possuem apenas 24 horas para finalizar todo seu processo de
maturação e são provenientes de folículos de 2,0 a 6,0 mm. Se compararmos
19
com a situação in vivo, folículos desse diâmetro levariam alguns dias até
chegarem ao estádio pré-ovulatório. Portanto, esse período que corresponde ao
de dominância folicular, é eliminado no cultivo in vitro. É possível que os vários
processos, pelos quais os oócitos passam durante esse período, possam afetar a
competência dos oócitos utilizados para PIV, já que nesses, o período final da
foliculogênese não ocorre (DODE & ADONA, 2001; DIELEMAN et al., 2002).
Visando superar essa situação várias tentativas têm sido feitas, utilizando agentes
fisiológicos e farmacológicos para reter os oócitos imaturos em meiose (DODE et
al., 1999; ADONA et al., 2000). Essa retenção do núcleo, por um determinado
período antes da retomada da meiose daria aos oócitos uma maior oportunidade
para que as mudanças citoplasmáticas necessárias à maturação pudessem
ocorrer. Entretanto, até o momento, nenhuma melhora na produção de embriões
tem sido obtida quando os oócitos são retidos até 24 horas após a aspiração
(DODE & ADONA, 2001).
Mesmo após a rigorosa seleção de oócitos e o uso de condições de
cultivo adequadas, a taxa de produção de embriões viáveis ainda é o dobro em
oócitos maturados in vivo quando comparados com os maturados in vitro (VAN de
LEEMPUT et al., 1999). Portanto, o folículo de origem parece ser vital para
conferir aos oócitos o ambiente necessário para atingir a completa competência
para o desenvolvimento. Essa hipótese foi confirmada por BLONDIN et al. (2002),
que utilizaram diferentes protocolos hormonais antes da OPU e obtiveram oócitos
mais competentes, aumentando o número de embriões produzidos na PIV.
Uma grande variedade de meios tem sido utilizada para maturação in
vitro de oócitos, todavia a maioria das equipes utilizam como meio base o TCM
199 com sais de EARLE. Esse meio é modificado conforme a rotina de cada
laboratório. Geralmente é adicionada L-glutamina, bicarbonato de sódio, HEPES,
piruvato de sódio e hormônios. Em relação aos hormônios, é usual a utilização do
LH ou do FSH ou ainda a combinação dessas gonadotrofinas. Há controvérsias
quanto à real necessidade desses hormônios e quanto às concentrações a serem
utilizadas, porém a maioria dos resultados demonstram que a adição de
gonadotrofinas ao meio de maturação de oócitos aumenta a capacidade de
fecundação e melhora o posterior desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et
al., 2002). O fluido sintético de oviduto (SOF) também pode ser utilizado na
20
maturação in vitro (MIV), porém seu uso é mais preconizado para cultivo
embrionário.
Modificações
desse meio dependem
dos
protocolos de
cada
laboratório, que pode ser uma suplementação com fonte energética (glicose e
piruvato), fonte protéica, soro fetal bovino (SFB) (DODE & RODOVALHO, 2002).
O processo de maturação in vitro de oócitos bovinos pode ser feito com TCM 199
ou com meio Ham's F10. Entretanto, esses meios sem suplementação não
suportam
altos
níveis
de
maturação
oocitária,
necessitando
de
uma
suplementação com soro. O uso do soro nos meios de maturação aumenta a
concentração
protéica
e
de
fatores
de
crescimento,
que
previnem
o
endurecimento da zona pelúcida, aumentando assim a capacidade de fecundação
dos oócitos, tendo sido utilizado na proporção de 10% a 20% do volume total do
meio (GONÇALVES et al., 2002).
As células do cumulus possuem um papel essencial nas primeiras
horas de maturação (MERTON et al., 2003) e protegem o oócito de estresse
oxidativo durante este processo (YUAN et al., 2003). As células do cumulus estão
intimamente ligadas ao oócito. Durante a fase de maturação, são secretados
hormônios endógenos e fatores promotores produzidos pelo oócito que estimulam
a síntese de ácido hialurônico pelas células do cumulus, induzindo a sua
expansão (GONÇALVES et al., 2002).
Alguns fatores de crescimento foram relatados como responsáveis no
incremento da produção de embriões bovinos, tais como o peptídeo intestinal
vasoativo (VIP), devido ao retardamento da maturação citoplasmática sem alterar
a maturação nuclear (BEKER et al., 2000); fator de crescimento de epiderme
(EGF), dentre outros (VAN de LEEMPUT et al., 1999).
Para se obter sucesso na maturação de oócitos é necessário também
que o meio esteja com o pH, a osmolaridade e a composição iônica adequada; a
temperatura da estufa de maturação devem estar ideal (38,5 a 39oC); e a tensão
de CO2 e O2, importantes para que a maturação ocorra com sucesso
(GONÇALVES et al., 2002).
Uma das grandes diferenças entre o ambiente in vivo e o in vitro é a
tensão de oxigênio, visto que a tensão de oxigênio no oviduto e no útero é menor
do que a utilizada nos sistemas de cultivo embrionário in vitro (VAN SOOM et al.,
21
2002). Tem sido demonstrado que a diminuição na tensão de oxigênio de 20%
para 5% aumenta a taxa de desenvolvimento embrionário in vitro em várias
espécies (TAKASHI et al., 2001). A mistura gasosa mais utilizada em meios
definidos sem soro e sem células é 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2
(GONÇALVES et al., 2002).
4. 1. 4 Fecundação in vitro
Para a FIV espermatozóides e oócitos maturos são co-incubados em
um meio específico, por um período de cerca de 18 horas, sendo possível coincubar por períodos menores sem afetar as taxas de produção de embriões
(DODE & RODOVALHO, 2002).
Para que a FIV ocorra com sucesso é necessário que os oócitos
tenham sofrido uma maturação completa e que os espermatozóides tenham sido
adequadamente preparados (DODE & RODOVALHO, 2000).
As técnicas mais utilizadas para separação de espermatozóides vivos
dos demais componentes do sêmen e dos crioprotetores são o swing-up, o
gradiente percoll e o lavado espermático. A técnica ideal para separação
espermática deve ser rápida, simples, de baixo custo, capaz de recuperar a
maioria dos espermatozóides móveis, não resultar em alterações espermáticas,
remover espermatozóides mortos e outras células, incluindo microorganismos,
remover substâncias tóxicas e bioativas, permitir o processamento de grandes
volumes de sêmen, além de permitir o controle da concentração e volume final da
suspensão (GONÇALVES et al., 2002).
Além do método utilizado para preparação do sêmen e do tempo de coincubação, outros fatores podem afetar a taxa de fecundação tais como, a dose
inseminante, a interação touro-vaca e a diferença entre touros na capacidade de
fecundar e produzir embriões. A variação individual de touros é um dos principais
fatores que interferem na FIV e na produção de embriões. Portanto, é necessário
testar os touros antes de seu uso na FIV de oócitos de diferentes doadoras
(WATANABE et al., 1999).
O processo de fecundação do oócito envolve uma cascata bioquímica
complexa, que começa no aumento da motilidade do espermatozóide, que deve
22
sofrer capacitação, reconhecer receptores na zona pelúcida do oócito, sofrer
reação acrossômica, ligar-se na membrana plasmática do oócito e, finalmente,
incorporar-se ao citoplasma (DODE & RODOVALHO, 2002).
A capacitação espermática esta relacionada com uma remoção gradual
e alteração de glicoproteínas periféricas, redução nos níveis de colesterol e
mudanças na distribuição e composição de certos fosfolipídeos de membrana.
Essas alterações culminam em uma exposição de fatores responsáveis pela
interação do espermatozóide com receptores do oócito. O espermatozóide
capacitado e com o acrossoma intacto consegue atravessar pelas células do
cumulus oophorus, porém não passa pela zona pelúcida do oócito. Por esse
motivo, GORDON (1994) relatou que a reação acrossômica é imprescindível para
a passagem do gameta masculino pela zona pelúcida. Consequentemente uma
cascata de eventos culmina o aumento intracelular de cálcio. Esse aumento é
responsável por ativar substâncias fusogênicas, além de agir em fosfolipídeos de
membrana, localizado na cabeça do espermatozóide. Após a fusão e a
incorporação do gameta masculino no oócito, grânulos corticais são liberados
dentro do espaço perivitelínico. Essa desgranulação resulta em uma extensa
reorganização da zona pelúcida e/ou superfície vitelínica, conhecida como reação
cortical. A reação cortical provoca um endurecimento da zona pelúcida através de
liberação de enzimas, que também são responsáveis pela inativação de
receptores espermáticos (ZP3), evitando assim a polispermia (DODE, 2002;
HAFEZ & HAFEZ, 2004).
Algumas glicosaminoglicanas presentes no trato genital feminino são
responsáveis pela indução e a capacitação espermática in vivo. Nos processos in
vitro, a heparina tem exercido o mesmo papel em bovinos. Antes de co-cultivar
oócitos e espermatozóides em meio de fertilização, o sêmen do touro deve ser
preparado por técnicas que permitem a separação dos espermatozóides vivos
dos demais componentes do sêmen e seus crioprotetores (GONÇALVES et al.,
2002).
23
4. 1. 4. 1 Gradiente de percoll
A seleção espermática pelo percoll, o sêmen é centrifugado através da
passagem
por
diferentes
gradientes
para
permitir
a
separação
dos
espermatozóides vivos dos mortos e demais constituintes do sêmen. A
composição do percoll baseia-se em partículas de sílica coloidal cobertos por
polivinilpirrolidona, preparado em diferentes concentrações para formar um
gradiente necessário de separação espermática (GONÇALVES et al., 2002).
Após a maturação dos oócitos e separação dos espermatozóides
viáveis (Figura 11), é necessário propiciar um ambiente adequado para que
ocorra a capacitação e fecundação. Com esse intuito diversos componentes são
adicionados ao meio de fecundação, como a heparina e PHE (penicilamina,
hipotaurina e epinefrina), pois ajudam na capacitação, incrementam a atividade
espermática e aumentam os índices de fecundação. Outro fator que interfere na
taxa de fecundação é o tempo de co-cultivo que varia de 18 a 22 horas
(GONÇALVES et al., 2002)
FIGURA 11 – Distribuição dos segmentos do sêmen nas diferentes camadas de Percoll®
após centrifugação (adaptado de: GONÇALVES et al., 2008)
O espermatozóide, ao penetrar a membrana do ovócito, estimula o
mesmo a completar a meiose, expelindo o segundo corpúsculo polar para dentro
do espaço perivitelínico. Os cromossomos maternos (haplóides) são englobados
por um pró-núcleo. O envelope nuclear do espermatozóide desintegra-se após a
fusão com a membrana plasmática do ovócito, descondensado assim a sua
24
cromatina. Ocorre a formação de um novo envelope nuclear dentro do citoplasma
do ovócito, formando o pró-núcleo masculino (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Ao final
da junção dos pró-núcleos masculinos e femininos, fenômeno intitulado de
singamia, o zigoto é formado com um novo arranjo citoplasmático e inicia-se uma
série de divisões mitóticas, até a formação do blastocisto (GONÇALVES et al.,
2002).
4. 1. 5 Cultivo in vitro de embriões
O cultivo embrionário, realizado logo após o período de FIV é
fundamental para o sucesso na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. O
sistema empregado nessa etapa deve proporcionar condições adequadas para as
primeiras
clivagens,
ativação
do
genoma
embrionário
e
consequente
desenvolvimento até o estádio de blastocisto nos programas comerciais ou de
pesquisa, visando a transferência para as receptoras. Atualmente, diversos
sistemas vêm sendo empregados com sucesso, todos eles tentando mimetizar ao
máximo as condições uterinas. No entanto, a tuba uterina e o útero apresentam
várias alterações no decorrer do desenvolvimento embrionário, o que os torna um
sistema muito complexo e de difícil reprodução in vitro (DODE et al., 1999).
Após a fecundação in vitro, os embriões são transferidos para o cultivo
embrionário onde permanecem por um período de sete dias, até atingirem o
estágio de blastocisto, quando, então, podem ser transferidos para o útero de
fêmeas receptoras que levarão a gestação a termo (DODE & RUMPF, 2002).
O cultivo in vitro de embriões requer um sistema que suporte um alto
desenvolvimento embrionário. O co-cultivo com células somáticas era essencial
para se obter taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário. Entretanto, com o
desenvolvimento do meio SOF, que foi criado baseado na constituição do fluído
do oviduto de bovinos, foi eliminada a necessidade de co-cultivo, visto que, nesse
meio, os zigotos se desenvolvem com boas taxas sem a presença de células
somáticas (WATSON, 2000). Esse meio, contudo, requer uma atmosfera de 5%
de O2, a qual difere da utilizada para a MIV e FIV. Estudos têm demonstrado,
entretanto, que o meio SOF pode ser utilizado com alta tensão de oxigênio, desde
que as células do cumulus remanescentes no zigoto após a FIV sejam mantidas
25
DODE & MATTOS (2002). Esses resultados sugerem que as células do cumulus
facilitariam o crescimento embrionário por retirarem substâncias tóxicas,
diminuindo o estresse oxidativo. Condições de cultivo in vitro normalmente
aumentam a produção de radicais livres, pois os embriões estão mais expostos à
luz e a altas concentrações de O2, afetando a taxa de desenvolvimento
embrionário. Comparando os embriões produzidos in vitro e os produzidos in vivo,
foi observado que eles diferem em várias características, tais como, aspectos
morfológicos, aspectos metabólicos, alterações cromossômicas, número de
células e expressão de mRNA específicos (VANSOOM et al., 1996; VIUFF et al.,
1999, 2000). Estas diferenças possivelmente determinam o começo de uma série
de problemas que levam a uma redução na eficiência da técnica (FARIN et al.,
2001). Os embriões PIV apresentam maior vacuolização, menores número de
células, menor densidade de mitocôndrias, maior densidade de lipídios
(CROSIER et al., 2001) e junções incompletas entre as células do botão
embrionário e do trofoblasto (FARIN et al., 2001). A maior densidade de lipídios
observada nesses embriões sugere que eles retiram mais lipídios do meio de
cultivo ou que seu metabolismo estaria alterado. Em estudo utilizando a técnica
de hibridação in situ por fluorescência (FISH) para avaliar poliploidias, foi
observado que 72% dos embriões produzidos in vitro eram mixoplóides e que,
apesar da mixopolidia ocorrer também em embriões in vivo, nos in vitro ocorre
com maior frequência e em estágios mais precoces do desenvolvimento (VIUFF
et al., 1999). Além disso, a poliploida somente foi observada nos in vitro e não nos
in vivo (VIUFF et al., 2000, 2001).
Muitos desses problemas são devidos ao processo de maturação, mas
que se manifestam no desenvolvimento embrionário, visto que o número de
células e as alterações cromossômicas, por exemplo, são diferentes quando os
embriões PIV são produzidos a partir de ovócitos maturados in vivo e in vitro
(VANSOOM et al., 1996; VIUFF et al., 2000; VIFF et al., 2001).
Na PIV cerca de 30% a 50% dos ovócitos inseminados chegam ao
estágio de blastocisto e os índices de gestação estão em torno de 35 % (DAYAN
et al., 2000). As maiores perdas no desenvolvimento embrionário ocorrem nos
estádios de oito para 16 células (ativação do genoma do embrião) e póstransferência, em torno dos dias 14 e 15 da gestação. Quando embriões PIV ou in
26
vivo foram transferidos no sétimo dia pós-inseminação e recuperados no dia 17
da gestação, foi observado que a degeneração e a perda embrionária foram
maiores nos embriões PIV (FARIN et al., 2001). Esse período coincide com o
reconhecimento materno da prenhez, o qual depende de um sinal enviado pelo
embrião, a produção de interferon tau (INFτ) ao organismo materno. De fato tem
sido demonstrado que embriões PIV secretam quantidades menores de INFτ do
que os in vivo, sendo que quanto pior a qualidade morfológica do embrião menor
a secreção (STOJKOVIC et al., 1999).
Além do sistema de cultivo usual, outros métodos estão sendo
propostos com vistas a aumentar as taxas de produção de blastocisto e os índices
de gestação. Entre eles pode-se citar o sistema de meio sequencial, em que é
realizado uma perfusão para introduzir mudanças na composição do meio de
cultivo. Essas mudanças são determinadas de acordo com as mudanças nos
requerimentos dos embriões em diferentes estádios de desenvolvimento
(THOMPSON, 1995). O cultivo em micro-câmara usando um sistema microfluídico
proporciona um ambiente mais próximo do sistema in vivo, do que do sistema
estático de micro-gotas. Além disso permite a utilização de meio sequencial com
mudança gradual sem movimentar os embriões (BEEBE et al., 2002).
O oviduto é o local onde ocorre a fecundação, e é também onde iniciase o desenvolvimento embrionário. Essa porção do trato reprodutivo tem sido
usada com sucesso na produção in vitro de embriões de várias espécies. Tanto
que, inicialmente, o cultivo de embriões totalmente in vitro só foi possível com a
utilização de um sistema de co-cultivo com células do oviduto. Posteriormente,
GORDON (1994) mostrou que era possível o uso de diversos tipos de células
somáticas, pois elas também são capazes de proporcionar um ambiente onde os
embriões possam se desenvolver até o estádio de blastocisto. As principais
células somáticas empregadas no sistema de co-cultivo de embriões, além das
células do oviduto, são: células de rim de macaco (VERO), células do cumulus
oophorus e células da granulosa (GONÇALVES et al., 2002).
Acredita-se que o mecanismo benéfico da presença das células e/ou
das proteínas do soro seria a retirada de substâncias embriotóxicas do meio de
cultivo, tais como os radicais livres, íons de amônia, dentre outros; além de terem
a capacidade de produzir fatores embriotróficos, auxiliando no desenvolvimento
27
dos embriões. Outra vantagem é a proteção contra o estresse oxidativo
provocado pela condição de cultivo (FATEHI et al., 2005). Entretanto, a falta de
controle dos fatores produzidos pelas células utilizadas e os diferentes níveis de
liberação desses fatores (dependendo da fase celular), tornam o meio de cultivo
indefinido, causando, dessa maneira, uma inconstância nos resultados.
Em níveis atmosféricos o oxigênio é tóxico para a maioria dos tipos
celulares por aumentar a formação de radicais livres. Os embriões in vivo são
protegidos dos radicais livres pelo fluido do oviduto, o que não ocorre no sistema
in vitro. O estresse oxidativo proveniente de uma alta tensão de oxigênio (20%)
causa retardo no desenvolvimento dos embriões em sistemas de cultivos
convencionais, devido à produção de peróxido de hidrogênio, que lesiona o DNA
da célula, como relataram TAKAHASHI et al. (2000).
Os embriões são capazes de se desenvolver em diferentes meios de
cultivo, desde simples soluções de sais balanceadas até sistemas complexos,
envolvendo co-cultivo e soro. O TCM 199 é um meio de cultivo complexo
desenvolvido para o cultivo celular em geral, enquanto que o SOF (fluido sintético
de oviduto) é classificado como um meio simples, desenvolvido e direcionado
para a produção de embriões (GONÇALVES et al., 2002). WRENZYCKI et al.
(2001) utilizaram os dois meios para cultivo embrionário em bovinos e não
encontraram diferenças nas taxas de clivagem, produção de mórulas e
blastocistos, porém sugeriram que o uso do SOF proporciona um ambiente mais
adequado, pois existem diferenças no padrão de expressão de genes
relacionados à pré-implantação de embriões.
Os componentes que fazem parte do meio de cultivo interferem na
produção e qualidade embrionária. Substâncias como lactato e piruvato são
essenciais durante a fase de clivagem e desenvolvimento inicial do embrião. A
glicose, na presença de fosfato, atrasa ou para o desenvolvimento embrionário
inicial; porém esse carboidrato é fundamental na fase de compactação e de
blastocisto, (PEREIRA, 2005).
28
5 DISCUSSÃO
O protocolo seguido pelo CES não seguia a metodologia proposta por
GONÇALVES et al. (2002), que preconizam o transporte de ovários em solução
salina a 0,9% de NaCl aquecida à 30-350C. Outros autores (BASSO et al., 2006;
CASTILHO et al., 2007) transportaram ovários com temperatura de 30oC em
solução fisiológica de NaCl a 0,9% adicionada com antibióticos à base de
penicilina e estreptomicina.
Quanto ao tempo de transporte o protocolo do CES obedecia ao que foi
preconizado por GONÇALVES et al. (2002), sendo que o tempo transcorrido entre
a coleta e a manipulação não excedia quatro horas.
No laboratório optava-se por utilizar meios com hormônios na sua
composição como o FSH e LH. Procedimento respaldado por YANG et al. (1993),
que demonstraram-se que a adição de gonadotrofinas e estradiol ao meio de
maturação melhorou tanto a capacidade fecundante como a competência de
desenvolvimento dos oócitos bovinos. Corroborando com tais achados, ALVES et
al. (2001), sugeriram que as concentrações de FSH interferiram na maturação
nuclear, mas que não exerceram influência sobre a clivagem. Porém embriões
provenientes de oócitos que no seu processo de maturação receberam qualquer
concentração de FSH desenvolveram-se normalmente até os diferentes estádios
de blastocisto. Entretanto FUKUI et al. (1989) relataram que a suplementação
hormonal não surtiu efeito positivo. DODE & MATTOS (2002), Provavelmente as
doses hormonais e as condições de cultura (tipo de soro e temperatura) sejam os
fatores que mais contribuíram para essas contradições.
Dentre os fatores que influenciam o desenvolvimento oocitário e
embrionário estão o tamanho dos folículos dos quais são recuperados os oócitos.
No CES os oócitos eram recuperados apenas de folículos menores que 4,0
milímetros, procedimento que encontra respaldo no trabalho de FUKUI &
SAKUMA (1980), no qual sugerem que oócitos recuperados de folículos de menor
diâmetro (≤ 4,0 mm) possuíam qualidade superior aos de maior diâmetro (> 4,0
mm). Em outro estudo estes mesmos autores observaram que oócitos bovinos
com células do cumulus exibindo sinais médios de atresia tiveram taxas maiores
de desenvolvimento embrionário que oócitos sem sinais de atresia e a
29
competência para o desenvolvimento embrionário in vitro somente era afetada por
altos níveis de atresia (BLONDIN & SIRARD, 1995). Entretanto, CAROLAN et al.
(1996) não observaram influência do diâmetro folicular sobre a maturação do
oócito. Resultado similar foi observado por SENEDA et al. (2001) estudando
oócitos oriundos de folículos pequenos (< 4,0 mm) e grandes (> 4,0 mm)
aspirados in vivo. Segundo BASSO et al. (2006), não há efeito do diâmetro
folicular sobre a qualidade dos oócitos. Um estudo realizado por HAGEMANN
(1999) sugeriu não existir diferença significativa na taxa de blastocisto entre
oócitos obtidos de folículos 3,0 a 5,0 ou 6,0 a 8,0 mm, mas a taxa de
desenvolvimento foi significativamente maior em oócitos de folículos dominantes
(> 13,0 mm) durante a fase de crescimento. Este resultado é corroborado por
CASTILHO et al. (2007), que citaram que os oócitos obtidos de folículos maiores
resultaram em melhores taxas de clivagem. Por outro lado, segundo estes
mesmos autores, o diâmetro folicular não influenciou a taxa de blastocisto, mas
houve interação diâmetro versus fase de desenvolvimento folicular, isto é, oócitos
oriundos de folículos pequenos têm melhor competência no início da onda e
oócitos de folículos maiores melhoram seu desenvolvimento com o avanço da
onda. A fase de desenvolvimento folicular influenciou a qualidade dos oócitos e a
taxa de desenvolvimento embrionário, independente do diâmetro do folículo,
sendo o início da onda o melhor momento para a aspiração.
Durante a rotina do Laboratório de Reprodução Animal do CES sempre
eram utilizados dois diferentes meios em quaisquer etapas da produção in vitro.
Um meio era da Nutricell®, e outro meio era do Laboratório de Reprodução Animal
do (CENARGEN), com a finalidade de compararem taxas de clivagem, e também
taxas de blastocisto expandido.
Alguns estudos têm mostrado que a presença de soro no cultivo pode
ter um efeito duplo, inibindo as clivagens iniciais e, posteriormente, aumentando a
velocidade de desenvolvimento do embrião até o estágio de blastocisto (RIZOS et
al., 2002; RIZOS et al., 2003). Nestes estudos foram avaliadas a produção de
embriões na presença de soro fetal (10%) e albumina sérica bovina (BSA) em
duas concentrações (3% e 16%) e não encontraram diferença na taxa de
clivagem entre os grupos, porém em D-6 houve maior produção de blastocisto na
presença de soro, comparando com a BSA, demonstrando o efeito do soro em
30
acelerar o desenvolvimento embrionário. Resultado similar também foi obtido por
WRENZYCKI et al., (2001), que utilizaram meio suplementado com soro fetal,
BSA, ou PVA e também não encontraram diferenças na taxa de clivagem, porém
a produção de mórulas e blastocisto foi significativamente maior no meio
suplementado com soro que no suplementado com BSA ou PVA. Apesar da
adição de soro parecer benéfica, alguns autores (THOMPSON, 1995; RIZOS et
al., 2003) sugeriram que a presença de soro no meio de cultivo está relacionada
com o aumento na quantidade de lipídios nos embriões PIV, o que reduz sua
criotolerância, sendo isto um sério problema no processo de congelamento.
O protocolo utilizado no laboratório do CES com a produção de
embriões em grupos de 35 estruturas em cada gota está de acordo com o
preconizado por PEREIRA et al. (2005), que sugeriram não haver diferenças
significativas
entre
a
produção
de
embriões
cultivados
em
grupo
ou
individualmente, porém observaram que os embriões produzidos individualmente
tendem a ter um menor número de células, podendo ser considerado de
qualidade inferior. Entretanto, OLIVEIRA et al. (2005) retaram diferença na
produção de embriões, sendo que quando o cultivo foi feito com 30 estruturas em
100 µL de meio de cultivo o desenvolvimento dos embriões foi inferior ao
observado em cultivos com 10 estruturas.
A tensão de O2 tem grande influência na produção e na qualidade dos
embriões, principalmente devido ao estresse oxidativo. Quanto à atmosfera
forçada de cultivo, o protocolo adotado pelo CES era o do uso de tensão de 5%
O2, 5% de CO2 e 90% de N2, procedimento respaldado por GONÇALVES et al.
(2008). Entretanto, KHURANA et al. (2000) avaliando a produção de embriões
bovinos, não encontraram diferença quando esses foram cultivados sob 5% ou
20% de O2.
Tem sido sugerido que a passagem dos espermatozóides pelo
gradiente de percoll poderia retirar algumas glicoproteínas da membrana do
espermatozóide e, com isso, acelerar a capacitação. Portanto, poderia ser
esperado que o método utilizado pudesse alterar o tempo de capacitação e a vida
útil do espermatozóide, o que poderia alterar o tempo necessário para a
fecundação (GONÇALVES et al., 2002). Entretanto, estudo comparando os
diferentes métodos de preparação espermática em diferentes períodos de co-
31
incubação demonstrou que a variação entre os tempos de duração da FIV foi
similar para todos os métodos utilizados. Os melhores resultados foram
observados quando a FIV foi realizada por um período de 12 horas, independente
do método utilizado. Tais informações sugerem que o protocolo adotado pelo CES
é respaldado pela comunidade científica (DODE & RODOVALHO, 2002).
32
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos
permitiram uma maior participação da fêmea bovina no processo de
melhoramento genético do rebanho. Isso porque o número de descendentes
deixados por uma única fêmea ao longo de sua vida reprodutiva aumentou
significativamente com a utilização das técnicas de transferência e produção in
vitro de embriões. O aperfeiçoamento dos sistemas de cultivo in vitro permitiu
também o avanço de outras biotécnicas, tais como a clonagem e a manipulação
de genes e transferência de embriões, etc.
Portanto a produção in vitro de embriões bovinos, em breve será uma
biotecnologia utilizada de forma mais ampla nos rebanhos comerciais, gerando
ganhos consideráveis aos criadores pelo aproveitamento do potencial genético de
seus animais em curto espaço de tempo, além dos avanços de grande relevância
que a aplicação dessa biotecnologia gera para a área da pesquisa.
Muitos estudos
e pesquisas estão sendo destinados à PIV,
principalmente focando cada uma das três etapas laboratoriais individualmente,
na tentativa de torná-las mais eficientes e viáveis em todos seus aspectos. As
perspectivas são boas, principalmente porque outras biotecnologias estão
ascendendo e tendo a PIV como procedimento padrão.
A realização do estágio curricular nesta área proporcionou a
possibilidade de conhecer in loco os conhecimentos acadêmicos obtidos durante
o período de graduação, além de proporcionar segurança para o exercício futuro
da profissão. Foi também um período rico em experiências pessoais, permitindo
que se conhecessem novos lugares, novas pessoas e novas oportunidades.
33
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39
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40
Anexos
41
Meios de Maturação
Anexo 1 - Meio para maturação de oócitos*
Componente
Unidade
Quantidade
TCM 199® base para maturação
mL
2,7
Soro fetal bovino
mL
0,3
LH
µg
15,0
FSH
µg
1,5
Piruvato de Sódio solução estoque
µL
10
Gentamicina
µL
15
*o soro fetal bovino (SFB) deve ser inativado a 60oC por 30 min. Gentamicina na
concentração de 10 mg/mL. Filtrar e preparar as placas de maturação.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 1.1 - TCM 199® estoque*
Componente
HEPES
TCM-199® com sais de Earle e L-glutamina q.s.p.
Unidade
Quantidade
g
5,9575
mL
1.000
* ajustar o pH para 7,36, utilizando HCl ou NaOH 0,1 N, filtrar através de membranas de
0,22µ e armazenar em temperatura entre 2 e 6ºC.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 1.2 - TCM 199® base para maturação*
Componente
Unidade
Quantidade
G
0,22
mL
100
NaHCO3
®
TCM 199 estoque q.s.p.
*ajustar o pH em 7,67 após equilíbrio em atmosfera com 5% de CO2, filtrar e armazenar
em temperatura entre 2 e 6oC. Se o TCM-199® for adquirido líquido, verificar se já contém
NaHCO3 em sua fórmula comercializada.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
42
Anexo 1.3 - Solução de estoque de Piruvato de Sódio para desenvolvimento
embrionário*
Componente
Unidade
Quantidade
Piruvato de Sódio
g
0,0075
Água ultrapura q.s.p.
µL
1.000
Filtrar e Congelar a -20ºC em alíquotas de 10 µL.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
43
Gradientes de Percoll
Anexo 2 - Solução de Sperm-TALP 10x*
Componente
Unidade
Quantidade
Solução KCl (1M)
mL
3,090
Solução NaH2PO4H2O 0,1M)
mL
2,920
NaCl
g
4,675
HEPES
g
2,380
mL
100,000
Unidade
Quantidade
Solução de Sperm-TALP 10x
mL
1
Água ultrapura q.s.p.
mL
9
Água ultrapura q.s.p.
*ajustar o pH 7,3 e armazenar 2 e 6oC.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 2.1 - Solução de Sperm-TALP 1x
Componente
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 2. 2 - Soluções para preparar Percoll*
Componente
KCl
Água ultrapura q.s.p.
Unidade
Quantidade
g
7,45
mL
100
o
*filtrar e armazenar entre 2 e 6 C. Cloreto de potássio (1M).
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 2. 3 - Fosfato diácido de sódio monoidratado (0,1M)*
Componente
NaH2PO4H2O
Água ultrapura q.s.p.
Unidade
Quantidade
g
1,38
mL
100,000
o
*filtrar e armazenar entre 2 e 6 C.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
44
Meios de capacitação e fecundação
Anexo 3 - Fert-TALP*
Componente
mM
Unidade
Quantidade
NaCl
114
g
0,6660
KCl
3,2
g
0,0238
NaH2PO4
0,4
g
0,0048
Lactato de Sódio
10
µL
85,57
MgCl2.7H2O
0,5
g
0,0101
NaHCO3
25
g
0,2100
CaCl2.2H2O
2,0
g
0,0294
Piruvato de Sódio
0,2
g
0,0022
mL
1,0
PHE estoque
Glicose
5
g
0,0900
Cafeína
5
g
0,0971
BSA
g
0,6000
Antibiótico solução estoque
µL
100,0
Água ultrapura q.s.p.
mL
100,0
* armazenar em geladeira; 60% de xarope de lactato de sódio (“sodium lactate syrup”).
BSA livre de ácidos graxos (“Fatty acid free”).
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2002)
Anexo 3. 1 - PHE estoque*
Componente
Unidade
Quantidade
Penicilinamina
g
0,0186
Hipotaurina
g
0,0055
Epinefrina
g
0,0009
mL
50
Água ultrapura q.s.p.
*fazer alíquotas de 1 mL e congela a -20ºC.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2002)
45
Anexo 3. 2 - Solução estoque de Antibiótico para os meios*
Componente
Unidade
Quantidade
Penicilina
UI
100.000
Estreptomicina
mg
50
Água ultrapura q.s.p.
mL
1
*congelar a -20ºC. Utilizar 1 µL da solução estoque/mL de meio.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2002)
Anexo 3. 3 - Solução estoque de heparina para fecundação*
Componente
Heparina
Fert-TALP q.s.p.
Unidade
Quantidade
g
0,0010
mL
4
*congelar a -20oC em alíquotas de 50 µL. Fazer gotas de fecundação com 95 µL de meio
Fert-TALP + 5 µL de heparina, totalizando 100 µL cada gota.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2002)
46
Meios de Cultivo
Anexo 4 - Fluido sintético de oviduto (SOF) solução final*
Componente
Unidade
Quantidade
SOF solução estoque
mL
9,5
Solução piruvato de sódio SOF estoque
µL
100,0
Soro fetal bovino (10%)
mL
1,0
Gentamicina (10 mg/ml
µL
50,0
*filtrar e equilibrar em estufa com 5% de CO2 por no mínimo duas horas antes do uso.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 4. 1 - Fluido sintético de oviduto (SOF) solução estoque. SOFaaci
(synthetic oviductal fluid mod. Com aminoácidos + citratos + inositol)*
Produtos
mM
Unidade
Quantidade
107,63
mg
629,00
KCl
7,16
mg
53,40
NaHCO3
25,00
mg
210,00
Lactato de sódio (xarope 60%)
5,35
µL
60
MgSO4 7H2O
1,51
mg
18,20
CaCl2 2H2O
1,78
mg
26,20
KH2PO4
1,19
mg
16,20
Aminoácidos essências BME 50x
µL
3.000
Aminoácidos não essenciais MEM 100x
µL
1.000
NaCl
Myo-inositol
2,77
mg
50,00
Sódio tricitrato
0,34
mg
10,00
L-glutamina
0,20
mg
2,92
Vermelho fenol
mg
0,15
Água ultrapura q.s.p.
mL
100
*filtrar e armazenar esta solução estoque entre 2 e 6ºC. Osmoralidade em 285mOsm.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
47
Anexo 4.2 - Solução estoque de cloreto de cálcio diidratado (1M; para preparação
de meios)*
Componente
MgCl2.2H2O
Água ultrapura q.s.p.
Unidade
Quantidade
g
1,470
mL
10
*filtrar e armazenar 2 e 6ºC.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 4. 3 - Solução estoque de cloreto de magnésio hexaidratado (0,1M; para
preparação de meios)*
Componente
MgCl2.6H2O
Água ultrapura q.s.p.
Unidade
Quantidade
g
0,203
mL
10
*filtrar e armazenar entre 2 e 6ºC.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Anexo 4. 4 - Solução de piruvato de sódio e fluido sintético de oviduto (SOF)
estoque
Componente
Piruvato de sódio (testado para embrião)
Água ultrapura q.s.p.
Adaptado de: GONÇALVES et al. (2008)
Unidade
Quantidade
g
0,04
mL
5