quimioterapia na toxoplasmose

QUIMIOTERAPIA NA TOXOPLASMOSE:
TRATAMENTO DE INTERAÇÕES DO TOXOPLASMA GONDII
COM CÉLULAS LLCMK2 USANDO DERIVADO DE
NAFTOQUINONA
Juliana de Araujo Portes
Rio de Janeiro
2009
JULIANA DE ARAUJO PORTES
Aluna do curso de Biotecnologia
Matrícula: 0613800011
QUIMIOTERAPIA NA TOXOPLASMOSE:
TRATAMENTO DE INTERAÇÕES DO TOXOPLASMA GONDII
COM CÉLULAS LLCMK2 USANDO DERIVADO DE
NAFTOQUINONA
Trabalho de Conclusão de
Curso, TCC, apresentado ao
Curso de Graduação em
Biotecnologia, da UEZO
como parte dos requisitos para
a obtenção do grau de
Tecnólogo em Biotecnologia
sob a orientação da Prof.
Sergio Henrique Seabra.
Rio de Janeiro
2009
ii
QUIMIOTERAPIA NA TOXOPLASMOSE:
TRATAMENTO DE INTERAÇÕES DO TOXOPLASMA GONDII
COM CÉLULAS LLCMK2 USANDO DERIVADO DE
NAFTOQUINONAS.
Elaborado por Juliana de Araujo Portes
Aluna do curso de Biotecnologia da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com
Grau: 10,0 (Dez)
Rio de Janeiro, 27 de Julho de 2009.
___________________________________________
Anderson Jack Franzen, Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica)
___________________________________________
Jessica Manya Bittencourt Dias Vieira, Doutora em Ciências (Microbiologia)
__________________________________________
Sergio Henrique Seabra, Pós-Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica)
Orientador e Presidente da Banca
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL
JULHO DE 2009
iii
Dedico este trabalho à minha
amada família.
iv
Agradecimentos
A Deus, minha fortaleza, autor de todas as coisas.
A meus pais, Maria da Penha e Josias José, por todo o apoio para a realização
deste trabalho durante a graduação e o amor dispensados a mim.
A meus queridos irmãos João, Mariana e Anderson, que mesmo com a distância
geográfica, estão sempre comigo, fazem parte da minha história.
A minha “grande família”, agradeço a todos os domingos que vocês me
proporcionaram, importantíssimos para o meu descanso dos estudos.
Ao amor da minha vida, Renato Serpa Muller, obrigada pela presença, pela força
e apoio em todos os momentos.
Ao meu “pai científico”, professor Sergio Henrique Seabra, agradeço pela
dedicação conferida à nossa UEZO, ao esforço para que hoje estivesse sendo formada a
primeira turma de alunos desta universidade! E como sua aluna de iniciação científica,
agradeço pela oportunidade confiada, pela experiência adquirida e pela convivência
agradável.
Ao companheiro de bancada e por muito tempo única companhia no laboratório,
Thiago.
Aos professores, pela transferência do conhecimento através de aulas práticas
descontraídas e também por meio de enriquecedoras aulas teóricas, que com tudo,
proporcionaram maior admiração a mais bela ciência, a ciência que estuda a vida!
Ao técnico Francisco Medros Júnior, mais conhecido como Chico, pois sem a
sua ajuda nas passagens de toxo em meus momentos de fobia, nenhum experimento
sairia do papel. Obrigada pela paciência e pelos ouvidos de terapeuta!
v
Ao técnico Eliandro, o Deda, pela atenção com “pellets” que geraram as bonitas
imagens de microscopia.
Aos horários de almoço mais engraçados que sem as histórias do Célio e as
notícias da Kátia, não seriam da mesma maneira.
Aos amigos da graduação, pelas risadas, pelas xerox, pelas festinhas, enfim..pela
parceria de todos. Sentirei saudades!
Ao trio: Bruna, Thaiane e Patrícia, pessoas muito importantes para mim, com as
quais sempre pude contar, inclusive nestes últimos meses, os mais corridos de toda a
graduação. Amizades como estas, construídas a cada dia, não passarão. Obrigada por
tudo minhas amigas!
A amiga Paula Fernandes, agradeço pela força com as Naftoquinonas e por me
ajudar a escrevê-las em muitas das linhas desta monografia. Agradeço também por
todas as reações da temida Química Orgânica!
Agradeço à Instituição UEZO representada pelo professor Roberto Soares de
Moura, reitor do Centro Universitário, também ao professor Anderson Jack Franzen,
pró-reitor de Graduação e ao professor Sergio Henrique Seabra, pró-reitor de Pesquisa,
Extensão e Pós-graduação pelo empenho no desenvolvimento de seus trabalhos junto à
Universidade que bem refletem na formação de futuros profissionais como nós, alunos
da primeira turma.
A todos os funcionários desta Instituição, agradeço pela agradável convivência.
A todas as pessoas que indiretamente colaboraram para o desenvolvimento deste
trabalho.
vi
Resumo:
Toxoplasma gondii, o agente causador da toxoplasmose, é protozoário
intracelular obrigatório, estando presente em todo o mundo e infectando uma variedade
de células dos vertebrados incluindo fagócitos não profissionais e profissionais, como
macrófagos. Por isso, os fármacos para controle deste parasito devem possuir atividade
intracelular. Em estudos anteriores, quinonas apresentaram diferentes atividades
biológicas como ação microbicida e tripanossomicida, como o “burst” oxidativo, que
produz derivados de oxigênio (O2, OH, O2 -, H2O2). Dentro das naftoquinonas naturais,
lapachol é representante importante, pois este composto pode gerar estresse oxidativo
dentro das células e causar danos aos parasitos intracelulares, como o T. gondii. O
derivado de naftoquinona que teve sua atividade avaliada neste estudo é um análogo
estrutural sintético do β-lapachol. Este trabalho apresenta resultados do teste de
citotoxicidade deste derivado frente às interações do T. gondii com células LLCMK2,
fagócitos não profissionais. As interações foram realizadas na presença do derivado em
concentrações que variaram de 1,0 a 10,0 µM e na ausência do derivado. Os resultados
apresentados por Microscopia Eletrônica de Varredura mostram que o fármaco causa
danos ao parasita sem afetar a célula hospedeira. O derivado foi capaz de reduzir o
índice de infecção em interações do T.gondii com células LLCMK2. Esses resultados
sugerem que o derivado pode ser quimioterápico potencial para a Toxoplasmose, porém
mais testes precisam ser realizados, principalmente in vivo para a confirmação destes
achados.
Palavras-chave: Quimioterapia, Toxoplasma gondii, ultraestrutura, derivado de
naftoquinonas, atividade antiproliferativa.
vii
Abstract:
Toxoplasma gondii, the agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular
protozoan able to infect a wide range of vertebrate cells including nonprofessional and
professional phagocytes.
For this, the drugs to control this parasite must have
intracellular Activity. In previous studies, quinines show different biological activity
with microbicide and trypanossomicide action like the oxidative burst, that produces
oxygen derivatives (O2, OH, O2 -, H2O2). As a natural naphthoquinone, lapachol is an
important representative, since it can generate oxidative stress inside cells and cause
damage in intracellular parasites, such as T. gondii. The derivative that had its activity
tested in this work was a synthetic structure analog of β-lapachol. This work show the
outcomes of the citotoxity test with this derivative during T. gondii interactions with
nonprofessional phagocytes LLCMK2 cells. The interaction assays were realized in the
presence of the derivative (1,0 at 10,0 µM) or absence of derivative.The finds shown by
Scanning Electron microscopy that the drug cause damages in parasite without affecting
the host cells.
The derivative was capable to reduce the infection index during
interaction with LLCMK2, in comparison to the control. These results suggest that
derivative can be a potential chemotherapic for Toxoplasmosis, but more tests,
especially in vivo, are necessary to confirm these findings.
Keywords:
chemotherapy, Toxoplasma
derivative, antiproliferative activity.
gondii,
ultraestruture,
naphthoquinones
viii
“... por toda a nossa elegância
e eloqüência como uma
espécie, por todos os nossos
maciços lobos frontais, por
toda a nossa música, nós não
progredimos muito além do
que os nossos antepassados
microbianos. Eles ainda estão
conosco, são partes de nós, ou,
em outras palavras, nós somos
parte deles”.
(Lewis Thomas, 1987)
SUMÁRIO
Resumo ........................................................................................................................... vi
Abstract ......................................................................................................................... vii
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................1
1.1. Toxoplasma gondii..................................................................................................1
1.2. FÁRMACOS UTILIZADOS NO TRATAMENTO DA TOXOPLASMOSE.......5
1.3. FÁRMACOS COM ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA CONTRA
Toxoplasma gondii.........................................................................................................7
1.4 QUINONAS E NAFTOQUINONAS. .....................................................................7
1.4.1 Derivados de Naftoquinonas.........................................................................9
2. OBJETIVO ...............................................................................................................12
3. METODOLOGIA. ....................................................................................................13
3.1. OBTENÇÃO DE TAQUIZOÍTAS DE TOXOPLASMA GONDII ......................13
3.2. OBTENÇÃO DE CÉLULAS LLCMK2 ..............................................................13
3.3. DERIVADO DE NAFTOQUINONA .................................................................13
3.4. INTERAÇÃO IN VITRO ......................................................................................14
3.5. PREPARO DAS INTERAÇÕES PARA OBSERVAÇÃO EM MICROSCOPIA
ÓPTICA .......................................................................................................................14
3.6. PREPARO DAS INTERAÇÕES PARA OBSERVAÇÃO EM MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA ............................................................................15
4. RESULTADOS .........................................................................................................16
4.1. MICROSCOPIA ÓPTICA ...................................................................................16
4.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ........................................17
5. DISCUSSÃO .............................................................................................................19
6. CONCLUSÃO. ..........................................................................................................21
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................22
1. INTRODUÇÃO
1.1. Toxoplasma gondii
O Toxoplasma gondii é protozoário parasita intracelular obrigatório pertencente ao
Filo Apicomplexa (LEVINE et al.,1980), sendo a única espécie deste gênero, com
distribuição mundial em animais e humanos, é o agente causador da Toxoplasmose
(LYONS & JOHNSON, 1995). Os membros da Família Felidae, principalmente gatos
domésticos, são os hospedeiros definitivos do protozoário T.gondii. No entanto, há uma
ampla variedade de hospedeiros intermediários entre animais homeotermos, como os
pássaros, caprinos, ovinos, bovinos e humanos (HOWE et al., 1996).
O T.gondii apresenta um ciclo de vida complexo, do qual participam diversos
hospedeiros (Figura 1). Além disso, o protozoário apresenta formas infectantes distintas e
com morfologias características. Em hospedeiros definitivos o T.gondii está presente nas
células epiteliais do intestino do animal, onde pode se multiplicar de forma assexuada, por
endodiogenia (forma especial de reprodução em que duas células-filhas nascem dentro do
parasita-mãe, consumindo-o) ou sexuadamente, dando origem à gametas para a formação
do zigoto, o qual é envolvido por uma membrana cística. Os oocistos assim formados são
liberados nas fezes do animal. Em meio externo, estes oocistos amadurecem, formando em
seu interior esporocistos, que contém uma das formas infectantes: esporozoíta (DUBEY et
al.,1998).
Outra forma infectante é a bradizoíta, que é uma forma assexuada e de metabolismo
lento, presente em cistos teciduais do hospedeiro intermediário especialmente durante a
fase crônica da infecção, chegando a permanecer por longos tempos no tecido (MACRE,
2002).
2
Figura 1. Ciclo de vida do Toxoplasma gondii (Retirado de MACRE, 2002)
Taquizoíta é a forma que se multiplica rapidamente em todas as células do
hospedeiro intermediário e nas células epiteliais não-intestinais do hospedeiro definitivo.
Taquizoítas multiplicam-se assexuadamente dentro da célula hospedeira por repetidas
endodiogenias (DUBEY et al., 1998). Na endodiogenia, inicialmente o sistema de Golgi
divide-se primeiramente, em seguida, as partes anteriores dos complexos internos da
membrana e os microtúbulos subpeliculares das células filhas aparecem. O núcleo do
parasita se modifica para um formato de ferradura, com as pontas crescendo em direção
aos conóides. As células-filhas continuam a crescer até que alcancem a superfície da
célula-mãe, a qual é consumida, deixando livres as células-filhas (REY, 2002). A célula
hospedeira rompe quando já não pode suportar o crescimento e multiplicação dos
taquizoítas (Figura 2).
3
Figura 2. Representação da reprodução do T.gondii por endodiogenia (Retirado de BLACK &
BOOTHROYD, 2000)
A infecção humana pode ocorrer através da ingestão de água ou alimentos
contaminados com oocistos, excretados em fezes de gatos, ou cistos, em carnes cruas ou
mal cozidas (MACRE, 2002). Em organismos com o sistema imunológico em condições
normais, a infecção com T.gondii raramente é severa, sendo freqüentemente assintomática
na maioria dos casos. Em indivíduos imunodeficientes, os mais susceptíveis à infecção
pelo parasita, a condição mais comum é uma encefalite severa, cujos sintomas incluem
cefaléia, desorientação, letargia, hemiparesia, alterações de reflexos, convulsões.
Pneumonia e miocardite também podem ocorrer nestes indivíduos. Em crianças infectadas
através da gravidez, o parasita infecta o cérebro e a retina podendo causar várias
conseqüências. A situação mais comum é diminuição da visão. Nos casos graves, ocorre
retardamento mental, calcificações intracerebrais e hidrocefalia (MCAULEY et al., 1994).
O T.gondii possui uma extremidade anterior e uma extremidade arredondada
posterior. Ultraestruturalmente, sua célula consiste em várias organelas e estruturas
especializadas, que incluem uma membrana, núcleo, anéis apicais, anéis polares, conóides,
róptrias, micronemas, microporos, mitocôndria, microtúbulos subpeliculares, retículo
4
endoplasmático rugoso e liso, sistema de Golgi, ribossomos, microporos, núcleo, grânulos
densos e apicoplasto (Figura 3) (DUBEY et al., 1998).
O T.gondii não tem nenhum meio visível de locomoção tal como cílios, flagelos, ou
pseudópodes. As funções do conóide, das róptrias, dos microporos, e dos micronemas
estão provavelmente associadas com a penetração na célula hospedeira e a criação de um
ambiente intracelular apropriado para o crescimento e o desenvolvimento do parasita. O
conóide pode girar, inclinar, estender, e retrair enquanto o parasita sonda a membrana da
célula hospedeira imediatamente antes da penetração. Róptrias tem uma função secretora
associada com a penetração na célula hospedeira, liberando seu conteúdo através da
membrana para o exterior (DUBEY et al., 1998).
Sistema de Golgi
Figura 3. Forma taquizoíta do T.gondii (Retirado de MACRE, 2002)
Estudos têm sido realizados com a finalidade de conhecer processos inerentes à
infecção com T.gondii como mecanismos de invasão e infecção gerados em células
fagocíticas como o macrófago (SEABRA et al., 2004) e células fibroblásticas nãofagocíticas como célula Vero (SEABRA et al., 2002) .
O processo de invasão do T. gondii em células hospedeiras nucleadas pode ocorrer
de duas formas: via fagocitose (JOINER & DUBREMETZ, 1993) na qual o parasita não
5
tem participação ativa na entrada; ou por penetração ativa, onde o parasita entra em contato
com a membrana da célula hospedeira, força-a, e forma um vacúolo em torno do seu corpo.
Durante esse processo, organelas do parasita liberam secreções de substâncias específicas
como a MIC 2 (BROSSIER et al., 2003) que irão mediar a invasão. A translocação de
adesinas ligadas a substratos ou mesmo nas células hospedeiras, como a MIC 2, é regulada
pela polimerização de filamentos de actina que serve como substrato de ligação para
pequenas moléculas de miosina do parasita (TgMyoA). Esta miosina é do tipo estática e é
ligada ao complexo de membrana interna do parasita (SIBLEY, 2003). A característica do
TgMyoA de não ser móvel, somada a relativa escassez de filamentos de actina do parasita,
sugere que sua motilidade é governada pela polimerização local de filamentos de actina
disparado por um enucleador da polimerização conhecido, a aldolase, enzima ligada à via
glicolítica (JEWETT & SIBLEY, 2003). A aldolase serve como ponte entre o domínio
adesivo extracelular (MIC 2) e o citoesqueleto do parasita, provendo então a ligação
necessária para gerar a mobilidade na invasão do parasita à célula hospedeira (SIBLEY,
2003).
1.2. FÁRMACOS UTILIZADOS NO TRATAMENTO DA TOXOPLASMOSE
A maioria dos quimioterápicos para a toxoplamsose são fármacos antifolato, como
a combinação de Pirimetamina e Sulfadiazina. Embora esta terapia seja frequentemente
bem sucedida, está associada a muitos efeitos colaterais incluindo a supressão medular,
minimizada pela administração concomitante de ácido folínico (HAVERKOS H.W., 1987
apud DE SOUZA, W., 2006). Entretanto, é comumente necessária uma pausa no
tratamento com antifolato e no caso de indivíduos imunocomprometidos a doença pode
significar risco de vida, exigindo a realização de outra terapia. A sulfa é uma substância
não muito tolerada, devendo ser substituída por outros fármacos como Clindamicina
(MONTOYA et al., 2004 apud DE SOUZA, W., 2006).
A Pirimetamina é uma droga antimalárica usada no tratamento da toxoplasmose
concomitantemente com sulfa. Este fármaco é capaz de interromper o ciclo metabólico do
parasita, causando a inibição da enzima diidrofolato-redutase, impedindo a conversão do
ácido fólico em acido folínico, que é importante na síntese de seu DNA e RNA. O uso de
pirimetamina não é indicado no primeiro trimestre da gestação, pois possui efeito
teratogênico (ANDERSON & MORSE, 1966). Sua administração em doses altas pode
6
provocar vômitos, tremores, convulsões e depressão da medula óssea (REMINGTON et
aI., 2001).
As sulfadiazinas são análogos estruturais e antagonistas competitivos do ácido
paraminobenzóico (PABA), que é utilizado pelos parasitas na síntese do ácido fólico. A
combinação da sulfadiazina com a pirimetamina no tratamento nas infecções pelo T.gondii
aumenta a sua atividade em até oito vezes (EYLES & COLEMAN, 1955; SHEFFIELD et
al., 1972). A administração de sulfadiazinas não é indicada no final do terceiro trimestre da
gestação (REMINGTON et al., 2001), pois podem deslocar a bilirrubina fetal circulante de
sua ligação com a albumina permitindo seu deslocamento para o SNC e ocasionando
Kernicterus , uma síndrome associada com hiperbilirrubinemia que tem como efeitos
tardios retardo mental, paralisia cerebral, surdez e a paralisia nos olhos.
O Ácido Folínico é um adjuvante no tratamento com drogas antifolato como a
pirimetamina, por ser o ácido folínico unicamente utilizado pelo organismo humano,
prevenindo-se os problemas hematológicos decorrentes do uso dos antifolatos (FRENKEL
& HITCHINGS, 1957; FRENKEL et al., 1960). Não existem relatos de efeitos adversos
com o seu uso, mesmo em doses elevadas (ORÉFICE & BONFIOII, 2000).
Um dos medicamentos para a terapêutica materna da toxoplasmose é a
espiramicina, antibiótico macrolídeo com ação efetiva contra os taquizoítas do T. gondii
(GARIN & EYLES, 1968; NIEL et al., 1981). Em humanos, mantém concentrações
terapêuticas no sangue materno em vários tecidos e particularmente na placenta
(FORESTIER et al., 1987; BOURGET et al., 1996). Doses altas de espiramicina, acima de
35 mg/kg produzem vasoespasmo, calafrios, gosto estranho, vertigem, hiperemia da face,
náusea, vômitos, diarréia, anorexia e arritmias cardíacas. Nenhuma toxicidade
hematológica, hepática ou renal foi notada (STRAMBA-BADIALE et al., 1997). Este
fármaco não apresenta efeito teratogênico e por isso é utilizado por gestantes com
toxoplasmose aguda na tentativa de se reduzir a transmissão ao feto (BOURGET et al.,
1996). Não há estudos que demonstrem a eficácia desse medicamento no tratamento de
fetos infectados (FORESTIER et al., 1987), mas a espiramicina pode reduzir a severidade
da infecção fetal, principalmente por retardar o período em que ocorre a transmissão
placentário-fetal, dando ao feto tempo para adquirir maior maturidade imunológica
(COUVREUR et al., 1993).
7
1.3 FÁRMACOS COM ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA CONTRA
Toxoplasma gondii
DE SOUZA W. et al mostraram os efeitos antiproliferativos de dois fármacos,
ER119884 e E5700, contra Toxoplasma gondii em células epiteliais. Os fármacos tiveram
sua síntese baseada em inibidores da enzima esqualeno sintase (SQS), que catalisa uma
reação fundamental na via de biossíntese de esteróides, e possuem atividade seletiva contra
o parasita, podendo ser usados em associação a terapias já existentes contra a
toxoplasmose. Neste estudo, a ação dos fármacos também sugere interferência no
metabolismo de lipídeos por modificarem a ultraestrutura do parasita.
1.4 QUINONAS E NAFTOQUINONAS
Quinonas são compostos orgânicos considerados como produtos da oxidação de
fenóis, da mesma forma, a redução de quinonas pode originar seus correspondentes fenóis.
Sua principal característica é a presença de grupos carbonílicos que formam um sistema
conjugado com pelo menos duas ligações duplas C-C (SIMÕES et al., 2003). A figura 4
mostra os núcleos básicos de quinonas, naftoquinonas e antraquinonas.
O
O
O
O
O
O
O
quinonas
O
O
naftoquinonas
O
antraquinonas
Figura 4. Núcleos básicos de quinonas, naftoquinonas e antraquinonas. (Retirado de CARNEIRO, 2007)
As quinonas possuem porções alquilantes em sua estrutura e representam uma
classe de substâncias de interesse antitumoral. As enzimas mais importantes envolvidas na
ativação dessas quinonas são a NADPH: citocromo P450 redutase e a NAD(P)H: quinona
oxidorredutase (DT-diaforase) (OLIVEIRA et al., 2002). Mais de mil tipos de quinonas
estão distribuídos pela natureza, podendo ser encontradas em fungos, liquens, bactérias,
dentre outros (SIMÕES et al., 2003).
As quinonas de plantas superiores são sintetizadas através de diversas rotas
metabólicas. A lausona (2-hidroxi-1,4-naftoquinona) (Figura 5), que é uma naftoquinona
8
natural proveniente da Henna (Lawsonia inermis), é formada a partir de unidades
provenientes do ácido O-succinilbenzóico (SIMÕES et al., 2003). A lausona em testes in
vitro induziu aberrações cromossômicas, provavelmente devido à lesão oxidativa ao DNA
(MARZIN & KIRKLAND, 2004), além de induzir dano oxidativo a glóbulos vermelhos
(ZINKHAM & OSKI, 1996).
O
OH
O
Figura 5. Estrutura química da lausona (Retirado de FONSECA et al., 2003)
A presença de um átomo de nitrogênio, na estrutura da naftoquinona,
potencializa as atividades antitumoral e antimalarial (CAMARA et al; 2001). Estudos
também mostram que a presença de um átomo de enxofre influencia fortemente na
atividade antifúngica (TANDOM et al.; 2004).
O lapachol (2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftoquinona), uma naftoquinona
natural, apresenta variadas atividades biológicas como: microbicida, antifúngica,
moluscida, leishmanicida, tripanossomicida, antimalárico, antiinflamatório, antineoplásico
e antiulcerante (SILVA et al., 2003). É isolado de várias espécies de plantas da família
Bignoniaceas e encontrado facilmente em todas as regiões do Brasil (ARAUJO et al.,
2002). O primeiro isolamento foi feito do lenho de uma árvore argentina conhecida como
Lapacho (FONSECA et al., 2003).
O Lapachol como antimicrobiano apresenta predominantemente atividade contra
bactérias Gram-positivas, e pouca atividade contra Gram-negativas (FONSECA et al.,
2003). A substância é também ativa contra células cancerígenas, causando a regressão
definitiva de câncer em 30% dos pacientes tratados. Porém, apresenta alguns efeitos
colaterais como anemia e alteração no tempo de coagulação devido à semelhança da
estrutura do lapachol com a vitamina K (OLIVEIRA et al., 1990). Porém, existe a
problemática de o nível plasmático adequado do composto (30mg/mL) não ser atingido,
sem produção concomitante de efeito tóxico ao organismo (FONSECA et al., 2003).
Em ensaio de teratogenicidade, a administração oral de 100mg/Kg de lapachol
gerou efeito abortivo em ratas prenhas (Almeida et al.,1988). GUERRA et al, em 1999,
9
confirmou a embrioletalidade do Lapachol em ratas grávidas, mas sem afetar o sistema
reprodutivo das mesmas (GUERRA et al., 1999).
O Lapachol mostrou-se ainda ativo contra vírus RNA, atuando tanto sobre vírus
envelopados quanto sobre vírus sem esta estrutura (P1S - pólio tipo 1), em concentrações
de 5 a 10mg/mL. Apresentou ainda pequena atividade sobre HSV (Herpes simplex I) e
Ad5 (Adeno tipo 5) (FONSECA et al., 2003).
Através da administração por via oral, o lapachol é rapidamente absorvido pelo
trato gastrointestinal, distribuindo-se por todos os tecidos. Seis horas após a administração,
boa parte do fármaco desaparece dos tecidos, sendo rapidamente metabolizado e
parcialmente transformado em β-lapachona. Em camundongos, quando administrado
intravenosamente detecta-se um tempo de meia-vida de 33 minutos da substância. Sua
excreção é feita prioritariamente pelas vias geniturinárias e gastrointestinais (FONSECA et
al., 2003).
1.4.1. Derivados de Naftoquinonas
Derivados de naftoquinona estruturalmente relacionados ao Lapachol foram
sintetizados da Lausona e Arilmercúrios oxigenados. Estes compostos são também
identificados como derivados de pterocarpanos onde o anel aromático A foi substituído por
um núcleo 1,4-naftoquinona e mostraram possuir atividades biológicas significativas ao
inibirem a proliferação de células do câncer de mama humano (linhagem celular MCF-7)
cultivadas in vitro, serem ativos contra a infecção pelo vírus Herpes Simplex tipo 2 (HSV2) (DA SILVA et al., 2002).
Um dos compostos, modificado através da adição de hidroxilas reativas ao anel
aromático D, foi particularmente ativo em relação à proteção contra à miotoxicidade
induzida por veneno botrópico. Os resultados mostraram atividade contra os danos
causados ao sarcolema das células musculares, com valor relativamente baixo de IC 50
(concentração inibitória para 50% das células) igual a 1,3µM, o que diminui o possível
risco de toxicidade do composto ao organismo em possibilidades futuras de administração
deste como um fármaco (DA SILVA et al., 2002).
Estudos comparativos do efeito citotóxico do lapachol, da α-lapachona e de 1,4naftoquinonas pentacíclicas em células leucêmicas humanas mostraram que os compostos
derivados podem ser bioativados in situ por redução seguida por rearranjo. Tal rearranjo
10
conduz a intermediários que são agentes alquilantes poderosos, capazes de alterar
grupamentos do DNA evitando a duplicação celular (NETTO et al., 2009).
Baseados em ensaios in vitro descobriu-se compostos ativos com seletivas
atividades antitumoral, antileishmanial e antimalarial. A arquitetura molecular apresentada
na estrutura destes compostos derivados de 1,4-naftoquinonas foi feita por hibridização
molecular entre lapachol, α-lapachona e pterocarpanos 5. Os compostos testados foram
seletivos para as terapias de interesse, apresentando baixos níveis de toxicidade a linfócitos
puros de camundongos, o que resulta em um alto nível de segurança terapêutica. Porém, a
taxa de segurança para as células MCF-7 de câncer de mama humano foi mais baixa do
que a observada para ambos os parasitas. Um resultado já esperado, pois sabe-se que os
linfócitos são geneticamente mais similares à células de carcinoma de mamíferos do que de
protozoários parasitas Leishmania amazonensis e Plasmodium falciparum, agentes
causadores da leishmaniose e da Malária, respectivamente (DA SILVA et al., 2009).
Mostrou-se que pterocarpanos entre outros grupos de produtos naturais agem como
fitoalexinas ou fitoxinas, pequenas substâncias produzidas por plantas em defesa a ataques
de microrganismos. Esses compostos inibem o crescimento de bactérias e fungos in vivo e
in vitro, e sua produção durante uma infecção pode induzir a resistência às infecções
subseqüentes. A fitoalexina faseolina, por exemplo, é expressa em altas concentrações na
espécie de feijão Colombiano resistente ao fungo Colletrotricum lindemuthianun, o agente
causador da doença antracnose (KAMAT et al., 1981; MITSCHER et al., 1987).
Pterocarpanos apresentam outras interessantes propriedades biológicas dependendo
do tipo de substituição presente nos anéis A e D (Figura 6). O edunol isolado de Harpalyce
braziliana, uma planta do nordeste brasileiro usada na medicina popular apresenta
propriedades antiofídicas in vitro e in vivo (CHILPA apud DA SILVA et al., 2009).
Pterocarpanos, isolados de uma planta do gênero Erythrina apresenta atividade anti-HIV in
vitro (BOYD et al., 1997) e Crotafurano B, isolado de Crotalaria pallida apresenta
propriedades antiinflamatórias in vitro (LIN et al., 2006). Em 1995, o pterocarpano catecol
5 foi isolado de Petalostemon purpureus e mostrou ser ativo nas células KB, uma linhagem
celular de carcinoma epidermóide humano (CHAUDHURI et al.,1995; GOTTLIEB et al.,
1978., SALEM et al., 2006).
11
Figura 6. Pterocarpanos bioativos que ocorrem naturalmente (1-5) e derivado (6) (Retirado de DA SILVA et
al., 2009)
As 1,4- naftoquinonas mostraram-se altamente eficazes na eliminação de células
leucêmicas, particularmente aquelas resistentes a diversos medicamentos – as chamadas
linhagens MDR, do inglês “Multi Drug Resistance”, como a linhagem celular Lucena-1.
Como conseqüência do desenvolvimento dessas linhagens, muitos pacientes não
apresentam mais resposta a quimioterápicos de uso corrente na clínica médica, fenômeno
que é o maior responsável pelos casos de insucesso terapêutico. As substâncias também
possuem caráter biosseletivo, ou seja, sem toxicidade significativa para os linfócitos
ativados por fitohemaglutinina (PHA) e mostrou resultado igualmente bem-sucedido em
cultura de células tumorais de pulmão – um dos cânceres mais difíceis de tratar (NETTO et
al., 2009; DA SILVA et al., 2009).
12
2. OBJETIVO
2.1. Verificar a toxicidade do fármaco, composto derivado de naftoquinona, contra
parasita intracelular Toxoplasma gondii em interação com células LLCMK2.
2.2. Observar os aspectos estruturais, ultraestruturais e a viabilidade das células
hospedeiras e dos parasitas em diferentes condições como tempo de interação e
concentração da droga (Cálculo de IC 50).
13
3. METODOLOGIA
3.1. OBTENÇÃO DE TAQUIZOÍTAS DE TOXOPLASMA GONDII
Taquizoítas de Toxoplasma gondii (Cepa RH) foram mantidos por passagens
intraperitoneais em camundongos suíços (CF-1). Após 48h de infecção, os parasitas foram
coletados em solução salina de tampão fosfato (PBS) através de lavagem peritoneal. O
lavado peritoneal sofreu centrifugação (100g; 5’; 4°C), o sobrenadante coletado foi
centrifugado (1000g; 10’; 4°C) para a obtenção das formas taquizoítas. Os parasitas
contidos no pellet foram ressuspensos em DMEM e diluídos em fixador (Paraformaldeído
4% em PBS) para quantificação através da câmara de Neubauer ao microscópio óptico
convencional.
3.2. OBTENÇÃO DE CÉLULAS LLCMK2
As células fibroblásticas LLCMK2 (Monkey kidney cells) foram cultivadas em
meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium ) suplementado com soro fetal bovino
a 10%, e o pH do meio foi mantido numa atmosfera com CO2 a 5%, e a 37ºC. As células
multiplicaram-se até a formação de monocamada, aderente à superfície do frasco de
cultura. A subcultura dessas células foi obtida a partir de culturas confluentes, enquanto a
infecção com o parasita foi realizada em culturas subconfluentes. As células foram
subcultivadas, a partir de suspensões celulares obtidas por tripsinização dos frascos de
células em monocamada. Todas as operações envolvidas no manuseio das células e meios
de cultura celular foram efetuadas em condições de assepsia, com o uso de material estéril
em câmara de fluxo laminar.
3.3. DERIVADO DE NAFTOQUINONA
O composto derivado de naftoquinona utilizado foi sintetizado e cedido por
Chaquip D. Netto e colaboradores (Laboratório de Química Bioorgânica (LQB), Núcleo de
Pesquisas de Produtos Naturais, Centro de Ciências da Saúde, Bloco H, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, RJ 21941-590, Brasil).
14
Para estudos in vitro, este composto foi diluído em 100 µL de DMSO (dimetil
sulfóxido), tendo o estoque 118 mM de concentração. Foram preparadas alíquotas do
composto na concentração de 5mM em 2 mL de meio de cultura DMEM ( [DMSO]final =
4,25%). As alíquotas foram mantidas em freezer (-22°C);
O composto foi testado nas seguintes concentrações: 1,0 µM, 2,5 µM, 5,0 µM e
10,0 µM. A diluição da alíquota foi feita momentos antes de sua utilização para que
passasse a ter as diferentes concentrações de interesse. O DMSO presente nas alíquotas foi
diluído de acordo com a concentração utilizada: 100.000 vezes para 1µM ( [DMSO]final =
0,00085%); 40.000 vezes para 2,5 µM ( [DMSO]final = 0,002125%); 20.000 vezes para
5µM ( [DMSO]final =0,00425%) e 500 vezes para 10,0 µM ( [DMSO]final = 0,0085 %). O
controle foi feito com meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino
e com a concentração máxima de DMSO utilizado nos experimentos ([DMSO]final = 0,0085
%).
A preparação e manipulação do composto puderam ser feitas sem cuidados em
relação à iluminação do ambiente, pois este não é sensível à luz.
3.4. INTERAÇÃO IN VITRO
As células foram plaqueadas em lamínulas de vidro em placas de 24 poços e
infectadas na proporção de 10:1 parasitas por célula. Para que houvesse a interação, a placa
foi mantida por 1 hora em estufa de CO2. Após esta etapa as células foram lavadas para que
fossem removidos os parasitas extracelulares não-aderidos. O composto foi adicionado nas
concentrações de 1µM, 2,5µM, 5,0µM e 10µM às células infectadas segundo protocolo
descrito por De Souza W. et al., 2006.
3.5.
PREPARO
DAS
INTERAÇÕES
PARA
OBSERVAÇÃO
EM
MICROSCOPIA ÓPTICA
Após 24 horas e 48 horas de contato com o fármaco, as células foram fixadas em
solução de paraformaldeído 4% em PBS, coradas com corante Giemsa 10% em água
destilada, desidratadas em diferentes concentrações de acetona-xilol: 1) 100% acetona; 2)
100% acetona; 3) 70% acetona e 30% xilol; 4) 30% acetona e 70% de xilol; 5) 10%
acetona e 90% de xilol; 6) 100% xilol. Após desidratação as lamínulas foram montadas
15
sobre gotas de Entellan. As lâminas prontas foram observadas ao microscópio, e foi
realizada a contagem para o cálculo do Índice de Infecção e realização das análises
estatísticas (Quadro 1).
Quadro 1. Fórmula para o cálculo de Índice de Infecção (I.I):
(I.I) = % células infectadas (nº parasitas intracelulares/ nº total de células infectadas)
3.6. PREPARO DE LAMÍNULAS PARA OBSERVAÇÃO EM MICROSCOPIA
ELETRÔNICA DE VARREDURA
Na preparação para microscopia eletrônica de varredura, as lamínulas foram fixadas
em fixador de Karnovsky (paraformaldeído 4%, glutaraldeído 2,5%, tampão cacodilato de
sódio 0,1M, pH 7.4), desidratadas nas seguintes concentrações de acetona: 30%, 40%,
50%, 70% e 100%, secas em ponto crítico e cobertas com ouro através de metalização com
25nm de espessura. Após esse processamento das amostras, foram analisadas através da
confecção de imagens ao microscópio eletrônico de varredura Jeol JSM 6490LV.
16
4. RESULTADOS
4.1. MICROSCOPIA ÓPTICA
O gráfico plotado para determinação do IC50 mostra que a concentração 2,5µM foi
capaz de reduzir a taxa de proliferação do parasita em 50% em relação ao controle, sendo
esta uma concentração relativamente baixa.
Figura 7. Índice de Infecção das interações do Toxoplasma gondii com células LLCMK2 tratadas por 24 h e
48h com o derivado de naftoquinonas para determinação do IC50%. * Diferença significativa em relação ao
controle (p≤ 0,05)
O resultado mostrado anteriormente pode ser confirmado através do gráfico
resultante de outro ensaio com o tratamento quimioterápico in vitro com a utilização do
derivado de naftoquinona em diferentes concentrações, como: 1 µM, 2,5 µM, 5,0 µM e
10,0 µM, onde a concentração de 2,5 µM aparece como o IC50% capaz de controlar a
multiplicação do parasita em relação ao controle (Figura 8).
17
Figura 8. Índice de Infecção das interações do Toxoplasma gondii com células
LLCMK2 durante 1 h, 24 h e 48 h de tratamento com o derivado de naftoquinona
4.2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Os resultados obtidos por microscopia eletrônica de varredura das interações do T.
gondii com células fibroblásticas LLCMK2 são mostrados na figura 9. A micrografia 9-A,
mostra uma hora de interação na ausência do composto, onde é possível notar a integridade
no formato do corpo do parasita. Em 24 horas de interação na ausência do tratamento há
um pequeno vacúolo, muito comum ao vacúolo formado em mecanismo ativo de invasão
(B) . Após 48 horas de interação na ausência do derivado,há a formação de rosáceas,
estrutura característica de momentos de proliferação do parasita (C/D). Em 24 horas de
interação com tratamento com o composto na concentração de 2,5 µM, há a formação de
poros na membrana do parasita (E/F). O formato do corpo do parasita é mostrado com
mudança significativa e diminuição do tamanho em 48 horas de interação na presença do
composto na concentração de 2,5 µM (G/H).
18
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 9. Microscopia Eletrônica de Varredura da interação de células LLCMK2 com Toxoplasma gondii
durante o tratamento com o fármaco derivado de naftoquinona. A- 1 hora de interação na ausência de
tratamento com o composto. Note o mecanismo de invasão do parasita. B- 24 horas de interação sem o
tratamento com o composto. Note o vacúolo pequeno próximo ao corpo do parasita, similar ao do mecanismo
ativo de invasão (seta). C/D- 48 horas de interação na ausência de tratamento com o composto. Note a
formação de rosáceas. E/F- 24 horas de interação e tratamento com o composto na concentração de 2,5 µM.
Note a formação de poros na membrana do parasita (seta). G/H- 48 horas de interação na presença do
composto com concentração de 2,5 µM. Note os danos provocados ao parasita pelo tratamento, como a
modificação de sua estrutura
19
5. DISCUSSÃO
Em estudos anteriores, ZUMA et al descreveram que a β-lapachona é muito ativa
contra o Trypanosoma cruzi, mostrando que em células Vero infectadas com T.cruzi e
tratadas com o fármaco em diferentes concentrações, as células hospedeiras sofrem o efeito
da alta toxicidade do composto, e mesmo com a taxa de proliferação do parasita reduzida,
há grande perda das células Vero. Da Silva et al., sintetizaram compostos derivados de
naftoquinonas que foram testados in vitro apresentando atividades seletivas antitumoral,
antileishmanial e antimalarial. Estes fatos impulsionaram a realização dos testes com o
derivado de naftoquinona, em concentrações diferentes das testadas nestes estudos e em
células fibroblásticas LLCMK2 infectadas com o Toxoplasma gondii. Verificou-se, que a
toxicidade do derivado de naftoquinona contra o parasita intracelular Toxoplasma gondii
em interação com células LLCMK2 ocorre, sugerindo efeito antiproliferativo do fármaco.
O composto foi ainda capaz de reduzir o índice de infecção destas células, sendo também
observadas alterações na membrana do parasita, o que aparentemente pode estar ligado à
via de biossíntese de lipídeos de membrana do mesmo.
De Souza, W. et al mostraram os efeitos antiproliferativos dos fármacos ER119884
e E5700, contra Toxoplasma gondii em células epiteliais. Suas sínteses se basearam em
inibidores da enzima Esqualeno sintase (SQS), enzima fundamental da via de biossíntese
de esteróides, que possuem atividade seletiva contra o parasita, sendo sugeridos para
utilização em associação a terapias já existentes contra a toxoplasmose. Protozoários
parasitas como o T.gondii, Tripanossoma cruzi e Leishmania spp. sintetizam o esterol
ergosterol, mas não o colesterol, e assim, neste parasita, etapas da biossíntese de esteróis
que são divergentes em relação à síntese realizada por células de mamíferos, têm sido
intensamente estudadas como alvo quimioterápico (DE SOUZA, W., 2006; CAMMERER,
S. B, 2007) . O possível mecanismo de ação destes fármacos estaria relacionado a
interferência com o metabolismo de lipídeos por modificar a ultraestrutura do parasita,
levando ao inchaço de organelas como a mitocôndria e também de estruturas de membrana
da célula, como vacúolos parasitóforos.
Os derivados de 1,4-naftoquinonas com seletivas atividades antitumoral,
antileishmanial e antimalarial possuem a interessante característica de ter baixa toxicidade
a linfócitos puros de camundongos, resultando em altos níveis de segurança terapêutica.
Sendo a taxa de segurança para as células MCF-7 de câncer de mama humano mais baixa
20
do que a observada para Leishmania amazonensis e Plasmodium falciparum, devido a
similaridade entre as estruturas celulares de células de carcinoma de mamíferos e os
linfócitos sadios (DA SILVA et al., 2009). O mecanismo de ação deste derivado de
naftoquinona é ainda desconhecido contra o Toxoplasma gondii e contra o Plasmodium
falciparum, agente etiológico da Malária, mas podem ser mecanismos similares, pois
ambos os parasitas são pertencentes ao filo Apicomplexa. Já é conhecido que estes
parasitas não possuem o complexo NADH desidrogenase tipo 1 (complexo I) mas no lugar
deste, possuem alternativamente NADH desidrogenase (tipo II), que são ausentes em
células de mamíferos e por isso são considerados alvos promissores para fármacos
antimicrobiais como o composto1-hidroxi-2-dodecil-4(1H)quinolona (HDQ), derivado de
quinona identificado como inibidor de alta afinidade desta enzima ( SALEH et al., 2007).
Fármacos para o tratamento da Toxoplasmose são eficazes, mas carregam com a
atividade biológica sobre a terapia de interesse, muitos efeitos colaterais, incluindo a
supressão da imunidade, e outros sintomas que levam a resistência dos pacientes ao
tratamento, como: vômitos, tremores, convulsões e depressão da medula óssea
(REMINGTON et aI., 2001). Estudos relacionados a quimioterapia antiparasitária se
tornam então importantes para o desenvolvimento de novos fármacos potenciais para o
tratamento da Toxoplasmose, que ocorrem através da identificação de alvos específicos em
vias metabólicas-chaves para os parasitas. Isso ressalta a importância de estudos como o
desenvolvido neste trabalho, que auxiliam na confirmação dos alvos escolhidos para o
tratamento quimioterápico.
Investigações posteriores devem incluir a análise do perfil lipídico das células
infectadas tratadas com o fármaco, além da observação e análise da estrutura celular do
parasita em nível de citoesqueleto, pois este fármaco age modificando a estrutura do
parasita, que adquire formato circular e reduzido após tratamento, diferente do seu formato
comum, traduzido em seu próprio nome (Toxon = arco e plasma = formato, do grego).
21
6. CONCLUSÃO
• Verificou-se que a toxicidade do derivado contra o T.gondii “in vitro”, é existente,
sugerindo efeito antiploriferativo da droga, que foi capaz de reduzir o índice de
infecção das células numa concentração relativamente baixa, 2,5 µM, sendo esta a
concentração inibitória para 50% parasitas em relação ao controle.
•
Em um ensaio de cinética, este dado pode ser confirmado, após tratamento
quimioterápico in vitro com a utilização do derivado de naftoquinona em diferentes
concentrações, variando de 1,0 µM a 10,0 µM, a concentração de 2,5 µM aparece
como IC50 em relação ao controle do índice de infecção das células.
• As imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura após o tratamento das
interações entre célula hospedeira e taquizoítas de Toxoplasma gondii com o
composto na concentração de interesse (2,5 µM) mostram que o parasita tem sua
estrutura danificada, com a presença de poros em sua membrana. É visível também
a perda do formato do corpo característico do parasita, além da diminuição de seu
tamanho.
• A observação das alterações na membrana do parasita sem no entanto afetar a
viabilidade e estrutura da célula hospedeira, indicam que o mecanismo de ação
deste composto derivado de naftoquinona pode estar ligado à via de biossíntese da
membrana plasmática do parasita, sendo um quimioterápico com resultados
promissores para uma futura aplicação terapêutica contra o parasita T.gondii.
22
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALMEIDA, E.R.; MELLO, A.C.; SANTANA, C.F.; FILHO, A.A.S.; DOS SANTOS, E.R.
The action of 2-hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)1,4-naphtoquinone (Lapachol) in pregnant
rats. Revista Portuguesa de Farmácia, v.38, Nº 3, p.21-23, 1988.
BLACK, M. W. & BOOTHROYD, J.C. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii. Microbiology
and Molecular Biology Reviews, v.64, Nº 3, p.607–623, Set. 2000.
BOYD, M.; MCKEE, T. C.; BOKESCH, H. R.; MCCORMICK, J. L.; RASHID, M. A.;
SPIELVOGEL, D.; GUSTAFSON, K. R.; ALAVANJA, M. M.; CARDELLINA, J. H.
Isolation and characterization of new anti-HIV and cytotoxic leads from plants, marine,
and microbial organisms. J. Nat. Prod., v.60, 431, 1997.
BROSSIER, F.; JEWETT, T.J.; LOVET, J.L. & SIBLEY, L.D. C-terminal processing of
the Toxoplasma protein MIC2 is essential for invasion into host cells. J. Biol. Chem.,
v.278, p.6229-6234, 2003.
CAMMERER, S. B.; JIMENEZ, C.; JONES, S.; GROS, L.; LORENTE, S. O.;
RODRIGUES, C.; RODRIGUES, J. C. F.; CALDERA, A.; PEREZ, L. M. R.; DE
SOUZA, W.; KAISER, M.; BRUN, R.; URBINA, J.A.; PACANOWSKA, D. G.;
GILBERT, I. H. Quinuclidine Derivatives as Potential Antiparasitics. Antimicrobial
Agents And Chemotherapy, v.51, Nº11, p.4049–4061, 2007.
CARNEIRO, P. F. Síntese de compostos naftoquinônicos com potencial atividade
anticâncer e estudo da atividade antimicrobiana. Trabalho de Conclusão de Curso
Superior de Tecnologia em Química de Produtos Naturais. Centro Federal de Educação
Tecnológica de Nilópolis : Rio de Janeiro, 2007.
CHAUNDHURI, S. K.; HUANG, L.; FULLAS, F.; BROWN, D. M; WANI, M. C.;
WALL, M. E. Isolation and Structure Identification of an Active DNA Strand-Scission
Agent, (+)-3,4-di-hydroxy-8,9-Methylenedioxypterocarpan. J. Nat. Prod., v.58, p.19661969,1995.
COURA, J. R.; DE CASTRO, S. L. A Critical Review on Chagas Disease Chemotherapy.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.97(1): p.3-24, 2002.
COUVREUR, J.; DESMONTS, G. Toxoplasmosis: Parasitic infections inpregnancy and
the newborn. New York, Oxford University Press, p.112-142, 1988;
COUVREUR, J.; THULLIEZ, P.; DAFFOS, F.; AUFRANT, C.; BOMPARD,Y.;
GESQUIERE, A.; DESMONTS, G. In útero treatment of toxoplasmic fetopathy with the
combination pvrimethamine-sulfadiazine. Feral. Diagn. Ther., v.8, p.45-50, 1962.
23
DA SILVA, A. J. M.; BUARQUE, C.D.; BRITO, F.V.; AURELIAN, L., MACEDO, L. F.;
MALKAS, L.H.; HICKEY, R. J.; LOPES, D. V. S.; NOEL, F.; YUGO, L. B. M.; SILVA,
N. M. V.; MELO, P. A.; CARUSO, R. R. B.; CASTRO, N. G.; COSTA, P. R. R. Synthesis
and Preliminary Pharmacological Evaluation of New (±) 1,4-Naphthoquinones Structurally
Related to Lapachol. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v.10, p.2731–2738, 2002.
DA SILVA, A. J. M.; NETTO, C. D.; COSTA, P. R. R.; J. Braz. Chem. Soc. 2004, 15,
979;
NETTO, C. D.2003. Dissertação, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil, 2003.
DA SILVA, A. J. M.; NETTO, C.D.; LIMA, W. P.; SANTOS, E.C.T.; BERGMANN,
B.R.; MARUEL, S.; VALENTIN ,A.; COSTA, P.R.R. Antitumoral, Antileishmanial and
Antimalarial Activity of Pentacyclic 1,4-Naphthoquinone Derivatives. J. Braz. Chem.
Soc., v. 20, Nº1, p.176-182, 2009.
DE MOURA, K. C. G.; EMERY, F. S.; PINTO, C. N.; PINTO, M. C. F. R.; DANTAS, A.
P.; SALOMÃO, K.; DE CASTRO, S. L.; PINTO, A. V. Trypanocidal Activity of Isolated
Naphthoquinones from Tabebuia and Some Heterocyclic Derivatives: A Review from an
Interdisciplinary Stud, J. Braz. Chem. Soc., v.12, p.325, 2001.
DE SOUZA, W.; DUARTE, E.S.M.; URBINA, J.A.; VOMMARO, R. C. Antiproliferative
activities of two novel quinuclidine inhibitors against Toxoplasma gondii tachyzoites in
vitro. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.58, p.59–65, 2006.
DE SOUZA, W.; RODRIGUES, J.C.F.; CONCEPCION, J.L.; RODRIGUES, C.;
CALDERA, A., URBINA, J.A. In vitro activities of ER-119884 and E5700, two potent
squalene synthase inhibitors, against Leishmania amazonensis: antiproliferative,
biochemical, and ultrastructural effects. Antimicrob Agents Chemother, v.52(11),
p.4098-4114, 2008.
DO AMARAL, W.N. Diagnóstico da Toxoplasmose fetal mediante a identificação de
anticorpos específicos no líquido amniótico.2006. Tese (Doutor em Doenças Infecciosas
e Parasitárias) – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. Universidade Federal de
Goiás, Goiânia, 2006.
DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S.; SPEER,C. A. Structures of Toxoplasma gondii
Tachyzoites, Bradyzoites, and Sporozoites and Biology and Development of Tissue Cysts.
Clinical Microbiology Reviews, v.11(2), p.267–299, 1998.
EYLES, D.E.; COLEMAN, N. Evaluation of the curative effects of pyrimethamine and
sulfadiazine, alone and in combination, on experimental mouse toxoplasmosis. Antibiot.
Chemother., v.5, p.529-539, 1955.
24
FORESTIER, F.; DAFFOS, F.; RAINAUT, M.; DESNOTTES, J.F.; GASCHARD, J.C.
Sulvi therapeutique foetomaternel de la spiramycine en cours de grossesse. Arch. Fr.
Pediatr., v.44, p.539-544,1987.
FRENKEL, J.K.; HITCHINGS, G.H. Relative revesal by vitamins (p-aminobenzoic, folic
and folinic acids) of the effects of sulfadiazine and pyrimethamine on Toxoplasma, mouse
and man. Anábiot Chemother. v.7, p.630-638,1957.
FRENKEL, J.K.; WEBER, R.I.V.; LUNDE, K.I.N.; Acute toxoplasmosis. Effective
treatment with pyrimethamine, sulfadiazine, leucovorin, calcium, and yeast. JAMA. v.173,
p.1471-1476, 1960.
GARIN, J.P.; PELLART, J.; MAILLARD, M. et al. Bases théoriques de la prevention par
la spiramycine de la toxoplasmose congénittale chez la femme enceinte, v.76, p.2266,
1968.
GOTTLIEB, O. R.; COOK, J. T.; OLLIS, W. D., SUTHERLAND, I. O. Pterocarpans from
Dalbergia spruceana. Phytochemistry, v.17, p.1419, 1978.
GUERRA, M. O. et al. Interceptive effect of Lapachol in rats. Contraception, v.60, p.305307, 1999.
GUERRA, M.O.; MAZONI, A.S.B.; Brandão, M.A.F. and Peters, V.M. Toxicology of
Lapachol in rats: embryolethality. Rev. Brasil. Biol., v.61(1), p.171-174, 2001.
HOWE, D. K.; SUMMERS, B. C. & SIBLEY, L. D. Acute virulence in mice is associated
with markers on chromossome VIII in Toxoplasma gondii. Infect. Immun., v.64(12), p.
5193-5198, 1996.
JEWETT, T.J. & Sibley, L.D. Aldolase forms a bridge between cell surface adhesins and
the actin cytoskeleton in apicomplexan parasites. Molec. Cell., v.11, p.885-894, 2003.
JOINER, K.A. & DUBREMETZ, J.F. Toxoplasma gondii: a protozoan for the nineties.
Infect. Immun., v.61, p.1169-1172, 1993.
LEVINE, N. D.; CORLISS, J. O.; COX, F. E. G.; DEROUX, G.; GRAIN, J.;
HONIGBERG, B. M.; LEEDALE, G. F.; LOEBLICH, A. R.; LOM, J.; LYNN, D.;
MERINFELD, E. G.; PAGE, F. C.; POLJANSKY, G.; SPRAGUE, V.; VAVRA, J. &
WALLACE, F. G. A newly revised classification of the Protozoa. J. Protozool., v.27(1),
p.37-58, 1980.
LIN, M.; TSAO, L.; HUANG, L.; KUO, S.; WENG, J.; KO, H.; LIN, C.; LEE, M.;
WANG, J. Inhibition of lipopolysaccharide-stimulated NO production by crotafuran B in
25
RAW 264.7 macrophages involves the blockade of NF-κB activation through the increase
in IκBα synthesis.Toxicol. Appl. Pharm.,v.210, p.108, 2006.
LYONS, R. E. & JOHNSON, A. M. Heat shock proteins of Toxoplasma gondii. Parasite
Immunology, v.17, p.353-359, 1995.
MACRE, M. S. Avaliação da Quantificação da avidez de anticorpos maternos na
abordagem laboratorial da Toxoplasmose congênita. 2002. 112p. Dissertação (Mestre
em Ciências) – Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002. Orientador : Heitor Franco de Andrade
Junior.
MCAULEY, J.; BOYER, K.M.; PATEL, D., et al. Early and longitudinal evaluations of
treated infants and children and untreated historical patients with congenital toxoplasmosis:
the Chicago Collaborative Treatment Trial. Clin. Infect. Dis., v.18, p.38–72, 1994.
NETTO, C. D.; SANTOS, E. S. J.; CASTRO, C. P.; DA SILVA, A. J. M.; RUMJANEK,
V. M.; COSTA, P. R. R.; European J. Med. Chem. DOI: 10.1016/j.ejmech. 01.027;2008.
NETTO, C.D.; SALUSTIANO,E. J. S.; FERNANDES,R. F.; BACELAR, T. S.;
RUMJANEK, V. M.; DA SILVA, A. J. M.; CASTRO,C. P.; BUARQUE,C. D.; MAIA, R.
C.; COSTA, P. R. R. Comparison of the cytotoxic effect of lapachol,α-lapachone and
pentacyclic 1,4-naphthoquinones on human leukemic cells. Invest. New Drugs, 2009.
NIEL, G.; VIDEAU. D. Activité de la spiramycione in vitro sur Toxoplasma gondii.
Reunión Inter Discipl. Chimioth. Antiinfect. 121: 8, 1981.
REY, L. Bases da parasitologia Médica. 2.ed. RIO DE JANEIRO: Guanabara Koogan,
2002. p.102-105.
SALEH, A.; FRIESEN, J.; BAUMEISTER, S.; GROSS, U.; BOHNE, W. Growth
Inhibition of Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum by Nanomolar
Concentrations of 1-Hydroxy-2-Dodecyl-4(1H)Quinolone, a High-Affinity Inhibitor of
Alternative (Type II) NADH Dehydrogenases. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 51, Nº4, p.1217–1222, 2007.
SALEM, M. M. & WERBOVETZ, K. A. Isoflavonoids and Other Compounds from
Psorothamnus arborescens with Antiprotozoal Activities. J. Nat. Prod., v.69, p.43, 2006.
SEABRA, S.H.; DAMATTA, R.A.; DE MELLO, F.G.; DE SOUZA, W. Endogenous
polyamine levels in macrophages is sufficient to support growth of Toxoplasma gondii. J.
Parasitol., v.90(3), p.455-60, 2004.
26
SEABRA, S.H.; DE SOUZA, W.; DAMATTA, R.A. Toxoplasma gondii partially inhibits
nitric oxide production of activated murine macrophages.Exp. Parasitol., v.100(1), p.6270, 2002.
SHEFFIELD, H.G.; MELTON, M.L.; Effect of pyrimerhamine and sulfadiazine on the
fine structure and multiplication of Toxoplasma gondii in cell cultures. J. Parasitol., v.61,
p.704-712, 1972.
SIBLEY, L. D. Toxoplasma gondii: perfecting an intracellular life style. Traffic., v.4,
p.581-586, 2003.
SILVA, M.N.; FERREIRA, V.F.; DE SOUZA, M.C.B.V. An overview of the chemistry
and pharmacology of naphthoquinones with emphasis on b-lapachone and derivatives.
Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Federal
Fluminense, Niterói, RJ, 2003.
STRAMBA-BADIALE, M.; NADOR, F.; PORTA, N.; GUFFANTI, S.; FREDIANI, M.;
COLNAGHI, C.; GRANCINI, F.; MOTTA, G.; CARNELLI, V.; SCHWARTZ, P.J.T.
Interval prolongation and risk of life-threatening arrhythmias during toxoplasmosis
prophylaxis with spiramycin m neonates. Am Heart J., v.133, p.108-111,1997.
SWAPAN, K.C.; Huang, L.; Fullas, F.; Brown, D.M.; MANSUKH, C. W.; MONROE,E.
W.; JOHN, C. T., Christopher W. W. B.; Kinghorn, A. D. Isolation and Structure
Identification of an Active DNA Strand-Scission Agent, (+)-3,4-di-hydroxy-8,9Methylenedioxypterocarpan. J. Nat. Prod., v.58, p.1966, 1995.