Bioinformática e Investigação Criminal

Bioinformática e Investigação
Criminal
aula 2
Eduardo Campos dos Santos
[email protected]
PCR – animações e simulação
animação 01: narrada (arquivo local)
PCR-Polymerase-Chain-reaction.fv
animação 02: passo-a-passo (arquivo local)
pcr.swf
animação 03: narrada e passo-a-passo (online)
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/pcr.swf
simulação
PCR_Biotechnique.swf
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RFLP versus PCR
Comparação: RFLP, VNTR, STR
RFLP
VNTR
16-70 bp
STR
2-4 bp
Restriction Site
PCR Primer
Os 13 loci
STR do
CODIS e
alguns outros
As sequências repetitivas e os alelos
Mas como atribuir um valor
quantitativo para nossas
conclusões?
Formas de
visualização
e análise
Eletroforese Capilar
The ABI 310 Genetic Analyzer
ABI 310 Genetic Analyzer:
Eletroforese Capilar
STR DNA amplificado
injetado em colunas
capilares
Cada coluna insere um
corante de cor diferente
Potencial elétrico aplicado
Fragmentos percorrem as
colunas capilares
Fragmentos maiores
trafegam mais lentamente
Cor do STR detectada e
gravada na medida que
passa pelo detector
ABI 310 Genetic Analyzer:
Eletroforese Capilar
STR DNA amplificado
injetado em colunas
capilares
Cada coluna insere um
corante de cor diferente
Potencial elétrico aplicado
Fragmentos percorrem as
colunas capilares
Fragmentos maiores
trafegam mais lentamente
Cor do STR detectada e
gravada na medida que
passa pelo detector
Detector
Window
Eletroferograma de loci STR
Explicações no próximo slide
Explicando cada ponto da figura no
slide anterior
1.O eixo x indica o tamanho do fragmento em bp (base pairs).
2.O eixo y indica representa a intensidade do sinal em relative fluorescent units (RFUs). Picos
maiores indicam maior número de cópias do alelo do STR na amostra.
3.Os menores fragmentos no eletroferograma aparecem como um ou dois picos na cor verde
mais à esquerda. Esses picos representam a ocorrência do marcador no locus amelogenina
nos cromossomos sexuais. Assim, um único pico indica que a amostra provém de uma mulher
enquanto dois picos indicam que é de um homem.
4.Os grandes picos vermelhos representam padrão de tamanho, uma mistura de fragmentos de
DNA de tamanhos conhecidos, usada para calibração do equipamento.
5.As quatro diferentes cores que aparecem no eletroferograma indicam quatro diferentes
corantes usados para identificar os alelos. São usados corantes vermelho, verde, amarelo e
azul. (Os picos pretos são usados aqui no lugar dos amarelos para fornecer melhor nitidez.)
6.Linha de base mostrando um pequeno ruído representado por linhas em todas as quatro
cores.
7.Em geral, um único pico indica um homozigoto enquanto dois picos próximos entre si de
mesma cor e mesma intensidade indicam um heterozigoto.
8.Algumas vezes, picos fracos aparecem próximos a picos fortes da mesma cor, sempre à
esquerda destes. O pequeno pico representa eco do pico maior e deve ser desconsiderado.
Problemas
●
Degradação da amostra de DNA
●
Amplificação preferencial
●
Drop-out e atenuação de alelos
●
Surgimentos de sttuters por efeitos estocásticos
●
●
Necessidade de definição de um threshold no
eletroferograma (veja o próximo slide)
Análises subjetivas
Efeitos da degradação
Loci maiores
●
●
●
Loci menores
A exposição a efeitos adversos do ambiente podem degradar
as amostras biológicas:
(vermes, umidade, luz solar, tempo).
A degradação quebra o DNA aleatoriamente.
Regiões amplificadas maiores são afetadas primeiro. Por
isso, o eletroferograma assume uma clássica forma de rampa
ou 'pista de squi' (ski-slope). Com isso, os picos referentes
aos loci menores podem se confundir com o ruído.
Compare a amostra de cima que foi extraída do suspeito ou vítima com a amostra de
baixo extraída de alguma evidência do crime (uma pequena mancha de sangue, por
exemplo). A degradação da amostra da evidência inviabilizou a amplificação de loci
maiores ocasionando um decréscimo na amplitude dos respectivos picos na medida
que caminhamos para a direita. A partir de determinado ponto, a atenuação foi tanta
que não foi possível detectar um pico sequer. (Veja os próximos slides.)
O efeito da atenuação devido à degradação da amostra da evidência é que foi
possível um reconhecimento apenas parcial na comparação dos perfis genéticos das
duas amostras. Observe que, mesmo alguns muito atenuados puderam ser
identificados. Mas a partir de determinado ponto, os picos (se é que aparecem,
apresentam altura comparável com a do ruído. Se o ruído fosse um pouco maior, seria
difícil identificar até mesmo o último pico reconhecido como autêntico.
Limiar (threshold)
Abaixo desta
linha, os picos
são considerados
ruído.
Esses pequenos picos
foram interpretados
como “ecos”
Já esses dois foram
identificados como picos
referentes a alelos
Degradação: Interativo
Veja o arquivo peaks_capillary_pcr_02_degradation.swf
É necessário um visualizador de shockwave fash
Drop out
Veja o arquivo peaks_capillary_pcr_03_drop-out.swf
É necessário um visualizador de shockwave fash
Alguns
kits
comerciais
O que caracteriza um
kit são os primers que
serão usados na PCR
(o que define quais loci
serão amplificados) e
como os corantes
fluorescentes serão
acoplados a esses
primers (o que define
a cor que identificará
cada locus).
Em destaque:
aquele que suporemos
que foi usado em nosso
laboratório (ver próximo
slide).
Estimativas estatísticas: a regra do produto
Estimativas estatísticas: a regra do produto
0.229 x 0.199 x 2
0.109 x 0.109
0.152 x 0.138 x2
Estimativas estatísticas: a regra do produto
0.152 x 0.138 x2
0.229 x 0.199 x 2
0.091 x 0.012
x
0.042
0.109 x 0.109
Estimativas estatísticas: a regra do produto
0.091 x 0.012
x
0.042
x
0.015 x 0.049
x
0.04
x
=
0.015
Total Final
6.88 x 10-15
cerca de 1 em 150 quadrilhões
x
0.066 x 0.078
Cálculo da probabilidade de um match perfeito com o perfil
do slide anterior para um indivíduo do nordeste da Polônia*
*Pepinski et.al. 2003
cerca de 1 em 150 quadrilhões
Mesmo cálculo do slide anterior descartando-se o locus
D3S1358*
*Pepinski et.al. 2003
cerca de 1 em 13 trilhões
Mesmo cálculo do slide anterior (sem o locus D3S1358) para
um indivíduo brasileiro da Amazônia*
*Francez et.al. 2011
cerca de 1 em 70 trilhões
Mesmo cálculo do slide anterior (apenas os três loci mais
curtos) para um indivíduo do nordeste da Polônia*
*Pepinski et.al. 2003
cerca de 1 em 137 mil
Mesmo cálculo do slide anterior (apenas os três loci mais
curtos) para um indivíduo brasileiro da Amazônia*
*Francez et.al. 2011
cerca de 1 em 2 milhões, 950 mil
Considerações sobre a etnia
●
●
●
Faz diferença para o cálculo da probabilidade?
Em que sentido deve-se usar uma tabela
referente à mesma etnia do acusado se não
houver qualquer evidência que sugira a etnia
do culpado? (Considere: inclusão/exclusão)
O cálculo da probabilidade de matching supõe
que as uniões entre os casais (que geram
novos indivíduos) se faz aleatoriamente. Essa
suposição é adequada ou é passível de crítica?
Argumento da promotoria
●
Se a probabilidade de um match de um perfil
de DNA obtido de uma evidência do crime
(mancha de sangue, sêmen etc.) for de cerca
de 1 em 1 bilhão e o perfil de um suspeito for
idêntico ao da evidência, podemos afirmar que
a chance do suspeito ser inocente seja também
de 1 em 1 bilhão. E podemos até calcular a
probabilidade dele ser culpado usando:
Pculpado = 1 - Pinocente
●
Correto? Há como contestar esse argumento?
“Falácia do promotor”
(Prosecutor's Fallacy)
Assume que a chance de um dado evento
estatístico seja igual à chance do acusado
ser culpado.
Leitura complementar
It's a match! by Philip Dawid and Rachel Thomas
http://plus.maths.org/content/os/issue55/features/dnacourt/index
Lab-on-a-chip (LOC)
NEC portable DNA analyzer
Veja o catálogo da NEC:
portable_dna_analyzer_NEC_catalogue.pdf