UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC CURSO DE FISIOTERAPIA BRUNA REMOR BAPTISTA ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL E CREATINA QUINASE NO CÉREBRO DE CAMUNDONGOS MDX CRICIÚMA, JUNHO DE 2009 1 BRUNA REMOR BAPTISTA ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL E CREATINA QUINASE NO CÉREBRO DE CAMUNDONGOS MDX Trabalho de conclusão de curso - TCC, do Curso de Fisioterapia da Universidade do Extremo Sul Catarinense UNESC. Orientador Técnico: Prof. Dr.Emilio Luiz Streck Co-orientadora: Profª Drª. Lisiane Tuon CRICIÚMA, JUNHO DE 2009 2 BRUNA REMOR BAPTISTA ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL E CREATINA QUINASE NO CÉREBRO DE CAMUNDONGOS MDX Trabalho de Conclusão de Curso aprovado pela Banca Examinadora para obtenção do Grau de Fisioterapeuta, no Curso de Fisioterapia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC, com Linha de Pesquisa em Fisiopatologia Experimental. Criciúma, 29 de Junho de 2008. BANCA EXAMINADORA Prof. Emílio Luiz Streck - Doutor - UNESC- Orientador Prof. Eduardo Ghisi Victor - Mestre - UNESC Prof. Tiago Petrucci Freitas - Mestre - UNESC 3 Dedico este trabalho a todos que direta ou indiretamente contribuíram para concretização de um sonho, de me tornar Fisioterapeuta, no decorrer destes últimos cinco anos de conquistas e aos meus incansáveis esforços durante esta jornada que me fizeram seguir em frente sempre confiante. 4 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ADP - Adenosina difosfato ATP – Adenosina trifosfato AVD´s – Atividade de vida diária CEP – Comitê de ética em pesquisa CK – Creatina quinase DMB – Distrofia Muscular de Becker DMD - Distrofia Muscular de Duchenne EMG – Eletromiográfico EEG- Eletroencéfalograma FADH – Flavina adenina dinucleotídeo FISIOPAT – Laboratório de Fisiopatologia Experimental GABA – Ácido gama-aminobutírico MDX – Modelo animal de distrofia muscular de Duchenne NAD- Nicotinamida adenina dinucleotídeo FAD - Dinucleótido de flavina e adenina NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo GTP- Guanosina trifosfato FADH2 - flavina adenina dinucleotideo CO2 – Gás carbônico O2- Oxigênio H2O- Água PK – Piruvato quinase FMN- Flavina mononucleotideo Fe-S – Ferro enxofre CoQ – Coenzima Q QH2- Ubiquinol SDH – Succinato desidrogenase 5 QI – Quociente de inteligência SNC – Sistema Nervoso Central Cu+2 - Cobre 6 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura A – Ciclo de Krebs...............................................................................21 Figura B – Cadeia respiratória mitocôndrial....................................................26 Figura 1 – Gráficos da análise dos Complexos Respiratórios I,II,III e IV........33 Figura 2 – Análise da Creatina Quinase..........................................................35 7 RESUMO A ausência de distrofina está envolvida com alterações cognitivas e doenças psiquiátricas, associada com comprometimento cognitivo e diminuição da obtenção de energia. Assim, o presente estudo investigou a atividade da cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase (CK) em cérebros de camundongos mdx. Camundongos machos (mdx) e normais C57BL10 foram utilizados. Os animais com três meses de idade foram mortos por decapitação, o córtex pré-frontal, cerebelo, hipocampo, estriado e córtex cerebral foram dissecados para a análise da atividade da cadeia respiratória mitocondrial e CK. Observou-se em todas as estruturas cerebrais, uma diminuição no complexo I, não se observando alteração na atividade do complexo II. Houve também um aumento da atividade do complexo III no córtex e na atividade do complexo IV no pré-frontal e estriado. A atividade da CK está aumentada em hipocampo, prefrontal, córtex e estriado. Nossos resultados mostraram uma disfunção da cadeia respiratória mitocondrial e um aumento na atividade da CK no cérebro de camundongo mdx. Este aumento na atividade CK pode ser um efeito protetor contra o dano celular. Palavras-chave: camundongo creatinofosfoquinase; cérebro. mdx; cadeia respiratória mitocondrial; 8 ABSTRACT Lack of dystrophin has been involved with cognitive impaired and psychiatric diseases, associated with cognitive impairment, present impairment of energy production. Thus, the present study investigated mitochondrial respiratory chain and creatine kinase (CK) activities in mdx mouse brain. Male dystrophic (mdx) and normal C57BL10 mice were used. The mice were killed after three months by decapitation when prefrontal, cerebellum, hippocampus, striatum and cortex were dissected for analyses of mitochondrial respiratory chain and CK activities. We observed, in all brain structures, a decrease in complex I but not in complex II activities, increases in complex III activity in cortex, in complex IV activity in prefrontal and striatum. CK activity was increased in hippocampus, prefrontal, cortex and striatum. Our results showed a dysfunction in mitochondrial respiratory chain activity and an increase in CK activity in the brain of mdx mouse. This increase in CK activity can be a protector effect against cellular damage. Key Words: mdx mouse; mitochondrial respiratory chain; creatine kinase; brain. 9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 10 2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 15 2.1 Distrofias musculares ................................................................................. 15 2.2 Distrofia muscular de Duchenne ................................................................ 16 2.3 Distrofina .................................................................................................... 17 2.4 Camundongos mdx X a distrofia muscular de Duchenne........................... 18 2.5 Metabolismo energético ............................................................................. 20 2.6 Cadeia respiratória ..................................................................................... 25 2.7 Creatina Quinase ....................................................................................... 30 3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. 32 3.1 Caracterização da pesquisa ....................................................................... 32 3.2 Local e Caracterização da amostra............................................................ 32 3.3 Instrumentos para coleta de dados ............................................................ 32 3.4 Procedimentos para coleta de dados ......................................................... 33 3.5 Procedimentos para análise ....................................................................... 34 4 APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS .............................................. 35 5 CONCLUSÃO................................................................................................ 39 REFERÊNCIAS................................................................................................ 40 ANEXOS .......................................................................................................... 46 10 1 INTRODUÇÃO As distrofias musculares são grupos de distúrbios determinados geneticamente e associados à degeneração progressiva dos músculos esqueléticos e em muitos casos, da musculatura cardíaca. São caracterizadas por fraqueza muscular progressiva, deterioração, degeneração e regeneração das fibras musculares (UMPHRED, 2004). Onde, a Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a segunda doença genética mais comum nos seres humanos e é a forma mais grave das distrofias. É uma condição ligada ao cromossomo X que afeta aproximadamente 3300 nascidos masculinos vivos, causada pela ausência ou pelo rompimento da distrofina da proteína, que é encontrado em uma variedade de tecidos, como nos músculos esqueléticos e nos neurônios em regiões particulares do sistema nervoso central (SNC) (ANDERSON et al., 2002; BOGLIOLO, 2000). A DMD tem início na região podálica começando com fraqueza da cintura pélvica e manifesta-se por dificuldade de deambular, subir escadas e elevar-se do solo evoluindo no sentido cefálico comprometendo a cintura escapular, resultando em transtornos para alimentar-se, envolvimento da musculatura cardíaca e frequentemente alguns pacientes desenvolvem alteração da cognição (BOGLIOLO, 2000). Trinta por cento dos meninos com distrofia muscular de Duchenne (DMD) sofrem dos vários graus de alteração cognitiva (KUMAGAI et al., 2001; GILIBERTO et al., 2004). Após a localização do gene da Distrofia Muscular de Duchenne, descobriu-se que o produto deste, é uma proteína do citoesqueleto da membrana celular encontrada na superfície interna do sarcolema de fibras musculares normais, denominada distrofina. A precisa função da distrofina ainda não está totalmente esclarecida, no entanto sabe-se que ela exerce uma importante função de manutenção da arquitetura de célula muscular e equilíbrio no processo de contração (RUBIN, 2002; BOGLIOLO, 2000). A distrofina, proteína ausente nos músculos dos meninos com DMD é produzida também no cérebro, e a sua deficiência no SNC pode esclarecer o retardo mental encontrado em meninos com DMD (KUMAGAI et al., 2001; GILIBERTO et al., 2004; BOGLIOLO, 2000). Estudo recente mostrou que déficits cognitivos são associados freqüentemente com a distrofia muscular de 11 Duchenne (DMD). Podem ser devido a um déficit nas isoformas no cérebro da distrofina. O diagnóstico da DMD engloba exame físico, dosagem sérica de creatina quinase (CK) onde os níveis séricos estão elevados e piruvato quinase (PK), eletroneuromiografia, eletrocardiograma e biópsia muscular que auxilia no diagnóstico final da doença. Pode-se ainda verificar a presença da proteína distrofina pela imunofluorecência, cuja ausência é patognomônima da DMD (BOGLIOLO, 2000; RUBIN, 2002). Os camundongos mdx apresentam ausência na distrofina no músculo e no cérebro, causando déficits moderados de aprendizagem e memória, além de comportamentais, ansiedade e a locomoção reduzida em comparação aos ratos do controle (VAILLEND and UNGERER, 1999). Dados recentes reforçam a hipótese que a deficiência da distrofina do cérebro está correlacionada com a disfunção cognitiva e indicam que os camundongos mdx podem ser um modelo de alteração cognitiva encontrado em meninos com DMD (MUNTONI et al.,1991; VAILLEND et al., 1995;). O modelo animal de DMD, não produz a distrofina no músculo e no cérebro sendo relevante para pesquisas em nível de SNC por que expressa o genótipo da doença e não o fenótipo, podendo ser utilizado para avaliação das possíveis alterações cognitivas e danos mitocôndriais. O animal de DMD é considerado um modelo valioso de DMD humano (VAILLEND, et al., 1995). Um aspecto importante de DMD que recebe menos atenção é a ausência ou pelo rompimento da distrofina na função do SNC. Os estudos comportamentais comparativos entre meninos com DMD e ratos mdx, mostraram que os meninos com DMD têm um déficit cognitivo e um quociente de inteligência (QI) mais baixo (média 85), enquanto os ratos mdx indicam um déficit na aprendizagem passiva de latência e na memória em curto prazo. Em meninos com DMD, há uma evidência de desordem na arquitetura do SNC, anormalidades nos dendritos e perda neural. No rato mdx, relatórios recentes descrevem uma diminuição de 50% no número de neurônios e perdas neurais nas regiões do córtex cerebral (ANDERSON et al., 2002). No estudo realizado por Navarro et al (2004), afirmou-se que a atividade enzimática dos complexos I (NADH desidrogenase) e IV (citocromo oxidase) são marcadores de função mitocondrial. Os aumentos da atividade dessas 12 enzimas são diretamente relacionados com os produtos oxidativos e a função neurológica em ratos mdx. Baseado na contextualização do problema elaborou-se a seguinte questão: A atividade da cadeia respiratória mitocondrial e creatina quinase podem estar relacionadas com as alterações comportamentais no modelo animal de distrofia muscular de Duchenne? Tendo como referência a questão problema acima citada, formularam-se as seguintes questões a investigar e suas respectivas hipóteses: I) Existe disfunção metabólica no cérebro de camundongos mdx? Acredita-se que a alteração do metabolismo leva a um aumento da sensibilidade das áreas cognitivas, principalmente hipocampo e córtex pré-frontal. II) A partir disto, qual parte do metabolismo está afetada: creatina quinase, cadeia respiratória ou ambos? Acredita-se que ambas estarão afetadas. A creatina quinase em estudos apresenta-se com os níveis séricos elevados em camundongos com distrofia muscular de Duchenne; já com relação à cadeia respiratória acredita-se que ela esteja diminuída devido ao fato de ela estar presente em todas as células cerebrais sendo necessário o O2 para a produção de ATP e uma membrana mitocondrial intacta; uma alteração na capacidade de produção de ATP leva a uma alteração do metabolismo. Este estudo visou correlacionar a importância da atividade da cadeia respiratória e creatina quinase no cérebro do modelo animal de camundongos com distrofia muscular de Duchenne (mdx). Como objetivos específicos: I) Analisar a relação dos complexos respiratórios I, II, III e IV, nas alterações comportamentais de camundongos mdx, nas estruturas cerebrais dissecadas: hipocampo, estriado, cerebelo, córtex pré-frontal e córtex; II) Analisar os níveis séricos de creatina quinase nas estruturas cerebrais no cérebro de camundongos mdx: hipocampo, estriado, cerebelo, córtex pré-frontal e córtex como parâmetro diagnóstico; 13 III) Analisar os níveis séricos de creatina quinase no sangue como parâmetro diagnóstico no cérebro de camundongos mdx. A Distrofia Muscular de Duchennne (DMD) é caracterizada por uma desordem recessiva, ligadas ao cromossomo X, causando distúrbios de caráter genético na região Xp21, acometendo músculos cardíaco, esquelético e cerebral. Esta alteração provoca uma deleção no gene responsável pela produção de uma proteína citoesquelética denominada distrofina, que tem a função de manter as propriedades mecânicas da célula, a flexibilidade e a integridade. A DMD acomete exclusivamente meninos com uma taxa de incidência de 1 a cada 3.300 meninos nascidos vivos (CARAKUSHANSKY. 2001, THOMPSON, 2002). Trinta por cento dos meninos com distrofia muscular de Duchenne (DMD) sofrem dos vários graus de alteração cognitiva (KUMAGAI et al., 2001; GILIBERTO et al., 2004). Uma análise de vinte e oito estudos relativos à avaliação das funções cognitivas em pacientes com DMD, mostrou que as funções verbais como processamento fonológico, memória verbal, aritmética, compreensão e leitura apresentam maior impacto no desempenho intelectual global destes pacientes, se comparadas às habilidades viso-espaciais. Algumas especificidades foram encontradas em relação à idade dos pacientes: aqueles mais jovens apresentaram maior comprometimento intelectual verbal. Em contrapartida, os pacientes mais velhos mostraram maior dificuldade motora. Estudos sugerem que a maior disfunção verbal nos jovens esteja associada à deleções nas partes distais do gene distrofina, mais freqüentemente a deleções downstream no exon 44, comprometendo, principalmente, a transcrição das proteínas Dp140 e Dp71. Tais proteínas estão presentes em estruturas corticais responsáveis por grande parte das funções cognitivas como hipocampo, giro denteado e córtex pré-frontal (ZACH et al., 2006). Por meio dos estudos realizados com os camundongos mdx, que é o modelo ideal para estudar a doença, e é o modelo que mais se assemelha com humanos com essa distrofia, poder-se-á encontrar respostas até então não conhecidas a respeito da DMD, para desenvolver possíveis tratamentos 14 fisioterapêuticos que melhorem a atividade respiratória dos portadores da distrofia e contribuir com comunidade científica e social. Tornam-se importantes investigações mais aprofundadas desta distrofinopatia que a cada ano vem aumentando o número de casos. O objetivo de melhorar a qualidade de vida destes pacientes e minimizar ao máximo os efeitos físicos e psicológicos que estes meninos apresentam com a progressão da doença, esta deve ser a principal meta dos profissionais da saúde. Este trabalho pretende mostrar o quão importante é a Fisioterapia nesta doença degenerativa e progressiva, que leva a uma deformidade e incapacidade desses pacientes que lutam pela vida mesmo sabendo que sua expectativa de vida não ultrapassará a segunda década de vida, com exercícios que ofertam melhora da capacidade respiratória, diminui significantemente a evolução das deformidades, a fadiga apresentada pelos portadores de DMD que dificulta na realização de suas atividades de vida diária (AVD´s), o tratamento com Fisioterapia auxilia esses pacientes a terem uma maior independência para realizarem suas atividades de forma que não precisem em tempo integral de um cuidador ou de um familiar para auxiliá-lo. Poder contribuir com uma parcela significativa para o entendimento das alterações do metabolismo desses pacientes e de que forma essa alteração se manifesta, visando esclarecer dúvidas que são pouco mencionadas, devido à escassez de estudos relacionados com essas alterações metabólicas dessa doença. Como são pouco conhecidos os efeitos das distrofinopatias no Sistema Nervoso Central, através da análise metabólica e da determinação em tecido cerebral, poderemos identificar e melhor compreender os mecanismos neurobiológicos que levam ao dano cognitivo em pacientes portadores de distrofia muscular de Duchenne e assim promover novas estratégias terapêuticas para esta doença. 15 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Distrofias musculares As distrofinopatias compreendem a Distrofia Muscular de Duchene (DMD) e a Distrofia Muscular de Becker (DMB), caracterizadas por uma desordem recessiva, ligadas ao cromossomo X, causando distúrbios de caráter genético na região Xp21, acometendo músculos cardíaco e esquelético. Esta alteração provoca uma deleção no gene responsável pela produção de uma proteína citoesquelética denominada distrofina, que tem a função de manter as propriedades mecânicas da célula muscular, a flexibilidade e a integridade que é necessária durante a contração e relaxamento das fibras musculares. Esta proteína encontra-se ausente na DMD e de forma parcial na DMB, caracterizando as formas mais severas e mais leves, respectivamente, onde ambas apresentam sinais e sintomas semelhantes, porém, com um tempo de evolução diferenciado (REED, 2002; BEHRMAN, 2002) A DMD e a DMB acometem exclusivamente meninos, sendo que a mãe é a portadora do gene e responsável pela transmissão genética do mesmo. A DMD apresenta uma taxa de incidência de 1 a cada 3.500 meninos nascidos vivos, e a DMB de 1,7 a 5,5 a cada 100.000 (CARAKUSHANSKY, 2001). A proteína distrofina, está presente no sarcolema da membrana celular dos músculos esqueléticos (REED, 2002), no entanto, se sabe que esta proteína possui três isoformas: a do tipo muscular, a do tipo cerebral e a do tipo Purkinje, As isoformas cerebrais, ainda que em pequenas concentrações, são encontradas em neurônios corticais e células cerebelares de Purking (KUDOH, 2005). Em doenças crônicas como as Distrofias Musculares, têm sido utilizadas indiretamente mensurações das atividades metabólicas e enzimáticas como a análise da cadeia respiratória mitocôndrial e CK (creatina quinase) para teor metodológico, pois em estudos já realizados com camundongos mdx, a degeneração celular ocasionada pela patologia pode ser correlacionada secundariamente à alteração do metabolismo energético. 16 2.2 Distrofia muscular de Duchenne Como definição a distrofia muscular de Duchenne (DMD) é considerada a segunda doença genética mais comum nos seres humanos. É uma condição ligada ao cromossomo X, do gene Xp21, no qual afeta aproximadamente 3300 nascidos masculinos vivos. O rompimento ou ausência da distrofina da proteína é o fator causal da doença, a distrofina pode ser encontrada em uma diversidade de tecidos, como nos músculos esqueléticos e nos neurônios em regiões particulares do SNC. DMD é caracterizada clinicamente por uma doença severa da musculatura esquelética, resultando na morte prematura do indivíduo. Trinta por cento dos meninos com distrofia muscular de Duchenne (DMD) sofrem dos vários graus de alteração cognitiva (ANDERSON et al., 2002; CARAKUSHANSKY, 2001). Já foram mapeados genes responsáveis por mais de 30 formas de distrofias, cuja herança pode ser autossômica dominante, autossômica recessiva e ligada ao cromossomo X. As distrofias musculares devem possuir cinco características essenciais, como: miopatia, definida por critérios clínicos, histológicos e eletromiográficos (EMG), sem sinais de desenervação ou déficits sensitivos; todos os sintomas são efeitos da fraqueza dos músculos (ROWLAND, 2002; MARQUES, 2005). Bem como o histórico da Distrofia Muscular de Duchenne que foi descrita pela primeira vez no século XIX, década de 60, por Guillaume Duchenne (STOKES, 2000). Na metade do século descrito, descobriu-se que a fraqueza dos músculos voluntários poderia ser causada por uma degeneração primária destes, onde o termo “distrofia muscular” designa esta característica de degeneração, sendo frequentemente de caráter hereditário, e implacavelmente progressivo. O estudo morfológico, realizado nesta época, demonstra necrose das fibras musculares, atividade regenerativa, fibrose progressiva e infiltração do músculo com tecido gorduroso (RUBIN, 2002). 17 2.3 Distrofina Logo após que se descobriu à localização do gene da Distrofia Muscular de Duchenne, constatou-se que o produto deste, é uma proteína, distrofina do citoesqueleto da membrana celular. No entanto ainda não se sabe exatamente qual a real função desta proteína. Originalmente, a distrofina foi relatada como sendo principal proteína reguladora do complexo glicoproteico no qual estabiliza a membrana celular dos músculos esqueléticos (CARAKUSHANSKY, 2001; THOMPSON, 2002). Na DMD, a distrofina é produzida defeituosamente, causando alteração do complexo glicoproteico, tornando a membrana plasmática instável. Esta alteração pode ser responsável pela maior fragilidade osmótica, bem como pelo influxo excessivo de íons de cálcio que se acumulam no interior da fibra muscular, levando a uma degradação das miofibrilas, áreas de necrose segmentares, ocasionando contínua degeneração e regeneração das fibras musculares, até que, a capacidade de reparo não seja suficiente e as fibras musculares esqueléticas sofram degeneração irreversível com substituição por tecido fibro-adiposo (MARQUES, 2005; RUBIN, 2002). A ausência da proteína distrofina proporciona nas membranas musculares maior permeabilidade, aumentando, consequentemente, a concentração de cálcio. O cálcio ativa as enzimas que causam colapso das células musculares (CARAKUSHANSKY,2001 apud CULLEN & FUTHORPE,1975; MONTRI & ENGEL,1975). A perda da habilidade de regeneração pode ser o resultado da exaustão das células miogênicas satélites causada pelos excessivos ciclos de degeneração e regeneração (ARAUJO, 2005; RUBIN, 2002). A distrofina ela também é produzida no cérebro, e a sua deficiência no SNC pode esclarecer a alteração da cognição em meninos com DMD, bem como a sua ausência nos músculos destes meninos leva a alterações físicas (KUMAGAI et al., 2001; GILIBERTO et al., 2004). 18 2.4 Camundongos mdx X a distrofia muscular de Duchenne A Distrofia Muscular de Duchennne (DMD) se caracteriza por ser uma desordem recessiva, ligadas ao cromossomo X, causando distúrbios de caráter genético na região Xp21, onde os músculos cardíaco, esquelético e cerebral são os mais acometidos. (CARAKUSHANSKY, 2001; THOMPSON, 2002). Dados recentes reforçam a hipótese que a deficiência da distrofina do cérebro está correlacionada com a disfunção cognitiva e indicam que os camundongos mdx podem ser um modelo para a alteração da cognição encontrada em meninos com DMD (MUNTONI et al .,1991; VAILLEND et al., 1995 ). No camundongo mdx, a distrofina encontra-se ausente em tecidos do músculo e do cérebro, é considerado ser um modelo valioso de DMD humano (VAILLEND et al., 1995). No sistema nervoso central, a distrofina é restringida às populações neurais específicas que mostram a suscetibilidade aos danos excito-tóxicos, localizados em dendritos proximais e nos corpos neurais. Relatou-se que os neurônios CA1 piramidais hipocampal no rato mdx, exibe uma significativa suscetibilidade aumentada aos danos hipóxicos-induzidos à transmissão sináptica. Esta vulnerabilidade seletiva foi melhorada substancialmente pela administração de diphenylhydantoin um anticonvulsivo que obstrui ambos os potenciais de ação sódio-dependentes e condutores de cálcio de baixo-ponto inicial. Estes achados sugerem que a deficiência da distrofina poderia predispor populações neurais susceptíveis aos insultos hipóxicos cumulativos que podem contribuir ao desenvolvimento de déficits cognitivos em pacientes com distrofia muscular de Duchenne e que os efeitos de tais períodos de hipóxia podem ser farmacologicamente remediados (MEHLER et al., 1992). Um aspecto importante de DMD que recebe menos atenção é o papel pela ausência ou pelo rompimento da distrofina na função do SNC. Os estudos comportamentais comparativos entre meninos com DMD e ratos mdx, mostraram que os meninos com DMD têm um déficit cognitivo e um QI mais baixo (média 85), enquanto os ratos mdx indicam um déficit na aprendizagem passiva de latência e na memória a curto prazo. Em meninos com DMD, há uma evidência de desordem na arquitetura do SNC, anormalidades nos 19 dendritos e perda neural. No rato mdx, relatórios recentes descrevem uma diminuição de 50% no número de neurônios e perdas neurais nas regiões do cortex cerebral. A evidência histológica mostra que a densidade de conjuntos do canal de GABAA está reduzida assim como as células de Purkinje e os neurônios CA1 hipocampal do mdx. A nível bioquímico, os meninos com DMD apresentam níveis bioenergéticos do SNC anormais e há um aumento nos níveis de compostos choline-containing, indicativos de patologia do SNC. Os ratos mdx também indicam bioenergética anormal, com um nível aumentado do fosfato inorgânico e aumento dos níveis de compostos choline-containing. Funcionalmente, os meninos com DMD têm anormalidades no EEG e há alguma evidência preliminar que a função sináptica está afetada adversamente pela ausência da distrofina. Os estudos eletrofisiológicos de ratos mdx mostraram que os neurônios hipocampais têm uma suscetibilidade aumentada à hipóxia (ANDERSON et al., 2002). Estudo recente mostrou que déficits cognitivos são associados freqüentemente com a distrofia muscular de Duchenne (DMD). Podem ser devido a um déficit nos isoformos do cérebro da distrofina. Os ratos mdx apresentam ausência na distrofina no músculo e no cérebro, causando déficits moderados de aprendizagem e memória, além de comportamentais, ansiedade e a locomoção reduzida em comparação aos ratos do controle (VAILLEND, UNGERER, 1999). Estudos investigativos de alterações em células endoteliais e da glia na barreira hemato-encefálica realizado por Nico et al.2003, indicam que a deficiência do distrofina no cérebro do mdx conduz a lesão severa das células endoteliais e gliais, indicando alterações na barreira hemato-encefálica, sugerindo que as mudanças na permeabilidade vascular estão envolvidas na patogênese da disfunção neurológica associada com a DMD. 20 2.5 Metabolismo energético Em 1937, Hans Krebs apresentou uma série de reações do metabolismo intermediário de carboidratos. O ciclo proposto por Krebs leva o seu nome nos dias de hoje. O ciclo de Krebs, ou ciclo do ácido cítrico, é a via final comum para a oxidação das moléculas alimentares, servindo também como fonte de precursores para biossínteses (BERG et al., 2004) Kennedy e Lehninger, em quase meio século, descobriram que as mitocôndrias contêm as enzimas do ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação dos ácidos graxos, além dos complexos respiratórios (STRYER, 2004). Mitocôndrias são organelas intracelulares, cuja função principal é a produção de ATP pelo metabolismo aeróbico. Do mesmo modo, exercem um papel importante e crítico no processo de apoptose celular e servem de tampão de cálcio. Tecidos com atividade metabólica aeróbica intensa, como o cérebro e os músculos esquelético e cardíaco, apresentam altas concentrações dessa organela (ORTH e SCHAPIRA, 2001). Para que ocorra um bom funcionamento dos neurotransmissores, sistema de segundos mensageiros, expressão gênica, hormonal entre outros, é necessário à obtenção de energia celular, pois os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como, por exemplo, o transporte ativo de íons e moléculas, síntese de macromoléculas e outras biomoléculas a partir de precursores simples e para a contração muscular. A energia necessária para realizar essas funções é obtida com a oxidação de substâncias pela respiração celular. A adenosina trifosfato (ATP) é o principal combustível da célula na maioria dos processos que precisam de energia. A energia é liberada pela hidrólise de ATP e serve para impulsionar uma série de reações (NELSON et al., 2000). Tendo por vez que os carboidratos são degradados à glicose, bem como os lipídios se convertem em ácidos graxos e as proteínas em aminoácidos, estes produtos finais estão envolvidos no processo de respiração celular e, conseqüentemente, na produção de ATP (LEHNINGER et al., 2002). 21 A glicose é um alimento importante e comum, em mamíferos, ela é a única fonte de energia que o cérebro utiliza em condições sem jejum e a única que as hemácias podem utilizar em qualquer circunstancia (BERG et al., 2004). Cada tipo celular nos humanos é capaz de produzir ATP, por meio da glicólise, uma rota no qual a glicose é transportada para dentro das células por proteínas transportadoras específicas. Onde é oxidada e quebrada para formar piruvato, produto final da via, por meio de reações metabólicas que ocorrem no citosol (LEHNINGER et al., 2002; SMITH et al.,2007). Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da mitocôndria e sofre ação combinada do ciclo de Krebs e da fosforilação oxidativa é responsável pela maior parte da produção de ATP gerada pelos seres humanos. Os elétrons presentes nas coenzimas nicotinamida adenina dinucleotideo (NADH) e flavina adenina dinucleotideo (FADH2) são transferidos para os complexos enzimáticos e posteriormente para o oxigênio levando a formação de água (WALLACE, 1999). O piruvato formado na via glicolítica não é reduzido a lactato, a etanol ou a qualquer outro produto de fermentação, em contrapartida ele é oxidado a CO2 e H2O essa fase aeróbia do catabolismo é denominada respiração. A respiração celular ocorre em três estágios: o primeiro, corresponde à molécula dos combustíveis orgânicos (glicose, ácidos graxos e alguns aminoácidos), liberam fragmentos de dois átomos de carbono na forma de um grupo acetil e acetil-coenzima A (acetil-CoA). No segundo momento os grupos acetil entram no ciclo do ácido cítrico, que os oxida por meio de enzimas até CO2. O NADH e o FADH2, que são elétrons reduzidos, transportam energia liberada pela oxidação e por fim no terceiro estágio da respiração o NADH e o FADH2 (coenzimas reduzidas), são oxidadas desfazendo-se de prótons e elétrons. A cadeia de moléculas transportadora de elétrons denominada cadeia respiratória, vai conduzir os elétrons até o O2, no qual se reduzem para formar água. Durante a transferência de elétrons, grande quantidade de energia é liberada e conservada na forma de ATP e esse processo dá-se o nome de fosforilação oxidativa (LEHNINGER et al., 2002; SMITH et al., 2007). Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da mitocôndria e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase, que forma acetil coenzima A (acetil-CoA). A acetil-CoA inicia o ciclo de Krebs. 22 É importante salientar que a acetil-CoA pode ser formada também pela oxidação de ácidos graxos e aminoácidos (BERG et al, 2004; CLARK et al, 1993; SMITH et al., 2007; NELSON e COX, 2000). O ciclo de Krebs é a rota central para recuperação de energia do metabolismo e ocorre na matriz mitocôndrial, no qual consiste de uma seqüência de reações onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas de NADH, uma de FADH2, duas de CO2 e uma de GTP. O NADH e FADH2 produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de elétrons e são utilizados na cadeia respiratória para a produção de ATP na fosforilação oxidativa. Altos níveis de ATP inibem o ciclo de Krebs por mecanismos complementares em vários locais do ciclo. (MARKS et a.l, 2005; NELSON e COX, 2000). 23 Figura A: Ciclo de Krebs. Fonte: SMITH et.al, 2007. Durante o processo de transporte de elétrons, tais proteínas obtêm os prótons da matriz e quando são reoxidadas elas liberam os prótons dentro do espaço intermembrana, originando assim o gradiente de prótons, que resulta em um aumento da concentração de prótons no espaço intermembrana, e a produção de ATP ocorre quando esses prótons migram de volta para o interior da matriz mitocondrial (VOET et al., 2002). Outra forma de produção de ATP é a partir da creatina quinase, uma enzima responsável por catalisar reversivelmente à reação entre a creatina fosfato e a adenosina difosfato (ADP), formando creatina e ATP (BERG et al., 2004). A enzima possui um papel central no metabolismo energético, 24 principalmente para tecidos com alta demanda energética, como cérebro, músculo cardíaco e esquelético, onde funciona como um efetivo sistema de tampão para os níveis celulares de ATP, sendo assim é uma enzima crucial para a homeostase energética (PAGANA et al., 2001). Estudos com músculo demonstraram deficiência no metabolismo energético mitocôndrial em pacientes com depressão, havendo redução da atividade da cadeia de transporte de elétrons e diminuição da produção de ATP (GARDNER et al., 2002), bem como foi demonstraram uma inibição da cadeia de transporte de elétrons em cérebro de ratos submetidos ao estresse crônico (MADRIGAL et al., 2001). No estudo realizado por NAVARRO et al (2004), afirma que a atividade enzimática mitocôndrial, NADH desidrogenase e citocromo oxidade, são marcadores de comportamento no cérebro. Os aumentos da atividade dessas enzimas são diretamente relacionados com os produtos oxidativos e a função neurológica em ratos mdx. Sabendo da gravidade da DMD, dos possíveis danos causados pelos tratamentos e da necessidade de ATP para o bom funcionamento celular, e também que a alteração no metabolismo energético cerebral parece estar associada com algumas doenças neurodegenerativas (BEAL, 1992; HEALES et.al, 1999), é importante conhecer possíveis alterações metabólicas na DMD, ou provenientes de formas de tratamentos para a mesma, como a Fisioterapia neuro-funcional que contribui de maneira construtiva e benigna para o bom desenvolvimento motor, prevenindo alterações osteomusculares mais graves, amenizando os sinais clínicos da distrofia muscular de Duchenne, tal qual a fadiga, melhora o padrão respiratório, prevenindo e minimizando os efeitos posteriores da evolução clínica da doença. 25 2.6 Cadeia respiratória A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de Krebs, ocorrem nas mitocôndrias, fonte principal de ATP em organismos aeróbios. A transferência de elétrons pela cadeia respiratória leva ao bombeamento de prótons da matriz para o lado citossólico da membrana mitocondrial interna. O gradiente de prótons é usado para impulsionar a síntese de ATP (ERECINSKA e DAGANI, 1990; HEALES et al., 1999; WALLACE, 1999; NELSON e COX, 2000). O NADH e o FADH2, formados na glicólise, na oxidação dos ácidos graxos, e no ciclo de Krebs, são moléculas ricas em energia, pois cada uma delas possui um par de elétrons com alto potencial de transferência. Estes elétrons quando são utilizados para reduzir o oxigênio molecular até a água, libera-se grande quantidade de energia que pode ser usada para gerar ATP. A fosforilação oxidativa é o estágio final do metabolismo que produz energia nos organismos aeróbicos, formada por uma série de complexos protéicos, e é o processo no qual se forma ATP quando o NADH e o FADH2 transferem elétrons, por uma série de transportadores de elétrons (SMITH et al., 2007; LEHNINGER et al., 2002; STRYER, 2004). As únicas espécies a atravessarem a membrana interna, que é impermeável, à maior parte das moléculas pequenas e de íons e prótons, são aquelas para as quais existem transportadores específicos. A membrana interna contém os componentes da cadeia respiratória e ATP sintase. Já na matriz mitocôndrial possui todas as vias de oxidação dos combustíveis, com exceção a glicólise, que ocorre no citosol. A membrana interna que é seletivamente permeável segrega os intermediários e as enzimas das vias metabólicas citosólicas por meio de processos metabólicos que ocorrem na matriz. O ATP recém-sintetizado é transportado para fora por meio de transportadores específicos ADP e o Pi que se encontram no interior da matriz (LEHNINGER et al., 2002). A maioria da energia da oxidação dos substratos energéticos no ciclo de Krebs e em outras vias é conservada na forma de co-enzimas aceptoras de elétrons, NADH e FADH2. A fosforilação oxidativa dá início com a entrada de elétrons na cadeia respiratória a maioria desses elétrons originados da ação desidrogenases que arrecadam elétrons das vias catabólicas e os canalizam para os aceptores 26 universais de elétrons, citados anteriormente. Na cadeia transportadora de elétrons o NADH ou FADH2 doam elétrons que passam de forma seqüencial por meio de uma série de carregadores de elétrons que estão localizados na membrana interna da mitocôndria que apresentam grupos prostéticos no qual são capazes de aceitar ou doar um ou dois elétrons. Os elétrons transferidos para o oxigênio passam por meio de uma cadeia de três grandes complexos protéicos, denominados NADH desidrogenase, citocromo redutase e citocromo c oxidase. O fluxo de elétrons por estes complexos pelas membranas levam transportes de prótons através da membrana mitocôndrial interna (MARZZOCO e TORRES, 1999; STRYER, 2004). Os elétrons transportados da NADH desidrogenase para citocromo redutase o segundo complexo da cadeia, pela forma reduzida da co-enzima Q (ubiquinona) também transporta elétrons do FADH2 gerado na succinato desitrogenase do ciclo de Krebs, para o citocromo redutase por meio da succinato oxirredutase. Transporte de elétrons para o oxigênio ocorre por uma série de etapas de oxirredução, onde cada componente sucessivo da cadeia quando recebe elétrons é reduzido e quando passa os elétrons para o próximo componente da cadeia é oxidado. A Flavina mononucleotideo (FMN), centros Fe-S, CoQ e Fe nos citocromos b, c1, c, a e a3, são componentes de oxiredução. O cobre também é um componente dos citocromos a e a3. Desconsiderando o CoQ, todos os aceptores de elétrons citados anteriormente são fortemente ligados a subunidades protéicas dos carregadores. O potencial de redução de cada complexo da cadeia está em um nível de energia mais baixo do que o anterior, de tal modo que a energia é liberada quando os elétrons passam de um complexo para outro. A energia é utilizada para mover prótons contra o seu gradiente de concentração da maneira que eles se tornam concetrados do lado citosolico da membrana interna (SMITH et al.2007). NADH carrega os elétrons derivados das reações catabolicas até o inicio da cadeia respiratória, com complexo NADH desidrogenase. O NADPH geralmente fornece elétrons nas reações anabólicas. Tanto NADH como NADPH não podem atravessar a membrana interna da mitocôndria, mas os elétrons que elas carregam podem ser lançados por meio delas. Os transportadores de elétrons funcionam em complexos multienzimáticos. 27 A cadeia respiratória é dividida em quatro complexos. Os complexos I e II catalisam a transferência de elétrons para ubiquinona a partir de dois doadores de elétrons diferentes o NADH (complexo I) e o succinato (complexo II). O complexo III transporta elétrons da ubiquinona até o citocromo c, e o complexo IV completa a seqüência transferindo elétrons do citocromo c para o complexo II (STRYER, 2004; LEHNINGER et al., 2002). Complexo I: NADH – ubiquinona oxirredutase. Realiza a transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona, formando ubiquinol (QH2). Um FMN recebe dois elétrons do NADH, originando a forma reduzida FMNH2, e é capaz de passar elétrons single para os centros Fe-S. Estes centros são capazes de deslocar elétrons single para orbitais grandes, quando sofrem reação de óxidoredução sem liberar ou captar prótons, deste modo transferindo elétrons para a CoQ e a partir dela. Por meio da NADH desidrogenase ocorre o bombeamento de quatro iontes de hidrogênio para fora da matriz da mitocôndria. A redução de CoQ a QH2 resulta na captação de dois prótons da matriz. O par de elétrons na QH2 ligada são transferidos a um centro 4 Fe-S, e os prótons são liberados no lado citossólico, por fim estes elétrons são transferidos a uma Q móvel no centro hidrófobo da membrana, resultando na captação de mais dois prótons da matriz. O complexo II, denominado de succinato: Q(ubiquinona) oxirredutase, é formado pela succinato desidrogenase (SDH), enzima do ciclo do ácido cítrico que gera FADH2 na oxidação de succinato a fumarato e três subunidades hidrofóbicas. Esta enzima tem FAD como grupo protético. Os elétrons e os prótons do succinato são transferidos para o FAD, que se reduz a FADH2. O FADH2, não sai do complexo. Também fazem parte do complexo II alguns centros de Fe-S e o citocromo b560. Por esses componentes passam os elétrons derivados do FADH2 antes de finalmente serem doados para a coenzima Q são transferidos para centros Fe-S e daí para coenzima Q, para entrarem na cadeia transportadora de elétrons. Duas outras enzimas a glicerol fosfato desidrogenase e a acil CoA desidrogenase, transferem do mesmo modo seus elétrons de alto potencial do FADH2, para coenzima Q, formando ubiquinol (QH2), o estado reduzido da ubiquinona. O complexo succinato: Q oxiredutase e outras enzimas que transferem elétrons do FADH2 para ubiquinona, ao contrário da NADH: Q oxirredutase, não transportam próton. Em 28 conseqüência, menos ATP é formada na oxidação do FADH2 do que do NADH (STRYER, 2002; SMITH et al., 2007). Figura B – Cadeia Respiratória Mitocondrial. Fonte: NELSON e COX (2000). O complexo III, ou citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do ubiquinol para o citocromo c, reação que serve para o bombeamento de mais quatro prótons. O complexo IV mais conhecido como, citocromo c oxidase, contém dois citocromos do tipo (a e a3) e dois íons de cobre, cada qual associado a um dos dois citocromos. Os íons de cobre, alternando entre os estados de oxidação Cu2+ e Cu1+, fazem parte do transporte dos elétrons. O complexo IV é responsável pela doação de quatro elétrons para a molécula de oxigênio (O2) que, liga-se a prótons do meio e converte-se em água (NELSON e COX, 2000). A retirada de prótons da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana contribui para o restabelecimento do gradiente de prótons. Nessa etapa os últimos dois prótons são bombeados (BERG et al, 2004; WALLACE, 1999). A importância da ligação indireta entre a transferência de elétrons é que um não ocorre sem o outro. Assim quando os prótons não estão sendo utilizados para a síntese de ATP, o gradiente de prótons e o potencial de membrana estão sendo formados. Essa pressão de retorno de prótons é o que 29 vai controlar a velocidade de bombeamento de prótons, no qual controla o transporte de elétrons e o consumo de oxigênio (SMITH et al., 2007). O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons durante a cadeia respiratória mitocondrial é utilizado como força motriz para a ATPsintase, formar ATP (fosforilação oxidativa). O ATP é transportado para fora da mitocôndria com o concomitante transporte de ADP para dentro da mitocôndria, através de um sistema antiporte (BERG et al, 2004; HEALES et al, 1999; WALLACE, 1999; NELSON e COX, 2000). A membrana mitocondrial interna é impermeável a prótons em toda a sua extensão, exceto na ATP sintase; e é por este canal que os prótons atravessam a membrana e retorna a matriz mitocôndrial, o ATP recém – sintetizado é utilizado para processos que necessitam de energia, como transporte ativo, a contração muscular ou as reações de biossíntese. Da mesma forma que o ADP, fosfato, piruvato e outros metabólicos devem ser transportados para o interior da matriz (SMITH et al., 2007). As necessidades celulares de ATP variam segundo o estado fisiológico do tecido ou órgão, o cérebro é um tecido de alta demanda mesmo em repouso. Evidências clínicas indicam que o cérebro é extremamente sensível às variações no metabolismo energético. O cérebro humano constitui somente 2% do peso corporal, entretanto pelos seus altos processos de energia consome aproximadamente 25% do total da glicose corporal. A glicose, em determinados tecidos, pode seguir vários caminhos metabólicos, no entanto no cérebro, é quase que totalmente oxidada a CO2 e H2O através de uma seqüência de passagens pela glicólise, ciclo do ácido cítrico associado à fosforilação oxidativa, na qual tem um rendimento de ATP por molécula de glicose. De fato, o consumo de oxigênio pelo cérebro é de 20% do consumo de todo o organismo. Deficiências no funcionamento normal da cadeia respiratória mitocondrial levam à diminuição da síntese de ATP (HEALES et al, 1999). Sabe-se também que o dano causado à mitocôndria leva a uma rápida queda na produção de energia e conseqüente morte celular (ANKARCRONA et al, 1995). 30 2.7 Creatina Quinase A creatina quinase consiste de um grupo de isoenzimas com um papel central no metabolismo energético, principalmente para tecidos com alta demanda energética, como cérebro, músculo cardíaco e esquelético, onde funciona como um efetivo sistema de tampão para os níveis celulares de ATP. (BESSMAN e CARPENTER, 1985; SCHNYDER et al., 1991; WALLIMANN et al., 1992). O suprimento de ATP no cérebro dura em torno de segundos, o que explica a rápida deterioração que ocorre no cérebro devida a privação de O2 (VOET, VOET e PRATT,2002). A creatina quinase catalisa a transfosforilação reversível entre ATP e creatina a ADP e fosfocreatina, auxiliando a manter os níveis dos substratos fosforilados. Durante a excitação nervosa e neuromuscular, sabe-se que ocorre um aumento de dez vezes no turnover celular de ATP, e que durante essas mudanças rápidas, o sistema creatina/fosfocreatina é necessário atuar tanto como um tampão de ATP nas células quanto como um sistema de transporte entre os locais de produção e consumo de ATP pelas ATPases para evitar grandes oscilações nos níveis de ATP/ADP celulares nesses tecidos excitáveis (BESSMAN e CARPENTER, 1985; SCHNYDER et al., 1991; WALLIMANN et al., 1992;VOET, VOET e PRATT,2002). As isoformas da creatina quinase estão localizadas em sítios de demanda e produção energética. Por ter à sua localização próxima a sítios onde ocorre a geração de energia e transporte de íons através de membranas, o sistema CK/fosfocreatina exerce um papel fundamental na homeostase energética neuromuscular. As células musculares e nervosas, que possuem uma alta reciclagem de ATP, dependem das fosfoguanidinas, um grupo de fosfato que regeneram ATP rapidamente e pode ser dividida em um grupo de fosfocreatina, de alto potencial de energia, e em fosfoarginina com potencial baixo de energia para a formação de ATP. Nos vertebrados a fosfocreatina é sintetizada pela fosforilação reversível da creatina e ATP, pela reação catalisada pela creatina quinase (VOET, VOET e PRATT, 2002). Assim, é presumível que alterações na função da creatina quinase levem ao desenvolvimento de vários estados patológicos envolvendo o cérebro, 31 músculo esquelético e músculo cardíaco (HAMMAN et al., 1995; DAVID et al., 1998, AKSENOV et al., 1999; AKSENOV et al., 2000). 32 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Caracterização da pesquisa No que diz respeito ao problema o estudo é quantitativo, sobre os objetivos, a pesquisa se mostra descritiva e exploratória e em relação aos procedimentos é experimental e ex-post-facto. 3.2 Local e Caracterização da amostra Foram utilizados camundongos mdx machos procedentes do biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Os animais foram mantidos em ambiente climatizado (22º C) com ciclo claro-escuro de 12 horas e livre acesso a água e alimentação padrão. Com base em estudos prévios para uma diferença de até 20% nos parâmetros a serem analisados entre os grupos, com uma variância de no máximo 10% entre as médias calculou-se um tamanho de amostra de 10 ratos por grupo, para um erro alfa de 0,05 e um poder de 80%. O experimento foi executado no Laboratório de Fisiopatologia Experimental - FISIOPAT. 3.3 Instrumentos para coleta de dados Através de técnicas espectrofotométricas, as atividades das enzimas creatina quinase e complexos respiratórios foram medidas. O laboratório de Fisiopatologia Experimental – FISIOPAT, sob a coordenação do Prof. Dr. Emílio Streck, aprovou o seguinte estudo, que foi enviado e analisado pelo comitê de ética da UNESC e conta com os recursos necessários para o estudo tais como: reagentes específicos para o experimento, tampões, micropipetas, eppendorfs, balança analítica, homogeneizador entre outros equipamentos que foram utilizados para a pesquisa. 33 3.4 Procedimentos para coleta de dados Após a aprovação do estudo pelo CEP, se deu início a coleta de dados que foi realizado pela pesquisadora, também bolsista no laboratório de Fisiopatologia Experimental. O estudo foi iniciado pelo aprendizado da pesquisadora sobre o metabolismo energético normal e as possíveis alterações da bioenergética nos camundongos com Duchenne; a partir disto os protocolos necessários para a pesquisa, estes baseados na continuação de um estudo prévio utilizando o modelo animal mdx, onde a autora deste estudo aplicou nos camundongos testes comportamentais para verificar a existência de alterações da cognição comparada ao grupo controle; logo após a aplicação desses testes os camundongos foram mortos por decaptação para análise. No presente trabalho, a primeira etapa consistiu em pegar as amostras de cérebros dos camundongos mortos e fazer a - Preparação de tecido e homogeneizado - O cérebro foi rapidamente removido e o córtex pré-frontal, estriado, hipocampo, córtex e cerebelo, separados. As estruturas cerebrais serão homogeneizadas (1:10 w/v) em tampão SETH, pH 7,4 (250 mM sacarose, 2 mM EDTA, 10 mM Trizma base, 50 IU/mL heparina). O homogeneizado foi centrifugado a 800 X g por 10 min e o sobrenadante foi armazenado a -70°C. As proteínas foram determinadas pelo método de Lowry et al (1951), e albumina sérica bovina foi utilizada como padrão. Na seqüência, a estrutura cerebral foi homogeneizada (atividade da creatina quinase) em solução salina (1:10, p/v), o homogeneizado foi centrifugado a 800 x g por 10 minutos e o sobrenadante utilizado para determinação da atividade da creatina quinase total. As frações mitocondriais foram separadas por centrifugação e dosadas da mesma forma. O meio de incubação é composto por fosfocreatina, ADP e glutationa reduzida. A formação de creatina foi utilizada para medir a atividade enzimática (Hughes, 1962). Após as técnicas citadas anteriormente iniciou-se a verificação da Atividade do complexo I - onde mostra a atividade da NADH desidrogenase foi avaliada pelo método descrito por Cassina e Radi (1996) pela taxa de NADH-dependente da redução do ferricianeto a 420 nm, seguindo da Atividade do complexo II + Succinato Desidrogenase - nos quais mostrou as atividades enzimáticas foram medidas pelo método descrito por Fischer et al 34 (1985), onde a diminuição da absorbância do 2,6-DCIP em 600 nm é usada para o cálculo da atividade do complexo II. Para o cálculo da SDH foi utilizado o mesmo sistema na presença de metassulfato de fenazina. Na seqüência, analisou-se - Atividade do complexo II-III - No qual a atividade do citocromo c oxiredutase (complexo II–III) foi determinado de acordo com Fischer et al (1985), onde foi medido pela redução do citocromo c para succinato. Finalizando com a preparação da amostra, a mesma utilizada para citrato sintase. (A atividade do complexo IV) foi determinada de acordo com Rustin e colaboradores (1994), e é calculada pela diminuição da absorbância causada pela oxidação do citocromo c reduzido, medido em 550 nm. 3.5 Procedimentos para análise Após a coleta e tabulação dos dados, os mesmos foram analisados e discutidos através de análise de variância de uma via seguida pelo teste de Duncan, quando o F for significativo, ou pelo teste t de Student, utilizando o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). 35 4 APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS A Figura 1 apresentou atividade da cadeia respiratória mitocondrial no cérebro de camundongos mdx. No Complexo I (1A) a atividade do hipocampo está diminuída (P=0,007), pré-frontal (P=0,004), córtex (P=0,010) estriado (P=0,008) e cerebelo (P=0,007). A atividade do Complexo II (1B) não foi alterada nas estruturas cerebrais. Já no Complexo III (1C) houve um aumento da atividade somente no córtex (P=0,014). Complexo IV (1D) teve uma diminuição na atividade do pré-frontal (P=0,026) e estriado (P=0,038). Todos os resultados foram comparados com o grupo controle. 36 Com relação à figura 1 sabe-se que houve uma diminuição na atividade de todas as estruturas do complexo I. A proteína distrofina está localizada na membrana interna celular nas células musculares e cerebrais. No músculo esquelético dos camundongos mdx, estudos indicam disfunção na mitocôndria e alteração na composição da proteína mitocôndrial. Estes autores demonstraram uma diminuição de 50% na atividade de todas as enzimas ligadas à cadeia respiratória do músculo quadríceps de camundongos mdx adultos quando comparados com grupo controle. Nas fibras dos músculos esqueléticos de camundongos mdx, a taxa máxima de respiração mitocôndrial foi cerca de duas vezes menor do que o controle. Essas alterações também foram encontradas em mitocôndrias isoladas demonstrando somente 60% de hemoproteínas na membrana interna mitocôndrial (KUZNETSOV et al., 1998). Achados similares foram observados na biópsia de músculo esquelético em pacientes com distrofia muscular de Duchenne (SCHOLET et al., 1985). Dados demonstrados por Kuznetsov e colaboradores sugerem que uma diminuição específica na quantidade de todas as enzimas na membrana interna da mitocôndria, provavelmente como resultado de sobrecarga de Ca+ nas fibras musculares, respondendo ao déficit bioenergético no músculo esquelético deficiente de distrofina. Outros estudos também demonstraram que na mitocôndria isolada do músculo quadríceps de camundongos mdx ocorre uma elevação do conteúdo de cálcio e diminuição da taxa de controle respiratório com NAD associado aos substratos piruvato/malato (GLESBY et al., 1988) e disfunção mitocôndrial no soro de ratos mdx. No cérebro de ratos, a proteína distrofina esta presente em todas as regiões (LIDEOV et al., 1990). No entanto, existem vários caminhos que podem afetar o cérebro. Primeiro, a distrofina é expressa no desenvolvimento cerebral (SOGOS et al., 1992), e mutações que afetam o complexo distrofina pode afetar a migração neuronal e diferenciação (MEHLER et al.,1992). Segundo, a falta de distrofina afeta a exitabilidade neuronal. A distrofina é encontrada nos aparatos pós-sinapticos, servindo de receptor ancora, incluindo o receptor GABAA. (HAENGGI e FRITSCHY, 2006). A falta de distrofina também afeta em longo prazo a plasticidade sinaptica (CULLIGAN e OHLENDIECK, 2002). Terceiro, a 37 perda de distrofina pode levar à morte neuronal (JAGADHA e BECKER, 1988), deixando os neurônios mais suscetíveis a insultos metabólicos e fisiológicos (CULLIGAN e OHLENDIECK, 2002). Devido à ausência de estudos e uma melhor compreensão desses mecanismos avaliamos a atividade da cadeia respiratória mitocondrial e da creatina quinase. Uma série de doenças neurológicas está associada à morte neuronal e neurodegeneração, culminando no comprometimento cognitivo (MANCUSO et al., 2007) causados principalmente pela diminuição da energia cerebral e disfunção mitocôndrial. Demonstramos, neste estudo, uma disfunção no cérebro de camundongos mdx. No hipocampo, uma estrutura importante para o aprendizado e memória, houve diminuição da atividade do Complexo I. Outras estruturas que contém proteína distrofina também apresentaram uma diminuição da atividade no complexo I. No estriado, complexo I e IV estava alterado. Recentemente, foi demonstrado no estriado que os níveis protéicos de BDNF estavam reduzidos (TUON et al.; 2009). A disfunção na função mitocôndrial poderia diminuir a produção de ATP. Foi comprovado um aumento da atividade de creatina quinase no hipocampo, córtex, estriado e pré-frontal no cérebro dos camundongos mdx. A Figura 2 demonstrou a atividade da creatina quinase no cérebro de camundongos mdx. Houve um aumento na atividade de CK no hipocampo (t=7,266; dp=8; p=0,0001), pré-frontal (t=-8,608; dp=8; p=0,0001), córtex (t=4,983; dp=8; p =0,0001) e estriado (t=-4,983; dp=8; p=0,001), comparado com o grupocontrole. 38 Neste contexto, o aumento da capacidade de regeneração de ATP via reação da creatina quinase pode ser relacionado a um retardo na depleção de ATP, e assim, proteger o cérebro contra danos. A creatina quinase desempenha um papel central no metabolismo de tecidos que consomem bastante energia, tais como o cérebro, ele catalisa a transferência reversível de fosforil para grupo de fosfocreatina a ADP, regenerando ATP (LIPTON e WHITTINGHAM,1982). A diminuição na atividade de creatina quinase está associada a uma via de neurodegeneração que resulta em perda neuronal (GREEN e FRY,1980; BRUSTOVETSKY, BRUSTOVETSKY e DUBINSKY, 2001). No camundongo mdx, a creatina quinase no soro é elevada em 5, 10 e 23 semanas de idade (GLESBY et al., 1988). . Outro estudo mostrou que no músculo esquelético a ausência de distrofina está associada à redistribuição de energia intracelular e um feedback nos sistemas de transferência de sinais entre mitocôndrias e ATPases. Como o mecanismo mediado por creatina quinase foi ineficiente, o papel de difusão da adenina nucleotídeos aumenta, devido à uma maior permeabilidade da membrana externa mitocondrial para ADP e aumenta a compartimentalização do fluxo de ADP. 39 5 CONCLUSÃO Fica evidente, em nossos resultados, uma disfunção na atividade da cadeia respiratória mitocôndrial e o aumento da atividade da creatina quinase no cérebro de camundongos mdx. Este aumento na atividade da creatina quinase pode estar causando um efeito protetor contra o dano celular. Futuros estudos podem ser realizados para elucidar o envolvimento dos mecanismos neurobiológicos envolvidos na alteração cognitiva no cérebro de camundongos mdx. 40 REFERÊNCIAS ANDERSON JL, HEAD SI, RAE C, MORLEY JW. Brain function in duchenne muscular dystrophy. Brain 125: 4-13; 2002. ANKARCRONA, M.; DYPBUKT, J.M.; BONFOCO, E.; ZHIVOTOVSKY, B.; ORRENIUS, S.; LIPTON, A.S.; NICOTERA, P. Glutamate-induced neuronal death: a sucession of necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function. Neuron, (15), p. 961-973, 1995. AKSENOV M.; AKSENOVA M.V.; BUTTERFIELD A.; MARKESBERY W.R. Oxidative Modification of Creatine Kinase BB in Alzheimer’s Disease Brain. Journal of Neurochemistry, 74: 2520–2527, 2000. AKSENOV, M.; AKSENOVA, M. V.; PAYNE, R. M.; TROJANOVSKI, J. Q.; SCHMIDT, K. L.; CARNEY, J. M.; BUTTERFIELD, D. A.; MARKESBERY, W. R. 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Streck b; Mariz Vainzoinf c; João Quevedo a a Laboratório de Neurociências, Programa de Pós-Graduação Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil; b Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806000 Criciúma, SC, Brazil. c Human Genome Research Center, Biosciences Institute, University of São Paulo, São Paulo, Brazil. *Corresponding author: Prof. Emílio Streck, MD, Ph Laboratório de Fisiopatologia Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil Fax: +55 48 3443 4817. 50 ABSTRACT Objective: To evaluate mitochondrial respiratory chain and creatine kinase activities in the brain mdx mouse. Design: Prospective, controlled experiment. Setting: Animal basic science laboratory. Subjects: mdx mouse (03 month week old) and normal C57BL10 (wild-type) Interventions: male dystrophic (mdx) and normal C57BL10, were killed by decapitation, and brain structures (cerebellum, hippocampus, striatum and cortex) were isolated. Mitochondrial respiratory chain and creatine kinase activity were then measured. Measurements and Main Results: There was observed that mdx mouse presented decreased mitochondrial respiratory chain activity in complex I, but not in complex II, increase in cortex complex III and decreased in striatum complex IV. Activity of succinate dehydrogenase was increase in cortex and striatum. Creatine kinase activity increased prefrontal, hippocampus, cortex and striatum. Conclusion: Our results showed that a fist relationship between mitochondrial respiratory chain and creatine kinase activities in brain and mdx mice. Key Words: mouse mdx; mitochondrial respiratory chain; creatine kinase; brain. 51 INTRODUCTION The mdx mouse with essential dystrophin deficiency is an established animal model de Duchenne’s muscular de dystrophy in humans. It well documented that dytrophin localizes at the sarcolemma creating a tight association with a glycoprotein complex of the plasma membrane. The protein is located at the inner-cell membrane in muscles and brain cells, in association with a membrane-bound cytoskeletal protein an complex known as the dystrophin-associated proteins. The selective loss of dystrophin is of significance in pathophysiology of muscular dystrophy. The current hypotheses attribute the necrosis of the dystrophin-deficient muscle fibrers to mechanical weakening of the outer membrane, to an excessive influx of de Ca2++ ions, or to a combination of these two mechanisms. Mitochondrial permeability transition pore by the Ca2++ overload or the release of cytochrome c from de defective mitochondria. The Brain dystrophin is enriched in the postsynaptic densities of pyramidal neurons specialized regions of the subsynaptic cytoskeletal network that are critical for synaptic transmission and plasticity [2]. The lack of dystrophin in brain structures have been involved in cognitive functions, such as the hippocampus and neocortex [3]. However, the nature, magnitude and biological support of the cognitive deficits involving the dystrophin still remain unclear, though they have been partly addressed by studies in the dystrophin-deficient mouse, a genetic model of DMD commonly named the mdx mouse [3,4]. 52 The brain dystrophin is abundant in the hippocampus and absent in other subcortical areas [2], selective behavioural deficits involving hippocampal function were predicted to occur in the mdx mice mutant. Pioneer studies showed that dystrophin deficiency in mdx mice is associated with impaired memory retention at long delays in certain procedural learning tasks and spatial alternation tasks [5-6]. At the cellular level, the absence of dystrophin in mdx mice causes altered calcium homeostasis and hippocampal neuronal function [8], particularly specific alterations of hippocampal long-term potentiation a form of plasticity widely believed to be critical for memory formation [4]. In accordance with this concept, substantial alterations of energy metabolism in skeletal muscle of mdx mice and patients with Duchenne’s muscular dystrophy not study on mitochondrial respiratory chain and creatine kinase activities. In this context, the present study investigated whether dystrophin deficiency modifies mitochondrial respiratory and creatine kinase activities activity in mdx mice in brain. 53 MATERIALS AND METHODS Animals MATERIALS AND METHODS Animals We used male dystrophic (mdx) and normal C57BL10 mice (3 months: wild-type n=5, mdx n=5) ceded by Human Genome Research Center, Biosciences Institute, University of São Paulo. The animals were housed 5 to a cage with food and water available ad libitum and were maintained on a 12h light/ dark cycle (lights on at 7:00 am). All experimental procedures involving animals were performed in accordance with the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and the Brazilian Society for Neuroscience and Behavior (SBNeC) recommendations for animal care. Mitochondrial respiratory chain enzymes activities Brain structures were homogenized (1:10, w/v) in SETH buffer (250 mM sucrose, 2 mM EDTA, 10 mM Trizma base, 50 IU/ml heparin, pH 7.4). The homogenates were centrifuged at 800 x g for 10 min and the supernatants were used for determination of mitochondrial respiratory chain enzyme activities (complexes I, II, II–III and IV). NADH dehydrogenase (complex I) was evaluated according to the method described by Cassina and Radi (1996) by the rate of NADH-dependent ferricyanide reduction at 420 nm (07). The activities of succinate: DCIP oxidoreductase (complex II) and succinate: cytochrome c oxidoreductase (complex II–III) were determined according to the method of Fischer et al. (1985) (08). Complex II activity was measured by following the 54 decrease in absorbance due to the reduction of 2,6-DCIP) at 600 nm. Complex II-III activity was measured by cytochrome c reduction from succinate. The activity of cytochrome c oxidase (complex IV) was assayed by following the decrease in absorbance due to the oxidation of previously reduced cytochrome c at 550 nm (09). The activities of the mitochondrial respiratory chain complexes were expressed as nmol/min mg protein (09). Creatine kinase activity Creatine kinase activity was measured in brain homogenates pre-treated with 0.625 mM lauryl maltoside. The reaction mixture consisted of 60 mM Tris– HCl, pH 7.5, containing 7 mM phosphocreatine, 9 mM MgSO4 and approximately 0.4–1.2 g protein in a final volume of 100 L. After 15 min of preincubation at 37 oC, the reaction was started by the addition of 0.3 plus 0.08 mol of ADP mol of reduced glutathione. The reaction was stopped after 10 min by the addition of 1 mol of p-hydroxymercuribenzoic acid. The creatine formed was estimated according to the colorimetric method of Hughes (1962) (10). The color was developed by the addition of 100 mL 2% -naphtol and 100 mL 0.05% diacetyl in a final volume of 1 mL and read spectrophotometrically after 20 min at 540 nm. Results were expressed as units/min x mg protein. The group mdx and wild type with five mouse were killed by decapitation, and brain structures (cerebellum, hippocampus, striatum and cortex) were immediately isolated and stored at -80ºC for posterior analyses. Sham animals (n=5) were killed at the same time after operation. 55 Statistical Analysis Data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Tukey test when F was significant and are expressed as mean ± standard deviation. All analyses were performed using the Statistical Package for the Social Science (version 12.0) software. RESULTS As demonstrated in Fig. 1 complex I activity decreased in all analyzed structures. In complex II (Figure 2) activities were not altered in all analyzed structures, III (Figure 3) activity increased in cortex, IV (Figure 4) activity increased in prefrontal and estriatum. Figure 5 demonstrated that succinate dehydrogenase activity increased cortex e striatum. We demonstrated in figure 6 that creatine kinase activity increased in hippocampus, prefrontal, cortex and striatum. DISCUSSION The present study demonstrated that (1figura) complex I and complex IV activity decreased dystrophy mdx mice in several rat brain structures (2 figura) creatine kinase, complex III and succinato activity increased in several rat brain structures in mice mdx. Researchs indicate that a substantial change in mitochondrial protein composition, most probably as result of the Ca++ overload of muscle fibers, is the reason for the bioenergetic deficts in adult mdx skeletal muscle and may of pathophysiological significance for the development of muscle fiber necrosis in diseases associated. In this context, mitochondrial dysfunction was demonstrated in musculus quadriceps of de mdx mice adult but, to the best of our knowledge, never in the brain. Brain energy impairment has been linked to neuronal death and neurodegeneration (11,12). Castaldo et al. demonstrated in 56 neurons, as in other excitable cells, mitochondria extrude Ca(2+) ions from their matrix in exchange with cytosolic Na(+) ions. This exchange is mediated by a specific transporter located in the inner mitochondrial membrane, the mitochondrial Na(+)/Ca(2+) exchanger (NCX(mito)). The stoichiometry of NCX(mito)-operated Na(+)/Ca(2+) exchange has been the subject of a long controversy, but evidence of an electrogenic 3 Na(+)/1 Ca(2+) exchange is increasing. Although the molecular identity of NCX (mito) is still undetermined, data obtained in our laboratory suggest that besides the long-sought and as yet unfound mitochondrial-specific NCX, the three isoforms of plasmamembrane NCX can contribute to NCX(mito) in neurons and astrocytes. NCX(mito) has a role in controlling neuronal Ca(2+) homeostasis and neuronal bioenergetics. (13) The inhibition in mitochondrial function could decrease ATP production. We demonstrated an increase in creatine kinase activity in the, hippocampus, cortex, striatum and prefrontal. The increase ATP-regenerating capacity via the creatine kinase reaction might be related to a delay in ATP depletion and, thereby, to protect the brain from damage (Lipton & Whittingham). Creatine kinase plays a central role in the metabolism of highenergy consuming tissues such as brain. It catalyzes the reversible transfer of the phosphoryl group from phosphocreatine to ADP, regenerating ATP. Our analysis, shown that a decrease in creatine kinase activity is associated with a neurodegenerative pathway that results in neuronal loss (13,14). We suppose that the observed increase in creatine kinase activity could be a response to dystrophy brain dysfunction 57 Our results showed that a fist relationship between mitochondrial respiratory chain and creatine kinase activities in brain and mdx mice. further studies are required for elucidate the neurobiology mechanisms involved on dystrophy in brain. 58 REFERENCES 1 – Kuznetsov AV, Winkler K, Wiedemann F R, Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation in skeletal muscle of the dystrophin-deficient mdx. Molecular and Cellular Biochemistry 1998; 183:87-96. 2 – Lidov HG, Byers TJ, Watkins SC, Kunkel LM. Localization of dystrophin to postsynaptic regions of central nervous system cortical neurons. Nature 1990; 348:725-8. 3 - Anderson JL, Head SI, Rae C, Morley JW. Brain function in Duchenne muscular dystrophy. Brain 2002; 125:4-13. 4 – Vaillend C, Rampon C, Davis S, Laroche S. 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(n=5). * significantly different from wild-type (p<0.05). 61 FIGURES 1) Complex I WT 250 mdx Complex I 200 150 100 * 50 * * * * 0 Hippocampus Prefrontal Cortex Striatum Cerebellum 2) Complex II Wt 5 mdx 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Hippocampus Prefrontal Cortex Striatum Cerebellum 62 3) Complex III Wt 3,5 * mdx 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Hippocampus Prefrontal Cortex Striatum Cerebellum 4) Complex IV Wt 450 mdx 400 350 300 250 200 150 * 100 * 50 0 Hippocampus Prefrontal Cortex Striatum Cerebellum 63 5)SuccinateDehydrogenase Wt 18 mdx 16 * 14 * 12 10 8 6 4 2 0 Hippocampus Prefrontal Cortex Striatum Cerebellum 6) Creatine Kinase activity Wt 9 mdx * 8 7 6 * * * 5 4 3 2 1 0 Hippocampus Prefrontal Cortex Striatum Cerebellum