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Kladine Monique Fernandes
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO PELO Vírus da
leucemia felina (FeLV): IMPLICAÇÕES NA
PRÁTICA CLÍNICA
São Paulo/SP 2015
Kladine Monique Fernandes
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO PELO Vírus da
leucemia felina (FeLV): IMPLICAÇÕES NA
PRÁTICA CLÍNICA
Monografia apresentada como requisito
para conclusão do Curso de Pós-Graduação,
Especialização em Clínica Médica de
Felinos, do Centro de Estudos Superiores
de Maceió, da Fundação Educacional
Jayme de Altavila, orientada pela Dra.
Claudia Filoni.
São Paulo/SP 2015
Agradecimento
Ao Sérgio Cundari Jr , meu esposo, pela paciência em me ouvir em todos os momentos
em que precisei e que sempre me incentivou em todos os momentos difíceis desta
caminhada.
A amiga Heloísa Faria e seu esposo Gabriel, que gentilmente me concediam seu
apartamento para que eu pudesse desfrutar das aulas.
À Professora Doutora Claudia Filoni, por ter aceitado orientar este trabalho. Obrigada
pela paciência e disponibilidade de contribuir com minha evolução. A você minha
eterna admiração, gratidão e carinho.
Lista de Abreviaturas: siglas, símbolos e acrônimos
DNA
ácido desoxirribonucleico
RNA
ácido ribonucleico
mRNA
RNA mensageiro
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay (ensaio imunossorvente ligado a enzima)
FeLV
Vírus da leucemia felina
enFeLV
FeLV endógeno
IFA
imunofluorescência indireta
gp
glicoproteína
MuLV
Vírus da leucemia murina
PCR
polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
RT-PCR
reverse transcription PCR (PCR precedida pela transcrição reversa)
SUMÁRIO
1.0
2.0
3.0
4.0
Introdução ................................................................................................. 1
Agente Etiológico ..................................................................................... 1
Patogenia ................................................................................................... 3
Epizootiologia ........................................................................................... 5
4.1Distribuição e Prevalência ........................................................................... 5
4.2 Transmissão ................................................................................................ 6
5.0 Sinais Clínicos .......................................................................................... 6
6.0 Diagnóstico ............................................................................................... 8
7.0 Vacinação ................................................................................................. 12
8.0 Considerações finais ................................................................................. 12
Referências ....................................................................................................... 14
RESUMO
O Vírus da leucemia felina (FeLV) foi isolado no ano de 1964 por Willian Jarrett e sua
equipe, no momento em que pesquisavam a origem de linfomas em gatos domésticos
em um abrigo de felinos na Escócia. O FeLV pertence à família Retroviridae, gênero
Gammaretrovirus. É de suma importância na medicina veterinária, por acometer felinos
domésticos e selvagens e devido estar envolvido com diversas alterações hematológicas,
imunossupressão e diversas doenças neoplásicas. A frequência de ocorrência de
infecção está associada a determinados fatores de risco e medidas de controle e
profilaxia. O meio mais comum de transmissão é o contato oronasal entre felinos sadios
e portadores assintomáticos, que fazem a eliminação viral durante anos. Este vírus
acarreta imunossupressão, doenças imunomediadas ou mesmo neoplasias. Uma
característica que diferencia os retrovírus dos demais vírus é que possuem a capacidade
de sintetizar uma DNA (ácido desoxirribonucleico) a partir de um genoma que é
constituído por RNA (ácido ribonucleico), por meio de um processo denominado
transcrição reversa mediado por uma enzima de mesmo nome. O gênero possui vírus
endógenos e exógenos. Podem ser classificados de acordo com as quantidades de
espécies que podem infectar e também de acordo com os receptores para essa espécie de
vírus. A classificação da infecção viral e suas fases levam em conta o tipo de resposta
imunitária, carga infectante e genética do hospedeiro e são denominadas de infecção
regressiva, infecção progressiva, infecção latente e infecção atípica. Diversos fatores
como idade, carga viral, subtipo viral, via de exposição ao vírus, estado imunitário do
animal e a presença de doenças concomitantes, podem influenciar na via como o FeLV
progride. A prevalência do FeLV e das doenças associadas estão diminuindo desde os
anos 1980 nos países que adotaram programas que têm por finalidade o diagnóstico e a
prevenção, mesmo sendo considerada uma doença infecto contagiosa entre os felinos. O
FeLV é uma infecção comum na rotina clínica de felinos, porém pouco diagnosticada.
O diagnóstico correto e confiável se torna extremamente importante na rotina, uma vez
que o diagnóstico laboratorial é a única forma de diagnóstico da infecção, que causa
sinais clínicos muito inespecíficos e também por questões sanitárias, pois muitos
animais progressores ou mesmo regressores podem estar atuando como fontes de
infecção para os demais animais de maneira totalmente inaparente. A importância dos
testes é que demonstrem eficácia, acurácia, facilidade de execução e tempo de
realização para de que meios efetivos possam ser utilizados com intuito de prevenir a
disseminação da doença, sendo usados para identificação e o isolamento de animais
infectados.
Palavras-chave: Medicina felina. Doenças Infecciosas. FeLV. Retrovírus. Diagnóstico
1
1.0 INTRODUÇÃO
O Vírus da leucemia felina(FeLV) foi isolado no ano de 1964 por Willian Jarrett
e sua equipe, no momento em que pesquisavam a origem de linfomas em gatos
domésticos em um abrigo de felinos na Escócia (Hardy et al. 1976). O FeLV pertence à
família Retroviridae, gênero Gammaretrovirus. É de suma importância na medicina
veterinária, por acometer felinos domésticos e selvagens e devido estar envolvido com
diversas alterações hematológicas, imunossupressão e diversas doenças neoplásicas.
O FeLV se encontra atualmente disseminado ao redor do mundo. A frequência
de ocorrência de infecção está associada a determinados fatores de risco e medidas de
controle e profilaxia. O meio mais comum de transmissão é o contato oronasal entre
felinos sadios e portadores assintomáticos, que fazem a eliminação viral durante anos.
Por este motivo, ambientes que possuem alta densidade populacional favorecem a
disseminação do vírus. Outros fatores como sexo, faixa etária, acesso à rua e origem
estão fortemente associados ao FeLV.Felinos jovens até cinco anos estão mais
predispostos à infecção. Gatos machos que possuem acesso livre às ruas apresentam
riscos maiores de se infectarem se comparados com os s que vivem confinados em casa.
Parece não haver predisposição racial. Este vírus consegue acarretar em
imunossupressão, doenças imunomediadas ou mesmo neoplasias e por este motivo é
que este retrovírus possui grande relevância na Medicina Veterinária (HARBOUR et
al., 2004; WISE & CARTER, 2005; DUNHAM & GRAHAM, 2008; LAIRMORE,
2011).O diagnóstico para a infecção pelo FeLV é fundamental para o controle da
doença.O objetivos deste trabalho foram rever os métodos empregados para a
finalidade diagnóstica de FeLV e relatar sobre as implicações da utilização destas
técnicas para uma correta interpretação e classificação das diferentes fases da infecção
do FeLV em gatos domésticos.
2.0 AGENTE ETIOLÓGICO
O Vírus da leucemia felina (FeLV) foi descrito e observado através de
microscopia eletrônica no ano de 1964 por Willian Jarrett ao encontrar partículas virais
que estavam conectadas a membrana de linfoblastos de um gato que continha linfoma
(JARRET et al., 1964). O FeLV pertence ao gênero Gammaretrovirus, família
Retroviridae.
Uma característica que diferencia os retrovírus dos demais vírus é que possuem
a capacidade de sintetizar uma DNA (ácido desoxirribonucleico) a partir de um genoma
que é constituído por RNA (ácido ribonucleico), por meio de um processo denominado
2
transcrição reversa mediado por uma enzima de mesmo nome (WISE & CARTER,
2005; DUNHAM & GRAHAM, 2008; LAIRMORE, 2011). Os retrovírus possuem
genomas diplóides, constituídos por duas cópias de uma cadeia simples de RNA
(ssRNA). Quando ocorre a transcrição reversa, o RNA é convertida em DNA de filta
dupla (dsDNA) que se integra ao genoma celular da célula hospedeira através de uma
enzima denominada integrase. Isso resultano chamado provírus,que será essencial para
a replicação viral. O provírus possui sequências que se repetem nas extremidades 5' e 3'
das fitas, cuja função é regulatória e de controle da expressão dos genes virais (long
terminal repeat - LTR) (HARTMANN, 2006). O provírus pode permanecer latente
(através da ativação e inativação de genes específicos) ou ser transcrito em RNA
mensageiro (mRNA) viral. A partir destes mRNAs, novos vírus serão sintetizados e
depois liberados da célula. Ocorre um grande número de mutações durante a replicação
do genoma viral. Estes vírus podem apresentar grande diversidade genética e por este
motivo também escapar da ação do sistema imunológico do hospedeiro (HARBOUR et
al., 2004; WISE & CARTER, 2005; DUNHAM & GRAHAM, 2008; LAIRMORE,
2011).
O gênero possui vírus endógenos e exógenos. Podem ser classificados de acordo
com as quantidades de espécies que podem infectar e também de acordo com os
receptores para essa espécie de vírus. (LAIRMORE, 2011).Possuem além da forma
exógena, asformas endógenas, como o enFeLV e o RD 114.Postula-se que enFeLV teria
tido origem em um evento ocorrido a centenas de anos com a integração do Vírus da
leucemia murina(MuLV) em células germinativas de um gato doméstico, após a
ingestão de camundongos ratos infectados. Após este acontecimento, todos os
descendentes desta linhagem teriam herdado o enFeLV. Porém, seu genoma é muito
incompleto e não possui a capacidade de se replicar de forma independente no
hospedeiro (LUTZ, et al., 2009; COSTA & NORSWORTHY, 2011; WILLETT & HOSIE,
2013).
O FeLV possui estrutura genômica composta pelos genes pol, gag e env. O gene
env faz a codificação das proteínas presentes no envelope viral, como a glicoproteína
70(gp70) e a proteína transmembrana 15E (p15E). A gp70 possui extrema relevância
por determinar o grau de patogenicidade do vírus e seu tropismo A p15E é responsável
pela ligação da gp70 a membrana celular do hospedeiro. , causando imunossupressão,
anemia não regenerativa que é observada em gatos que apresentam infecção persistente.
O gene pol é o responsável pela transcriptase reversa e a integrasse. O gene gag é o
responsável pelas proteínas estruturais internas, como a proteína p27. que é a
responsável pela detecção das infecções pela FeLV, pois podem ser encontradas em
quantidades significativas no plasma e no citoplasma das células dos animais
infectados(HARDY JR et al., 1976; LAIRMORE, 2011; HARTMANN, 2012).
O vírus apresenta diversos mecanismos oncogênicos e que são nomeados
oncogenes virais (tais como o v-myc) e que possuem a capacidade de ativar os protooncogenes do hospedeiro e contrariam a ação dos genes supressores de tumores,
induzindo a mutagênese devido à alteração na estrutura ou função dos genes envolvidos
na regulação do ciclo celular (COFFIN et al., 1997; LEE & REDDY, 1999).O FeLV
pode ser classificado em 4 subgrupos, como FeLV A,B,C e T e são classificados de
3
acordo com as diferenças no gene env e dos receptores localizados na entrada das
células hospedeiras (OVERBAUGH & BANGHAM, 2001).
O FeLVA é o único transmissível entre os felinos(JARRET, 1994). Este possui o
feTHTR1(feline high affinity thiamine transporter 1)que é uma proteína utilizada como
co-receptor para receptores de membrana hospedeira localizados em intestino delgado,
fígado, rins e tecidos linfóides (MENDOZA et al., 2006). O FeLV-A por estar presente
em diversos tecidos e células, possui vantagens sobre os demais subgrupos no que diz
respeito a transmissibilidade, podendo causar linfomas, porém pode gerar lesões leves
na ausência dos demais subgrupos ( MOSER et al., 1998).
O FeLV B é gerado a partir da recombinação entre FeLV A e as sequências
retrovirais endógenas. (JARRETT et al., 1973; HARTMANN, 2006).Partilha menor
identidade entre as sequências e geralmente está associado a linfomas(STEWART et
al., 1986). O mais patogênico é o subgrupo C, por causar anemia aplástica, surgindo a
partir de mutações no geneenvdo FeLV A ( HARDY et al.,1976).O FeLV T foi
reconhecido e isolado em felinos que desenvolveram imunodeficiência associada ao
FeLV e apresenta 96% de similaridade com o FeLV A, surgindo a partir de mutações na
sequência do gene env do FeLV-A(HARDY et al.,1976).
3.0 PATOGENIA
A classificação da infecção viral e suas fases levam em conta o tipo de resposta
imunitária, carga infectante e genética do hospedeiro e são denominadas de infecção
regressiva, infecção progressiva, infecção latente e infecção atípica (TORRES et al.,
2005). Diversos fatores como idade, carga viral, subtipo viral, via de exposição ao
vírus, estado imunitário do animal e a presença de doenças concomitantes, podem
influenciar na via como o FeLV progride (LAIRMORE,2011).
O FeLV penetra no organismo através da orofaringe, replicando-se nos tecidos
linfóides locais e linfonodos regionais (1ª etapa) infectando posteriormente monócitos
e linfócitos (2ª etapa), que são transportados posteriormente via sanguínea para a
medula óssea e outros órgãos linfóides como o timo, baço e linfonodos distantes
(3ªetapa), onde se replica nas células em mitose ( 4ª etapa). Entre 4-6 semanas depois,
o vírus difunde-se a partir destes locais pelo corpo através do plasma (5ª etapa) e
infecta células epiteliais de vários órgãos como as glândulas salivares, mucosa
nasal e orofaringe, de onde é posteriormente excretado através de fluidos corporais
como a saliva (6ª etapa). O tempo de incubação desde o momento em que começam
as alterações genéticas até que se desenvolvem de fato doenças associadas ao FeLV
varia entre 2-4 anos (HORZINEK et al., 2007; HARTMANN, 2012).
Este ciclo pode durar semanas a meses, apesar de poder ser interrompido
pelo sistema imunitário em qualquer altura. Se a infecção é debelada antes do vírus
infectar a medula óssea, o animal nunca entra em fase de viremia secundária e a
replicação do vírus é contida no organismo. Isto é possível quando o animal infectado
produz anticorpos contra a gp70, restringindo assim a replicação viral e a capacidade
4
do vírus de penetrar nas células do hospedeiro. Neste caso, ocorre uma infecção
regressiva com eliminação da infecção (KAHN, 2007; HARTMANN, 2012). Quando
ocorre uma resposta imunitária mais tardia, ocorrerá uma viremia transitória que
poderá durar semanas ou meses. Estes animais raramente excretam o vírus e
ocasionalmente não desenvolvem sinais clínicos associados a doença, o que se torna
possível na maioria dos casos eliminar a infecção. O vírus se encontra sob a forma
proviral ( PACITTI & JARRETT, 1985; LEVY J. , et al., 2008a; COSTA &
NORSWORTHY, 2011).
Em alguns casos em que a viremia secundária se completa, ocorre a infecção
das células epiteliais de vários órgãos e com isto já não é mais possível que o sistema
imunológico consiga eliminar o vírus do organismo, acarretando uma viremia
persistente. Este tipo de infecção denomina-se infecção progressiva, na qual as seis
fases da infecção se encontram presentes (BORETTI, et al., 2004; HARTMANN,
2006).
Raríssimos são os casos em que os animais são parcialmente imunes ao FeLV
e a infecção permanece em locais específicos, como epitélio das glândulas salivares,
na qual não ocorre a excreção viral e os sintomas típicos da infecção pelo FeLV, o que
resulta em uma infecção atípica e que pode evoluir para infecção latente ou
progressiva. (PACITTI & JARRETT, 1985; HARTMANN, 2006). Quando os animais
consegue debelar a infecção pelo FeLV, apresentam altos níveis de anticorpos
antivirais específicos contra os componentes virais. Porém, não são todos os animais
que apresentam altos níveis de anticorpos. Os linfócitos citotóxicos T também
possuem papel importante na eliminação viral e aparecem antes dos anticorpos
neutralizantes. (FLYNN et al., 2002).
Apenas cerca de 30% dos animais desenvolvem viremia persistente com
infecção progressiva. Cerca de 40% dos animais infectados consegue desenvolver
anticorpos, desenvolvendo apenas a infecção regressiva com eliminação da
infecção e 28% dos animais desenvolve infecção regressiva com latência. Somente
5-10% dos animais desenvolvem infecção atípica (BARR, 1996; HARTMANN,
2006). Esses dados são controversos; incluir publicações de (HOFMANNLEHMANN, 2007, 2008)
Torres e colaboradores (2005), utilizaram a qPCR para quantificar o DNA
proviral nos estágios iniciais a avançados da infecção, comparando-se com dados já
existentes obtidos através do teste para o antígeno p27. Conforme os resultados, os
autores incluíram uma nova categoria para classificar as diferentes evoluções da
infecção ocasionadas pela FeLV. Animais que apresentaram resultados negativos em
presença de p27, mas positivos para o DNA proviral foram classificados como infecção
abortiva. Animais que constatados com p27 negativos, porém positivo para DNA
proviral, foram classificados como infecção regressiva. Animais que constataram p27
positivos com DNA proviral durante a segunda a quarta semana após a infecção, porem
com p27negativos e DNA positivos após a sexta semana, foram classificados como
infecção latente. Os animais que apresentavam p27 e DNA proviral positivos foram
classificados como infecção progressiva.
5
HOFMANN-LEHMANN et al. (2007,2008), empregando ensaios ainda mais
sensíveis, demonstraram resultados um pouco diferentes e classificaram os animais com
antigenemia indetectável ou transiente e níveis moderados de DNA proviral em
Infecção Regressiva. Já a Infecção Latente foi caracterizada como a presença de
antigenemia transiente, mas com níveis de DNA proviral indistinguíveis dos animais em
infecção regressiva.
De acordo com a interpretação proposta por Torres e colaboradores, os animais
que foram expostos a o FeLV, mas que não foi comprovada antigenemia, conseguiram
eliminar o vírus antes que ocorresse a integração no genoma do hospedeiro (infecção
abortiva), ou conseguiram reter a replicação viral, na qual foram mantidas células
infectadas não produtivas na circulação e em tecidos (infecção regressiva).Animais que
possuem a capacidade diminuída de conter a progressão da infecção somente
apresentaram antigenemia nas primeiras semanas e em níveis moderados(o que se
distingue de outros grupos) de DNA proviral (infecção latente). Células infectadas
estariam em latência, porém seriam potencialmente produtivas. A reativação seria mais
esperada neste caso. Animais incapazes de conter a progressão da infecção
demostrariam níveis mais elevados de p27 e DNA proviral no período superior até três
anos após a exposição (infecção progressiva) (TORRES et al., 2005).
4.0 EPIZOOTIOLOGIA
4.1 Distribuição e prevalência
A prevalência do FeLV e das doenças associadas estão diminuindo desde os
anos 1980 nos países que adotaram programas que têm por finalidade o diagnóstico e a
prevenção, mesmo sendo considerada uma doença infecto contagiosa entre os felinos.
(MEICHNER et al., 2012). O FeLV apresenta distribuição mundial e sua prevalência
é muito influenciada pela densidade populacional. A prevalência se torna muito
diferente entre gatos errantes e gatos domiciliados. Esta pode se manter uma constante
em gatos errantes, porém em uma casa em que apresentam inúmeros gatos e sem
quaisquer medidas de prevenção, poderão atingir valores relativamente elevados como
20% (LEVY J. K. et al., 2006; ETTINGER & FELDMAN., 2010).
Um estudo realizado na Polônia com 676 animais detectou que a prevalência de
FeLV no país é de 6,4%. Em um estudo realizado nos Estados Unidos com
18000 gatos testados, 2,3% obtiveram resultados positivos para FeLV (LEVY J. K. et
al., 2006; RYPUŁA et al., 2014). Em Portugal, estudos encontraram prevalência em
torno de 10%. (ROSADO, 2009; DUARTE, 2010; RODRIGUES, 2012). Dados
encontrados no Brasil apresentam muitas variações entre valores como 32,5% a 47,5%
de amostras positivas no estado de Minas Gerais e 38.3% no estado do Rio Grande do
Sul ( SOUZA.,2002, TEIXEIRA., 2007,COELHO et al., 2008.). As diferenças podem
ser variadas tanto pelas diferenças entre os estudos e técnicas empregadas para o
diagnóstico, como pelos diferentes grupamentos dos animais, uma vez que felinos que
possuem acesso à rua tendem a ter probabilidades muito maiores de adquirir o vírus
6
aos que possuem acesso restrito (MEINERZ et al., 2010).Estudos conduzidos por
(COELHO et al.,2008), detectou uma elevada porcentagem de animais positivos,
usando o emprego de métodos diagnósticos de maior sensibilidade em uma faz e em
que os demais testes não detectavam.
4.2 Transmissão
O vírus se faz presente em secreções de animais infectados, tais como a
saliva, secreções nasais, fezes e leite. A transmissão ocorre de forma horizontal
através da via oronasal, apesar de também poder ocorrer através de mordidas. A
transmissão vertical durante a gravidez também é possível, apesar de geralmente
resultar em morte embrionária e fetal. Os gatinhos, quando sobrevivem, nascem
infectados e morrem rapidamente. Quando a fêmea apresenta infecção regressiva com
latência é pouco provável que transmita o vírus à ninhada, apesar de alguns
gatinhos poderem ser virêmicos após o nascimento. Este fato deve-se ao fato de
o vírus poder manter-se latente na glândula mamária até ao desenvolvimento da
mesma no período final da gravidez. Filhotes de gatas que tenham tido uma
infecção regressiva e conseguiram a eliminação da infecção adquirem anticorpos
que lhes conferem imunidade durante 2-3 meses (HARDY JR et al., 1976;
PACITTI et al., 1986).
5.0 SINAIS CLÍNICOS
O FeLV pode provocar doenças muito variáveis entre si, sendo que a maioria
dos casos são potencialmente fatais. As mais comuns são os linfomas , leucemias
mielóides e linfóides, anemia, imunossupressão, enterite, supressão da medula óssea e
desordens reprodutivas (LUTZ et al., 2009). Outros sinais clínicos como anisocoria,
midríase, síndrome de Horner, incontinência, vocalização anormal, hiperestesia,
paresia e paralisia são comuns em gatos infectados com FeLV. Doenças neurológicas
podem estar associadas a linfoma do sistema nervoso central ou a infecções ligadas
diretamente ao vírus. (DOW & HOOVER, 1992; CARMICHAEl et al., 2002).
Os sinais clínicos de FeLV podem se desenvolver em animais persistentemente
infectados. Poder ocorrer em gatos de qualquer idade. Afeta geralmente animais com
cerca de 2-4 anos de idade, uma vez que a maior parte é infectada durante as primeiras
semanas de vida, na qual os animais jovens são mais susceptíveis (LUTZ et al.,
2009).Algumas proteínas virais podem ser diretamente imunossupressoras, como a
p15E, que possui ação direta na interleucina 2,bloqueando a maturação dos linfócitos.
O FeLV atrapalha uma grande variedade de leucócitos, acarretando neutropenia e
alterações na função dos neutrófilos e linfopenia com perda de linfócitos CD4+ e
CD8+ e atrofia do timo (LAFRADO et al., 1987; MEHROTRA et al., 2003).Os
animais infectados que se tornam imunodeprimidos, independentemente de exibirem
sinais evidentes ou não, podem ter diminuição do número de anticorpos e atrasos na
resposta imune. Assim sendo, os gatos se tornam susceptíveis a microrganismos a que
normalmente seriam resistentes, tais como Salmonella spp, e têm uma resposta mais
7
exacerbada a microrganismos como Mycoplasma haemofelis e Cryptococcus spp.
Também podem demonstrar sinais clínicos de doenças crônicas como estomatite ou
gengivite crônica, o que torna mais difícil tratar doenças simples como abcessos, uma
vez que estes têm tendência à recorrência devido à imunossupressão (TENORIO et
al., 1991; LUTZ et al., 2009; SHALEV et al., 2009).
Os animais infectados podem desenvolver diversos tipos de anemia, sendo a
maioria do tipo não regenerativa. As anemias regenerativas são raras e ocorrem
devido asinfecções secundárias, como por Mycoplasma haemofelis, por exemplo,
ou a processos imunomediados que acarretam na hemólise dos eritrócitos. A causa
mais comum de anemia não regenerativa é a hipoplasia eritróide, uma doença
degenerativa e fatal. O vírus acarreta aplasia eritrocitária ou pancitopenia, o que a tem
como consequência o impedimento e a diferenciação dos precursores dos eritrócitos
na medula óssea, o que resulta em uma anemia macrocítica. (KOCIBA, 1986;
QUIGLEY et al., 2000).Também pode ocorrer o surgimento da mielodisplasia
associada ao aparecimento de anemia não regenerativa e as anomalias que ocorrem
no processo de maturação celular na medula óssea. Nestes casos também é comum
ocorrer mielofibrose, granulopenia e trombocitopenia. A partir do momento que as
células blásticas apresentarem níveis inferiores a 30% da medula óssea, leva ao
desenvolvimento a da leucemia, e que tem progressão para este estado em semanas a
meses após o diagnóstico de mielodisplasia (CARMICHAEL et al., 2002; LEVY et
al., 2006b; LUTZ et al., 2009).Também poderá ocorrer anemias hemolíticas,
glomerulonefrites e poliartrites, situações que podem ser desencadeadas pela
deposição de complexos antígeno-anticorpo em diversos locais do organismo,
juntamente com a diminuição da atividade das célula supressoras T, que são as
responsáveis pela regulação do sistema imune (COHN, 2006; LUTZ et al., 2009).
As leucemias associadas ao FeLV podem afetar diversas linhagens medulares ,
como os elementos eritróides (eritroleucemia, reticuloendoteliose), mielóides,
leucemias granulociticas ( monocíticas ou mielomonociticas) ou megacariócitos.
(CARMICHAEL et al., 2002; LEVY et al., 2006b; LUTZ ET AL., 2009).A leucemia
linfoblástica aguda se caracteriza por infiltração da medula óssea (e possivelmente
outros órgãos) por linfoblastos, e esta muitas vezes acompanhada de anemias e
presença de blastos na circulação. A maioria dos animais com leucemia linfoblástica
aguda são FeLV positivos. Por outra vertente, a leucemia linfocítica crônica não
está associada ao FeLV. Ainda existe a probabilidade de ocorrer mielofibrose, que é
uma proliferação de fibroblastos que resultam em osteosclerose medular
(CARMICHAEl et al., 2002; LEVY et al., 2006b; LUTZ ET AL., 2009).
Os linfomas induzidos pelo FeLV estão entre os tumores mais comuns
nos gato (cerca de 70% de todos os linfomas), tendo os animais afetados por
vezes maior
probalidade de desenvolver este tipo de tumor do que os animais
saudáveis. Os diferentes tipos de linfoma são classificados de acordo com as suas
localizações mais frequentes, sendo reconhecidas quatro formas: a forma tímica ou
mediastínica, a mais comum em gatinhos; a forma alimentar, onde as células tumorais
estão relacionadas ao trato gastrointestinal e que pode ocorrer em animais mais
idosos; a forma multicêntrica ou periférica, que afeta os linfonodos; a forma atípica,
8
também conhecida como extranodal, em que os tumores estão associados aos rins, à
pele, olhos ou ao sistema nervoso. Estes tumores afetam diretamente os linfócitos
T. Independente da sua localização, o seu aspecto é semelhante, e podem
apresentar lesões de tamanho variáveis, firmes e homogêneas, sendo compostas por
linfócitos neoplásicos (BORETTI et al., 2004; LOUWERENS et al., 2005; FUJINO et
al., 2008; MOCHIZUKI et al., 2011; STÜTZER et al., 2011).A linfoadenopatia
periférica também está associada ao FeLV, mesmo sendo benigna é muitas vezes
confundida com linfoma. Outras alterações como doençashepáticas degenerativas e
inflamatórias e enterite crônica, estão associadas à degeneração do epitélio intestinal
e necrose em criptas intestinais, também estão associadas ao FeLV(COHN, 2006;
LUTZ et al., 2009).
6.0 DIAGNÓSTICO
Os testes diagnósticos de infecção pelo FeLV eram realizados mediante
detecção de antigenemia, com a detecção de antígenos p27 extracelulares por ELISA
(LUTZ, et al.,1983), antigenemia com detecção de antígenos intracelulares p27 pelo
teste de IFA ( HARDY, 1973) e através de detecção de viremia por isolamento no
cultivo celular (FISCHINGER et al., 1974).A cultura viral é realizada somente em
laboratórios de excelência, porém não aplicado na prática clínica. (HARTMANN,2006 ;
LEVY et al, 2008). Uma vez detectado vírus infectivos, o cultivo celular foi
considerado um teste definitivo, porém é pouco praticado na rotina pela sua
complexidade (LUTZ et al., 2009).
A importância dos testes é que demonstrem eficácia, acurácia, facilidade de
execução e tempo de realização para de que meios efetivos possam ser utilizados com
intuito de prevenir a disseminação da doença, sendo usados para identificação e o
isolamento de animais infectados(COUTO 1994). Os métodos sorológicos de
diagnóstico direto possuem maior acurácia (SPARKES, 2003; PINCHES et al., 2007),
uma vez que detectam antígenos e não anticorpos. (HARTMANN, 2012).É possível que
animais desenvolvam anticorpos contra o enFeLV, o que não significa que estão
infectados com o FeLV, gerando como resultado falso-positivos.
Os pioneiros nos testes ELISA que apareceram no mercado para o diagnóstico
de FeLVeram testes indiretos, porém não eram possíveis a distinção dos anticorpos
vacinais e maternais aos anticorpos virais e com isto muitos animais apresentavam
resultados falsos-positivos. E o fato de os anticorpos detectarem os virais e os não
virais, acarretavam em aumento de falso-positivos (FLYNN et al., 2002). Entretanto
pensa-se que o teste ELISA para a detecção de anticorpos específicos para a proteína
p15E, possam ter algum valor, por apresentar sensibilidade no valor mínimo de 77% e
especificidade de 85,6% e o fato de os animais vacinados apresentarem níveis mínimos
destes anticorpos, torna o teste capaz de distinguir animais naturalmente infectados de
9
animais vacinados, o que se torna impossível com outros teste de detecção indireta
(BOENZLI et al., 2014).
O exame de imunoflorescência direta baseia em informações em que animais
virêmicos possuem granulócitos, linfócitos e plaquetas com componentes do gene gag.
Estes podem ser detectados por anticorpos específicos através de esfregaços sanguíneos
(HARDY et al., 1973). Contudo, a imunofluorescência direta não é um exemplar exame
de triagem, devido a detecção dos antígenos intracelulares não coincidirem com o
aparecimento da p27 no soro ou no plasma (LUTZ ET AL., 1980).
Os testes de ELISA direto e imunofluorescência indireta (IFA) utilizam
anticorpos contra a p27, que é uma proteína que se encontra localizada no
nucleocapsídeo viral. O ELISA faz a detecção da p27, que se encontra localizada
solúvel no plasma, soro, lágrima e saliva. O teste ELISA possui alta sensibilidade por
detectar o vírus nos primeiros dias de infecção e animais que apresentam infecção
transitória e latente também podem ser analisados através deste método. Este teste é
muito utilizado na rotina clínica através de kits comercias.A IFA detecta a proteína em
leucócitos e plaquetas infectadas através de esfregaços de sangue periférico ou medula
óssea.
No ano de 1996,JACKSON e colaboradores propuseram que a reação em cadeia
da polimerase (PCR) seria um exame de maior sensibilidade, na qual detectaria o DNA
proviral nas amostras dos animais que continham sinais clínicos sugestivos da infecção
causado pelo FeLV, porém apresentavam resultado negativo para o antígeno p27. No
ano de 2001, HOFMANN-LEHMANN colaboradores realizaram uma técnica com
maior sensibilidade, especificidade e rendimento. Foi utilizada a PCR em tempo real ou
quantitativa (qPCR), para detectar DNA proviral. Resultados mostraram que 10% das
597 amostras negativas para ELISA foram positivas para o PCR; dois animais foram
infectados para o experimento e obtiveram como resultado negativo por ELISA e
positivo para o PCR,na primeira semana após infecção; alguns animais com
antigenemia transitória resultaram testaram positivos na PCR, mesmo após a eliminação
da antigenemia.
Os resultados sugerem novas interpretações e classificações, na qual implicam
em uma nova forma de detecção de FeLV cuja finalidade seja diagnóstico (LUTZ et al).
A American Association of Feline Practitioners (AAFP) e o European Advisor Board
on Cat Diseases (ABCD), recomendam que o diagnóstico de FeLV seja realizado
como teste de triagem para a detecção do antígeno via ELISA. Todo resultado positivo
que for confirmado com um segundo teste após um período de um mês para o antígeno
p27, deverá ser testado por PCR. O que se recomenda é que a PCR seja realizada em
laboratório de confiança pelo motivo que se consegue detectar o DNA proviral na
primeira semana de infecção. A detecção do antígeno p27 deverá ser empregado
juntamente com a PCR, uma vez que a presença do antígeno circulante pode ajudar a
estabelecer no prognóstico da infecção (LEVY et al.).
O teste ELISA faz a detecção da proteína de capsídeo p27 localizada no soro ou
no plasma, local em que é encontrado com abundancia em animais que se encontram
infectados. É classificado como bom detector de animais positivos a partir da quarta
semana após infecção. É um exame recomendado como exame de triagem (JARRET et
10
al., 1982; FLYNN et al., 2002; LEVY et al., 2008; LUTZ et al., 2009). É utilizado
por apresentar alta sensibilidade, especificidade e praticidade. O mais utilizado é o kit
comercial Snap™ Combo FeLV antigen/FIV antibody Test Kit (IDEXX Laboratories
Inc., Westbrook, Maine 04092, USA).É utilizado na rotina com a finalidade de detectar
a proteína p27 solúvel no sangue, soro ou plasma. O soro se torna a amostra mais
aconselhável para a utilização, por resultar poucos resultados falsos positivos e
negativos ( JARRET 1999). O p27 é encontrado no sangue de animais infectados no
período de um mês após a exposição. O teste apresenta anticorpos com epítopos
específicos para a p27 fixos em uma fase sólida.Este método apresenta especificidade
superior a 98% e sensibilidade de 90% (HARTMANN, 2012; KIM et al., 2014;
BOENZLI et al., 2014).
Podem existir diversos motivos para a ocorrência de falsos positivos e negativos
no teste ELISA. Animais que se apresentam em fase de regressão da infecção, poderão
demonstrar viremia transitória, com resultado positivo para o teste ELISA, porém se for
repetido determinados meses depois, o resultado já será negativo. O inverso poderá
ocorrer quando o animal apresentar uma infecção latente, o que não será possível a
detecção de antígenos na circulação. Os resultados poderão ser conflitantes durante
anos, até que ocorra a reativação viral (JARRETt & HOSIE, 2004). Em filhotes, o
aparecimento da viremia pode variar, recomendando-se a realização do teste. Na
maioria das vezes, o diagnóstico da infecção será baseado no histórico clínico e na
detecção dos antígenos, especialmente a proteína p27 em leucócitos, saliva, plasma e
soro (BARR, 1998).
Animais que apresentam resultados positivos para o ELISA podem estar
apresentando infecção transitória ou permanecerem infectados. Trinta por cento dos
felinos podem eliminar a p27 da circulação devido à infecção transitória ou estar por
desenvolveriam uma infecção latente. Felinos que apresentarem resultados positivos no
ELISA, porém não apresentarem sintomatologia para o FeLV, deverão ser testados
através de outros métodos de diagnóstico como a IFA, ou refazer o teste ELISA no
período superior a oito semanas para se determinar se a viremia é transitória ou
persistente (MEHL, 2001). O teste ELISA se torna o teste para triagem para felinos que
apresentam resultados positivos para FeLV, por apresentar resultado rápido e ser
altamente sensível, porém é ideal que se faça a confirmação do resultado através da
técnica de IFI, para afirmação se estão persistentemente virêmicos. Animais que
apresentarem resultados discordantes, deverão ser testados novamente após doze
semanas (BARR, 1998).
A IFA é indicada para confirmar a presença de antígenos do FeLV e podem ser
encontrados em leucócitos infectados, o que só ocorre após a viremia. Entretanto, pode
ser controversa devido à possibilidade de apresentar resultados falsos, sendo também
pouco acessível na rotina diagnóstica. (HARTMANN,2006; LEVY et al, 2008).A IFA
torna-se positiva após a infecção da medula óssea, ou seja, animais positivos na IFA são
geralmente virêmicos,porém este teste não é capaz de detectar animais no início da
infecção. Desta forma a IFA torna-se um teste confirmatório ou também como indicador
do prognóstico (HARTMAN, 2006)
11
Para casos de risco reduzido, assintomáticos ou discordantes, recomenda-se a
utilização do exame PCR, o que aumenta a sensibilidade de detecção para confirmar um
teste que contém o antígeno positivo.A PCR é o meio mais utilizado como teste
confirmatório na rotina do FeLV. Este não detecta antígenos virais, mas sequências
genéticas que estão inseridas em células infectadas (DNA proviral), sendo portanto
muito sensível e muito específica. Apresenta como desvantagem a necessidade de
laboratórios bem equipados. O teste permite a detecção do FeLV em culturas, sangue e
tecidos, tanto fresco ou fixados, no período de uma semana após a exposição do vírus
(LEVY et al, 2008). No caso de infecção latente, quando o vírus não se replica, os testes
convencionais que possuem como base a detecção do antígenos será negativo. Nesse
caso a PCR é o único exame capaz de detectar animais positivos para FeLV. Em muitos
animais, os antígenos virais não são detectados devido a ação do sistema imune, porém
o vírus estará inserido no genoma celular, podendo ser identificado pela PCR (
HARTMANN,2006).
A PCR não é capaz de distinguir entre FeLV endógeno e exógeno, porém
apresenta alta sensibilidade e especificidade. É muito utilizada nos casos em que os
resultados se apresentam discordantes e se mantém por vários meses com ELISA
positivo e IFA negativo ou quando o animal apresenta sintomas suspeitos de FeLV,
porém é antigeneticamente negativo. Apesar de utilizar sangue para o teste, também
pode-se utilizar medula óssea, amostras de tecido e até mesmo saliva. Estudos
comprovaram que entre 5 -10% dos animais que apresentaram resultados negativos nos
testes de detecção de antígenos, apresentaram positivos quando utilizada a técnica de
PCR (HOFMANN-LEHMANN et al., 2001; GOMES-KELLER et al., 2006;
CATTORI, et al., 2008; WILLI et al., 2008).
Além da detecção (PCR) e quantificação de provírus (qPCR), o RNA viral
também pode ser detectado e quantificado através da RT-PCR e RT-qPCR. As técnicas
para detecção e quantificação de RNApodem ser realizadas com amostras de sangue,
soro, saliva, fezes e outros tecidos e é muito útil, uma vez que é capaz de detectar o
vírus na ausência de células, ao contrário da PCR. A RT- PCR é extremamente
confiável em todos os tipos de infecção pela FeLV, exceto durante a fase latente,
devido neste caso não existir viremia e o vírus se encontrar presente no organismo
apenas como provírus (Lutz et al., 2009).
A American Association of FelinePractitioners (AAFP) (LEVY et al., 2008)
ressalta que o diagnóstico de FeLV pode ser realizado em testes de triagem pela
detecção de antígenos através do teste ELISA, sendo que todo resultado positivo seria
confirmado com um segundo teste no período de trinta dias para o antígeno p27 ou
DNA proviral por PCR. Porém, recomenda-se o emprego da PCR para o diagnóstico
conclusivo, pois detecta o DNA proviral na primeira semana após a infecção. A
detecção do antígeno p27 poderá ser empregado, associado à PCR, uma vez que a
presença do antígeno circulante pode ajudar a estabelecer o prognóstico da infecção.
(LUTZ et al.,2009).
12
7.0 VACINAÇÃO
Em se tratando da capacidade de os gatos domésticos conterem a infecção,
muitos investimentos foram realizados para o desenvolvimento de vacinas contra o
FeLV. Nos anos de 2001 e 2002, foi descoberto que animais expostos ao FeLV e que
apresentavam o quadro de infecção regressiva, continham o DNA proviral. Isso colocou
em dúvida a proteção imune que era induzida pelas vacinas contra o FeLV. No ano de
2005 foram avaliadas e eficácia das vacinas com o uso de qPCR. A vacina FEL O-Vax
Lv-K (Fort Dodge Animal Health) em relação a eficiência foi similar em relação a
encontrada nas demais, ocorrendo a detecção de DNA proviral nos animais
considerados protegidos pela vacina (TORRES,et al.; 2005).
HOFMANN LEHMANN e colaboradores (2005) realizaram uma pesquisa com
as vacinas Eurifel (Merial), e Fel-O-Vax Lv-K IV (Fort Dodge Animal Health) e no ano
de 2007 com a vacina Leucogen (Virbac) e detectaram DNA proviral e RNA viral na
totalidade de amostras de animais vacinados. Os animais foram acompanhados pelo
período de vinte e quatro meses e os resultados encontrados foram que o DNA proviral
foi detectado em todos os animais, na qual conclui-se que as vacinas não impediriam a
integração virale mínima replicação.A presença viral como era indetectável pelos
métodos tradicionais, em animais vacinados tornou-se importante para uma sólida
imunidade para uma constante indução de resposta específica (HOFMANNLEHMANN et al., 2006).No ano de 2010, TORRES e colaboradores avaliaram as
vacinas Fel-O-Vax Lv-K (Fort Dodge Animal Health) e FEVAXYN FeLV (SheringPlough Animal Health Corporation) e LEUKOCELL 2 (Pfizer Animal Health).
Somente as vacinas que eram compostas de vírus inativados, é que foram capazes de
induzir imunidade suficiente, com eficácia garantindo
resistência a
antigenemia/viremia. Salienta-se que a vacina Fel-O-Vax Lv-K IV possui outros quatro
antígenos, e a mesma constituição de antígenos de FeLV.
8.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O FeLV é uma infecção comum na rotina clínica de felinos, porém pouco
diagnosticada. Algumas limitações são encontradas para a realização do exame
diagnóstico devido limitações econômicas. O diagnóstico correto e confiável se torna
extremamente importante na rotina, uma vez que o diagnóstico laboratorial é a única
forma de diagnóstico da infecção, que causa sinais clínicos muito inespecíficos e
também por questões sanitárias, pois muitos animais progressores ou mesmo
regressores podem estar atuando como fontes de infecção para os demais animais de
maneira totalmente inaparente.
O mesmo deverá ser utilizado em determinadas ocasiões como, animais recém
adquiridos, como método de prevenção a exposição dos animais já existentes
(HARTMANN, 2004), animais recém adaptados, mesmo que seja o único animal na
13
residência até o momento, pois não se avalia até o momento de uma nova introdução de
um novo membro a família (HARTMANN, 2004), animais que coabitem com outros
em estado de infecção até o momento desconhecida (HARTMANN, 2004), animais que
foram recentemente a outros animais, independente se seu estado prévio tenha sido
negativo (HARTMANN, 2004), animais doentes, uma vez que o FeLV pode estar
associadas a diversas doenças (HARTMANN, et al, 2007).
É importante ressaltar que existem diversos métodos diagnósticos para detectar
infecção por FeLV em gatos domésticos, com especificidades e sensibilidades diversas.
Na maioria dos casos, por facilitar a rotina clínica, é comumente utilizado o teste
imunoenzimático comercial que faz a detecção da proteína viral p27 do capsídeo solúvel
no sangue. Entretanto, o mesmo não é capaz de identificar animais que estão
apresentando infecção latente quando não existe a ocorrência da transcrição viral.
Também apresentará resultados negativos se o animal se infectou muito recentemente
ou a replicação ainda está abaixo do limite de detecção do teste, mas o animal é
infectado. A IFA é importante para verificar se a infecção atingiu a medula óssea, pois
detecta o p27 dentro das células sanguíneas que foram geradas por células pluripotentes
da medula que albergam provírus ativos. Resultados negativos na IFA e positivos pelo
teste imunoenzimático comercial indicam que o animal está infectado, mas ainda não
houve acometimento da medula óssea.
Contudo, a PCR é o método mais fidedigno para diagnóstico confirmatório do
FeLV.O objetivo da PCR é amplificar sequências genômicas virais ou provirais. É mais
sensível, rápido, conveniente e a sua aplicabilidade para o diagnóstico excelente, uma
vez que sensibilidade e uma especificidade maiores, o que não acontece com os demais
testes sorológicos(ARJONA et al., 2007). Além disso, as recentes técnicas disponíveis
de qPCR podem não apenas dar o diagnóstico de infecção proviral ou viral, como a
PCR convencional já fazia, mas também quantificar as cargas provirais e virais,
fundamentais para auxiliar a classificar o animal em uma categoria de infecção como
também para monitorar a progressão da infecção no animal.
14
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