Vanessa Árabe Lenza

UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO – UNAERP
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
Eclipta alba (L) Hassk FRENTE A LINHAGENS
MUTANTES DE Trichophyton rubrum E ISOLADOS
CLÍNICOS DE BACTÉRIAS RESISTENTES A
ANTIBIÓTICOS
Vanessa Árabe Lenza
Ribeirão Preto
2008
UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO – UNAERP
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
Eclipta alba (L) Hassk FRENTE A LINHAGENS
MUTANTES DE Trichophyton rubrum E ISOLADOS
CLÍNICOS DE BACTÉRIAS RESISTENTES A
ANTIBIÓTICOS
Mestranda: Vanessa Árabe Lenza
Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Fachin Saltoratto
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Pereira
Ribeirão Preto
2008
UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO - UNAERP
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
Eclipta alba (L) Hassk FRENTE A LINHAGENS
MUTANTES DE Trichophyton rubrum E ISOLADOS
CLÍNICOS DE BACTÉRIAS RESISTENTES A
ANTIBIÓTICOS
Dissertação apresentada ao curso de
Biotecnologia
da
Universidade
de
Ribeirão Preto para obtenção do Título de
Mestre em Biotecnologia aplicada à saúde
Mestranda: Vanessa Árabe Lenza
Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Fachin Saltoratto
Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Sérgio Pereira
Ribeirão Preto
2008
iv
AGRADECIMENTOS
.
À Profª Drª Ana Lúcia Fachin, por todo o seu carinho e dedicação ao orientar o
trabalho.
Ao Prof. Dr. Paulo Sérgio Pereira por ter cedido os extratos e frações de E.alba.
À Profª Drª Suzelei de Castro França Coordenadora do Programa de Mestrado em
Biotecnologia pela atenção dispensada.
À Profª Drª Bianca Waléria Bertoni e a Profª Drª Lindamar Maria Souza pelas
sugestões e correções do texto de qualificação.
.
Ao aluno de iniciação científica Lucas Junqueira de Freitas Morel por ter me
auxiliado em todo o processo prático dos experimentos.
À Vanessa Colnaghi Fernandes pelo auxílio técnico.
v
LISTA DE ABREVIATURAS
ATCC- “American type culture collection”
CIM- Concentração inibitória mínima
D -demetilwedelactona
LAC -Laboratório de Análises Clinicas da UNAERP
MDR- múltipla resistência a drogas
OMS - Organização Mundial da Saúde
WL- wedelactona
vi
INDICE DE TABELAS
Tabela 1: Antibiograma dos isolados de campo do LAC, demonstrando a
31
resistência das amostras.
Tabela 2: Concentração inibitória mínima (CIM) em mg/mL dos extratos
40
e frações de E.alba frente a linhagens de bactérias gram positivas e gram
negativas ATCC
Tabela 3: Concentração inibitória mínima (CIM) em mg/ mL, dos
41
extratos e frações de E.alba testadas na faixa de concentração de 5mg até
0,019 mg /mL nas linhagens de isolados clínicos resistentes a antibióticos
Tabela 4: Concentração inibitória mínima (CIM) em mg/ mL dos extratos
e frações de E.alba contra as linhagens H6 (selvagem) e ∆TruMDR2
(mutante) de T rubrum.
46
vii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Exemplar de Eclipta alba da coleção de plantas medicinais da
20
Unaerp
Figura 2: Estrutura química dos isoflavonoides: wedelactona e a
21
demetilwedelactona (PIMOLPAN et al., 2004)
Figura 3: Preparação e purificação dos extratos e frações
29
Figura 4: Ilustração do método de microdiluição em meio BHI em placa
33
contendo 96 poços, testando a atividade antibacteriana do extrato bruto
E.alba e frações obtidas a partir dele contra a linhagem de S.epidermidis
(arquivo pessoal).
Figura 5: Linhagens H6 (selvagem) e mutante (∆TruMDR2) cultivadas
35
por 15 dias em meio Sabouraud (arquivo pessoal)
Figura 6: Ilustração do método de microdiluição em placa de 96 poços
testando a atividade antifúngica de E.alba contra a linhagem H6 de
T.rubrum (arquivo pessoal).
37
viii
SUMÁRIO SUMÁRIO
RESUMO
09
ABSTRACT
10
1. INTRODUÇÃO
11
1.1 Infecções causadas por microorganismos
11
1.2 Trichophyton rubrum
13
1.3 Atividade antimicrobianas das plantas medicinais
16
1.4 Eclipta alba
19
2. JUSTIFICATIVA
23
3. OBJETIVOS
25
3.1 Objetivo Geral
25
3.2 Objetivos Específicos
25
4. METODOLOGIA
26
4.1 Métodos de coleta e preparação de extratos e frações
26
4.2. Testes de sensibilidade a extratos vegetais nas linhagens de bactérias
28
4.2.1.Linhagens Bacterianas ATCC
28
4.2.2 Isolados de campo resistentes a antibióticos
28
4..2.3.Métodos de identificação
28
4.2.4.Antibiograma
29
4.3 Ensaios de sensibilidade dos extratos de Eclipta alba nas
29
linhagens de bactérias
4.4. Testes de sensibilidade .dos extratos de Eclipta alba nas linhagens de
30
Dermatofitos
4.4.1 Linhagens de dermatofitos
30
4.4.2 Manutenção das linhagens
31
4.4.3 Ensaios de sensibilidade dos fungos
32
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO
33
6. CONCLUSÕES
46
7- REFERÊNCIAS
47
9
RESUMO
As infecções provocadas por fungos e bactérias em humanos têm aumentado
drasticamente nos últimos anos. O tratamento atual das micoses tem se baseado na
terapia utilizada contra bactérias e poucos antifúngicos são disponíveis em relação aos
antibacterianos. Desta forma, pesquisas voltadas para o estudo e avaliação de produtos
naturais extraídos de plantas medicinais com atividade antibiótica devem ser
estimuladas no intuito de criar novas drogas com atividade antimicrobiana. Eclipta alba
(L) Hassk. (syn:Eclipta prostrata) cuja origem no Brasil é creditada ao território
amazônico, é uma Asteraceae cosmopolita que possui atividade anti-hepatotóxica e
anti-fúngica que é atribuída a dois cumestanos: wedelolactona e demetilwedelolactona.
Assim sendo, este trabalho teve como objetivo realizar uma prospecção da planta
Eclipta alba visando à busca de substâncias com atividade antimicrobiana sobre duas
linhagens (selvagem e mutante) do dermatofito Trichophyton rubrum e em linhagens
de bactérias ATCC e isolados de campo resistentes a antibióticos. Os resultados
demonstraram que as linhagens ATCC mais sensíveis para a fração de Acetato de Etila
(que apresentava cumestanos) foram as bactérias gram positivas Staphylococcus aureus
e Staphylococcus epidermidis nas concentrações de 1,25mg/mL e 0,625 mg/mL,
respectivamente. Os isolados clínicos Enterococcus sp e S. aureus, resistentes a
antibióticos obtidos de pacientes atendidos no Laboratório de Análises Clínicas da
UNAERP apresentaram-se também mais sensíveis à fração de Acetato de Etila, ambas
na concentração de 0,07mg/mL. Em relação à atividade antifúngica, o extrato etanólico
bruto foi mais efetivo contra as duas linhagens de dermatófito (CIM=0,125mg/mL).
Estes resultados sugerem que a atividade antimicrobiana de E.alba contra os
dermatófitos não está relacionada diretamente com os compostos wedelolactona e
demetilwedelolactona,
mas com o
fitocomplexo
presente no
extrato
bruto,
diferentemente para as bactérias as duas substâncias puras demonstraram atividade
especifica.
10
ABSTRACT
Fungi and bacteria-derived human infections have drastically increased in the
past years. The current mycoses treatments have been based on therapies used against
bacteria and very few anti-fungicides are available compared to available anti-bacterial
drugs. Hence, researches focusing on the study and evaluation of natural products
extracted from medicinal plants of antibiotic activity should be stimulated in order to
create new drugs with antimicrobial activity. Eclipta alba (L) Hassk. (syn:Eclipta
prostrata), whose origin in Brasil is credited to the Amazon region, is a Asteraceae
cosmopolite that possesses anti-hepatotoxic and anti-fungicide activities due to two
cumestanes: wedelolactone and demethylwedelolactone. Therefore, this work aimed to
conduct a Eclipta alba plant prospection in search of substances with anti-microbial
activity over two strains (wild and mutant) of the Trichophyton rubrum dermatophyte
and ATCC bacterial strains and clinical isolates resistant to antibiotics. The results
showed that the ATCC strains most sensitive to the ethyl-acetate fraction (which
presented cumestanes) were the gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and
Staphylococcus epidermidis in concentrations of
1.25mg/mL and 0.625mg/mL
respectively. The clinical isolates Enterococcus sp and S. aureus, antibiotic resistant
and obtained from patients attended at UNAERP Clinical Analysis Laboratory, were
also sensitive to the ethyl-acetate fraction, both in the concentration of 0.07mg/mL.
Regarding the anti-fungicide activity, the brute ethanolic extract was more effective
against the two dermatophyte strains (CIM=0.125mg/mL). These results suggest that
the E.alba anti-microbial activity on dermatophytes is not directly related to
wedelolactone and demethylwedelolactone compounds, but to the phytocomplex found
in the brute extract. Contrastingly for the bacteria, both pure substances presented
specific activities.
11
1.
INTRODUÇÃO
1.1-Infecções causadas por microorganismos
Os microorganismos participam de todas as funções vitais observadas em
formas de vidas superiores e podem ser encontrados em associação com ambientes
inanimados e com outros organismos viventes, incluindo plantas, animais e o homem.
Entretanto, quando um microorganismo é capaz de quebrar esta relação e causar algum
tipo de injúria ao hospedeiro, desencadeando o mecanismo de defesa do agente
agredido, têm-se um quadro de infecção (KONEMAN, 2001).
As bactérias são microorganismos procariotos, que podem ser encontrados
comum
e abundantemente
na
microbiota
normal humana,
a
exemplo
da
Corynebacterium e Staphylococus epidermides. Estas podem provocar doenças em
situações de imunossupressão do hospedeiro. Outras
bactérias são tidas como
patogênicas, sendo caracterizadas pela sua toxicidade e capacidade de escapar do
sistema imune, como é o caso de várias espécies de Pseudomonas (KONEMAN, 2001).
As portas de entrada desses agentes são as mucosas que entram em contato com
a pele ou áreas não usuais em que exista algum tipo de lesão, como é o caso da
Escherichia coli (BUTEL, 2001).
As pneumonias são as infecções bacterianas mais freqüentes no ser humano e
estão associadas as principais causas de morte imediata em pacientes hospitalizados. O
Mycobacterium tuberculosis é o agente causador da tuberculose, sendo um dos agentes
infecciosos mais importante no mundo. Outro patógeno bastante importante é a E. coli,
que é responsável por cerca de 70 a 75% das infecções do trato urinário, como também
por outras enfermidades como a gastroenterite, infecções biliares, peritoneais, infecções
neonatais entre outras e, ainda infectam úlceras e feridas (COTRAN, 2000).
12
Profissionais da área de saúde têm se deparado com um aumento na emergência
e disseminação de microorganismos resistentes a agentes antimicrobianos. O problema
atual difere daquele que ocorreu no passado devido à ocorrência de infecções causadas
por diferentes organismos o que dificulta o tratamento. Um exemplo típico é a presença
de linhagens de S. aureus resistentes a meticilina. Este agente infeccioso tem se tornado
endêmico e numeroso nos hospitais e unidades de terapia intensiva, sendo que a
vancomicina é o único antibiótico efetivo para pacientes infectados com este
microorganismo (SMITH E BAGG, 1998)
Os fungos são microorganismos de organização rudimentar que podem ser
encontrados como mutualistas, comensais ou como parasitas, provocando, neste último
caso, prejuízo ao hospedeiro. No homem, os fungos podem desempenhar o papel de
parasitos obrigatórios, facultativos ou ocasionais e, conforme seu poder invasor e
virulência determinam processos mórbidos de intensidade e gravidade variáveis
(MORAES, 2000).
Em humanos, as infecções fúngicas variam de superficiais a invasivas ou
disseminadas, e tem aumentado drasticamente nos últimos anos. O tratamento das
micoses tem se baseado na terapia utilizada contra bactéria e poucos antifúngicos são
disponíveis em relação aos antibacterianos. Desta forma, a pesquisa por novas drogas
antifúngicas é extremamente necessária (FORTES et al., 2008).
Muitos fatores se relacionam ao crescimento dessas infecções fúngicas,
dentre os quais: o melhor diagnóstico laboratorial e clínico, o aumento da sobrevida de
pacientes com doenças
imunossupressoras
e
o
emprego
de
medicamentos
imunossupressores, utilizados às vezes de forma abusiva, permitindo a instalação de
microorganismos convencionalmente saprófitos (SIDRIM et al., 1998).
13
Entre os fungos patogênicos, os dermatofitos dos gêneros Trichophyton,
Epidermophyton, e Microsporum têm a abilidade de invadir tecidos queratinizados de
animais e humanos causando a dermatofitose, que a doença fúngica contagiosa humana
mais comum (SIDAT et al., 2006). Trichophyton rubrum é o fungo patogênico mais
prevalecente no mundo e no Brasil e representa 80% dos isolados clínicos (CHAN,
2002).
O tratamento das micoses humanas, por exemplo, nem sempre produz
resultados efetivos, tendo em vista que os fármacos antifúngicos disponíveis causam
resistência ou produzem recorrência, apresentando, por sua vez, importante toxicidade.
Por isso, há uma busca incessante de novos fármacos antifúngicos mais potentes, mas,
sobretudo, mais seguros que os existentes. Além das infecções em humanos, os animais
também podem ser atacados esporadicamente por fungos muito difíceis de serem
combatidos. Além disso, as infecções fúngicas em plantas (espécies de Rhizoctonia,
Phytophtora,
Sclerotinia,
Fusarium,
Phomopsis,
Colletotrichum,
Diaphorte,
Macrophomina, Cercospora) representam perdas incalculáveis para a produção agrícola
(ZACCHINO, 2001).
Devido a resistência de linhagens de fungos a agentes inibidores sintéticos
existentes no mercado, pesquisas e estudos de produtos naturais com atividade
antimicrobiana começaram a receber mais atenção dos cientistas (YUNES FILHO,
2001). Entre as principais ferramentas na busca de novos modelos moleculares estão à
informação de como as plantas são utilizadas por diferentes grupos étnicos e o estudo
farmacológico das preparações utilizadas, abordadas, respectivamente no âmbito da
Etnobotânica e da Etnofarmacologia (FENNER, 2006).
14
1.2 Trichophyton rubrum
Observa-se um aumento dramático em infecções fúngicas na última década,
que pode ser atribuído ao aumento do número de pacientes imunocomprometidos e
imunodeprimidos, tornando-se mais suscetíveis às micoses superficiais oportunistas. O
T. rubrum, entre os dermatófitos, é o maior agente causador de dermatofitoses
superficiais, representando 70% das infecções (GURGEL et al, 2004) em populações de
diferentes países inclusive no Brasil, indicam que esse é o agente etiológico mais
freqüente (SADAHIRO, 2004). O grupo de fungos queratinofílicos, os chamados
dermatófitos, apresentam cerca de 40 fungos pertencentes a três gêneros: Microsporum,
Trichophyton e Epidermophyton. Estes são responsáveis por infecções denominadas
dermatofitoses, que figuram entre as mais prevalentes no mundo (SANTOS, 2006). Os
dermatófitos são um grupo de fungos taxonomicamente relacionados que têm a
capacidade de invadir os tecidos queratinizados (pele, pêlo e unha) dos homens e
animais produzindo infecções denominadas dermatofitoses.
O T. rubrum é um fungo do tipo filamentoso responsável por infecções
superficiais em pele e unhas humanas. Este fungo que normalmente provoca micoses
superficiais bem caracterizadas tem causado infecções em regiões não usuais do corpo,
atuando de modo invasivo em pacientes imunodeprimidos. (GROSMAN et al., 1995).
Quanto à distribuição geográfica, T. rubrum são onipresentes, não havendo
área ou grupo de pessoas que se encontrem isoladas destes fungos. A variada
distribuição etiológica das dermatofitoses pode ser explicada por áreas onde condições
geoclimáticas e sociais são extremamente diferenciadas, fatalmente influenciando nas
espécies de dermatófitos isolados (SIDRIM, 2004).
FACHIN et al. (1996) descreveram a obtenção in vitro de um mutante de T.
rubrum (gri1) por irradiação ultravioleta que apresentou hiper-resistência à
15
griseofulvina e ao tioconazol. A dupla resistência deste mutante poderia ser explicada
pela possível existência de um mecanismo de múltipla-resistência a drogas em T.
rubrum. O desenvolvimento do fenótipo MDR está associado com a super-expressão de
uma glicoproteína de membrana que atua como uma bomba de efluxo de droga
dependente de ATP que transporta uma ampla variedade de drogas aparentemente não
relacionadas. Como a griseofulvina atua nos microtúbulos (GULL & TRINCI, 1973) e o
tioconazol, como os outros azoles, atua na inibição da biossíntese do ergosterol
(GUPTA et al., 1994) estas duas drogas atuam diferentemente na célula do fungo e
podem portanto ser substratos para MDR. Estes dados foram consideravelmente
importantes do ponto de vista clínico devido ao alto nível de resistência à griseofulvina
e ao tioconazol apresentado pelo mutante gri1 e também porque estas drogas são
algumas vezes usadas em combinação na terapia (HAY et al., 1985).
A idéia de múltipla resistência à drogas em T. rubrum começou a evoluir a
partir de estudos comparativos com Aspergillus nidulans. Duas linhagens T. rubrum
também se tornaram simultaneamente resistentes a acriflavina e a brometo de etídio,
sugerindo a existência de um mecanismo similar ao do gene acrA1 de A. nidulans que
confere resistência à acriflavina e a outros derivados de acridina (acrA1), indicando o
envolvimento de um mecanismo de resistência a múltiplas drogas (PEREIRA et al.,
1998).
Baseado nestes resultados prévios, primers degenerados desenhados a partir
de domínios de transportadores ABC envolvidos em MDR de vários organismos foram
utilizados para amplificar um fragmento de PCR a partir do DNA genômico de
T.rubrum. Após a clonagem, este fragmento foi utilizado no rastreamento do gene
TruMDR2, que codifica um transportador do tipo ABC. Pela análise da seqüência
deduzida de aminoácidos, foi observado que a proteína codificada por este gene é
16
altamente homóloga a proteínas transportadoras ABC previamente caracterizadas em
outros organismos. Experimentos de northern blot com a linhagem ATCC MYA-3108,
indicaram que o nível de transcrição do gene TruMDR2 aumentava significantemente
após 15 minutos de tratamento do micélio de T.rubrum a diversos agentes inibidores
como acriflavina, benomil, tioconazol, fluconazol e griseofulvina, sendo que a
expressão deste gene foi fortemente induzida por cloranfenicol e itraconazol (FACHIN
et al., 2006).
Para caracterizar funcionalmente o gene TruMDR2 um sistema de
transformação foi padronizado, utilizando o gene de resistência a higromicina, como
marca de seleção, presente no vetor PCSN43 (STABEN et al., 1989). Após a ruptura
gênica o mutante ∆TruMDR2 apresentou sensibilidade para brometo de etídio, 4NQO,
terbinafina e cloranfenicol. Assim a transcrição do gene TruMDR2 e a sensibilidade
observada no mutante ∆TruMDR2 na presença de diversos compostos de grupos
químicos não relacionados, são evidências que o transportador de T. rubrum pode
participar de um mecanismo de múltipla resistência a drogas (FACHIN, 2001;
FACHIN, 2006). Desta forma, mutantes com os genes ABC nocauteados, sensíveis a
drogas, podem ser utilizados como instrumentos para ensaiar novos compostos com
atividade fungitóxica específica (ANDRADE et al., 1999).
1.3 Atividade antimicrobiana de plantas medicinais
O emprego dos vegetais como alimento, medicamento ou cosmético se perde na
historia do homem na face da terra. Os estudos de arqueologia demonstram que há mais
de 3000 anos as ervas eram utilizadas para este fim. No momento atual, em todos os
paises tanto desenvolvidos como em desenvolvimento as plantas medicinais são
utilizadas. Nos primeiros as plantas não só constituem materias primas para a produção
17
industrial de derivados especiais quimicos puros,mas nos paises em desenvolvimento,
fazem parte de extratos ou compostos fitoterápicos utilizados no tratamento de diversas
enfermidades (TESKE e TRENTINE,1995).
Desde 1977, a Organização Mundial da Saúde (OMS) tem incentivado o estudo
de plantas tradicionalmente conhecidas como medicinais, com o objetivo de avaliar
cientificamente os benefícios da utilização de medicamentos fitoterápicos e de
conhecer, ao mesmo tempo, os riscos de seu uso indevido. Muitos centros de pesquisa,
em todo o mundo, vêm desenvolvendo estudos sobre as propriedades farmacológicas
das plantas medicinais. No entanto, faltam ainda evidências laboratoriais e clínicas
sobre a eficácia e a segurança de seu emprego, tanto em animais como em seres
humanos. Os supostos méritos terapêuticos que possuem devem-se, principalmente, a
informações empíricas e subjetivas da medicina folclórica (YUNES & CECHINEL
FILHO, 2001).
Apesar das indústrias farmacêuticas produzirem um expressivo número de novos
antibióticos nas últimas três décadas, a resistência microbiana a essas drogas também
aumentou. Em geral, as bactérias têm a habilidade genética de adquirir e de transmitir
resistência às drogas utilizadas como agentes terapêuticos (COHEN, 1992). O problema
da resistência microbiana é crescente e a perspectiva futura do uso de drogas
antimicrobianas, incerta. Torna-se urgente adotar, portanto, medidas de enfrentar o
problema, entre elas a do controle no uso de antibióticos, a do desenvolvimento de
pesquisas para uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos da resistência
microbiana e a da continuação dos estudos acerca de novas drogas, sintéticas e naturais
(COHEN, 1992).
Aproximadamente um terço dos medicamentos mais prescritos e vendidos no
mundo foram desenvolvidos a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003), entretanto,
18
muitas espécies vegetais com imenso potencial terapêutico estão sendo extintas sem
terem sido estudadas química e farmacologicamente.
O uso de extratos vegetais de conhecida atividade antimicrobiana podem adquirir
significado nos tratamentos terapêuticos. Desenvolvem-se inúmeros estudos, em
diferentes países, para comprovar-lhes a eficácia (RAMESH et al., 2002). Muitas
espécies vegetais têm sido usadas, pelas características antimicrobianas, através de
compostos sintetizados pelo metabolismo secundário da planta. Estes produtos são
reconhecidos por suas substâncias ativas, como é o caso dos compostos fenólicos, que
fazem parte dos óleos essenciais e dos taninos (NASCIMENTO et al., 2000).
A necessidade de medicar e a disponibilidade de plantas mescladas no
processo civilizatório constituíram os primórdios do ato de curar, remontando à
antiguidade o uso de vegetais como medicamentos (NASCIMENTO et al., 2000).
No Brasil estão localizadas cerca de 20% das 250 mil espécies medicinais
catalogadas pela UNESCO, facilitando o aproveitamento do potencial curativo dos
vegetais para o tratamento de doenças.
Nos últimos anos têm aumentado o interesse em plantas com atividade
antimicrobiana devido os freqüentes problemas de uso indiscriminado de antibióticos e
o surgimento de resistências bacterianas. As plantas medicinais possuem uma ilimitada
habilidade para sintetizar metabólitos secundários. Em muitos casos, estas substâncias
servem como mecanismos de defesa da planta contra a predação por microorganismos,
insetos e herbívoros (ALMEIDA, 1993).
Os compostos isolados de plantas são substâncias cuja estrutura química,
com raras exceções, apresentam grandes diferenças estruturais em relação aos
antibióticos derivados de microorganismos. Estes agentes antimicrobianos isolados de
plantas superiores podem agir como reguladores do metabolismo intermediário,
19
ativando ou bloqueando reações enzimáticas, afetando diretamente uma síntese
enzimática, seja a nível nuclear ou ribossomal, ou mesmo alterando estruturas de
membranas (SINGH e SHUKLA, 1984).
A atividade antifúngica de plantas medicinais brasileiras utilizadas no
tratamento popular de micoses foi avaliada por Cruz et al. (2007). Os resultados
demonstraram que extratos aquosos de Ziziphus joazeiro e Caesalpinea pyramidalis
apresentaram significante atividade antifúngica contra Trichophyton rubrum.
CHUANG et al (2007) avaliou as propriedades terapêuticas de folhas de
Moringa oleifera Lam, extratos etanólicos mostraram atividade antifúngica in vitro
contra dermatofitos tais como Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes. A
análise de CG-MS demonstrou a presença de 44 compostos presentes no óleo essencial
das folhas.
1.4 Eclipta alba
Eclipta alba (L) Hassk.(syn:Eclipta prostrata) cuja origem no Brasil é
creditada ao território amazônico (FROLINGSDORF, 2006), é da família Asteraceae
cosmopolita, possui atividade anti-hepatotóxica e anti-fúngica que é atribuída a dois
cumestanos: wedelolactona e demetilwedelolactona. As sementes dessa espécie
apresentam boa germinação, entretanto o estabelecimento de um cultivo em escala, a
partir de sementes, visando a produção de extratos é inviável, uma vez que apresenta
diferentes quimiotipos com produção irregular dos compostos de interesse.
É uma planta anual, de pequeno porte, podendo atingir no máximo 80 cm de
altura (Figura 1). Possui uma ampla distribuição geográfica, sendo encontrada
espontaneamente por quase todo o território nacional. É considerada uma planta
20
invasora, principalmente em culturas de terrenos alagadiços ou muito úmidos, como por
exemplo, a do arroz irrigado em tabuleiros. Além disso, é uma planta empregada há
séculos pelos indianos para uma infinidade de propósitos, dentre eles com pronunciado
efeito anti-ofídico (SANTOS, 2004). A planta fresca é usada amplamente no tratamento
de doenças do fígado baço e doenças crônicas de pele e também para aliviar a dor de
cabeça (SAWANT; et al. 2004). A Eclipta não é uma planta encontrada no comércio de
drogas, devido aos seus valores terapêuticos no Brasil ainda serem pouco conhecidos,
não existe um esquema de coleta ou cultivo para atender ao mercado, além de poucas
pessoas conhecerem a planta em seu estado nativo (PEREIRA, 2005)
Figura 1: Exemplar de Eclipta alba (www.missouriplants.com)
21
Os flavonóides são compostos fenólicos de baixo peso molecular que tem
como base um núcleo flavona, sendo constituído de 15 carbonos. Os flavonoides atuam
nas plantas como protetores contra doenças causadas por microorganismos, servindo
como alimento dissuasivo contra insetos e animais herbívoros. Os flavóides podem
atuar como preventivo em patologias cardivasculares, envelhecimento, cânceres e ainda
exibem uma grande variedade de efeitos biológicos como: antibacteriano, antialérgico e
vasodilatadores e inibem tanto a agregação plaquetária como a permeabilidade e
fragilidade capilar (ZUANAZZI, 2002).
Os isoflavonóides ao contrário das outras classes de flavóides apresentam
uma distribuição taxonômica restrita. Dentre as suas diferentes formas estruturais
encontra-se as ciclizadas como os cumestanos, rotenóides e cumaronocromonas. A
wedelactona e a demetilwedelactona (Figura 2) são isoflavonóides classificados como
cumestanos, sendo que a wedelolactona foi isolada pela primeira vez na planta Wedelia
calandalaceae em 1956 e mais tarde na Eclipta alba (LI et al., 2003).
Figura 2: Estrutura química dos isoflavonoides: wedelactona e a demetilwedelactona
(PIMOLPAN et al., 2004)
22
Quanto à obtenção de plantas transgênicas de Eclipta alba, a mesma tem
sido utilizada na Unidade de Biotecnologia da UNAERP como um modelo para se
analisar a produção de fenilpropanóides do tipo cumestanos, cuja formação é
dependente da enzima isoflavona redutase (IFR), com o objetivo de analisar
molecularmente a via metabólica que leva à formação dos cumestanos, o seu papel
fisiológico na planta bem como gerar plantas com uma produção aumentada destas
moléculas.
França et al. (1995) desenvolveram a micropropagação a partir de
segmentos nodais dessa espécies e estabeleceram um protocolo eficiente para produção
em escala de E. alba. Esse tipo de propagação promove o desenvolvimento de estruturas
morfologicamente pré-existentes e a exposição de segmentos nodais a concentrações
adequadas de reguladores vegetais e nutrientes estimula a quebra de dormência das
gemas axilares e promove uma rápida multiplicação de novas plântulas.
A análise macroscópica das folhas de E.alba verificou que são
membranáceas, apecioladas, com superfície superior e inferior pilosa, peninervias, ápice
agudo, borda serrilhada com dentes voltados para cima, superfície superior e a inferior
pilosa de cor verde. O caule de E. alba apresentou consistência herbácea com coloração
avermelhada e aspecto piloso, com nó e entre nó e folhas opostas cruzadas (ARANTES,
2005).
De acordo com Arantes, (2005), na análise microscópica das folhas de E.
alba foram observados como características marcantes desta espécie vegetal os pêlos
tectores tricelulares com parede granulosa em ambas as epidermes. Predominam
estômatos anomocíticos e estão presentes em ambas as epidermes. No caule também
foram visualizados pêlos tectores tricelulares e região cortical constituída por
aerênquima. A secção transversal da raiz de E. alba apresentou cilindro central
23
constituído por floema e xilema contendo vasos de grande abertura, isolados ou
agrupados. Diante deste contexto, e da importância desta espécie vegetal, propõem-se
neste trabalho realizar uma bioprospecção em E.alba em busca de substâncias com
potencial atividade antimicrobiana contra o dermatofito T.rubrum e linhagens da
bactérias ATCC e isolados clínicos resistentes a antibióticos.
24
JUSTIFICATIVA
Acredita-se que a utilização de plantas medicinais como terapia preventiva e
curativa seja tão antiga quanto o próprio ser humano (MARTINS et al., 1994). De
acordo com o Centro Internacional do Comércio, a proporção das plantas utilizadas no
preparo de produtos farmacêuticos chega à terça parte das substâncias sintéticas
empregadas na terapêutica convencional.
Nos últimos vinte anos no Brasil, país com a maior diversidade vegetal do
mundo, o número de informações sobre plantas medicinais tem crescido apenas 8%
anualmente (SIANI, 2003). Isso mostra que em um país biologicamente tão rico, mas
com ecossistemas tão ameaçados, pesquisas com plantas medicinais devem ser
incentivadas. Afinal, elas poderiam levar à reorganização das estruturas de uso dos
recursos naturais (em vista da necessidade de sua extração estar associada aos planos de
manejo) e à elevação do PIB, visto que há grande tendência mundial de aumento na
utilização de fitoterápicos.
O mercado mundial de fitoterápicos é estimado em mais de US$ 20 bilhões
anuais e, somente na Europa, atinge cerca de US$ 7 bilhões ao ano, sendo que a
Alemanha é responsável por cerca de 50% desse total. Segundo estimativa feita pela
PhytoPharm Consulting em Berlim, até o ano de 2007 a fitoterapia deve movimentar
cerca de US$ 47 bilhões anualmente.
No Brasil, em 1998, os produtos naturais na saúde foram responsáveis pelo
controle de 5,5% do mercado total de medicamentos, o que representa algo em torno de
US$ 566 milhões. Em 2000, foram negociados US$ 700 milhões e a previsão é de R$ 1
bilhão nos próximos 10 anos (SIANI, 2003).
25
Existe hoje a preocupação com a qualidade do produto a ser consumido e a
reformulação no conceito de qualidade de vida. Neste contexto, a cadeia produtiva de
plantas medicinais, que segue desde o cultivo até a comercialização deve ser muito bem
estudada em todas as etapas do processo, para que o conjunto proporcione o
medicamento final com qualidade e eficiência.
Desta forma, este estudo pretende caracterizar princípios ativos de extratos
de Eclipta alba que apresente atividade antifúngica e conseqüentemente colaborar para
a valorização da biodiversidade brasileira, além de fornecer subsídios científicos para
estimular a incipiente indústria brasileira de medicamentos a investir na produção de
fitoterápicos.
26
3 . OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Realizar prospecção da planta Eclipta alba visando à busca de substâncias
com atividade antimicrobiana.
3.2 Objetivos específicos:
•
Avaliar a atividade antifúngica dos extratos, frações e substâncias de E.alba na
linhagem clínica ATCC MYA-3108 (selvagem) e em uma linhagem mutante
com o gene TruMDR2 deletado, que codifica um transportador do tipo ABC
envolvido em múltipla resistência a drogas no dermatófito T.rubrum;
•
Avaliar a atividade antibacteriana do extrato vegetal em linhagens de bactérias
gram-positivas e gram-negativas;
•
Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos em isolados de bactérias de
campo resistentes a antibióticos,
27
4. MATERIAIS E MÉTODOS:
4.1. Métodos de coleta e preparação dos extratos e frações :
Acessos de E. alba foram coletados no Estado de São Paulo e os dados da coleta
foram georeferenciado com GPS (Lat 21° 11' 55,2"; Long 47° 46' 42,1" altura 606
metros. O exemplar foi depositado no herbário de plantas medicinais da Unaerp com o
número da exsicata HPMU 058.
Partes aéreas (folhas, caules e inflorescências) de E. alba (2200 g) foram secas,
em estufa com ar circulante a 50°C, por 48 h, a seguir foram moídas em moinho de
facas até a pulverização total. O material vegetal seco foi macerado em ethanol 95%
(5:1; m/v) por 24 horas a 25°C. Após filtração o material foi concentrado em um roto
evaporador e liofilizado produzindo 295,8 g de extrato etanólico seco. O extrato
etanólico (100 g) foi dissolvido em 500 mL de metanol:água milli Q water (1:1; v/v) e
foi submetido a extração com n-hexano (500 mL) por três vezes. A fração solúvel em
água foi concentrada em roto evaporador até que o volume de água fosse reduzido pela
metade e então foi submetido a extração com acetato de etila (300 mL) por três vezes.
A fração hexânica e a fração acetato de etila foram roto evaporadas e a fração aquosa foi
liofilizada.
A fração acetato de etila (5 g) foi submetida a purificação em uma coluna
cromatográfica Sephadex® LH20 (3,3 x 120 cm) usando metanol como fase móvel.
Após análise de CCD (Cromatografia de camada delgada) as frações foram
seletivamente agrupadas. As condições de CCD TLC foram: placa de sílica gel (10 x 10
cm), choroformio:metanol (8:2; v/v) como fase móvel e vapores de iodina e vanillina
sulfúrica como reveladores. Frações contendo coumestanos foram aplicadas em uma
coluna de HPLC RP18
(SupelcosilTM RP-18, 250 x 10 mm-i.d.), produzindo
28
wedelolactona (32.5 mg; Rt = 70-80 min) and demetilwedelolactona (16.0 mg; Rt = 5062 min). Detecção foi realizada a 210 and 350 nm. Dois sistemas de gradiente solvente
foram utilizadas água (A) e metanol (B). O programa de gradiente consistiu de quatro
períodos de tempo: (1) 0-100 min, 0-60 % B, (2) 100-110 min, 60 % B, (3) 110-112
min, 60-0 % B e (4) 112-120 min, 0 % B. O fluxo foi de 2.0 mL/min, o volume de
amostra injetada foi 0.8 ml (100 mg/mL). As frações cromatográficas contendo
Demetilwedelolactona e Wedelolactona (DWL/WL) e somente Wedelolactone (WL),
ambas em um alto grau de homogeneidade, foram identificadas pelo perfil da HPLC e
em espectro UV e NMR (1H and
13
C). Para realizar os ensaios biológicos o extrato
etanólico e as frações foram dissolvidas em dimethyl sulfoxide (DMSO) 10%.
Os extratos e frações foram gentilmente cedidos pelo Prof .Dr Paulo Sérgio
Pereira e o esquema da preparação dos extratos pode ser observado no fluxograma
apresentado na figura 3.
29
Coleta E.alba
Secagem
Moagem
Maceração
Extrato bruto etanólico
Partição liquido/líquido
Fração Hidroalcoólica
Fração Hexânica
Fração Acetato de Etila
Fração Aquosa
D /WL
WL
Figura 3: Preparação e purificação dos extratos e frações
4.2. Testes de sensibilidade a extratos vegetais nas linhagens de bactérias:
4.2.1. Linhagens bacterianas ATCC:
Escolhemos
linhagens
bacterianas
usualmente
utilizadas
em
testes
antimicrobianos por serem freqüentes em infecções hospitalares. Foram testadas duas
linhagens de bactérias gram positivas S. aureus ATCC 6538 e S. epidermides
ATCC2228 e duas linhagens de bactérias gram negativas E. coli ATCC 25922 e
Pseudomonas aeruginosa. As linhagens foram cultivadas em meio BHI (Oxoid).
30
4.2.2- Isolados de campo resistentes à antibióticos
Foram testados isolados de campo de S. aureus, Enterococcus sp, E. coli
Citrobacter sp. Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis e Klebsiella pneumoniae
resistentes a antibióticos coletadas em pacientes atendidos no Laboratório de Análises
Clínicas da UNAERP (LAC), gentilmente cedidas pela Dra. Adriana Pelegrino Pinho
Ramos e identificadas pela farmacêutica Janine de Castilho Andrade.
4.2.3 Métodos de Identificação
Para identificação das bactérias foram utilizados os seguintes testes:
Bacilo Gram - → serie bioquímica – TSI e fenilalanina
Bacilo Gram + → catalase + para Staphylococcus
catalase + →semeia-se em manitol e MI para coagulase
catalase - →ágar sangue (de acordo com a hemólise)
4.2.4 Antibiograma
A resistência dos isolados clínicos obtidos a partir de pacientes atendidos do LAC
foram obtidos através do método de Kirby-Bauer por princípio de difusão em Àgar
utilizando-se o meio Miller Hinton. Após a identificação da bactéria fez-se turvação em
salina de acordo com a escala de MacFarland 0,5, a seguir a bactéria foi espalhada no
meio de cultura Miller Hinton e adicionados os discos de antibióticos numa
concentração que variou de 5 a 30 µg/mL. Após confirmação da resistência as amostras
foram armazenadas em meio BHI com 15% de glicerol a -80C°. Os dados do
antibiograma das amostras são apresentados na tabela 1.
31
Tabela 1: Antibiograma dos isolados de campo do LAC, demonstrando a
resistência das amostras.
Isolados
Resistência ao (s) antibiótico (s) *
Enterococcus sp
T, CP, G, NO, NT
E. coli
A,TS
K. oxytoca
A
Citrobacter sp
A
K. pneumoniae
A, AC, T, TS,
S.aureus
A, P
Proteus mirabilis
NT
* Para ser considerada resistente as amostras bacterianas apresentaram
crescimento na concentração igual ou maior de 30µg/mL para cada antibiótico testado
T: Tetraciclina; CP: Ciprofloxacina; A: Ampicilina; G: Gentamicina; NO: Norfloxacina;
NT: Nitrofurantoina; TS: Associação trimetoprina/ sulfametazona; P: Penicilina; AC:
ácido nalidíxico
4.3. Ensaios de sensibilidade em bactérias
O efeito da atividade antimicrobiana das bactérias ATCC e dos isolados clínicos
resistentes a antibióticos foi avaliado pelo método de microdiluição em meio BHI em
placas contendo 96 poços , como descrito pelo NCCLS M7-A2 (1990) com pequenas
modificações para adaptar o protocolo no intuito de avaliar os extratos vegetais E. alba .
A concentração do inóculo foi ajustada em espectro utilizando comprimento de onda de
550nm, numa faixa de absorbância de 0,10 a 0,15. Em seguida, o inoculo padrão será
diluído 50 vezes em meio BHI e 100µL deste será utilizado por poço o que equivale a
32
1x 104 CFU/mL de cada linhagem de bactéria ensaiada. Os testes ocorreram numa faixa
de concentração de 5,0mg/mL até 0,019mg/mL do extrato bruto e frações ensaiadas.
Controles de esterilidade do meio de cultura e dos extratos foram realizados
conjuntamente. A concentração inibitória mínima que inibiu o crescimento
macroscópico das bactérias (CIM) foi determinada após 24 horas de crescimento
comparado com o crescimento do controle. Foram utilizados os antibióticos ampicilina,
cloranfenicol, sulfametazol e sulfadiazina de prata para controle de referência. Os
antibióticos foram dissolvidos em DMSO 10% na concentração estoque de 50mg/mL. A
figura 4 ilustra o ensaio de atividade antimicrobiana em placas de 96 poços.
33
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
Figura 4: Ilustração do método de microdiluição em meio BHI em placa contendo 96
poços, testando a atividade antibacteriana do extrato bruto E.alba e frações obtidas a partir
dele contra a linhagem de S.epidermidis (arquivo pessoal).
Linha 1: Controle de esterilidade do meio de cultura
Linha 2: Controle de esterilidade dos extratos e frações
Linha 3: Inóculo padrão da cultura de S.epidermidis
Linhas 4 a 12: Diluições seriadas das concentrações dos extratos e frações (5; 2,5; 1,25;
0,625; 0,321; 0,156; 0,078; 0,039 e 0,019 mg/mL).
A: Extrato bruto de partes aéreas etanólico
B: Fração fase aquosa
C: Fração acetato de etila: rica em cumestanos
D: Fração partição hexano
34
4.4. Testes de sensibilidade do extrato de Eclipta alba nas linhagens de
Dermatófitos:
4.4.1. Linhagens de dermatófitos:
O fungo Trichophyton rubrum foi selecionado para os testes por ser um fungo
endêmico encontrado em micoses de pele, pêlo e unha, e ultimamente muitos trabalhos
citam o aparecimento deste em casos de pacientes imunodeprimidos com freqüência.
Foram utilizadas duas linhagens (Figura 5), o isolado clínico H6 (depositado no
ATCC e que recebeu a denominação MYA-3108) e a linhagem mutante ∆TruMDR2
que apresenta o gene TruMDR2 rompido, este codifica um transportador do tipo ABC
em T. rubrum (FACHIN, 2006). O cultivo das linhagens foi realizado segundo os
métodos previamente descritos (FACHIN et al., 1996; 2001, 2006).
A linhagem ∆TruMDR2 é um transformante da linhagem H6 com o gene
TruMDR2 rompido, este gene codifica um transportador do tipo ABC, envolvido na
múltipla resistência à drogas. O gene marcador da transformação é o gene de resistência
à higromicina (hygBr ). A metodologia de ruptura gênica foi descrita e comprovada por
Fachin et al. (2006).
35
Linhagem
selvagem
Linhagem
mutante
Figura 5: Linhagens H6 (selvagem) e mutante (∆TruMDR2) cultivadas por 15 dias em
meio Sabouraud (arquivo pessoal)
4.4.2. Manutenção das linhagens:
Para repiques periódicos, o isolados ATCC MYA-3108 foi inoculado com o
auxílio de palitos de madeira estéreis em placas de Petri contendo meio ágar Sabouraud,
a linhagem ∆TruMDR2 foi mantida em meio ágar Sabouraud acrescida de 400µg/ml de
higromicina e mantidas em estufa a 28°C por um período de 15 dias. Para a preservação
dos isolados por períodos maiores foram utilizados tubos de ensaio inclinados com meio
ágar Sabouraud e a seguir foram cobertos com água estéril. Após o cultivo as linhagens
foram mantidas à temperatura ambiente.
36
4.4.3. Ensaios de sensibilidade dos fungos:
Soluções estoque das linhagens foi preparada como descrito pelo National
Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002 (NCCLS) protocolo M-38-P. A
formação de conídios foi induzida pelo crescimento das linhagens em placas de meio
Sabouraud a 28°C por cerca de 15 dias. As colônias foram cobertas com
aproximadamente 5 ml de solução salina 0,8%, a seguir o material foi colhido com o
auxílio de uma espátula estéril e transferido para um tubo estéril. Esta suspensão foi
diluída 1:50 em meio RPMI-1640 (LGC), que corresponde a duas vezes a densidade
necessária para testar aproximadamente 3.10
4
a 5.10 4 CFU/ml. Os extratos de E.alba
foram diluídos em DMSO 10%, pois experimentos prévios demonstraram que esta
proporção do solvente não interfere na viabilidade da solução de conídios do fungo
testado. Os testes para obtenção da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi realizado
em triplicata em três experimentos independentes em placas contendo 96 poços com
várias concentrações do extrato de planta ou frações deste na faixa de concentração de
5,0mg/mL até 0,01mg/mL. Para tal, primeiramente foram adicionados 100µL do meio
RPMI-1640 em cada poço da microplaca. A coluna 1 foi usada como controle negativo
adicionando-se somente 200 µL de meio RPMI (controle de esterilidade do meio de
cultura). A coluna 2 foi usada como controle de esterilidade do extrato vegetal (meio
RPMI + extrato ou fração vegetal). A coluna 3 foi usada como controle positivo
(contendo somente o inoculo padrão do fungo). Na coluna 4 foram colocados 100 µL da
solução estoque de E. alba na concentração de 10mg/mL antes da adição do inoculo e
5mg/mL após a adição do inoculo. A partir da solução da coluna 4 foram realizadas
diluições seriadas até a ultima coluna. A seguir, o inoculo padrão do fungo previamente
preparado foi distribuído com pipeta de 8 canais nos poços respectivos (controle
positivo e concentrações testadas). As placas de microdiluição foram incubados a 28°C
37
e examinados após 7 dias. Solução de fluconazol (1mg/mL) dissolvido em DMSO 10%
foi utilizado como controle de referência. No sentido de visualizar a metodologia a
Figura 6 exemplifica o ensaio de antividade antifúngica de extratos de E.alba contra as
linhagens de T.rubrum
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
C
D
Figura 6: Ilustração do método de microdiluição em placa de 96 poços testando a atividade
antifúngica de E.alba contra a linhagem H6 de T.rubrum (arquivo pessoal).
Linha 1: Controle de esterilidade do meio de cultura RPMI
Linha 2: Controle de esterilidade das frações
Linha 3: Inóculo padrão da solução de conídios da linhagem H6
Linhas 4 a 12: Diluições seriadas das concentrações das frações (5 a 0,019 mg/mL)
C: Fração acetato de etila: rica em cumestanos
D: Fração partição hexano
38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Ensaios de atividade antimicrobiana
5.1.1 Ensaios de atividade antibacteriana de extratos e frações de E.alba
Os resultados dos testes de sensibilidade antibacteriana (Tabela 2) indicaram que
a fração 3 e as substâncias demetil e wedelolactona apresentaram melhores resultados
frente as linhagens de bactérias testadas tanto Gram positivas quanto Gram negativas.
Para a fração partição hexano, obteve-se os valor de 5 mg/ml de CIM frente a S.aureus,
E. coli e P. aeruginosa. Já para S. epidemidis, o valor foi de 1,25mg/ml. Para a demetil
e wedelolactona o CIM foi 0,075 para S. aureus e 0,125 para S. epidermidis e E.coli e
para P.aeruginosa >1mg/mL. Para wedelolactona o valor de CIM para S.aureus e
P.aeruginosa foi 0,250 mg/mL, para S.epidermidis 0,500mg/mL e para E.coli
>1mg/mL. Estas frações mostraram resultados promissores, já que a concentração
inibitória mínima destes assemelha-se ao do agente inibidor de amplo espectro
sulfametozol, utilizado amplamente no controle de infecções microbianas (Tabela 2).
Outros antibióticos como a ampicilina, cloranfenicol e sulfadiazina de prata foram
ensaiados como controle de referência e mostraram atividade antimicrobiana
pronunciada para as bactérias ATCC ensaiadas (Tabela 2).
Para os isolados resistentes a antibióticos obtidos a partir de pacientes atendidos
no LAC da Unaerp as linhagens de Enterococcus sp e S. aureus foram mais sensíveis
para a fração rica em coumestanos e para a fração rica em wedelolactona (Tabela 3).
Apesar de Enterococcus sp e S. aureus, apresentarem resistência a vários antibióticos,
estas linhagens foram mais sensíveis ao extrato bruto estanólico que a linhagens ATCC
(Tabela 2), demonstrando a necessidade de caracterização clínica e microbiológica dos
isolados bacterianos de cada país a fim de evitar o uso de CIMs de antibióticos baseado
39
exclusivamente em dados de linhagens ATCC.
Assim sendo, estes resultados são
promissores devido ao valor de CIM obtido para os compostos vegetais de E.alba pois
este isolado clínico de S.aureus apresenta resistência à ampicilina. Nascimento et al.
(2000), avaliou a atividade antimicrobiana de extratos das plantas Achillea millifolium,
Caryophyllus aromaticus, Melissa offficinalis, Ocimun basilucum, Psidium guajava,
Punica granatum, Rosmarinus officinalis, Salvia officinalis, Syzygyum joabolanum
(jambolan) e Thymus vulgaris em linhagens sensíveis e resistentes a antibióticos.
Segundo os autores o maior potencial antimicrobiano foi observado para os extratos de
Caryophyllus aromaticus e Syzygyum joabolanum, que inibiram 64,2 e 57,1%
respectivamente dos microorganismos testados, sendo que a maior atividade foi
observada contra bactérias resistentes a antibióticos (83,3%). A associação de
antibióticos e extratos de planta demonstrou atividade antibacteriana sinérgica contra
bactérias resistentes.
40
Tabela 2: Concentração inibitória mínima (CIM) em mg/mL dos extratos e frações de
E.alba frente a linhagens de bactérias gram positivas e gram negativas ATCC
Compostos
Bactérias
S. aureus
S. epidermidis
E. coli
P. aeruginosa
1
2,5
1,25
5,0
5,0
2
5,0
5,0
5,0
5,0
3
1,25
0,625
5,0
2,5
4
5,0
1,25
5,0
5,0
D/WL
0,075
0,125
0,125
>1,0
WL
0,250
0,500
>1,0
0,250
Sulfametazol
1,25
2,5
5
1,25
Ampicilina
< 0,019
0,156
<0,019
0,078
Cloranfenicol
<0,019
<0,019
<0,019
0,078
Sulfadiazina de
0,625
0,156
0,078
0,078
prata
1:extrato bruto de partes aéreas etanólico
2: fração fase aquosa
3: fração acetato de etila:rica em cumestanos
4: fração partição hexano
D/WL: fração rica em demetil e wedelolactona (faixa de concentração testada foi de 1 a
0,019 mg/mL )
WL: fração rica em wedelolactona (faixa de concentração testada foi de 1 a 0,019
mg/mL )
Sulfametazol, ampicilina, cloranfenicol e sulfadiazina de prata : foram utilizados como
controle de referência
Para os compostos 1,2,3 e 4 a faixa de concentração testada foi 5 a 0,019mg/mL
41
Tabela 3: Concentração inibitória mínima (CIM) em mg/ mL, dos extratos e frações de
E.alba testadas na faixa de concentração de 5mg até 0,019mg /mL nas linhagens de
isolados clínicos resistentes a antibióticos
Bactérias
Compostos
1
2
3
4
WL
Enterococcus sp
0,312
>5,0
0,078
>5,0
0,250
E. coli
>5,0
>5,0
>5,0
>5,0
>500
Klebsiella oxytoca
>5,0
>5,0
>5,0
>5,0
>500
Citrobacter sp
>5,0
>5,0
>5,0
>5,0
>500
Klebsiella
>5,0
>5,0
>5,0
>5,0
>500
S.aureus
0,078
1,25
0,078
0,156
0,125
Proteus mirabilis
>5,0
>5,0
>5,0
>5,0
>500
pneumoniae
1:extrato bruto de partes aéreas etanólico
2: fração fase aquosa
3: fração acetato de etila: rico em cumestanos
4: fração partição hexano
WL: fração rica em wedelolactona (faixa de concentração testada foi de 500 a 0,019
mg/mL )
A fração D/WL não foi testada
42
Os primeiros estudos descritos na literatura a respeito da E. alba datam da década de
70, para uma infinidade de propósitos, principalmente como anti-ofídico (SANTOS,
2004). Além disso, a literatura relata efeitos antivirais (MI et al. 1997); efeito
antihiperglicemiante (ANANTHI, 2003); efeitos análgesicos (SAWANT et al. 2004);
efeitos antihepatotóxicos (SINGH, 2001, SAXENA et al., 1993), hipotensivos, diurético
e hipocolerosteloremico (RANGINENI et al. 2007). Não encontramos relatos na
literatura de efeitos antibacteriano e antifúngico dessa espécie vegetal. Entretanto,
Sawant et al. (2004), descreveu a aplicação desta planta no tratamento de várias doenças
de pele, provavelmente devido à ação antiinflamatória.
No entanto, inúmeros estudos com relação à atividade antibacteriana de algumas
espécies vegetais já foram relatados. Ribeiro et al, (2005) verificou a atividade
antibacteriana de Tabebuia avellanedae diante de linhagens de S.aureus. E. coli, S.
aureus, P. aeruginosa bem como S. epidermides, aparecem em destaque como causa
freqüente de infecções adquiridas na comunidade e no meio hospitalar. Kone (2004)
demonstrou também a atividade bactericida de extratos etanólicos de espécies como a
Erythrina senegalensis, Bobgunnia madagascariensis, Waltheria lanceolata, Uapaca
togoensis entre outras, sobre linhagens de bactérias Gram- Positivas e Gram-Negativas,
inclusive sobre aquelas que apresentavam resistência a antibióticos, tal como os
aminosídios, penicilina M, lincosamidas. Beker et al (2005) analisaram a atividade do
extrato metanólico de Lythrum salicaria do qual foram isolados ácido ursólico, ácido
oleanóico e flavonóides. Estas frações mostraram forte atividade contra S. aureus.
Schulz (2005) também realizou um estudo comparativo entre extratos metanólicos,
hexânicos, alcoólicos e hidroalcoolico de folhas de Newbouldia laevis, uma
bignoninaceae, para avaliação da atividade antimicrobiana, frente ao Gram-positivo
43
Bacillus megaterium, sendo constatado a bioatividade do extrato metanólico bem como,
a presença do triterpeno ácido oleanólico neste extrato. Samy (2005) comparou a
atividade antimicrobiana de extratos metanólicos e hexânicos de várias espécies
vegetais empregadas folcloricamente na Índia, os resultados também apontaram que
apenas os extratos metanólicos apresentaram atividade antimicrobiana.
5.2.2 Ensaios de atividade antifúngica de extratos e frações de E.alba
No que se diz respeito à linhagem fúngica testada, ou seja, o H6 e sua versão
mutante, ∆TruMDR2 de T rubrum, os valores de concentração inibitória mínima (CIM)
dos extratos e frações de E.alba testadas nas concentrações de 5 a 0,19 mg/mL estão
apresentados na Tabela 4. Esse estudo foi realizado em triplicata, e em todos foram
encontrados os mesmos valores. Assim sendo, a CIM do extrato bruto etanólico foi de
0,125 µg/ml frente às duas linhagens de T.rubrum.
Quanto ao extrato 2, cuja fração foi obtida pela adição aquosa, a CIM frente ao
H6 foi de 1,25 mg/ml e para sua versão mutante, o valor encontrado foi de 0,625 µg/ml.
Neste caso, o mutante mostrou-se mais sensível que a linhagem selvagem,
demonstrando que o gene TruMDR2 está envolvido com o transporte de substâncias
ativas presentes na fase aquosa do fracionamento. Fachin et al (2006) clonaram e
sequenciaram o gene TruMDR2 que codifica um transportador do tipo ABC. A ruptura
do gene TruMDR2 demonstrou que o mutante tornou-se mais sensível a três agentes
inibidores, sugerindo que este transportador desempenha uma função na modulação de
susceptibilidade a drogas em T. rubrum. Tal mutante tornou-se um importante modelo
para o estudo de resistência a drogas in vitro, o que pode auxiliar no desenvolvimento
de um fitoterápico que possa ser eficaz quando a terapia usual não for efetiva devido à
44
múltipla resistência. Todos esses fatores justificam o uso dessas duas linhagens na
ampliação de maiores possibilidades de tratamento.
Para fração 3 acetato de etila (rica em cumestanos ) a CIM tanto para o H6,
como para versão mutante, foram de 2,5 mg/ml. Valores coincidentes de CIM também
foram encontrados quando foi utilizada fração partição hexano, sendo de 1, 25mg/ml
para as duas linhagens. Assim, os resultados demonstraram que o valor de CIM foi
menor para o extrato bruto do que para as frações, o que pode ser um indício da
atividade antifúngica de um fitocomplexo. Diferentemente para a atividade
antibacteriana podemos observar que o menor valor de CIM foi de 0,075mg/mL obtidos
para as substâncias demetil e wedelolactona, sendo que para o extrato bruto o menor
valor de CIM foi de 1,25 mg/mL. Estes resultados sugerem que o fitocomplexo presente
no extrato bruto de E.alba tem efeito antifúngico mais pronunciado e a demetil e
wedelolactona puras tem ação mais específica contra as bactérias.
Na literatura não encontramos trabalhos que se diz respeito à inibição fúngica
alcançada pela E. Alba. No entanto, a inibição fúngica através de outros extratos
vegetais é bem conhecida. Assim, extratos vegetais de inúmeras espécies, como a
Coccinia adoensis, Cineraria grandiflora, Pavonia urens mostraram excelente
atividade contra Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Fusarium culmorum,
Staphylococcus aureus, Pseudomas syingae e Erwinia amylovora (BOER, 2005).
Determinadas substâncias, como as cumarinas, possuem excelente propriedade
antimicrobiana, principalmente na inibição do desenvolvimento da Candida albicans
(COWAN, 1999). Extratos alcoólicos de oito espécies de plantas medicinais,
Acokanthera schimperi (Apocynaceae), Calpurnia aurea (Leguminosae), Kalanchoe
petitiana
(Crassulaceae),
Lippia
adoensis
(Verbenaceae),
Malva
parviflora
(Malvaceae), Olinia rochetiana (Oliniaceae), Phytolacca dodecandra (Phytolaccaceae)
45
e Verbascum sinaiticum (Scrophulariaceae), tradicionalmente usadas no tratamento de
várias doenças de pele foram avaliadas pela sua atividade antimicrobiana contra
diferentes linhagens de bactérias e fungos que normalmente causam diferentes tipos de
lesão de pele. De todas as plantas testadas, Lippia adoensis e Olinia rochetiana foram
as mais efetivas contra linhagens de bactérias e fungos, respectivamente. Além disso, o
perfil de atividade antimicrobiana demonstrou que Staphylococcus aureus e
Trichophyton mentagrophytes foram as linhagens bacteriana e fúngica mais suscetíveis
respectivamente (TADEG et al, 2005).
46
Tabela 4: Concentração inibitória mínima (CIM) em mg/ mL dos extratos e frações de
E.alba contra as linhagens H6 (selvagem) e ∆TruMDR2 (mutante) de T rubrum.
Compostos
1
2
3
4
D/WL
WL
Fluconazol
Microorganismo
CIM
H6
0,125
Mutante
0,125
H6
1,25
Mutante
0,625
H6
2,5
Mutante
2,5
H6
1,25
Mutante
1,25
H6
>0,500
Mutante
0,500
H6
0,500
Mutante
0,500
H6
0,075
Mutante
0,075
1:extrato bruto de partes aéreas etanólico
2: fração fase aquosa
3: fração acetato de etila: rica em cumestanos
4: fração partição hexano
D/WL: fração rica em demetil e wedelolactona (faixa de concentração testada de 1 a
0,019 mg/mL )
WL: fração rica em wedelolactona (faixa de concentração testada de 1 a 0,019 mg/mL )
*Para os compostos 1,2,3 e 4 a faixa de concentração testada foi 5 a 0,019mg/mL
Fluconazol foi utilizado como controle de referência
47
6.CONCLUSÕES:
Os testes utilizados conseguiram comprovar a atividade antimicrobiana dos
extratos da E. alba, tanto nas linhagens de dermatófitos quanto nas linhagens
bacterianas ATCC e isolados resistentes a antibióticos.
Para as bactérias gram positivas S. aureus e S. epidermidis as duas substâncias
puras demetil e wedelolactona demonstraram atividade mais pronunciada que para o
extrato bruto.
Os isolado clínicos Enterococcus sp e S aureus, resistentes a antibióticos obtidos
de pacientes atendidos no LAC apresentaram-se também mais sensíveis à fração de
Acetato de Etila (rica em cumestanos) ambas na concentração de 0,078mg/mL ,
Em relação a atividade antifúngica, o extrato etanólico bruto foi mais efetivo
contra as duas linhagens de T.rubrum (CIM=0,125mg/mL) que para as frações ricas em
demetil e wedelolactona.
Os resultados sugerem que a atividade antimicrobiana de E.alba contra os
dermatófitos não está relacionada diretamente com a ação dos compostos wedelolactona
e demetilwedelolactona, mas com o fitocomplexo presente no extrato bruto,
diferentemente estas duas substâncias puras demonstraram atividade especifica e mais
pronunciada contra as bactérias ATCC Gram positivas ensaiadas.
.
48
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