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ESTUDO DA EFICÊNCIA DE MÉTODOS DE PRESERVAÇÃO
DE BACTÉRIAS
J.M. Tibola1, F.M.S. Godinho1, E.M.M. Rossoni1
1- Fundação de Ciência e Tecnologia – CIENTEC - Departamento de Alimentos – Laboratório de Microbiologia
–Rua Washington Luiz, 675 –CEP: 90010-460 – Porto Alegre – RS – Brasil, Telefone: (55-51) 3287-2190 –
Fax: (55-51) 3287-2080 – e-mail: ([email protected])
RESUMO – Laboratórios e indústrias necessitam dispor de microrganismos para diversos fins,
gerando interesse em métodos capazes de preservar esses microrganismos, bem como manter sua
viabilidade e características por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo comparar a
viabilidade celular por dois métodos de preservação: liofilização e criopreservação. Tal avaliação foi
realizada com nove diferentes espécies de três grupos de bactérias: Gram positivas esporuladas, Gram
positivas não esporuladas e Gram negativas. A viabilidade foi verificada sete dias após tratamento
através de técnicas de contagem, coloração de Gram e provas bioquímicas. Os resultados mostraram
que ambos os métodos foram eficientes para preservação de microrganismos, pois mantiveram suas
caraterísticas morfológicas, celulares e metabólicas após os tratamentos. De uma maneira geral
verificou-se, ainda, que o método de criopreservação conseguiu melhores taxas de recuperação
celular. Pretende-se uma continuação deste trabalho com outros meios de cultura e crioprotetores e
por períodos maiores de armazenamento desses microrganismos.
ABSTRACT – Laboratories and industries need to have micro-organisms for various purposes,
generating interest in methods to preserve these micro-organisms and maintain their viability and
performance for long periods. This study aimed at comparing the cell viability by two preservation
methods: lyophilization and cryopreservation This evaluation was performed with nine different
species of three groups of bacteria: Gram positive sporulating, Gram positive nonsporulating and
Gram negative. Viability was assessed seven days following treatment by counting techniques, Gram
staining and biochemical tests. The results showed that both methods were effective for preservation
of microorganisms, it maintained its morphological, cellular and metabolic characteristics after
treatments. Furthermore, it has been found, in general, the cryopreservation method could better cell
recovery rates. The aim is to a continuation of this work with other culture media and cryoprotectants
and for longer periods of these storage microorganisms.
PALAVRAS-CHAVE: microrganismos, preservação, liofilização, criopreservação.
KEYWORDS: microorganisms, preservation, freeze drying, cryopreservation.
1. INTRODUCÃO
A importância da preservação de culturas bacterianas está na necessidade de se
dispor do microrganismo a qualquer momento, para fins experimentais, didáticos, industriais
ou estudos comparativos. A escolha da técnica a ser utilizada deve levar em consideração as
características da espécie bem como as vantagens e desvantagens do procedimento escolhido.
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O objetivo de todos os métodos é manter viabilidade e, principalmente, proporcionar a
estabilidade genética por maior tempo possível, evitando excessivas mutações que alterem
suas características.
Esse trabalho tem como objetivo comparar a viabilidade celular de microrganismos
utilizados como controles em laboratório de microbiologia mantidos por dois métodos de
preservação: criogenia e liofilização.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram avaliadas nove bactérias: três Gram positivas esporuladas (Bacillus cereus, Bacillus
subtilis e Clostridium perfringens), três Gram positivas não esporuladas (Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes e Enterococcus faecalis) e três Gram negativas (Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa e Samonella Tiphymurium).
Para o crescimento das cepas foram utilizados os meios nutritivos agar nutriente e caldo
cérebro coração (BHI). Para a determinação da viabilidade celular foi utilizado o agar padrão para
contagem (PCA). Para os testes bioquímicos foram utilizados meios de cultura seletivos e diferenciais
específicos para a caracterização das espécies bacterianas e para provas bioquímicas. Os meios sólidos
usados foram os agares Listeria Otaviani-Agosti (ALOA), Baird Parker (BP), Citrato de Simmons,
leite, Mac Conkey, Manitol Gema de Ovo Polimixina (MYP), Oxford, Rambach, sangue, Triptose
Sulfito Ciclocerina (TSC) e Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). Os meios líquidos utilizados foram os
caldos de fermentação, triptona e tioglicolato.
2.1 Liofilização
Cada microrganismo foi inoculado em agar nutriente e incubado por 24 horas a 36°C.
Posteriormente foram feitas as suspensões em solução salina, com o auxílio da escala de McFarland,
até a concentração de 108 UFC/mL (Figura 1a). Foram misturados 2 mL de cada uma das suspensões
com 50 mL de um meio próprio para liofilização, composto por leite, inositol e água
As preparações foram distribuídas em frascos estéreis próprios para liofilização (Figura 1b) e
congeladas em gelo seco (Figura 1c). Finalmente os frascos foram colocados no liofilizador (Figura
1d). A liofilização durou cerca de 17 horas. Depois de liofilizadas, as amostras foram mantidas a 20°C.
Para o Clostridium perfringens, que é um anaeróbio estrito, foi utilizado o caldo tioglicolato
como meio de suspensão e condições anaeróbias nas incubações.
2.2 Criopreservação
Cada microrganismo foi inoculado em BHI a 37°C por 24 horas. Após foi feito o ajuste de
concentração da suspensão para 108 UFC/mL, com o auxílio da escala de McFarland. Em seguida a
suspensão bacteriana foi aliquotada em microtubos, adicionada de 10% de glicerol e vitrificada a 60°C em ultrafreezer (Figura 1e).
a
b
c
d
e
E
Figura 1 – Técnicas de liofilização e criopreservação
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2.3 Teste de viabilidade
Após 7 dias, as amostras liofilizadas e criopreservadas foram ressuspendidos em solução
salina com diluições até 10-5, inoculadas pela técnica de pour plate em PCA e incubadas por 48 h a
37°C para posterior contagem. Para Clostridium perfringens foi utilizado o meio de cultura TSC em
dupla camada e incubação em condições anaeróbias.
2.4 Caracterização bioquímica e morfológica
Paralelamente, foram feitas lâminas com coloração de Gram para caracterização da
morfologia celular de cada microrganismo. Os microrganismos também foram inoculados em meios
seletivos para verificação das características morfológicas da colônia. Ainda, foram realizadas provas
bioquímicas para caracterização dos microrganismos.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados do teste de viabilidade celular para os métodos de liofilização e
criopreservação geraram as medias que estão representadas na Tabela 1. Esses valores foram obtidos a
partir da média aritmética das contagens em placa da diluição seriada 10-5 em duplicata. Na tabela é
possível visualizar algumas observações:
- a técnica de liofilização foi mais efetiva que a criopreservação para a bactéria Listeria
monocytogenes.
- as taxas de recuperação das bactérias Bacillus cereus e Enterococcus faecalis foram muito
semelhantes para as duas técnicas;
- para as demais bactérias pode-se visualizar uma melhor recuperação pela técnica de criopreservação;
- a maior diferença visível nos dados é a recuperação do Clostridium perfringens, onde a bactéria foi
recuperada com muito mais eficiência pela técnica de criopreservação. Devido as suas condições de
anaerobiose, provavelmente o método de criopreservação fez com que a quantidade de oxigênio que
entrou em contato com o microrganismo fosse menor que a quantidade desse gás presente na técnica
de liofilização, elevando a taxa de sobrevivência da bactéria.
Tabela 1 – Contagem dos microrganismos submetidos às técnicas de preservação
Microrganismo
Liofilização (UFC)
Criopreservação (UFC)
6
2,4 x 10
5,1 x 106
Bacillus cereus
6
1,8 x 10
1,1 x 108
Bacillus subtilis
1,5 x 102
1,0 x 108
Clostridium perfringens
7
6,8 x 10
1,6 x 108
Staphylococcus aureus
6
2,2 x 10
2,0 x 105
Listeria monocytogenes
8
7,3 x 10
4,1 x 106
Enterococcus faecalis
5
4,0 x 10
5,0 x 108
Escherichia coli
5
3,5 x 10
7,6 x 107
Pseudomonas aeruginosa
2,9 x 106
3,6 x 108
Salmonella Typhimurium
Os testes bioquímicos apresentaram resultados satisfatórios, confirmando que ambas as
técnicas utilizadas mantiveram as características das bactérias. O Bacillus cereus apresentou colônias
características de coloração pink com halo de precipitação em agar MYP (Figura 2a) e atividade
hemolítica em agar sangue (Figura 2b), assim como o Bacillus subtilis apresentou colônias amarelas
em agar MYP (Figura 2c). O Clostridium perfringens apresentou colônias características no TSC de
coloração negras devido à precipitação de sulfeto de ferro e formação de gás (Figura 2d). O
Staphylococcus aureus permaneceu com atividade hemolítica, produziu coagulase (Figura 2e) e
morfologia colonial com halo característico em BP (Figura 2f). A Listeria monocytogenes permaneceu
com crescimento característico nos meios ALOA, colônias de coloração verde azulada, e Oxford,
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colônias de coloração escura (Figura 2g) e motilidade em meio SIM. A Escherichia coli produziu
indol (Figura 2h), fermentou a glicose (Figura 2i) e apresentou crescimento característico em agar
MacConkey (Figura 2j). A Pseudomonas aeruginosa permaneceu com atividade hemolítica e
degradou a lecitina do agar leite formando halo característico (Figura 2l). A Samonella Tiphymurium
manteve a capacidade de utilização de citrato como única fonte de carbono, alterando a coloração do
meio de verde para azul (Figura 2m) e suas colônias também mantiveram as características
morfológicas no agar XLD, com colônias negras, e no agar Rambach, com colônias de coloração rosa
(Figura 2n).
b
a
c
C
e
f
g
d
h
C
j
i
C
l
k
m
n
C
Figura 2 - Testes bioquímicos utilizados para caracterização dos microrganismos.
A morfologia celular das bactérias preservadas pelas duas técnicas se mostrou característica na
avaliação após a coloração. Verificou-se, porém, que a técnica de criopreservação foi mais eficiente
em manter a integridade das células e a visualização dos esporos.
4. CONCLUSÕES
Ambas as metodologias foram eficientes na recuperação dos microrganismos testados, pois
não afetaram as características morfológicas e metabólicas. Porém, observamos neste trabalho uma
melhor recuperação dos microrganismos pela técnica de criopreservação, provavelmente devido ao
glicerol, que evita a formação de cristais de gelo e rompimento das membranas celulares. A
liofilização, porem, apresenta vantagens com relação a transporte e armazenamento em temperatura
ambiente.
Pretende-se uma continuação deste trabalho avaliando a utilização de outros meios para
liofilização e crioprotetores, além da viabilidade desses microrganismos depois de armazenados por
períodos mais longos.
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5. REFERÊNCIAS
SOLA, M. C; OLIVEIRA, A.P; FEISTEL, J.C.; MINAFRA E REZENDE, C.S. Manutenção de
microrganismos: conservação e viabilidade. Enciclopédia Biosfera, Goiânia, v. 8, n. 14, p. 13981418, 2012.
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